Humboldt Universität zu Berlin

Dissertation

Tumor-spezifische T-Zellen und T-Zellepitope
bei kutanen Lymphomen

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat)
im Fach Biologie eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I
von

Diplom-Biologe Tumenjargal Sharav

geboren am 25.09.70 in Ulaanbaatar

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter Walden
2. Prof. Dr. Peter-M. Kloetzel
3. Prof. Dr. Wolfgang Uckert

eingereicht:18.08.2004

Datum der Promotion:26.01.2005

Abstract

The major goals of this work was the identification of tumour-associated T cell epitopes (TATE) in cutaneous T cell lymphoma (CTCL) and the characterisation of the tumour-specific cytolytic immune response. Two tumour-specific cytolytic T cell clones were established from the tumour-infiltrating lymphocytes (TIL) of one CTCL-patient. The potential natural T cell epitopes and mimotopes (epitopes without natural correlates but with more T cell stimulating capacity) for these T cell clones were identified using a combinatorial peptide library. The quantity and quality of the T cell response was different. The functional avidity of the peptides differed more than 3 orders of magnitude. The cytolysis and cytokine release did not correlate for each peptide. Some of the mimotopes were injected into CTCL-patients for therapeutic purpose. The frequency of the mimotope-specific T cell increased during the first vaccination cycles and a tumouricidal capacity could be observed. This first clinical application of the mimotopes showed the capacity of the mimotopes for the modulation of weak anti-tumour immune response. The identification of the new TATE allowed further characterisation of the tumour-specific T cells in the periphery and in the tumour of the patient. High frequency of the tumour-specific T cells could be detected in the tumour but they failed to show effector functions in comparison to the tumour-specific T cells in the peripheral blood. The tumour-specific T cells had the effector memory phenotype but expressed none or less amount of the cytolytic effector molecules. The reason for the suboptimal anti-tumour response in CTCL could be the immunesuppressive cytokine TGF-beta.

Keywords: cutaneous T cell lymphoma, T cell, T cell epitope , combinatorial peptide library , mimotope

Abstract

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von Tumor-assozierten T-Zellepitopen (TATE) in kutanen T-Zelllymphomen (CTCL) und die Charakterisierung der Tumour-spezifischen zytotoxischen Immunabwehr. Zwei Tumor-spezifische T-Zellklone wurden aus den Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) eines CTCL-Patienten etabliert. Die potentiellen natürlichen T-Zellepitope und Mimotope (synthetische Epitope ohne natürliche Korrelate aber mit meist hohen T-Zellaktivitäten) für diese Klone wurden mit einer kombinatorischen Peptidbibliothek identifiziert. Die Qualität und Quantität der T-Zellaktivitäten waren bei den jeweiligen Peptiden unterschiedlich. Die funktionellen Aviditäten varierten dabei um 3 Größenordnungen. Bei den einzelnen Peptiden korrelierte die Zytolyse und Zytokinsekretion nicht immer. Mit einigen Mimotopen wurden CTCL-Patienten für therapeutische Zwecke vakziniert. Die Frequenzen der Mimotop-spezifischen T-Zellen erhöhten sich während der ersten Vakzinationszyklen und tumorizide Aktivitäten konnten nachgewiesen werden. Diese ersten klinischen Anwendungen der Mimotope zeigen die Möglichkeit solcher Mimotope die sonst unzureichende Immunabwehr zu modulieren. Die Identifizierung neuer TATE ermöglichte die weitere Untersuchung der Tumor-spezifischen T-Zellen in der Peripherie und im Tumor des Patienten. Diese Analysen zeigten, dass diese Zellen im peripheren Blut aktiv aber im Tumor inaktiv waren. Die TILs waren vom effektor-memory Phänotyp expremierten aber nur schwach oder z. T. keine der Moleküle mit Effektorfunktion. Das immunsuppressive Zytokin TGF-beta könnte eine wichtige Rolle bei dieser unzureichenden Immunabwehr bei CTCL spielen.

Schlagwörter: kutane T-Zell-Lymphome, T-Zellen , T-Zellepitope, kombinatorische Peptidbibliotheken , Mimotope

Für meine Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1  Abkürzungen
• 2  Einführung
  • 2.1 Kutane Lymphome
  • 2.2  T-Zell-vermittelte Immunantworten
    • 2.2.1 MHC-restringierte Antigenerkennung
    • 2.2.2 Antigenprozessierung und Antigenpresentation
    • 2.2.3 T-Zellrezeptor
    • 2.2.4 Zytotoxische T-Zellen
    • 2.2.5 T-Zellentwicklung
  • 2.3  Tumor-assoziierte Antigene
    • 2.3.1 Tumor-assoziierte T-Zellepitope
    • 2.3.2 Methoden zur Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen
    • 2.3.3 Tumor-assoziierte T-Zellepitope bei kutanen Lymphomen
• 3  Zielstellung
• 4  Material und Methoden
  • 4.1 Materialien
    • 4.1.1 Klinische Materialien und Zelllinien
    • 4.1.2  Standardmedien, Puffer und Medienzusätze
    • 4.1.3 Kombinatorische Peptidbibliotheken und synthetische Peptide
    • 4.1.4 Antikörper
  • 4.2  Zellkulturtechniken
    • 4.2.1 Isolierung von Lymphozyten aus Bluten und Geweben
    • 4.2.2 Cryokonservierung von Zellen
    • 4.2.3 Zellseparation mittels magnetischer Beads
  • 4.3 Funktionelle T-Zellaktivitätsversuche
    • 4.3.1 Chromfreisetzungsanalysen
    • 4.3.2 ELISpot-assay
  • 4.4  Durchflusszytometrie
    • 4.4.1 Phänotypische Analyse von Oberflächenmolekülen
    • 4.4.2 Intrazelluläre Färbungen auf Zytokine
    • 4.4.3 Färbung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit DimerX
    • 4.4.4 Sortieren von Zellen per Durchflusszytometrie
  • 4.5 Molekulargenetische Arbeitsmethoden
    • 4.5.1 Präparation genomischer DNA
    • 4.5.2 TCR-γ-PCR
    • 4.5.3 Heteroduplex-Temperaturgradienten-Gelelektrophorese
    • 4.5.4 Sequenzierung der klonal dominanten PCR-Banden
    • 4.5.5 AT-Klonierung
    • 4.5.6  Isolierung von RNA
    • 4.5.7 PCR-Primer
    • 4.5.8 cDNA-Synthese
• 5  Experimente und Ergebnisse
  • 5.1 Identifizierung von Tumor-spezifischen T-Zellepitopen
    • 5.1.1 Generierung von Tumor-reaktiven CTL-Klonen
    • 5.1.2  Charakterisierung der CTCL-Tumorzellen
    • 5.1.3 Tumorspezifität der klonierten Tumor-infiltrierenden CD8+-T-Zellen
    • 5.1.4 Die Spezifität des Tumor-reaktiven CTL-Klons PN2
    • 5.1.5  Expressionsanalysen für die potentielle WeW-Tumor-spezifische TAA
    • 5.1.6 Spezifität des Tumor-reaktiven CTL-Klons L1
  • 5.2 Funktionelle Avidität der Tumor-spezifischen T-Zellen
  • 5.3 Charakterisierung der Tumorzellen und der Tumor-infiltrierenden T-Zellen
  • 5.4 Repertoire der Tumor-spezifischen T-Zellen
  • 5.5 Induktion von Tumor-reaktiven T-Zellen in vivo durch Mimotopenvakzination
  • 5.6 Tumorreaktivität Mimotop-induzierter T-Zellen
• 6  Diskussion
• 7  Zusammenfassung
• 8. Literaturverzeichnis
• 9. Anhang
• 10. Publikationensliste
• Selbständigkeitserklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Liste aller bislang bekannten CTCL-assoziierten TATE
• Tabelle 2: verwendete Zelllinien und –klone
• Tabelle 3: Liste der Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden
• Tabelle 4: Primer für TCRγ-PCR-Analyse (Muche, et al., 1997).
• Tabelle 5: Liste der verwendeten cDNA-spezifischen Primer
• Tabelle 6: Ergebnis des Positional scans mit dem Tumor-spezifischen CTL-Klon PN2 mit kombinatorischen Peptidbibliotheken.
• Tabelle 7: Potentielle Epitope für den CTL-Klon PN2. Als MHC-Bindungswerte wurden theoretische Scores für die Bindung der Peptide an HLA-A*0201 Molekül nach dem SYFPEITHI-Algorithmus berechnet und hier dargestellt. Die T-Zellaktivität wurde in spot forming units (SFU) für 1x106 Zellen angegeben. Für die beiden Oktapeptide konnte keine Scores für MHC-Bindung berechnet werden. Die Mimotope sind in fett dargestellt.
• Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse für das Positional Scan des Klons L1
• Tabelle 9: Aktivität des CTL-Klons L1. Die Werte für Zytolyse sind in % netto-51Cr-Freisetzung angegeben, d.h. 51Cr-Freisetzungswert ohne Peptid (4,6%) ist abgezogen. Die Werte für IFNγ-Synthese sind in SFU pro 1x106 Zellen angegeben, wobei der Basiswert für IFNγ-Synthese, d.h. ohne Peptid (48 SFU) abgezogen ist. Die natürlichen Epitope sind in fett und der Antagonist in kursiv gezeigt.
• Tabelle 10: Das Reaktionsprofile des Klons PN2 auf L1-Peptide. Die Zytolyse wurde anhand der 51Cr-Freisetzung gemessen und in % angegeben. Der 51Cr-Freisetzungswert ohne Peptid war 1,75%.
• Tabelle 11: Die funktionelle Avidität des CTL-Klons PN2. Die Peptidmenge für halbmaximale Zytolyse wurde in nM angegeben. Die Mimotope sind in fett dargestellt. * markiert die L1-Peptide
• Tabelle 12: Die funktionelle Aviditäten der CTL-Linien CMV-IrM und ELA-Trit wurden mit Chromfreisetzungsversuchen, die Halbwertszeiten der Dissoziation der tetrameren MHC-Peptidkomplexe von den T-Zellen per Durchflußzytometrie bestimmt.
• Tabelle 13: Frequenzen von Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor von Patient WeW (Anteil an CD3+CD8+-T-Zellen in Prozent).
• Tabelle 14: Durchflusszytometrische Analyse der Tumorzellen, d.h. große TCR-Vß2+-Zellen, und CD8+-T-Zellen im Tumor des Patienten WeW. Für die einzelnen Marker ist jeweils, der prozentuale Anteil an positiven Zellen wie folgt angezeigt: +++++ 80-100% positive Zellen; ++++ 60-80% positive Zellen; +++ 40-60% positive Zellen; ++ 20-40%; + unter 20% positive Zellen; - keine positive Zellen
• Tabelle 15: Phänotyp der Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor: Die Zellen wurden mit DimerX (65, 367, 347, 351, 276, 341, 358) markiert. Für die einzelnen Marker ist jeweils, der prozentuale Anteil an positiven Zellen wie gefolgt angezeigt: +++++ 80-100% positive Zellen; ++++ 60-80% positive Zellen; +++ 40-60% positive Zellen; ++ 20-40% positive Zellen; + unter 20% positive Zellen; - keine positive Zellen

Bilder

• Abbildung 1: Kombinatorische Peptidbibliotheken in X9 - und OX8-Format. O: definierte Sequenzposition, X: randomisierte Sequenzposition mit A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y.
• Abbildung 2: Isolierung von Tumorzellen. A: Die im Streulicht (FSC) gross erscheinende Tumorzellpopulation wurde an FACS-DIVA durchflusszytometrisch isoliert. B: TCR-Vγ-Fragmentlängenanalyse der isolierten Tumorzellen für die TCR-Vγ-Familien 1, 2, 3, 4, 5, 5p, 6p, 7p und 8 (γ-1) sowie 10, 11, B (A) (γ-2). C. Die Sequenzen für die N-Regionen der TCR-Vγ— und von TCR-Vß-Rearrangements der Tumorzellen
• Abbildung 3: 51Cr-Freisetzungsversuch mit den ausgewachsenen CD8+-T-Zellen aus TIL des Patient WeW. Als Zielzellen wurden Tumorzellen aus denselben Patienten verwendet, die anhand ihrer Größe an der FACS-DIVA isoliert worden waren; E/T-Ratio war 30/1.
• Abbildung 4: PCR-Fragmentlängenanalyse des CTL-Klons PN2 (A, B) und des CTL-Klons L1 (C, D). Die TCR-Vγ-PCR-Produkte wurden mit den Primern VG1 (A, C) und VG2 (B, D) generiert. Die Sequenzen der Primer und die TCR-Vγ-Familienspezifitäten sind in Tabelle 4 aufgelistet.
• Abbildung 5: Positional scan mit dem Tumor-spezifischen CTL-Klon PN2. Auf der vertikalen Achse sind Mittelwerte aus Doppelbestimmung von 51Cr-Freisetzungswerten in Prozent angezeigt. Die Buchstaben auf der horizontalen Achse geben die in der jeweiligen OX8-Subbibliothek definierte Aminosäure an. P1 bis P9 bezeichnet die Sequenzposition im Peptid. E/T-Ratio war 30/1.
• Abbildung 6: RT-PCR-Analyse von Tumorzellen des Patienten WeW, die als Zielzellen für den Tumorspezifitätstest mit den 2 Tumor-spezifischen CTL-Klonen benutzt wurden. B: NDRG-1 (423bp); C: Glucosylceramidase precursor (335bp); D: Tumorangiogenese Protein (392bp); A, E: 100 bp DNA-Marker.
• Abbildung 7: Positional Scan mit dem CTL-Klons L1. Die Werte für 51Cr-Freisetzung (vertikale Achse) sind als Mittelwerte aus Doppelbestimmungen dargestellt. Die Buchstaben auf der horizontalen Achse geben die in der jeweiligen OX8-Subbibliothek definierten Aminosäuren an. P1 bis P9 bezeichnen die Sequenzposition im Peptid. E/T-Ratio war 30/1.
• Abbildung 8: Vergleich der zytolytischen Aktivität (schwarze Säulen) und der IFNγ-Synthese (weisse Säulen) des Klons L1 auf die Mimotope und Epitope. Die Werte aus der Tabelle 8 sind normalisiert, wobei die jeweiligen maximalen Werte in 100% gesetzt wurden. Die Peptide sind entsprechend der Numerierung in der Tabelle aufgelistet.
• Abbildung 9: 51Cr-Freisetzungsversuch zur Bestimmung der funktionellen Avidität. Die Peptidnummern mit entsprechenden Sequenzen sind im Abb. 16 aufgelistet.
• Abbildung 10: Die funktionelle Avidität von CTL-Klon PN2.Auf der X-Achse sind die Werte des natürlichen Logarithmus (ln) der Peptikonzentration (pM), auf der Y-Achse die Werte für Logit (p) dargestellt. Für die linearisierten Titrationskurven wurden die Regressionsgraden berechnet und hier dargestellt.
• Abbildung 11: Expression von FasL bei den Tumorzellen und Vß2-negativen T-Zellen sowie von Fas-Rezeptor bei Nicht-Tumorzellen vom Patient WeW
• Abbildung 12: Expression von TGF-ß aber nicht von IL-10 duch die Tumorzellen. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse einer RT-PCR-Analyse auf die mRNA für die Zytokine
• Abbildung 13: CD8+ Subpopulation mit Expression von GITR und CTLA-4 im Tumor. Auf dem rechten Bild sind nur CD8+-T-Zellen angezeigt.
• Abbildung 14: Repertoireanalyse der L1-peptidspezifischen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x106 CD8+-T-Zellen angezeigt. Die Peptidsequenzen sind in Tabelle 9 aufgelistet.
• Abbildung 15: Repertoireanalyse der PN2-Peptid-spezifschen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x106 CD8+-T-Zellen angezeigt. Peptidsequenzen sind in Tabelle 7 aufgelistet.
• Abbildung 16: Vergleich der Spezifitätsrepertoires der Mimotop-induzierten T-Zelllinien und des CTL-Klons PN2. Die mit 1 bis 4 numerierten Spalten zeigen die Aktivität der T-Zellen in Zytotoxizitätsanalysen mit T2-Zellen als Zielzellen: Spalte 1-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender A; Spalte 2-mit Peptid 352 induzierte T-Zelllinie aus Spender A; Spalte 3-Klon PN2; Spalte 4-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender B. Zytolysedaten sind entsprechend der Zahl der reaktiven T-Zelllinie farblich wie folgt dargestellt: rot - von allen 4 T-Zelllinien erkannt; grün - von 3 T-Zelllinien erkannt, blau - von 2 T-Zelllinien erkannt; gelb - von einer T-Zelllinie erkannt. Die spezifischen Chromfreisetzungswerte sind auf 100% normalisiert (maximaler Chromfreisetzungswert > 30%). Die T-Zellreaktionen sind mit steigender Farbintensität (0-33%, 34-66%, 67-100%) in Abstufen dargestellt.
• Abbildung 17: IntrazelluläreAnalyse der IFNγ-Induktion in Antigen-spezifischen T-Zellen per Durchflusszytometrie aus dem peripheren Blut des Patienten 2 nach der 8. Mimotopvakzination. Hier wurden nur die CD3+CD8+-Zellen dargestellt. Als negative Kontrolle wurde PBMC ohne Peptid und als positive Kontrolle wurde PBMC mit PMA/Ionomycin (hier nicht gezeigt) oder mit dem CMV-Epitop NLVPMVATV inkubiert.
• Abbildung 18: Frequenzanalyse von mimotop-spezifischen T-Zellen in Patient 1 nach der Vakzination. Verlauf der Entwicklung der T-Zellreaktion während der drei Vaktinationszyklen. Die Pfeile oberhalb der Zeitachse weist auf die Vakzinationszyklen, die unterhalb der Achse auf die Zeitpunkte für das Immunmonitoring.
• Abbildung 19: Frequenzanalyse der Mimotop-spezifischen T-Zellen in Patient 2 unter Vakzination. Wie in Abbildung 18 geben die Pfeile oberhalb und unterhalb der Zeitachse die Zeitpunkte für die Vakzination und für die Blutentnahme für das Immunmonitoring an.
• Abbildung 20:51Cr-Freisetzungsversuch mit Mimotop-spezifischen CTL, die während der Vakzination (a) oder während des leukämischen Endstadiums (b) bzw. mit CTL, die gegen das CMV-Epitop (c) gerichtet sind. Dargestellt sind die Effektor-zu-Target-Titrationen. Zielzellen waren EBV-transformierte B-Zellen des Patienten oder heterogene MyLa-Tumorzellen oder NK-sensitive K562-Zellen. Offene Dreiecke: EBV-transformierte B-Zellen; gefüllte Dreiecke: diese Zellen in Gegenwart von Mimotop PVKTKDIKL; gefüllte Karos: diese Zellen in Gegenwart von Mimotop PVKTYDIKL; gefüllte Quadraten: MyLa-Tumorzellen; offene Quadrate: EBV-transformierte B-Zellen mit dem CMV-Epitop; gefüllte Kreise: K562-Zellen.
• Abbildung 21: Tumorizide Kapazität von Mimotop-spezifischen CTL aus Patient 2. Fragmentlängenanalyse der Tumorzellen (A), Mimotop-spezifischen CTL (B), virus-spezifschen CTL (E), Tumorzellen vor der Inkubation zusammen mit Mimotop-spezifschen CTL (C) und mit Virus-spezifischen CTL (F), Tumorzellen nach der Inkubation mit Mimotop-spezifischen CTL (D), mit Virus-spezifschen CTL (G) und mit Virus-spezifischen CTL in Gegenwart vom CMV-Peptid (H). Das rote Pfeil ist ein Kalibrierungsmarker, d.h. ein Oligonukleotid mit 245 bp.
• Abbildung 22: Spezifische Lyse der Tumorzellen im peripheren Blut des Patienten 2 durch Mimotop-spezifische CTL oder als Kontrolle CMV-spezifische CTL. Die Referenzwerte (in Prozent) für das Tumor-spezifische Signal mit Mimotop-spezifischen CTL (A) und mit Virus-spezifische CTL (B) vor der Inkubation (0°C) und nach der 4 h Inkubation (37°C), bzw. nach 4h bei 37°C in Gegenwart des CMV-Epitops (37°C mit Peptid).