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6  Diskussion

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei CTCL-Tumor-spezifische CTL-Klone etabliert und ihre Feinspezifität durch positional scan mit kombinatorischen Peptidbibliotheken bestimmt. Solche scans liefern Informationen über die bevorzugten Aminosäuren in den einzelnen Sequenzpositionen der Epitope. Diese Informationen können auf zweierlei Arten genutzt werden, um T-Zellepitope zu identifizieren. Erstens können die Reaktionsprofile in Suchmatrizen für Datenbanksuchen nach potentiellen Epitopen in den Sequenzdatenbanken umgesetzt werden. Zweitens können die bevorzugten Aminosäuren zu vollständigen Sequenzen kombiniert und damit Mimotope, Mimetika natürlicher T-Zellepitope, generiert werden. In beiden Fällen muss in nachfolgenden Experimenten untersucht werden, ob die Epitope und Mimotope tatsächlich von den T-Zellen erkannt werden. Für den Klon PN2 konnten durch Datenbanksuchen 250 potentielle Epitope identifiziert werden von denen 91 aktiv waren, d.h. Reaktionen der T-Zellen induzieren konnten. Zusätzlich waren 8 Mimotope konstruiert worden, die sich alle als aktiv erwiesen. Für Klon L1 ergab die Datenbanksuche nur 2 potentielle Epitope, die zwar beide potente Stimulatoren der T-Zellen waren, deren Präsenz in den Quellproteinen aber spezielle RNA-Splicevarianten voraussetzen, die in den Tumorzellen des Patienten nicht nachgewiesen werden konnten. Für diesen Klon wurden deswegen Mimotope durch Kombination der aktiven Aminosäuren konstruiert. Nahezu alle, insgesamt 60 Mimotope waren in T-Zellassays aktiv. Damit konnten für beide T-Zellklone zusammengenommen 159 neue Tumor-assoziierte T-Zellepitope identifiziert werden.

Die in diesen Ergebnissen deutliche hohe Degeneriertheit der Antigenerkennung ist eine typische Eigenschaft von T-Zellen und korreliert mit der nur schwach ausgeprägten Komplementarität der Interaktionsoberflächen von TCR und MHC-Peptidkomplexen (Brock, et al., 1996, Evavold, et al., 1995, Garcia, et al., 1998). Udaka und Kollegen konnten mit kombinatorischen Peptidbibliotheksanalysen als erste zeigen, dass der Maus CTL-Klon 4G3 mindestens 104 verschiedene Oktapeptide erkennen kann (Udaka, et al., 1995). Eine komplette kombinatorische OX8-Bibliothek enthält etwa 320 x 109 Nonapeptide, also alle möglichen Kombinationen der 19 proteinogenen Aminosäuren ohne Cystein in jeder der 9 Sequenzpositionen. Abschätzungen haben ergeben, dass eine T-Zelle 106-107 verschiedene MHC-Nonapeptid-Komplexe oder mehr als 108 verschiedene MHC-Undecapeptidkomplexe erkennen kann (Mason, 1998). Vielfach repräsentieren die von einem T-Zellklon erkannten Peptide Variationen eines Sequenzmotifs. Brock und Kollegen (Brock, et al., 1996) sowie [Seite 78↓]Wilson und Kollegen (Speir, et al., 1998) konnten allerdings zeigen, dass auch vollkommen unverwandte und unähnliche MHC-Peptidkomplexe von ein und demselben TCR erkannt werden können. Nicht alle diese Sequenzen kommen natürlicherweise vor und selbst wenn sie vorkämen, würde nur ein Teil der entsprechenden Peptide durch die Antigenprozessierungs-maschinerie der Zelle generiert und davon wiederum nur ein Teil an die MHC-Klasse-I-Moleküle der Zelle binden können. Die Kombination der Selektivitäten der einzelnen Komponenten und Prozesse, die zur Antigenprozessierung und –präsentation beitragen, hat einen wesentlichen Anteil an der Spezifität der Reaktionen von T-Zellen auf natürliche Antigene. Für die beiden hier untersuchten T-Zellklone konnten einmal 2 und beim zweiten Klon 250 potentielle natürliche Epitope in der Humangenomdatenbank gefunden werden. Die beiden potentiellen natürlichen Epitope für Klon L1 waren zwar aktiv, können aber, da die erforderliche Splicevariante nicht nachgewiesen werden konnten, nicht als Teil einer Proteinsequenz in den Tumorzellen exprimiert sein. Dieser negative Befund schließt allerdings nicht vollständig aus, dass diese Epitope nicht doch natürlicherweise generiert und von den MHC-Molekülen der Tumorzelle präsentiert werden. Es wurden bereits mehrfach von T-Zellepitopen berichtet, die aus Intronsequenzen oder aus nicht exprimierten Genen stammen (Bullock, et al., 1997, Cardinaud, et al., 2004, Ronsin, et al., 1999). Aufgrund der geringen Menge an Tumormaterial bei den CTCL-Patienten lässt sich diese Frage im vorliegenden Beispiel nicht klären. Für den Klon PN2 konnte für die 3 potentiellen Quellproteine für aktive T-Zellepitope Ceramidase, NDRG-1 und ein Tumorangiogeneseprotein nachgewiesen werden, dass sie von den Tumorzellen des Patienten exprimiert werden. Diese drei Proteine sind sehr interessant, da sie verschiedene wichtige Prozesse in der Tumorentwicklung beeinflussen können.

Ceramidase ist ein Enzym, das Sphingophospholipide abbaut. Es gibt Hinweise für die Beteiligung von Ceramiden bei der Induktion der Apoptose und für die Blockade der Apoptose, wenn in den Zellen Ceramidase exprimiert ist. Ceramide werden durch Hydrolyse von Sphingophospholipiden (Sphingomyelin), die Bestandteile der Plasmamembran der Zellen sind, generiert. Danach induzieren Ceramide die Aktivierung von Stress-aktivierte Proteinkinasen wie JNK/SAPK (JNK, c-Jun N-terminal kinase; SAPK, stress activated protein kinase) (Verheij, et al., 1996). Die molekularen Mechanismen der JNK/SAPK-Aktivierung bis hin zur Apoptoseinduzierung sind noch unklar. Erhöhte Ceramidspiegel wurde bei Fas-vermittelter Apoptose beobachtet (Herr, et al., 1997, Tepper, et al., 1997). In der Fas-resistenten Prostata-Tumorzelllinie DU145 konnte durch den Ceramidase-Inhibitor [Seite 79↓]LCL405 Apoptose ausgelöst werden (Norris J. S. et al., Abstract, International Society for Cancer Gene Therapy, Singapore 2004).

Verschiedene Arbeitsgruppen haben unabhängig voneinander unter Verwendung unterschiedlicher Namen wie DRG1 (van Belzen, et al., 1997), Cap43 (Zhou, et al., 1998) oder rit43 (Kurdistani, et al., 1998) von demselben Protein berichtet. Nach diesen Arbeiten wird die Transkription, Translation und mRNA-Stabilität des Proteins durch verschiedene Zustände der Zellen wie Hypoxie, Zelldifferenzierung und Neoplasie oder unterschiedliche Faktoren wie Schwermetalle, Tunicamycin, Homocystein oder N-Myc reguliert. N-myc ist ein Transkriptionsfaktor der Oncogenfamilie myc und häufig in Tumoren wie Neoroblastomen amplipfiziert bzw. mutiert. Die Überexpression dieses Gens scheint die Zelldifferenzierung zu blockieren und die Proliferation zu erhöhen. Zwei Mitgleider der myc-Familie, N-myc und c-myc, unterdrücken in der Maus die Expression von NDRG-1 (Shimono, et al., 1999). Die Aktivierung von p53 scheint eine erhöhte Expression von NDRG-1 zu bewirken (Kurdistani, et al., 1998, Yu, et al., 1999). Die Transkription des Gens ist ubiquitär, die Expression des Proteins aber hauptsächlich in Epithelzellen zu beobachten (Lachat, et al., 2002), was für das Protein auf eine Regulationen auf translationaler oder posttranslationaler Ebene hindeutet. Eine erhöhte Expression von NDRG-1-Protein wurde bei verschiedenen Tumoren wie Lungen-, Hirn-, Leber-, Brust- und Prostatakrebs sowie Melanomen beobachtet (Cangul, et al., 2002). Dagegen wurde in anderen Tumoren (Kurdistani, et al., 1998) wie auch in Embryonen (Kokame, et al., 1998, Shimono, et al., 1999) eine reduzierte Expression gefunden. Testosteron hat einen negativen Effekt auf die NDRG-1-Expression (Lin and Chang, 1997). Intrazellulär geht die Herabregulation des Proteins mit der Formierung eines N-myc/Max-Komplexes (Shimono, et al., 1999) einher. Eine erhöhte Expression von NDRG-1 korreliert mit einer reduzierten Proliferation von transformierten Zellen (Kurdistani, et al., 1998). Andererseits war die Expression in der Wachstumsphase höher als in der stationären Phase (Agarwala, et al., 2000). Diese Arbeiten deuten auf eine mögliche Rolle von NDRG-1 bei der Proliferation hin, was aber angesichts der zum Teil widersprüchlichen Beobachtungen noch genauer untersucht werden muss. Agarwala und Kollegen haben von minimal sieben potentiellen Phosphorylierungsstellen auf NDRG-1 berichtet. Protein Kinase A phosphoryliert rekombinantes NDRG-1 in vitro direkt. Die phosphorylierte Form ist in frühen Log-Phase-Zellen reichlich vorhanden, fällt aber mit zunehmender Zelldichte ab. Andere Arbeiten deuten auf eine funktionelle Rolle von NDRG-1 bei der Zelladhäsion über die Beeinflussung der [Seite 80↓]Bildung von E-cadherin/catenin-Komplexen (Bobryshev, et al., 1998, Sato, et al., 1998), wobei die erhöhte Expression von E-cadherin mit der erhöhten Expression von NDRG-1 korrelierte.

Ähnlich wie beim NDRG-1 weisen eine Reihe von indirekten Beobachtungen auf eine Rolle des als Tumorangiogenesefaktor ausgewiesenen hypothetischen Proteins bei der Tumorangiogenese hin. Das Protein ist in Endothelzellen der Blutgefäße exprimiert (Liu, et al., 2002). Northernblot- und in-situ-Hybridisierungs-Analysen belegen auch eine Expression in Epithelzellen. Bei Brust-, Prostata- und Darmkrebs zeigte sich im Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben eine erhöhte Expression des Proteins, die nach immunhistochemischen Untersuchungen mit erhöhten Expressionen von weiteren Oberflächenmolekülen wie E-Selektin (Nguyen, et al., 1997), avß3 Integrin, VCAM-(vascular cellular adhesion molecule)-1, ICAM-(intercellular adhesion molecule)-1 und –2, CD31, CD34, CD36 und CD44 (Polverini, 1996) in den Gefäßen der Tumoren in Vergleich zu normalen Gefäßen einhergeht. Die Funktion des hypothetischen Proteins ist noch unklar. Die vier nachgewiesenen Phosphorylierungsstellen für Casein-Kinase-II könnten auf eine mögliche Rolle bei der Signaltransduktion hindeuten. In gesundem erwachsenem Gewebe findet außer bei Wundheilungen nach Verletzungen normalerweise keine Angiogenese statt. Damit stellt die Hemmung der tumorzellinduzierten Neoangiogenese theoretisch einen gut geeigneten Angriffspunkt für eine Tumortherapie dar. In der antiangiogenetischen Tumortherapie werden Inhibitoren spezifischer Angiogenesefaktoren eingesetzt (Birmingham, 2002, Folkman, 2003). Die Aufklärung der genauen funktionellen Rolle des Tumorangiogenese-Proteins und seine Inhibierung könnte ein möglicher Ansatz für die Tumortherapie sein.

Obwohl die Expression dieser potentiellen Quellproteine für PN2-Epitope gezeigt wurde und nachgewiesen werden konnte, dass normale Lymphozyten sie nicht exprimieren, sie also für die Differenzierungslinie der Lymphozyten Tumor-spezifisch sind, ist damit nicht belegt, dass die Epitope natürlicherweise präsentiert werden. Hier offenbart sich ein Nachteil der Identifizierung von T-Zellepitopen mit Hilfe von kombinatorischen Peptidbibliotheken. Andererseits, wie bereits diskutiert, beweist der fehlende Nachweis der Expression eines potentiellen Quellproteins für ein mit Bibliotheken definiertes Epitope nicht, dass die Zuordnung falsch ist. Wie diese Arbeit gezeigt hat, sind kombinatorische Peptidbibliotheken potente Instrumente für die Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen besonders, wenn andere Verfahren aufgrund der raren und i.d.R. unzureichenden Tumormaterialien nicht [Seite 81↓]eingesetzt werden können. Für die biochemische Identifizierung von TAA wird in der Regel viel Tumormaterial gebraucht, welches bei CTCL äußerst selten und in früheren Stadien der Tumorerkrankung gar nicht zur Verfügung steht. Für die bioinformatischen Methoden müssen Kandidatengene für TAA bekannt sein, was bei CTCL mit Ausnahme des TCR der malignen Zelle nicht der Fall ist. Grundsätzlich kann man mit bioinformatischen Ansätzen keine neuen, bislang in dieser Funktion unbekannte TAA finden. Molekulargenetische Methoden setzen stabile Tumor-spezifische T-Zelllinien voraus und brauchen wegen der erforderlichen sukzessiven Selektionsschritte viel Zeit. Der Vorteil der Anwendung von kombinatorischen Peptidbibliotheken bei der Identifizierung von TATE ist, dass mit wenig Tumormaterial und mit wenigen T-Zellversuchen simultan eine Reihe von TATE identifiziert werden können. Die Identifizierung von Serien ähnlicher Epitope, die alle von den Tumor-spezifischen T-Zellen erkannt werden, bietet eine gute Voraussetzung für die Entwicklung von optimierten Vakzinantigenen. Es stellt sich aber die Frage, ob komplett artifizielle Mimotope, die keine natürlichen Korrelate in der humanen Genomdatenbank haben, überhaupt Tumor-spezifische T-Zellen induzieren können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde diese Frage für Mimotope untersucht, die bereits früher identifiziert worden waren und für die weder identische noch ähnliche Sequenzen in den Datenbanken gefunden werden konnten. Diese Mimotope, PVKTKDIKL und PVKTYDIKL, die beide für die Präsentation durch das HLA-Allomorph HLA-B8 konstruiert worden waren, wurden von T-Zellen in mehr als 80% der CTCL-Patienten, die dieses HLA hatten, erkannt (Linnemann, et al., 2001). In gesunden Individuen konnten T-Zellen mit dieser Spezifität gar nicht oder nur in äußerst geringen, eher zweifelhaften Frequenzen nachgewiesen werden. In den CTCL-Patienten hingegen waren diese Frequenzen stark erhöht. Diese Befunde lassen vermuten, dass es sich bei den beiden Peptiden um Mimetika eines weit verbreiteten CTCL-Tumor-assoziierten Antigens handelt. Bei Vakzinationsversuchen bei zwei MF-Patienten, bei denen vor der Vakzinierung keine Mimotop-spezifische T-Zellen im peripheren Blut nachweisbar waren, konnten nach wiederholter Mimotopvakzinierung die spezifischen T-Zellen konstant nachgewiesen werden (Tumenjargal, et al., 2003). Beim Peptid PVKTKDIKL mit der besseren HLA-Bindung konnten Anstiege der Frequenz spezifischer T-Zellen während der ersten vier Vakzinationszyklen beobachtet werden. Das Immunmonitoring während der Vakzination mit dem anderen Peptid PVKTYDIKL zeigte bereits nach der ersten Vakzination eine starke Induktion spezifischer T-Zellen nach bereits einem Tag bis zwei Tagen, was für eine primäre Induktion von spezifischen T-Zellen zu schnell ist und auf eine sekundäre Immunantwort hinweist. D.h. die T-Zellen waren bereits vorher, möglicherweise durch den Tumor induziert [Seite 82↓]worden. Da die Tumorzellen selbst in der Regel nur unzureichende Stimulatoren für T-Zellen sind, waren vermutlich andere Antigen-präsentierende Zellen, eventuell dendritische Zellen, in die Induktion der primären T-Zellantwort involviert. Diese zum Teil neu induzierten, zum Teil restimulierten Mimotop-spezifischen T-Zellen konnten aus einem der Patienten isoliert und in Zellkultur expandiert werden. In Zytotoxizitätsanalysen mit Tumorzellen des Patienten erwiesen sich diese T-Zellen als Tumor-spezifisch und tumorizid. Mimotope können also, selbst wenn sie artifiziell generiert und ohne erkennbare Ähnlichkeit mit einem potentiellen natürlichen Gegenstück in den Genomdatenbanken sind, potente Induktoren Tumor-spezifischer Immunreaktionen und damit für die Entwicklung therapeutischer Vakzine für die Krebsbehandlung wertvoll sein.

Alternativ zum kombinatorischen Bibliotheksansatz wurden Mimotope mehrfach durch gezielte Modifikation von bekannten Tumor-assoziierten T-Zellepitopen entwickelt. Das Ziel der Entwicklung solcher modifizierter Epitope war eine effektivere T-Zell-vermittelte Immunreaktion gegen Tumoren (Brinckerhoff, et al., 1999, Chen, et al., 2000, Clay, et al., 1999, Fisk, et al., 1995, Rivoltini, et al., 1999, Salazar, et al., 2000, Tourdot, et al., 2000, Valmori, et al., 1998). Die Modifikationen in den Epitopen können dabei sein:

Für alle diese Ansätze gibt es in der Literatur wie auch in der hier vorgelegten Arbeit Beispiele. Der Austausch von Alanin zu Leucin in Ankerposition 9 beim L1-Peptid Nr. 66 steigerte die Aktivität des CTL-Klons L1 um mehr als das zweifache. Da hierbei eine schwache mit einer starken Ankeraminosäure ersetzt wurde, ist die stärkere T-Zellantwort vermutlich durch eine bessere Bindung des Peptids an das HLA-Molekül bedingt. Bei anderen Peptiden wurde eine verbesserte T-Zellreaktion bei Erhaltung der Besetzung der Ankerpositionen erreicht. Hier wurde vermutlich die Interaktion mit dem TCR optimiert. Ähnliche Beobachtungen wurden von anderen Autoren für polyklonale T-Zellen berichtet. Rivoltini und Kollegen haben mit der superagonistischen Variante von Melan-A/MART-127-35 mit einem Leucin statt Alanin in der zweiten Sequenzposition des Epitops in vitro quantitativ [Seite 83↓]und qualitativ bessere anti-Melan-A/MART-1 T-Zellantworten induzieren können (Rivoltini, et al., 1999). Mit dieser superagonistischen Variante des natürlichen Epitopsstimulierte CD8+-T-Zellen aus einem Melanompatienten produzierten peptidabhängig IL-2 in Reaktion auf eine autologe Melanomzelllinie, was für T-Zellen die mit dem natürlichen Epitop induziert worden waren, nicht der Fall war (Dutton, 1996). Auch andere T-Zellreaktionen wie Zytolyse und IFNγ-Produktion wurden mit dem Superagonisten deutlich effizienter induziert als mit dem natürlichen Epitop. Eine Analysen der TCR-Vß der durch das Mimotop und durch das Epitop induzierten T-Zellen hatte gezeigt, dass es sich hierbei um unterschiedliche T-Zellpopulationen innerhalb der Melan-A/MART-127-35–reaktiven T-Zellrepertoire handelte. D.h. mit der superagonistischen Variante werden andere T-Zellen angesprochen als mit der natürlichen Variante, wobei beide T-Zellpopulationen die Tumorzellen erkennen und zerstören können.

Es gibt allerdings auch in vitro Untersuchungen, die zeigen, dass man bei der Benutzung von solchen modifizierten TATE vorsichtig sein sollte (Chen, et al., 2000, Kersh, et al., 2001, Nielsen, et al., 2000). Die Stimulation von zwei Melan-A/MART-126-35 spezifischer CTL-Klone mit einer modifizierten Variante des MART/Melan-Epitops, bei der Asparaginsäure in Position 6 durch Phenylalanin ersetzt wurde, führte überraschenderweise neben der Zunahme von Th1-Zytokinen wie IFNγ auch zur Zunahme von Th2-Zytokinen wie IL-10 und IL-13, was mit einer erhöhten Tyrosinphosphorylierung in den reagierenden Zellen korreliert war (Nielsen, et al., 2000). Da Th2-Zytokine wie IL-10 immunsuppressiv auf die anti-Tumor Immunantwort wirken, könnte dies fatale Folgen haben. Bei der superagonistischen Variante hingegen beobachtete man zwar auch eine erhöhte Tyrosinphosphorylierung aber die IL-10-mRNA-Mengen waren im Vergleich zur Stimulation mit dem natürlichen Epitop reduziert.

Die Bindungsaffinitäten der beiden MART-1-Varianten für das MHC-Molekül sind sowohl experimentiell in funktionellen Peptidkompetitionsversuchen als auch theoretisch nach SYFPEITHI-Datenbank-Abschätzungen vergleichbar und 5-fach höher als die des natürlichen Epitops (Valmori, et al., 1998, Valmori, et al., 1998), d.h. die erhöhte Aktivierung der CTL-Klone kann nicht allein mit der Bindungseigenschaften der Peptid für das MHC-Molekül erklärt werden. Die Autoren der zitierten Arbeiten vermuten, dass der Austausch von Alanin zu Leucin in Position 2 zu einer effizienteren Interaktion mit dem TCR führt, wodurch eine volle im Gegensatz zu einer suboptimalen Aktivierung der T-Zelle mit dem natürlichen Epitop erreicht wird. Warum allerdings nach Verbesserung der MHC-Bindungseigenschaft [Seite 84↓]des anderen Peptids zwar eine stärkere T-Zellreaktion aber mit der Induktion von IL-10 und IL-13 eine eher immunsuppressive Wirkung erreicht wurde (Nielsen, et al., 2000), ist noch nicht verstanden. Diese Daten zeigen, dass es durchaus möglich ist, mit Mimotopen eine quantitativ wie qualitativ effektivere T-Zellreaktion gegen Tumorzellen zu induzieren, wobei auch ein anderes, in verschiedenen Beispielen wesentlich breiteres T-Zellrepertoire angesprochen werden kann (Clay, et al., 1999, Gundlach, et al., 1996, La Rosa, et al., 2001, Linnemann, et al., 2001). Andererseits muss für jedes Mimotop untersucht werden, ob nicht auch eine unerwünschte weil immunsuppressive oder antagonistische Reaktion erzeugt wird.

Die Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen für CTCL gibt zum ersten Mal die Möglichkeit Tumor-spezifische T-Zellen bei dieser Tumorart zu untersuchen. Diese T-Zellen können mit MHC-Oligomeren, die mit den jeweiligen Peptiden spezifisch beladen sind, angefärbt und dann durchflußzytometrisch quantifiziert und phänotypisch analysiert werden. Mit Hilfe von rekombinanten HLA-A2.1-Dimeren (Hu, et al., 2004, Woll, et al., 2004) mit den in dieser Arbeit identifizierten Tumor-assoziierten Epitopen und Mimotopen konnten mit 0,89-20% der CD3+CD8+-T-Zellen relativ hohe Frequenzen Tumor-spezifischer T-Zellen im Tumor des Lymphompatienten WeW nachgewiesen werden. Diese hohe Frequenzen belegen die Immunogenität dieser Art von Tumor und zeigen, dass das Immunsystem auf dem Tumor reagiert und dass die Tumor-spezifischen T-Zellen in Reaktion auf den Tumor proliferiert sind, d.h. der Tumor wird vom Immunsystem des Patienten erkannt und bekämpft. Vergleichbare Beobachtungen wurden auch von anderen Arbeitsgruppen berichtet, die einen Anstieg der Frequenzen Tumor-spezifischer T-Zellen im Verlauf der Tumorprogression sowie nach Immuntherapien fanden. Powell und Rosenberg berichteten, dass nach der Immunisierung mit einem modifizierten gp100-Peptid die Frequenzen Tumorepitop-spezifischer T-Zellen in peripheren Bluten von Melanompatienten von durchschnittlich 4,8% auf durchschnittlich 38,1% anstiegen (Powell and Rosenberg, 2004). Allerdings sind derart hohe Frequenzen von Tumor-spezifischen T-Zellen selten. In der Regel wird von Frequenzen zwischen 0,03% und 5% berichtet (Lee, et al., 1999, Trefzer, et al., 2004), was im Vergleich zu akuten EBV-Infektionen, bei denen von bis zu 40% spezifische T-Zellen gegen ein einzelnes EBV-Epitop berichtet wird (Callan et al., 1996), als relativ niedrig erscheint. Aber auch bei den Immunreaktionen auf Virusinfektionen sind die Spannbreiten sehr groß und für Influenzainfektionen z.B. wird selten von mehr als 1% spezifischer T-Zellen berichtet (Lucas, et al., 2004), wobei bei Influenza eine sterile Immunität erreicht wird, bei EBV-Infektionen aber nicht. Die im peripheren Blut gemessenen Frequenzen für die spezifischen T-Zellen [Seite 85↓]korrelieren also nicht direkt mit der Effektivität der zellulären Immunreaktion. Die Tatsache, dass trotz hoher Frequenzen von Tumor-spezifischen T-Zellen in vivo in limuting dilution assays nur 4% der ausgewachsenen CD8+-T-Zellen tumor-reaktiv waren, könnte auf eine Anergie der Tumor-spezifischen T-Zellen hindeuten. Eine alternative Erklärung wäre eine niedrige Avidität dieser Zellen bei intakter Funktionskapazität. Dabei könnten TAA-spezifische T-Zellen aufgrund einer geringen Avidität zwar auf extern applizierte synthetische Peptide reagieren aber nicht auf die natürlich prozessierten auf den Tumorzellen (Dutoit, et al., 2001).

Die intrinsische Affinität eines TCR für den korrespondierenden MHC-Peptidkomplex ist experimentell schwer zugänglich, da dafür monovalente Wechselwirkungen zwischen zwei Molekülen vermessen werden müssen, die normalerweise in der Zellmembran verankert sind. In einzelnen Fällen konnten lösliche Varianten eines TCR und des MHC-Peptidkomplexes hergestellt und für solche Messungen eingesetzt werden. Die dabei bestimmten Affinitäten von TCR zu Peptid-MHC-Komplexen sind mit Dissoziationskonstanten von 10-4 bis 10-6 M relativ niedrig im Vergleich zur Affinität von B-Zellrezeptoren (BCR) mit 10-7-10‑12 M (Eisen, et al., 1996, Valitutti and Lanzavecchia, 1997). Da diese Messungen aufgrund des hohen technischen Aufwands bei der Generierung löslicher TCR auf einzelne Beispiele beschränkt blieben, wurden verschiedene indirekte Bestimmungsmethoden entwickelt, die sich leichter auf beliebige Situationen übertragen lassen. Häufig wird in Inhibitionsexperimenten mit blockierenden anti-MHC Antikörpern (Amrani, et al., 2000, Lee, et al., 1999), unmarkierten Tetrameren (Dutoit, et al., 2002, Valmori, et al., 2002) oder anti-TCR-Fab-Fragmenten (Blattman, et al., 2002) oder in Tetramerdissoziationsexperimenten ohne blockierende Reagenzien (Busch and Pamer, 1999, Rubio-Godoy, et al., 2001) eine relative Affinität oder Avidität bestimmt. Es gibt derzeit zwei auf der Verwendung von MHC-Tetrameren basierenden Methoden zur Messung der TCR-Avidität für spezifische MHC-Peptidkomplexe. Mehrere Gruppen haben eine Korrelation zwischen MHC-Tetramer-Bindungsintensität und T-Zellavidität zeigen können und geben als Avidität eine relative Messgröße abhängig von der per Durchflußzytometrie bestimmten Intensität der Färbung mit den MHC-Tetrameren an (Crawford, et al., 1998, Dutoit, et al., 2001, Fahmy, et al., 2001, Lee, et al., 1999, Rees, et al., 1999). Andere haben zur Bestimmung der Avidität die Dissoziationskinetik von MHC-Tetrameren von den spezifisch gefärbten T-Zellen bestimmt und zur Unterscheidung verschiedener T-Zellpopulationen mit der gleicher Spezifität angewandt (Amrani, et al., 2000, Blattman, et al., 2002, Busch and Pamer, 1999, Dutoit, et al., 2002, Rubio-Godoy, et al., 2001, Savage, et al., 1999, Valmori, et al., 2002). Diese Arbeiten haben gezeigt, dass die TCR-Avidität für spezifische MHC-Peptidkomplexe eine wichtige Rolle bei der Gestaltung des reifen T-Zellrepertoires, der Induktion der peripheren Toleranz gegen Selbstantigene und bei der Deletion selbstreaktiver T-Zellen spielt. Die Avidität der TCR von T-Zellpopulationen ist also T-Zell-entwicklungsbiologisch reguliert.

Im Gegensatz zur Avidität und Affinität des TCR ist die FA eines T-Zellklons relativ einfach als Peptidkonzentration, die für halb-maximale Reaktion erforderlich ist, bestimmbar. Bei unseren Dissoziationsmessungen mit löslichen MHC-Tetramerpeptidkomplexen mit zwei T-Zelllinien korrelierte die FA mit der Bindunsgsstärke des TCR-MHC-Peptidkomplexes. Je stärker die Bindung des TCR-MHC-Peptidkomplexes war, desto stärker war auch die FA. Gleiche Beobachtungen wurden auch von Dutoit und Kollegen gezeigt (Dutoit, et al., 2002). Dagegen wurden Diskrepanzen zwischen TCR-MHC-Tetramerbindungintensität und der FA berichtet (Derby, et al., 2001, Dutoit, et al., 2001, Dutoit, et al., 2002, Kalergis, et al., 2001, Rubio-Godoy, et al., 2001). Die Ursache dafür konnte an den unterschiedlichen Färbungsprotokollen der Autoren liegen.

Nach Aktivierung einer T-Zellpopulation durch spezifische Antigenstimulierung ist eine Erhöhung der TCR-Avidität der T-Zellen festzustellen (Fahmy, et al., 2001, Slifka and Whitton, 2001). Diese Aviditätserhöhung ist zum einen mit der Selektion hochavider T-Zellen erklärbar, zum anderen aber auch mit Veränderungen in der Physiologie der T-Zellen. Nach Antigenkontakt werden B-Zellen mit höherer BCR-Affinität selektiv expandiert (Janeway et al., 2001). Im Gegensatz zu B-Zellen fehlt den T-Zellen aber die Möglichkeit, ihre Rezeptoraffinität zum Antigen durch somatische Hypermutation zu steigern (Janeway et al., 2001). Daher wird die Optimierung der zellulären Immunität nur durch selektive Expansion bereits vorhandener T-Zellen mit höherer TCR-Affinität für das Antigen erfolgen. Dementsprechend wurde von verschiedenen Autoren von einer relativ geringen Steigerung der TCR-Affinität um das 2-4-fache bei einer sekundären Immunantwort im Vergleich zur primären Antwort beobachtet (Busch and Pamer, 1999, Savage, et al., 1999). Im Gegensatz dazu wurde von Slifka und Whitton für die funktionelle Avidität eine mehr als 50-fache Steigerung beschrieben, wobei jeweils monoklonale T-Zellen analysiert wurden (Slifka and Whitton, 2001). Die Autoren erklären ihre Ergebnisse mit einer Optimierung der Signaltransduktionsmaschinerie der T-Zelle. Die erhöhte Expression von lck korrelierte mit einer erhöhten IFNγ-Produktion. Bezüglich der Expression von Adhäsionsmolekülen gab es [Seite 87↓]hingegen keine Unterschiede. Es gibt einzelne Beobachtungen, die zeigen, dass hochavide T-Zellen im Gegensatz zu niederaviden T-Zellen gegen die Tumorzellen reagieren können. Yee und Kollegen haben anhand der Intensität der Färbung von T-Zellen einer heterogenen Population mit Peptid-MHC-Tetrameren hochavide T-Zellen sortiert, in vitro expandiert und dann gezeigt, dass diese im Gegensatz zu niederaviden T-Zellen Tumor-reaktiv waren (Yee, et al., 1999). Im Gegensatz zu den nicht Tumor-reaktiven T-Zellen beobachteten die Autoren eine Peptid-spezifische Zytolyse bei weniger als 10 ng/ml Peptid. Andere Autoren haben unterschiedliche Aviditäten von Tumor-spezifischen T-Zellen bei Patienten und Gesunden beobachtet (Rezvani, et al., 2003). Auch bei der Induktion der IFNγ-Produktion war dieser Unterschied deutlich. Zur Stimulation der TAA-reaktiven T-Zellen aus Patienten waren 1-10µM Peptid erforderlich, bei Gesunden aber nur 0,1µM. Im Gegensatz dazu haben wir nachweisen können, dass es hochavide Tumor-spezifische T-Zellen in Tumoren gibt (eigene Arbeiten, in dieser Arbeit nicht gezeigt). Dabei konnten wir aus dem Tumor eines Melanompatienten eine CD8+-T-Zelllinie isolieren, die spezifisch für das bekannte Melanom-assoziierte Antigen MART-1/Melan A war, und die Avidität des TCR dieser Zellen als Halbwertzeit der Dissoziation spezifischer MHC-Peptidtetramere von den Zellen bestimmen. Diese t1/2-Werte waren mit etwa 40 Stunden sehr lang und vergleichbar mit den Halbwertzeiten, die wir für T-Zellen mit Spezifität für virale Epitope gemessen hatten. Die hochaviden Tumor-spezifischen T-Zellen konnten auch die autologen Tumorzellen, die das entsprechendes Antigen exprimierten, antigenabhängig lysieren. Ein Vergleich verschiedener T-Zelllinien mit Spezifitäten für Tumor-assoziierte und virale Epitope ergab, dass es für beide Klassen an Spezifitäten - einmal gegen Selbstantigene und zum anderen gegen Fremdantigene - eine vergleichbare Verteilung von hoch- und niederaviden T-Zellen gab. Während es also Hinweise gibt, dass in manchen Fällen eine niedrige Avidität der Tumor-spezifischen T-Zellen die Erklärung dafür sein könnte, dass die Tumorzellen trotz hoher Frequenzen an Tumor-spezifischen T-Zellen expandieren, gibt es auch Gegenbeispiele, die eine fehlende Korrelation belegen.

Eine zweite Erklärung wäre, dass die Tumor-spezifischen T-Zellen in den Patienten funktionell defekt, also anerg sind. Die Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor des Patienten WeW zeigten zum größeren Teil einen besonderen Phänotyp, der sich weder den effector memory noch den central memory Zellen zuordnen lässt. Klar ist hingegen, dass diese Zellen anerg sind. So wird der Transferinrezeptor CD71 nicht exprimiert, was bedeutet, dass diese Zellen nicht proliferieren. Die reduzierte Expression von Granzym B und fehlende Expression [Seite 88↓]von Perforin belegen zudem, dass sie nicht über die für die Zerstörung der Tumorzellen erforderliche zytolytische Maschinerie verfügen. Auch der alternative zytotoxische Mechanismus über Fas-induzierte Apoptose ist nicht verfügbar, da die T-Zellen Fas-Ligand nicht exprimieren. Die Tumor-spezifischen T-Zellen haben also weder das Effektorinstrumentarium der effector memory noch die Proliferationskapazität der central memory Zellen. Mit dieser funktionellen Anergie korreliert auch die Expression der CD45-Isoformen und das Fehlen von CCR7. Auf der anderen Seite belegen die hohe Frequenzen dieser Zellen, dass sie vorher proliferiert und damit funktionell aktiv gewesen sein müssen. Dieser Gegensatz deutet auf Mechanismen im Tumor, die vorher aktive Tumor-spezifische T-Zellpopulationen inaktivieren. Verschiedene solcher Mechanismen werden als Ursache für das Versagen der Immunreaktionen gegen Tumoren diskutiert:

  1. Erschöpfung der Tumor-spezifischen T-Zellen aufgrund der Überzahl an Tumorzellen;
  2. Tolerisierung der T-Zellen durch die Tumorzellen wegen fehlender Kostimulation;
  3. Ignoranz des Tumors aufgrund suboptimaler Antigenpräsentation was zu ausbleibender Stimulation der T-Zellen führt;
  4. Suppression der Tumor-spezifischen T-Zellen durch immunsuppressive Faktoren, die von den Tumorzellen sezerniert werden;
  5. Suppression der Tumor-spezifischen T-Zellen durch regulatorische T-Zellen im Tumor.

Eine Erschöpfung von Antigen-spezifischen T-Zellen durch ein Überangebot von Antigen war in Zellkulturen wie auch in Tierexperimenten in vivo beobachtet worden (Fields et al., 1992). Bei den Tierversuchen wurden TCR-transgene Mäuse generiert, deren Antigen in der Leber durch Gabe eines Induktors spezifisch zur Expression gebracht werden konnte. Die Autoren berichten von Schäden in der Leber, die auf zytotoxische Aktivitäten hindeuten, ohne das die Funktion des Organs beeinträchtigt war. Die spezifischen T-Zellen allerdings waren nicht mehr nachweisbar, was annehmen lässt, dass sie aufgrund der Erschöpfung starben. Im Tumor des Patienten WeW dagegen waren die spezifischen T-Zellen noch vorhanden, zeigten keine für eine Apoptose typischen Veränderungen und ließen sich ex vivo durch Kultivierung in IL-2-haltigem Medium wieder reaktivieren. Die Ursache für die Anergie muss also eine andere sein als die in dem Tiermodell für erschöpfungsassoziierte Eliminierung der Zellen. Für die zweite mögliche Erklärung gibt es verschiedene experimentelle Beispiele, die zeigen, dass die primäre Induktion von T-Zellen mit Antigen ohne Kostimulation zu einen anergen Zustand der Zellen führt, der dann aber durch Gabe von kostimulierenden Zytokinen aufgehoben werden kann (Tan et al., 1993). Auch die anergen T-Zellen aus dem Tumor des [Seite 89↓]Patienten WeW konnten mit IL-2 zu aktiven Zellen konvertiert werden. Gegen die dritte Erklärung, zu wenig Antigen für eine Aktivierung der T-Zellen im Tumor, spricht, dass diese Zellen im Tumor angereichert zu sein scheinen. Sie müssen also auf ihre spezifischen MHC-Peptidkomplexe im Tumor reagiert haben.

Aktive Suppression von Tumor-spezifischen T-Zellen in Tumoren ist eine der am häufigsten formulierten Erklärungen für die fehlende Effizienz der Tumor-spezifischen Immunreaktionen. Für kutane T-Zelllymphome wurde von Assadullah und Kollegen gezeigt, dass das immunsuppressive Zytokin IL-10 im Verlauf der Erkrankung zunehmend stark exprimiert wird (Asadullah, et al., 1996). Im Fall des Patienten WeW konnte dies nicht bestätigt werden. Bei den Arbeiten von Assadullah und Kollegen blieb auch ungeklärt, ob dieses Zytokin von den Tumorzellen oder von Tumor-infiltrierenden Zellen produziert wird. Im Gegensatz zum IL-10 war beim Patienten WeW eine starke Expression des immunsuppressiven Zytokins TGF-β nachzuweisen. TGF-ß-Expression wurde schon für eine Reihe anderer Tumoren nachgewiesen (Esser, et al., 2001, Steiner, et al., 1994, Tsamandas, et al., 2004). Auch für kutane Lymphome gibt es einen ersten Bericht von der Arbeitsgruppe von Bagot (Bagot, et al., 2001), wobei die Autoren allerdings nicht unterscheiden konnten, ob die Tumor- oder die Tumor-infiltrierenden Zellen dieses Zytokin exprimierten. Im Fall des Patienten WeW ist hingegen klar, dass die Tumorzellen und nicht die Tumor-infiltrierenden Zellen die Quelle für TGF-β sind.

In letzter Zeit gab es verstärkt Berichte von verschiedenen Arbeitsgruppen, dass eine spezielle Subpopulation an CD4+-T-Zellen, die gleichzeitig auch den hochaffinen IL-2-Rezeptor CD25 exprimieren, immunsuppressive Eigenschaften haben und einen wesentlichen Anteil an der Erhaltung der Autotoleranz haben (Sakaguchi, et al., 2001, Shevach, et al., 2001). Vereinzelt wurden Zellen mit dem CD4+CD25+-Phänotyp auch in Tumoren nachgewiesen und postuliert, dass sie für die fehlende Effektivität der Tumor-spezifischen Immunreaktionen mitverantwortlich sein könnten (Liyanage, et al., 2002, Woo, et al., 2002). In Mäusen wurden besonders von der Arbeitsgruppe von Hayday eine Reihe weiterer T-Zelltypen gefunden, die ebenfalls immunsuppressiv sind und denen eine Rolle beim Erhalt der peripheren Toleranz zugeschrieben wird (Girardi, et al., 2002, Hayday, 2000). Dabei wurden CD8+, CD4-CD8--doppelt negative, γδ und natural killer T-Zellen (NKT) mit regulatorischen, d.h. suppressiven, Funktionen beschrieben. Regulatorische oder suppressor T-Zellen (Treg) können die Aktivierung von potentiell schädlichen selbst-reaktiven T-Zellen verhindern und laufende T-[Seite 90↓]Zellantworten modulieren (Roncarolo and Levings, 2000). Dies könnte bei T-Zellantworten gegen Tumoren eine wichtige Rolle spielen, besonders wenn dabei Selbstantigene das Ziel dieser Immunreaktionen sind. Auch Tumor-spezifische CD4+-T-Zellen mit regulatorischen Funktion wurden aus TIL von Krebspatienten isoliert (Wang, et al., 2004). Diese exprimierten CD25 und GITR und suppremierten die Proliferation von naïven CD4+-T-Zellen auf anti-CD3-Antikörper-Stimulation (Wang, et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnten keine konventionellen CD4+CD25+-Tregs im Tumor des Patienten WeW nachgewiesen werden. Allerdings war unter den TIL eine sehr ungewöhnliche CD8+-T-Zellpopulation zu finden, welche die Oberflächenmoleküle GITR und CTLA-4, die gewöhnlich mit Suppressor-T-Zellen assoziiert sind (Liu, et al., 2003, McHugh, et al., 2002), exprimieren. Diese Zellen könnten ein neuer Typ von regulatorische T-Zellen sein. Die Expression von TGF-ß durch die Tumorzellen könnte diese Treg-Population induzieren. Eine Rolle von TGF-ß bei der Induktion von CD8+-Treg wurde in Mitte der neunziger Jahre beschrieben (Rich, et al., 1995). Maus CD8+-T-Zellen hatten nach der Stimulation mit Staphylococcal enterotoxin B und TGF-ß1 erhöhte Mengen an TGF-ß und IL-10 sekretiert und inhibierten die Proliferation von anderen T-Zellen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass IL-2 plus TGF-ß CD4+-Tregs mit Zell-Zell-Kontakt-abhängigen und Zytokin-unabhängigen Suppressionseigenschaften induzieren kann (Horwitz, et al., 2003). Nakamura und andere haben gezeigt, dass Zell-kontaktabhängige Suppression durch CD4+CD25+-Treg durch membrangebundenes TGF-ß verursacht wird (Nakamura, et al., 2001). Treg-Zellen exprimieren sowohl TGF-ß auf der Zellmemran als auch den dazugehörenden Rezeptor TßRII. Dies könnte erklären, warum Tregs selbst funktionell inaktiv und nach TCR-Stimulation kein IL-2 machen. Durch die Bindung von TGF-ß an den TßRII wird TßRI phosphoryliert. TßTII und TßRI sind Serin-Threonin-Kinasen. Als Folge werden cytosolische Proteine wie SMAD 2 und SMAD 3 phosphoryliert und zusammen mit SMAD-4 in den Zellkern transportiert, wo die Transkription von spezifischen Genen induziert wird (Genestier, et al., 1999, Roberts, 2002). Die ex vivo mit IL-2 und TGF-ß generierten CD4+- oder CD8+-Tregs suppremierten graft-versus-host disease und lymphoide Hyperplasien (Zheng, et al., 2004).

Schlussfolgerungen:

Mit Hilfe der neu identifizierten CTCL-assoziierten T-Zellepitope und Mimotope konnten mit dieser Arbeit zum ersten Mal Tumor-spezifische T-Zellen bei kutanen Lymphomen untersucht werden. Diese T-Zellen waren in hohen Frequenzen im Tumor nachweisbar, müssen also expandiert sein, was auf eine starke Immunogenität dieser Tumoren hinweist. [Seite 91↓]Die großen Unterschiede in den Frequenzen Tumor-spezifischer T-Zellen, die mit MHC-Oligomeren mit verschiedenen Mimotopen desselben natürlichen Epitops nachgewiesen werden konnten, belegen, dass das Tumor-spezifische T-Zellrepertoire über die Wahl des Mimotops gesteuert werden kann. Die Untersuchungen ergaben, dass die Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor nahezu vollständig anerg waren, d.h. sie waren nicht mehr in einem aktiven Proliferationzyklus und exprimierten keines der beiden für die Zytolyse essentiellen Effektormoleküle Perforin und Granzym B. Die Gründe für diese Anergie sind nicht vollständig aufgeklärt aber nach den hier vorgestellten Untersuchungen mit größter Wahrscheinlichkeit auf eine Tumor-assoziierte Immunsuppression zurückzuführen, die entweder mit einer direkten Wirkung des von den Tumorzellen produzierten TGF-β auf die Tumor-spezifischen T-Zellen oder mit einer indirekten Wirkung über die Induktion von Suppressor-T-Zellen zusammenhängt. T-Zellen mit einem ungewöhnlichen Suppressorphänotyp konnten im Tumor nachgewiesen werden. Möglichweise spielen verschiedene Faktoren bei der Blockade der T-Zellen zusammen. Auf jeden Fall ist der anerge Zustand reversibel. Sowohl ex vivo durch Kultivierung in IL-2-haltigem Medium als auch in vivo durch Vakzination können die T-Zellen in einen aktiven, tumoriziden Zustand überführt werden.


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17.03.2005