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2  Einführung

Tumoren stellen nach Herz-Kreislauf-Erkrankungen die zweithäufigste Todesursache in den westlichen Ländern dar. Tumorzellen sind veränderte körpereigene Zellen, die ihre normale Wachstumskontrolle verloren haben. Tumor-spezifische T-Zellen erkennen antigene Strukturen auf der Oberfläche der Tumorzellen und können diese zerstören. Die T-Zell vermittelte Immunantwort spielt damit eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung von entarteten körpereigenen Zellen wie auch von Viruserkrankungen.

2.1 Kutane Lymphome

Kutane Lymphome sind eine heterogene Gruppe von lymphoproliferativen Tumoren mit Primärmanifestation in der Haut, die sich entweder von T-Zellen (engl. cutaneous T cell lymphoma, CTCL) oder B-Zellen (engl. cutaneous B cell lymphoma, CBCL) ableiten. Die Häufigkeit der Erkrankung liegt bei 0,5-1/100000 und macht damit etwa 25% aller Non-Hodgkin-Lymphome aus (Eichmuller, 2002). Nach der Klassifizierung der EORTC (Willemze, et al., 1997) umfassen die CTCL verschiedene Erkrankungen, von denen die sogenannte Mycosis fungoides (MF) mit 44% die häufigste Form darstellt. Die grundlegenden Kriterien für die Diagnose dieser Erkrankungen sind Klinik und Histologie. Klinisch können drei verschiedene Arten von Hautläsionen unterschieden werden: Exzematöse, häufig atrophische Läsionen, rot-schuppende Plaques und Tumoren. Diese Formen sind jeweils für frühe, fortgeschrittene und späte Stadien charakteristisch. CTCL ist meistens eine Erkrankung mit geringer Malignität und einer langsamen Progression, die sich über Jahrzehnte entwickeln kann. Das histologische Erscheinungsbild ist durch typische bandförmige Infiltrate, Epidermotropismus der T-Zellen und eventuell morphologische Besonderheiten der Tumorzellen wie zerebriforme Zellkerne gekennzeichnet. Molekulargenetisch wird die Erkrankung durch den Nachweis eines dominant expandierten T-Zellklons diagnosiert. In der Regel ist eine Diagnose nur durch Kombination dieser Kriterien möglich. Mycosis fungoides mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von 87% stellt eher eine indolente Form im Gegensatz zum grosszelligen CD30+-CTCL und Sezary Syndrom mit 5-Jahres-Überlebensraten von 11%-15% dar. Die Behandlung ist insbesondere in den fortgeschrittenen Stadien problematisch, da keine kurative Therapie zur Verfügung steht. Immunologische Therapien könnten eine vielversprechende Alternative darstellen, für die jedoch Tumor-spezifische Zielstrukturen benötigt werden.


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Phänotypische Analysen zeigen, dass die Haut-infiltrierenden Zellen überwiegend reife Th-Zellen vom memory Phänotyp sind, d.h. CD3+CD4+CD8-CD45RO+ (Willemze, et al., 1997). Nur ein kleiner Teil (5%) von allen CTCL-Fällen sind vom CD3+CD8+CD4--Phänotyp (Nasu, et al., 1985). Es gibt keinen phänotypischen Marker, mit dem die normalen T-Zellen von den malignen T-Zellen unterschieden werden können. Es sind allerdings eine Reihe von phänotypischer Markern für die malignen T-Zellen vorgeschlagen worden: reduzierte CD3-Expression (Edelman and Meyerson, 2000), Fehlen von CD7-Molekülen (Laetsch, et al., 2000, Rappl, et al., 2001), abartig verminderte Expression von CD26 (Bernengo, et al., 2001, Jones, et al., 2001), Verlust von Fas-Rezeptoren (Dereure, et al., 2000, Zoi-Toli, et al., 2000), Expression der NK-Rezeptoren (NKR) p140/KIR3DL2 und Expression des inhibitorischen Rezeptors SC5 (Nikolova, et al., 2002). Keines dieser Marker ist Tumor-spezifisch.

In den meisten Fällen dieser Erkrankung kann ein dominant expandierter T-Zellklon anhand des TCR-γ-Ketten-Rearrangements nachgewiesen und als genetischer Marker für die Tumorzelle benutzt werden (Hindkjaer, et al., 1993, Karenko, et al., 1997, Mielke, et al., 1994). In vielen Fällen findet man auch phänotypisch die Dominanz einer bestimmten TCR-Vß-Familie. Die Demonstration von mono- und oligoklonalen TCR-γ-Rearrangements in läsionaler Haut mit Hilfe von PCR und hochauflösender Elektrophoresetechniken oder Fragmentlängenanalysen ist ein wichtiger diagnostischer Marker und eine Ergänzung der klinischen und histologischen Diagnostik von CTCL (Kneba et al., 1994; Wood et al., 1992).

Tumorzellen akkumulieren im Laufe ihrer Evolution immer mehr genetische Veränderungen. Die häufigen Mutationen bei Genen, die Mitose und Apoptose der Zellen regulieren, werden als Promotoren der Tumorentstehung angesehen. Änderungen der Zahl der Chromosomen oder von Chromosomenabschnitten, Translokationen, Amplifikation von bestimmten Genen und Änderungen eines oder weniger Nukleotide können die wesentlichen Mutationsarten bei Tumoren sein. Das Genom von Lymphozyten scheint wegen ihrer zeitweise aktivierten DNA-Rekombinationsmaschinerie besonders für chromosomale Translokationen anfällig zu sein. Bei kutanen T-Zell-Lymphomen können chromosomale Aberrationen große Ausmaße erreichen und einen Großteil der Chromosomen erfassen. Am häufigsten treten Veränderungen in den chromosomalen Bereichen 17q, 10p/q, 13q, 7p/q, X, 3p/q und 6p/q (Fischer, et al., 2004, Karenko, et al., 1997, Thangavelu, et al., 1997) auf.


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2.2  T-Zell-vermittelte Immunantworten

2.2.1 MHC-restringierte Antigenerkennung

T-Zellen erkennen über ihren T-Zellrezeptor (TCR) Peptide im Komplex mit den Haupthistokompatibilitätsantigenen (MHC, engl. major histocompatibilty complex). CD8+-T-Zellen (CD, engl. cluster of differentiation) erkennen Peptide von 8 bis 10 Aminosäuren im Komplex mit MHC-Klasse-I-Molekülen (MHC-I) und CD4+-T-Zellen Peptide von 11 bis 15 Aminosäuren im Komplex mit MHC-Klasse-II-Molekülen (MHC-II) (Janeway et al., 2001). CD8+-T-Zellen sind in der Regel zytotoxische T-Zellen (CTL, engl. cytotoxic T lymphocytes) und Haupteffektorzellen bei der Abwehr von Virusinfektionen und Tumoren. CD4+-T-Zellen dagegen sind meistens T-Helfer-Zellen (Th), die bei der Aktivierung von B-Zellen und CTL eine wichtige Rolle spielen. Es gibt aber auch Ausnahmen hinsichtlich der Funktion der beiden Zelltypen.

HLA-A, -B und –C werden als sogenannte klassische Transplantationsantigene oder auch Klasse-Ia-Moleküle bezeichnet. Diese Moleküle sind hochpolymorph mit derzeit 303 bekannten Allelen für HLA-A, 559 für HLA-B und 150 für HLA-C (http://www.ihwg.org 01/2004). Die meisten Unterschiede zwischen den Allomorphen finden sich dabei in Bereichen, die in die Peptidbindung involviert sind und beeinflussen so die Peptidbindungseigenschaften der einzelnen Allele (Janeway et al., 2001). Im Gegensatz dazu wurden HLA-E, -F und –G aufgrund des begrenzten Polymorphismus, der beschränkten Gewebeverteilung und der geringen Expression als nicht-klassische Klasse-I-Moleküle oder auch als Klasse-Ib bezeichnet (Le Bouteiller and Lenfant, 1996).

Peptide, die an die MHC-Klasse-Ia-Moleküle binden, müssen ein bestimmtes Bindungsmotiv aufweisen, das von der Struktur des MHC-Allomorphs in der Peptidbindungstasche abhängig ist. Durch Röntgenstrukturanalysen wurde gezeigt, dass sich MHC-I- und MHC-II-Moleküle strukturell sehr ähnlich sind (Bjorkman, et al., 1987, Brown, et al., 1993, Fremont, et al., 1992), selbst bei unterschiedlichen Spezies wie Maus und Mensch. Die Peptidbindungsregion wird jeweils von zwei Domänen gebildet und formt sich aus 2 α-Helices und einer darunter liegenden Platte aus 8 ß-Faltblattsträngen. Die Bindungsregion für antigene Peptide ist bei MHC-Ia-Moleküle an beiden Seiten geschlossen, bei MHC-II-Molekülen dagegen offen. Bei HLA-A*0201 sind die Position 2 und 9 eines Nonapeptids in engem Kontakt mit dem MHC –Molekül und werden als Ankerpositionen bezeichnet. Frühere Daten aus Poolsequenzierungen [Seite 8↓]von Peptiden, die an MHC-I gebunden waren, zeigten, dass für diese Ankerpositionen bestimmte Aminosäuren (AS) bevorzugt sind. Im Falle von HLA-A*0201 sind Leucin und Valin die bevorzugten Ankeraminosäuren in diesen Positionen. Es gibt auch subdominante Anker, die nicht so eng wie die Hauptankerpositionen mit dem MHC in Kontakt stehen, z. B. Position 6 für HLA-A*0201. Bei den MHC-II-Molekülen sind die N- und C-Termini der Peptiden nicht in den Taschen der Peptidbindungsregion verankert, wodurch die Peptide länger als bei den MHC-I-Molekülen sein können. Die Röntgenstrukturanalysen von HLA-DR1, an dem ein Hämagglutinin-Peptid (HA306-318) von Influenza gebunden war, zeigten nur 9 AS innerhalb der Peptidbindungsregion (Stern, et al., 1994). Im Gegensatz zu MHC-I-Molekülen erlauben die MHC-II-Moleküle eine relativ degenerierte Peptidbindung (Falk, et al., 1994).

Kristallstrukturanalysen für den Maus TCR-MHC-Peptidkomplex 2C-TCR-dEV8-H-2Kb (Garcia, et al., 1998, Speir, et al., 1998) sowie für die humane TCR-MHC-Peptidkomplexe A6-TCR–Tax-HLA-A2 (Garboczi, et al., 1996) und B7-TC–Tax-HLA-A2 (Ding, et al., 1998) zeigen ein übereinstimmendes Andockprofil unabhängig von der TCR-Spezifität oder Spezies: TCR-Vα bindet die MHC α2-Helix und TCR-Vß die MHC-α1-Helix. Als Konsequenz scheinen die CDR1- und CDR3-Regionen von den jeweiligen TCR-Vα- und -Vß Ketten an der Peptidbindung, die CDR2-Regionen aber mehr an der Bindung an MHC beteiligt zu sein.Im Gegensatz zu Antikörpern scheinen die TCR ähnliche und fixierte Bindungsgeometrien für ihre Antigenbindung zu nutzen mit dem TCR diagonal zum MHC-Peptidkomplex.

Die Kristallstrukturanalysen der TCR-MHC-Peptid-Komplexe B7-TCR-Tax-HLA-A2 (Ding, et al., 1998) und A6-TCR-Tax-HLA-A2 (Garboczi, et al., 1996), beide spezifisch für dasselbe Tax-Peptid LLFGYPVYV des humanen T cell lymphotropic virus HTLV-1, zeigen, dass bis auf eine Position von 17 TCR-Aminosäurepositionen unterschiedliche TCR-Aminosäurepositionen für das Binden am selben HLA-A2/Tax-Peptidkomplex verantwortlich sind. Dies könnte die unterschiedlichen Effekte von modifizierten Tax-Peptiden auf die Aktivierung von Tax-spezifischen CTL-Klonen erklären. Einzelne AS-Austausche im Tax-Peptid hatten unterschiedliche Auswirkungen auf die Effektorfunktion der beiden CTL-Klone (Ding, et al., 1998). Die Y8A-Variante, Austausch von Tyrosin gegen Alanin in Position 8, des Tax-Peptids wurde nicht vom CTL-Klon A6 erkannt (Nullpeptid). Der B7-CTL-Klon erkannte zwar bei der Zytolyse diese Variante schwächer als das Tax-Peptid (partieller [Seite 9↓]Agonist) aber produzierte kein IFNγ. Die Y5A-Variante, Austausch von Tyrosin gegen Alanin in Position 5, hatte dagegen ein partiell agonistischen Effekt bei CTL-Klon A6 war ein Nullpeptid für CTL-Klon B7.

2.2.2 Antigenprozessierung und Antigenpresentation

Bei der Antigenprozessierung von Proteinen entstehen Peptide, die als Komplexe mit MHC-Klasse-I- bzw. MHC-Klasse-II-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden können. Für die Präsentation der MHC-Klasse-I-Peptidkomplexe werden Proteine im Zytosol durch Proteasomen (Coux et al., 1996; Rock et al., 1994) und durch den kürzlich beschriebenen TPP-II-Komplex (engl. Tripeptidyl peptidase II) (Seifert, et al., 2003) unter Energieverbrauch abgebaut, wobei Peptidfragmente entstehen, die von Aminopeptidasen weiter abgebaut werden können. Wahrscheinlich spielt die Markierung der zu verarbeitenden Proteine mit Ubiquitin eine wichtige Rolle für den Abbau durch Proteasen (Bachmair and Varshavsky, 1989, Townsend, et al., 1988, Varshavsky, 1997). Die entstandenen Peptidfragmente werden durch den TAP-Transporter (engl. transporter associated with antigen processing) ins ER transportiert. TAP ist ein Heterodimer aus TAP1 und TAP2, und gehört zur Familie der ABC-Transporter. Im ER werden die Peptide in die neuentstandenen MHC-I-Moleküle eingebaut. Die MHC-Klasse-I-Moleküle bestehen aus 2 Untereinheiten, einer α-Kette mit 45kDa und einer ß-Kette, dem ß2-Mikroglobulin (ß2m) mit 12kDa. Die neusynthetisierte α-Kette wird durch Bindung an das membrangebundene Calnexin partiell gefaltet und im ER zurückgehalten (Vassilakos, et al., 1996). Lagert sich ß2m an die α-Kette dissoziert das αß2m-Molekül von Calnexin und bindet an einen Proteinkomplex aus Calreticulin und Tapasin, einem mit TAP1 assoziierten Protein.Es ist noch nicht geklärt, ob das TAP-Protein direkt an der Bindung eines Peptids durch das MHC-Klasse-I-Molekül beteiligt ist, oder ob einfach die räumliche Nähe von TAP und MHC-I-Molekülen eine effiziente Bindung gewährleistet. Die Bindung eines Peptids an das MHC-Molekül bewirkt die Loslösung vom TAP-Komplex. Das nun vollständig gefaltete und beladene MHC-I-Molekül wird über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert.

Die Prozessierung von extrazellulär aufgenommen Proteinen zu Peptiden, die auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden, findet in den Endolysosomen statt (Braciale and Braciale, 1991). Auch zytosolische Peptide können von MHC-II-Molekülen gebunden und präsentiert werden (Oxenius, et al., 1995, Pinet, et al., 1994). Durch den Abbau durch Proteasen entstehen [Seite 10↓]Peptide von 12-24 AS (Hunt, et al., 1992, Rudensky, et al., 1991). Im endoplasmatischen Retikulum (ER) können vermutlich keine Peptide an den MHC-II-Molekülen gebunden werden, da diese während ihres Aufenthalts im ER mit der invarianten (Ii)–Kette assoziert sind, wodurch die Peptidbindungsgrube blockiert ist (Long, et al., 1994). Lysosomale Proteasen (Wolf and Ploegh, 1995), insbesondere Cathepsin L (Nakagawa, et al., 1998), degradieren die Ii-Kette. Anschließend wird CLIP (engl. class II-associated invariant chain peptide) unter Wirkung des Chaperonmoleküls HLA-DM aus der Bindungsgrube entfernt (Denzin and Cresswell, 1995, Kelly, et al., 1991, Sloan, et al., 1995), wodurch vermutlich der Austausch mit den antigenen Peptiden ermöglicht wird. Eine alternativer Weg, bei dem rezirkulierte MHC-II-Moleküle unabhängig von Proteinsynthese und HLA-DM in frühe Endosomen Peptide binden können, wurde ebenfalls beschrieben (Pinet and Long, 1998).

2.2.3 T-Zellrezeptor

Der T-Zellrezeptor (TCR) besteht entweder aus α- und ß-Ketten oder γ- und δ-Ketten, die jeweils über Disulfidbrücken miteinander verbundene Glycoproteine mit Immunglobulinstruktur sind. Die meisten peripheren, d.h. reifen, ausserhalb des Thymus existierenden T-Lymphozyten, exprimieren den αβ-T-Zellrezeptor, welcher für die Erkennung von MHC-Peptid-Komplexen verantwortlich ist (Schwartz, 1985). Mit dem αβ-Dimer sind weitere Moleküle aus der CD3-Familie nicht-kovalent assoziiert nämlich CD3γ, δ, ζ, ε und η, die an der Signaltransduktion in Zelle beteiligt sind. Diese Moleküle bilden über Disulfidbrücken Heterodimere (γε, δε, ζη) oder Homodimere (ζζ). Die zytoplasmatischen Teile dieser CD3-Ketten enthalten sogenannte ITAM (engl. immunreceptor tyrosine-based activation motiv), die mit Tyrosinkinasen in Wechselwirkung treten, phosphoryliert werden und so zur Signaltransduktion beitragen (Flaswinkel et al., 1995).

Der variable N-terminale Bereich des Rezeptors ist für die Antigenerkennung und –spezifität verantwortlich. Die Gene für die variablen Domänen des TCR setzen sich auf genomischer Ebene aus bis zu drei Gensegmenten zusammen, die in den Frühphasen der T-Zellontogenese rearrangiert werden. Bei β - und δ-Ketten werden die variablen Domäne aus V- (Variability), D- (Diversity) und J- (Joining) Regionen zusammengesetzt. Die α- und γ- Ketten bestehen nur aus V- und J-Region. Jedes dieser Gensegmente ist durch mehrere verschiedene Exone kodiert von denen jeweils eins beim Rearrangement in das komplette Gen für den TCR eingefügt wird. Bei der Rekombination dieser Gene werden scheinbar wahllos Nukleotide [Seite 11↓]eingefügt oder einzelne Nukleotide herausgeschnitten. Sofern das Leseraster nicht verschoben wird, entsteht ein funktionales TCR-Gen. Diese neu entstandene Nukleotidsequenz wird als N-Region bezeichnet und ist spezifisch für jede einzelne T-Zelle und deren Abkömmlinge. Durch das Rearrangement der einzelnen Gensegmente zusammen mit der N-Region-Diversifizierung ergibt sich insgesamt eine Diversität von bis zu 1015 potentiellen TCR-Varianten (Janeway et al., 2001).

2.2.4 Zytotoxische T-Zellen

Nach Erkennung von geeigneten MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexen auf der Oberfläche von Zielzellen werden die zytotoxische T-Zellen (CTL) aktiviert. Infolge der Aktivierung wird die Zielzelle lysiert und/oder spezifisch IFNγ produziert. Es gibt bis jetzt 2 bekannte Mechanismen für die zellvermittelten Zytotoxizität der CD8+-T-Zellen. Der erste besteht in der Sekretion von Perforin und Granzymen. Beide sind in Granula in den CTL gespeichert und werden nach Antigenerkennung freigesetzt. Perforin polymerisiert in der Membran der Zielzelle zu einer großen Pore. Durch diese Poren werden Granzyme ins Zellinnere geschleust. Dort aktivieren sie Caspasen, spezifische Proteasen, die die Apoptosemaschinerie der Zellen in Gang setzen (Masson and Tschopp, 1987, Nabholz and Tschopp, 1989, Pasternack, et al., 1986, Podack ER, 1984, Tschopp and Jongeneel, 1988). Dieser Mechanismus der zellvermittelten Zytotoxizität ist Ca2+ abhängig und kann durch EGTA unterdrückt werden (MacLennan, et al., 1980). Der zweite Zytotoxizitätsmechanismus ist antigenunabhängig und zugleich nicht abhängig von Ca2+ im extrazellulären Milieu. Der Kontakt zwischen Fas (CD95) auf der Oberfläche von Zielzellen und FasL auf der Effektorzelle führt zur Aktivierung von Caspasen in der Zielzelle und Apoptose (Longthorne and Williams, 1997, Rouvier, et al., 1993). Die Apoptose der Zielzelle äußert sich durch charakteristische morphologische Änderungen wie Schrumpfung der Zelle, Kondensation des Chromatins, DNA-Degradation und schliesslich Zerfall der Zelle.

2.2.5 T-Zellentwicklung

Die reifen T-Zellen entwickeln sich aus T-Vorläuferzellen (Thymozyten) im Thymus, wo auch das Rearrangement der TCR-Genen stattfindet. Bei Mäusen wurde jedoch mehrfach gezeigt, dass auch außerhalb des Thymuses, vermutlich im Darmepithel, eine Entwicklung von T-Vorläuferzellen möglich ist (Guy-Grand, et al., 1991, Rocha, et al., 1994). Beim Menschen gibt es entsprechende Untersuchungen von Howie und Kollegen (Howie, et al., 1998). Während ihrer Entwicklung im Thymus durchlaufen die T-Vorläuferzellen verschiedene Differenzierungsstufen, in denen sie mehrfach phänotypisch und funktionell selektioniert (positive und negative Selektion) werden. T-Vorläuferzellen (Thymozyten) mit passenden TCR für das MHC-Molekül des Thymusepithels bekommen durch ihr erfolgreiches Andocken ein Überlebenssignal und werden positiv selektioniert. Thymozyten, deren TCR nicht paßt, bekommen dieses Überlebenssignal nicht und gehen in die Apoptose (non-selection; death by neglect). Die positive Selektion bewirkt eine Selbst-MHC-Restriktion, d.h. alle Zellen, die diesen Prozeß überstehen, erkennen Peptide zusammen mit den eigenen MHC-Molekülen. Unter den Thymozyten, die TCR exprimieren und die mehr oder weniger gut mit eigenen MHC-Molekülen harmonieren, gibt es auch solche, die perfekt auf eine Kombination von eigenem MHC mit darauf präsentiertem Selbst-Peptid passen. Diese sind eigentlich unerwünscht, weil sie autoreaktiv und damit gefährlich sind. Solche autoreaktiven T-Zellen werden negativ selektioniert d.h. eine sehr starke Bindung führt zu einem qualitativ anderen Signal und zur Apoptose (von Boehmer et al., 1989; Nossal et al., 1994). Bisher wurde angenommen, dass die Selektionsprozesse im Thymus gewährleisten, dass nur solche T-Zellen in die Peripherie wandern, die in der Lage sind, körpereigene von körperfremden Antigenen zu unterscheiden. Bei den bislang identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen handelt es sich aber z.T. um körpereigene Antigene. Die Detektion von autoreaktiven T-Zellen in der Peripherie von Krebspatienten und Gesunden zeigt, dass T-Zellen der negativen Selektion entgehen können.

Im Thymus beginnen die T-Vorläuferzellen CD2 und CD1a zu exprimieren, gefolgt von CD4, CD8α und als letztes CD8ß (Galy, et al., 1993). Während dieser Entwicklung werden die TCR-Gensegmente für δ-, γ- und ß-Ketten des TCR rearrangiert. Die TCR δ-Gensegmente werden bereits in den früheren CD34+CD1a+-Thymozyten rekombiniert, danach folgen die TCRγ-Gensegmente. Das Rearrangement der TCRß-Kette dagegen kann erst bei CD4+CD8α+ß--Zellen nachgewiesen werden (Blom, et al., 1999). Die TCRα-Gensegmente werden vermutlich erst danach rearrangiert. Da die TCRδ-Gensegmente innerhalb der Region der TCRα-Gene lokalisiert sind, werden sie beim Rearrangement von TCRα deletiert. Obwohl der größte Teil der reifen T-Zelllinien beim Menschen den TCRαβ exprimiert und nur ein kleiner Teil den TCRγδ, kann die rearrangierte γ-Kette in allen T-Zellen nachgewiesen werden (Jensenius and Williams, 1982).


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2.3  Tumor-assoziierte Antigene

2.3.1 Tumor-assoziierte T-Zellepitope

Die T-Zell-definierten Tumorantigene werden durch Tumor-spezifische CTL erkannt. Im allgemeinen können zwei Arten von Tumorantigenen unterschieden werden: Tumor-spezifische (TSA) und Tumor-assoziierte Antigene (TAA). Tumor-spezifische Antigene (TSA) werden nur von den Tumorzellen exprimiert. Im Gegensatz dazu können die Tumor-assoziierten Antigene (TAA) auch von nicht-transformierten Zellen exprimiert werden. Desweiteren können die Antigene aufgrund ihrer Expressionsmuster folgendermaßen unterschieden werden:

Gewebe-spezifische Differenzierungsantigene, die von Proteinen abgeleitet sind, welche dem Zelltyp und dem Differenzierungsgrad der Zellen entsprechend exprimiert werden. Zahlreiche Melanom-assoziierten Antigene wie MART-1/Melan A, gp100, Tyrosinase und Tyrosin-related protein (TRP) gehören zu dieser Gruppe. Diese Antigene sind nicht Tumor-spezifisch, da sie auch von normalen Melanozyten exprimiert werden. Dementsprechend wird befürchtet, dass der Einsatz solcher Antigene für die Immuntherapie Autoimmunreaktionen gegen das entsprechende gesunde Gewebe auslösen könnte.

„Cancer-testis“-Antigene werden von Tumorzellen nicht aber von normalen Zellen mit Ausnahme von Testis und Plazenta exprimiert. Zahlreiche Tumor-assoziierte T-Zellepitope (TATE) aus den Proteinen der MAGE-, BAGE-, GAGE-, LAGE- und NY-ESO-1 Familien wurden identifiziert. Da die Trophoblasten im Plazenta und Keimbahnzellen in Testisgewebe keine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren, werden die Antigene nicht auf der Zelloberfläche präsentiert und sind daher für die T-Zellen nicht zugänglich. Die „cancer-testis“-Antigene sind deswegen relativ Tumor-spezifisch.

Durch Punktmutationen kann es zu einem AS-Austausch oder einer Verschiebung des Leserasters innerhalb eines Gens kommen (Echchakir, et al., 2001, Novellino, et al., 2003). Auch Peptide aus kryptischen Translationsprodukten (Malarkannan, et al., 1995) und sogar Intron-kodierende Sequenzen können Antigene für CTL sein (Coulie, et al., 1995, Guilloux, et al., 1996, Robbins, et al., 1997). Antigene, die aus Genmutationen entstehen, sind meistens Patienten- und Tumor-spezifisch und können nicht für Immuntherapien bei anderen Patienten angewendet werden. Manche der Mutationen können auch an der Transformation der malignen Zelle beteiligt sein. T-Zellepitope, die aus Mutationen hervorgehen, sind die einzigen wirklichen Tumor-spezifischen Epitope.


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In Tumorzellen überexprimierte Proteine können auch von normalen, nicht transformierten Zellen exprimiert werden. Durch geringer exprimierte Antigenmengen könnten die normalen Zellen der Zytolyse durch niedrig affine auto-reaktive T-Zellen entgehen.

In Tumoren können Gene exprimiert werden, die normalerweise nur in frühen embryonalen Entwicklungsstadien aktiv sind. z.B. α-Fetoprotein wird in fötalen oder malignen aber nicht in normalen Hepatozyten exprimiert (Abelev, et al., 1963, Sell, et al., 1976). Ein entsprechendes T-Zellepitop wurde in diesem Protein von Butterfield und Kollegen identiziert (Butterfield, et al., 1999).

Auch Viren wie HTLV (engl. human T lymphocyte virus), EBV (Ebstein-Barr Virus) und Papillomavirus wurden im Zusammenhang mit Tumoren beschrieben. Es sind eine Reihe von T-Zellepitopen aus solchen onkogenen Viren beschrieben worden (Jochmus, et al., 1997, Rammensee, et al., 1995).

2.3.2 Methoden zur Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen

Es gibt eine Reihe von Strategien für die Identifizierung von Tumor-assoziierten Antigenen bzw. T-Zellepitopen, die je nach Tumor und Situation ausgewählt werden können.

Die direkte Isolierung und Sequenzierung von MHC-gebundenen Peptiden mit Hilfe von hoch auflösenden Chromatographie-Verfahren und Massenspektrometrie bietet die Möglichkeit eine Reihe von Peptiden simultan zu analysieren (Castelli, et al., 1995, Flad, et al., 1998). Mit einem nicht-ionischen Detergenz in isotonischem Puffer werden die Membran-gebundenen Proteine der Tumorzellen solubilisiert. Danach werden die MHC-Peptid-Komplexe affinitätschromatographisch isoliert und die Peptide sauer extrahiert. Mit Hilfe von reversed-Phase (RP)-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC, engl. high performance liquid chromatography) werden die eluierten Peptide entsprechend ihrer Hydrophobizität aufgetrennt. Da die HPLC-Fraktionen eine Mischung aus vielen verschiedenen Peptiden darstellen, ist ein weiterer HPLC-Trennschritt häufig erforderlich. Die Erkennung von immunologisch interessanten Peptiden kann durch etablierte Tumor-spezifische T-Zelllinien oder durch frisch isolierte TILs bzw. PBMC des Tumorpatienten erfolgen. Peptide in Mengen von 100 fMol bis 1,5 pMol reichen zur hoch sensitiven Analyse mittels Massenspektrometrie (MALDI-PSD, engl. matrix-assisted laser desorption ionization-post source decay). Um aber diese Mengen an Peptid für die Endanalyse zu bekommen, braucht man in der Regel 5 bis 10 g reines Ausgangstumormaterial, was selten der Fall ist. Eine Alternative wäre es, etablierte Tumorzelllinien in großen Mengen zu züchten. Dies spiegelt aber leider nicht unbedingt die [Seite 15↓]Physiologie der Tumorzelle in vivo wieder. Demsprechend kann in diesem Falle der Nachweis, dass das gefundene Peptid wirklich in Verbindung mit in vivo zirkulierenden Tumor-assoziierten T-Zellen steht, schwieriger werden. Die Induktion von Tumor-assoziierten T-Zellen mit den isolierten Peptiden oder HPLC-Fraktionen in vitro ist dann notwendig für die Verifizierung der TATE.

Mit molekulargenetischen Verfahren wurden die ersten (van der Bruggen, et al., 1991) und auch die meisten der bekannten TAA bei Melanomen identifiziert. Mit Hilfe von cDNA-Expressionsbibliotheken und Co-Transfektion mit MHC-Molekülen in geeignete Zellen können Gene, die ein Tumorantigen kodieren, mittels Tumor-spezifische CTL-Linien identifiziert werden. Dabei werden cDNA-Klone zusammen mit den Genen für die MHC-Moleküle in COS-7 Zellen transfiziert. COS-7 ist eine Affenzelllinie, d.h. sie exprimiert keine humanen MHC-Moleküle. Dies ermöglicht eine genaue Untersuchung der HLA-Restriktion der humanen CTL-Klone. Durch weitere Subklonierung und Sequenzierung der cDNA-Klone werden die Tumorantigen-kodierenden Gene identifiziert. Der Vorteil dieser Methode ist, dass man mit wenig Tumormaterial auskommen kann, allerdings sind mehrere zeitaufwendige Selektionsschritte erforderlich.

Die serologische Analyse von rekombinanten cDNA-Expressionsbibliotheken (SEREX, engl. serological analysis of recombinant cDNA expression libraries) wurde von Pfreundschuh und Kollegen in die Tumorimmunologie eingeführt (Pfreundschuh, et al., 1978). Für die Identifizierung von Tumorantigen-kodierenden Genen werden autologe Antikörper benutzt. Aus dem Tumormaterial werden cDNA-Expressionbibliotheken hergestellt und über den Bakteriophage Lambda in Escherichia coli zur Expression gebracht. Die Lysate von transfizierten E.coli werden auf einer Nitrozellulosemembran gebunden und anschliessend mit Patientenseren inkubiert. Die Entwicklung des Blots erfolgt mit einem sekundären anti-human Fcγ-Antikörper, an den alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Klone, die ein Tumorantigen-kodierendes Gen enthalten, werden durch Zugabe eines geeigneten Substrats sichtbar gemacht. Mehrere bereits bekannte Tumor-assoziierte Antigene wie MAGE-1 und Tyrosinase konnten bei der Anwendung dieser Methode wiederentdeckt werden (Sahin, et al., 1995). SEREX führt primär zur Identifizierung von Antigenen für humorale Immunantwort. Bisher wurde in wenigen Fällen in demselben Antigen auch T-Zellepitope für MHC-Klasse-I-restringierte T-Zellen gefunden.


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Die Bioinformatik eröffnet neue Wege zur Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen. Die Vollendung des Humangenom-Projektesund Algorithmen zur Epitopvorhersage über deren HLA-Bindung erlauben die Identifizierung von neuen T-Zellepitopen. Die Expressionanalysen mit Hilfe von Array-Techniken könnte zu Kandidatengenen führen, die in Tumor spezifisch exprimiert werden. Die Kombination der Vorhersage von MHC-Liganden mit den Daten zur proteosomalen Spaltung könnte zu Epitope, die auch natürlicherweise präsentiert werden, führen. Für die Vorhersage der proteosomalen Spaltung von Proteinen gibt es derzeit drei Datenbanken mit Vorhersagealgorithmen: FragPredict: http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/, PAProc: http://www.paproc.de und NetChop: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetChop/. Kuon und Kollegen konnten mit Hilfe von FragPredict und des SYFPEITH-Programms potentielle T-Zellepitope aus Chlamydia trachomatis Genom identifizieren (Kuon, et al., 2001).

Randomisierte kombinatorische Peptidbibliotheken wurden für die Bestimmung von MHC-Bindungsmotiven bei MHC-Klasse-II-Molekülen (Fleckenstein, et al., 1996) und für die Identifizierung von Epitopen alloreaktiver (Gundlach, et al., 1996, Udaka, et al., 1995, Udaka, et al., 1996), Antigen-spezifischer (Hemmer, et al., 1997, Hemmer, et al., 2000, La Rosa, et al., 2001) und Tumor-spezifischer (Blake, et al., 1996, Linnemann, et al., 2001, Pinilla, et al., 2001, Rubio-Godoy, et al., 2002) T-Zellen erfolgreich angewendet. Die Anwendung der Peptidbibliotheken für die Identifizierung von neuen TATE eines Tumor-spezifischen CTL-Klons wurde erstmals von Linnemann und Kollegen berichtet (Linnemann, et al., 1998). Neben der Identifizierung von TCR-Liganden für CTL-Klone mit bekannter Spezifität (Pinilla, et al., 2001, Rubio-Godoy, et al., 2002) wurde auch ein natürlicher TCR-Ligand für einen Tumor-spezifischen CTL-Klon mit bis dahin unbekannter Spezifität identifiziert (Rubio-Godoy, et al., 2002).

2.3.3 Tumor-assoziierte T-Zellepitope bei kutanen Lymphomen

Da bisher nur zwei CTCL-Zelllinien (Kaltoft, et al., 1992, Kaltoft, et al., 1987) etabliert werden konnte und die primären Tumormaterialien rar und häufig nicht ausreichend sind, können die meisten der oben genannten Methoden nicht angewandt werden. Dementsprechend stehen die Bemühungen zur Aufklärung der Antigenität kutaner Lymphome noch am Anfang. Eichmüller und Kollegen zeigten, dass viele der bekannten cancer-testis-Antigene auch in CTCL in unterschiedlichem Maße exprimiert werden (Eichmuller, et al., 2003). Allerdings wurde bis jetzt keine T-Zellepitope aus den cancer-testis[Seite 17↓]Proteinfamilien für CTCL nachgewiesen. Bagot und andere Kollegen haben zwar MHC-Klasse-I-restringierte, Tumor-reaktive T-Zelllinien aus PBMC oder TIL von CTCL-Patienten etablieren können, aber das Antigen dafür nicht gefunden (Bagot, et al., 1998, Berger, et al., 1996, Seo, et al., 1998). Der klontypische TCR der malignen T-Zelle könnte eine potentielle Tumorantigenquelle bei CTCL sein.Peptide mit den jeweiligen passenden MHC-Motiven aus variablen (V), konstanten (C) und CDR3-Regionen von TCRα— und TCRß-Ketten konnten durch in vitro generierte CTLs erkannt werden (Berger, et al., 2001, Winter, et al., 2003). Der Nachteil hier ist, dass die klontypischen TCR-Sequenzen nur für einen Patient Bedeutung haben. Mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken wurden sogenannte Mimotope für CTCL identifiziert (Linnemann, et al., 2001). Diese HLA-B8-restringierte Mimotope wurden aus der Spezifität des T-Zellklons MyLa-CTL abgeleitet. MyLa-CTL ist spezifisch für die CTCL-Tumorzelllinie MyLa. Obwohl das natürliche Antigen für diese Mimotope nicht bekannt ist, konnten in 80% (13/16) der HLA-identenCTCL-Patienten Mimotop-spezifische T-Zellen detektiert werden. In 2 von 9 gesunden Probanden wurden niedrige Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen nachgewiesen. Diese Mimotope repräsentieren damit ein verbreitetes CTCL-assoziiertes TATE. Allerdings fehlte bislang der experimentielle Nachweis für die Tumorspezifität der Mimotop-spezifischen T-Zellen in CTCL-Patienten.

Tabelle 1: Liste aller bislang bekannten CTCL-assoziierten TATE

Ursprungs-

proteine

Sequenz

Methode für die Entdeckung

Literatur

TCR

VYFCASSFV

TCR-Sequenzierung

und Epitopvorhersage

Berger et al., 2001

unbekannt

PVKTYDIKL

PVKTKDAKL

Peptidbibliotheken

Linnemann et al., 2001

TCR

ALLGILSAQV

GQLINLFYI

ILWLQPDWV

VIFGPGTSL

KLVEKSFET

LLLKVAGFNL

TCR-Sequenzierung

und Epitopvorhersage

Winter et al., 2003


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17.03.2005