Inhaltsverzeichnis

• 1  Abkürzungen

• 2  Einführung

  • 2.1 Kutane Lymphome

  • 2.2  T-Zell-vermittelte Immunantworten

    • 2.2.1 MHC-restringierte Antigenerkennung

    • 2.2.2 Antigenprozessierung und Antigenpresentation

    • 2.2.3 T-Zellrezeptor

    • 2.2.4 Zytotoxische T-Zellen

    • 2.2.5 T-Zellentwicklung

  • 2.3  Tumor-assoziierte Antigene

    • 2.3.1 Tumor-assoziierte T-Zellepitope

    • 2.3.2 Methoden zur Identifizierung von Tumor-assoziierten T-Zellepitopen

    • 2.3.3 Tumor-assoziierte T-Zellepitope bei kutanen Lymphomen

• 3  Zielstellung

• 4  Material und Methoden

  • 4.1 Materialien

    • 4.1.1 Klinische Materialien und Zelllinien

    • 4.1.2  Standardmedien, Puffer und Medienzusätze

    • 4.1.3 Kombinatorische Peptidbibliotheken und synthetische Peptide

    • 4.1.4 Antikörper

  • 4.2  Zellkulturtechniken

    • 4.2.1 Isolierung von Lymphozyten aus Bluten und Geweben

    • 4.2.2 Cryokonservierung von Zellen

    • 4.2.3 Zellseparation mittels magnetischer Beads

  • 4.3 Funktionelle T-Zellaktivitätsversuche

    • 4.3.1 Chromfreisetzungsanalysen

    • 4.3.2 ELISpot-assay

  • 4.4  Durchflusszytometrie

    • 4.4.1 Phänotypische Analyse von Oberflächenmolekülen

    • 4.4.2 Intrazelluläre Färbungen auf Zytokine

    • 4.4.3 Färbung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit DimerX

    • 4.4.4 Sortieren von Zellen per Durchflusszytometrie

  • 4.5 Molekulargenetische Arbeitsmethoden

    • 4.5.1 Präparation genomischer DNA

    • 4.5.2 TCR-γ-PCR

    • 4.5.3 Heteroduplex-Temperaturgradienten-Gelelektrophorese

    • 4.5.4 Sequenzierung der klonal dominanten PCR-Banden

    • 4.5.5 AT-Klonierung

    • 4.5.6  Isolierung von RNA

    • 4.5.7 PCR-Primer

    • 4.5.8 cDNA-Synthese

• 5  Experimente und Ergebnisse

  • 5.1 Identifizierung von Tumor-spezifischen T-Zellepitopen

    • 5.1.1 Generierung von Tumor-reaktiven CTL-Klonen

    • 5.1.2  Charakterisierung der CTCL-Tumorzellen

    • 5.1.3 Tumorspezifität der klonierten Tumor-infiltrierenden CD8+-T-Zellen

    • 5.1.4 Die Spezifität des Tumor-reaktiven CTL-Klons PN2

    • 5.1.5  Expressionsanalysen für die potentielle WeW-Tumor-spezifische TAA

    • 5.1.6 Spezifität des Tumor-reaktiven CTL-Klons L1

  • 5.2 Funktionelle Avidität der Tumor-spezifischen T-Zellen

  • 5.3 Charakterisierung der Tumorzellen und der Tumor-infiltrierenden T-Zellen

  • 5.4 Repertoire der Tumor-spezifischen T-Zellen

  • 5.5 Induktion von Tumor-reaktiven T-Zellen in vivo durch Mimotopenvakzination

  • 5.6 Tumorreaktivität Mimotop-induzierter T-Zellen

• 6  Diskussion

• 7  Zusammenfassung

• 8. Literaturverzeichnis

• 9. Anhang

• 10. Publikationensliste

• Selbständigkeitserklärung

• Danksagung

• Tabelle 1: Liste aller bislang bekannten CTCL-assoziierten TATE

• Tabelle 2: verwendete Zelllinien und –klone

• Tabelle 3: Liste der Antikörper, die in dieser Arbeit verwendet wurden

• Tabelle 4: Primer für TCRγ-PCR-Analyse (Muche, et al., 1997).

• Tabelle 5: Liste der verwendeten cDNA-spezifischen Primer

• Tabelle 6: Ergebnis des Positional scans mit dem Tumor-spezifischen CTL-Klon PN2 mit kombinatorischen Peptidbibliotheken.

• Tabelle 7: Potentielle Epitope für den CTL-Klon PN2. Als MHC-Bindungswerte wurden theoretische Scores für die Bindung der Peptide an HLA-A*0201 Molekül nach dem SYFPEITHI-Algorithmus berechnet und hier dargestellt. Die T-Zellaktivität wurde in spot forming units (SFU) für 1x106 Zellen angegeben. Für die beiden Oktapeptide konnte keine Scores für MHC-Bindung berechnet werden. Die Mimotope sind in fett dargestellt.

• Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse für das Positional Scan des Klons L1

• Tabelle 9: Aktivität des CTL-Klons L1. Die Werte für Zytolyse sind in % netto-51Cr-Freisetzung angegeben, d.h. 51Cr-Freisetzungswert ohne Peptid (4,6%) ist abgezogen. Die Werte für IFNγ-Synthese sind in SFU pro 1x106 Zellen angegeben, wobei der Basiswert für IFNγ-Synthese, d.h. ohne Peptid (48 SFU) abgezogen ist. Die natürlichen Epitope sind in fett und der Antagonist in kursiv gezeigt.

• Tabelle 10: Das Reaktionsprofile des Klons PN2 auf L1-Peptide. Die Zytolyse wurde anhand der 51Cr-Freisetzung gemessen und in % angegeben. Der 51Cr-Freisetzungswert ohne Peptid war 1,75%.

• Tabelle 11: Die funktionelle Avidität des CTL-Klons PN2. Die Peptidmenge für halbmaximale Zytolyse wurde in nM angegeben. Die Mimotope sind in fett dargestellt. * markiert die L1-Peptide

• Tabelle 12: Die funktionelle Aviditäten der CTL-Linien CMV-IrM und ELA-Trit wurden mit Chromfreisetzungsversuchen, die Halbwertszeiten der Dissoziation der tetrameren MHC-Peptidkomplexe von den T-Zellen per Durchflußzytometrie bestimmt.

• Tabelle 13: Frequenzen von Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor von Patient WeW (Anteil an CD3+CD8+-T-Zellen in Prozent).

• Tabelle 14: Durchflusszytometrische Analyse der Tumorzellen, d.h. große TCR-Vß2+-Zellen, und CD8+-T-Zellen im Tumor des Patienten WeW. Für die einzelnen Marker ist jeweils, der prozentuale Anteil an positiven Zellen wie folgt angezeigt: +++++ 80-100% positive Zellen; ++++ 60-80% positive Zellen; +++ 40-60% positive Zellen; ++ 20-40%; + unter 20% positive Zellen; - keine positive Zellen

• Tabelle 15: Phänotyp der Tumor-spezifischen T-Zellen im Tumor: Die Zellen wurden mit DimerX (65, 367, 347, 351, 276, 341, 358) markiert. Für die einzelnen Marker ist jeweils, der prozentuale Anteil an positiven Zellen wie gefolgt angezeigt: +++++ 80-100% positive Zellen; ++++ 60-80% positive Zellen; +++ 40-60% positive Zellen; ++ 20-40% positive Zellen; + unter 20% positive Zellen; - keine positive Zellen

• Abbildung 1: Kombinatorische Peptidbibliotheken in X9 - und OX8-Format. O: definierte Sequenzposition, X: randomisierte Sequenzposition mit A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y.

• Abbildung 2: Isolierung von Tumorzellen. A: Die im Streulicht (FSC) gross erscheinende Tumorzellpopulation wurde an FACS-DIVA durchflusszytometrisch isoliert. B: TCR-Vγ-Fragmentlängenanalyse der isolierten Tumorzellen für die TCR-Vγ-Familien 1, 2, 3, 4, 5, 5p, 6p, 7p und 8 (γ-1) sowie 10, 11, B (A) (γ-2). C. Die Sequenzen für die N-Regionen der TCR-Vγ— und von TCR-Vß-Rearrangements der Tumorzellen

• Abbildung 3: 51Cr-Freisetzungsversuch mit den ausgewachsenen CD8+-T-Zellen aus TIL des Patient WeW. Als Zielzellen wurden Tumorzellen aus denselben Patienten verwendet, die anhand ihrer Größe an der FACS-DIVA isoliert worden waren; E/T-Ratio war 30/1.

• Abbildung 4: PCR-Fragmentlängenanalyse des CTL-Klons PN2 (A, B) und des CTL-Klons L1 (C, D). Die TCR-Vγ-PCR-Produkte wurden mit den Primern VG1 (A, C) und VG2 (B, D) generiert. Die Sequenzen der Primer und die TCR-Vγ-Familienspezifitäten sind in Tabelle 4 aufgelistet.

• Abbildung 5: Positional scan mit dem Tumor-spezifischen CTL-Klon PN2. Auf der vertikalen Achse sind Mittelwerte aus Doppelbestimmung von 51Cr-Freisetzungswerten in Prozent angezeigt. Die Buchstaben auf der horizontalen Achse geben die in der jeweiligen OX8-Subbibliothek definierte Aminosäure an. P1 bis P9 bezeichnet die Sequenzposition im Peptid. E/T-Ratio war 30/1.

• Abbildung 6: RT-PCR-Analyse von Tumorzellen des Patienten WeW, die als Zielzellen für den Tumorspezifitätstest mit den 2 Tumor-spezifischen CTL-Klonen benutzt wurden. B: NDRG-1 (423bp); C: Glucosylceramidase precursor (335bp); D: Tumorangiogenese Protein (392bp); A, E: 100 bp DNA-Marker.

• Abbildung 7: Positional Scan mit dem CTL-Klons L1. Die Werte für 51Cr-Freisetzung (vertikale Achse) sind als Mittelwerte aus Doppelbestimmungen dargestellt. Die Buchstaben auf der horizontalen Achse geben die in der jeweiligen OX8-Subbibliothek definierten Aminosäuren an. P1 bis P9 bezeichnen die Sequenzposition im Peptid. E/T-Ratio war 30/1.

• Abbildung 8: Vergleich der zytolytischen Aktivität (schwarze Säulen) und der IFNγ-Synthese (weisse Säulen) des Klons L1 auf die Mimotope und Epitope. Die Werte aus der Tabelle 8 sind normalisiert, wobei die jeweiligen maximalen Werte in 100% gesetzt wurden. Die Peptide sind entsprechend der Numerierung in der Tabelle aufgelistet.

• Abbildung 9: 51Cr-Freisetzungsversuch zur Bestimmung der funktionellen Avidität. Die Peptidnummern mit entsprechenden Sequenzen sind im Abb. 16 aufgelistet.

• Abbildung 10: Die funktionelle Avidität von CTL-Klon PN2.Auf der X-Achse sind die Werte des natürlichen Logarithmus (ln) der Peptikonzentration (pM), auf der Y-Achse die Werte für Logit (p) dargestellt. Für die linearisierten Titrationskurven wurden die Regressionsgraden berechnet und hier dargestellt.

• Abbildung 11: Expression von FasL bei den Tumorzellen und Vß2-negativen T-Zellen sowie von Fas-Rezeptor bei Nicht-Tumorzellen vom Patient WeW

• Abbildung 12: Expression von TGF-ß aber nicht von IL-10 duch die Tumorzellen. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse einer RT-PCR-Analyse auf die mRNA für die Zytokine

• Abbildung 13: CD8+ Subpopulation mit Expression von GITR und CTLA-4 im Tumor. Auf dem rechten Bild sind nur CD8+-T-Zellen angezeigt.

• Abbildung 14: Repertoireanalyse der L1-peptidspezifischen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x106 CD8+-T-Zellen angezeigt. Die Peptidsequenzen sind in Tabelle 9 aufgelistet.

• Abbildung 15: Repertoireanalyse der PN2-Peptid-spezifschen T-Zellen im peripheren Blut des Patienten WeW per ELISpot. In der vertikalen Achse ist SFU pro 1x106 CD8+-T-Zellen angezeigt. Peptidsequenzen sind in Tabelle 7 aufgelistet.

• Abbildung 16: Vergleich der Spezifitätsrepertoires der Mimotop-induzierten T-Zelllinien und des CTL-Klons PN2. Die mit 1 bis 4 numerierten Spalten zeigen die Aktivität der T-Zellen in Zytotoxizitätsanalysen mit T2-Zellen als Zielzellen: Spalte 1-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender A; Spalte 2-mit Peptid 352 induzierte T-Zelllinie aus Spender A; Spalte 3-Klon PN2; Spalte 4-mit Peptid 347 induzierte T-Zelllinie aus Spender B. Zytolysedaten sind entsprechend der Zahl der reaktiven T-Zelllinie farblich wie folgt dargestellt: rot - von allen 4 T-Zelllinien erkannt; grün - von 3 T-Zelllinien erkannt, blau - von 2 T-Zelllinien erkannt; gelb - von einer T-Zelllinie erkannt. Die spezifischen Chromfreisetzungswerte sind auf 100% normalisiert (maximaler Chromfreisetzungswert > 30%). Die T-Zellreaktionen sind mit steigender Farbintensität (0-33%, 34-66%, 67-100%) in Abstufen dargestellt.

• Abbildung 17: IntrazelluläreAnalyse der IFNγ-Induktion in Antigen-spezifischen T-Zellen per Durchflusszytometrie aus dem peripheren Blut des Patienten 2 nach der 8. Mimotopvakzination. Hier wurden nur die CD3+CD8+-Zellen dargestellt. Als negative Kontrolle wurde PBMC ohne Peptid und als positive Kontrolle wurde PBMC mit PMA/Ionomycin (hier nicht gezeigt) oder mit dem CMV-Epitop NLVPMVATV inkubiert.

• Abbildung 18: Frequenzanalyse von mimotop-spezifischen T-Zellen in Patient 1 nach der Vakzination. Verlauf der Entwicklung der T-Zellreaktion während der drei Vaktinationszyklen. Die Pfeile oberhalb der Zeitachse weist auf die Vakzinationszyklen, die unterhalb der Achse auf die Zeitpunkte für das Immunmonitoring.

• Abbildung 19: Frequenzanalyse der Mimotop-spezifischen T-Zellen in Patient 2 unter Vakzination. Wie in Abbildung 18 geben die Pfeile oberhalb und unterhalb der Zeitachse die Zeitpunkte für die Vakzination und für die Blutentnahme für das Immunmonitoring an.

• Abbildung 20:51Cr-Freisetzungsversuch mit Mimotop-spezifischen CTL, die während der Vakzination (a) oder während des leukämischen Endstadiums (b) bzw. mit CTL, die gegen das CMV-Epitop (c) gerichtet sind. Dargestellt sind die Effektor-zu-Target-Titrationen. Zielzellen waren EBV-transformierte B-Zellen des Patienten oder heterogene MyLa-Tumorzellen oder NK-sensitive K562-Zellen. Offene Dreiecke: EBV-transformierte B-Zellen; gefüllte Dreiecke: diese Zellen in Gegenwart von Mimotop PVKTKDIKL; gefüllte Karos: diese Zellen in Gegenwart von Mimotop PVKTYDIKL; gefüllte Quadraten: MyLa-Tumorzellen; offene Quadrate: EBV-transformierte B-Zellen mit dem CMV-Epitop; gefüllte Kreise: K562-Zellen.

• Abbildung 21: Tumorizide Kapazität von Mimotop-spezifischen CTL aus Patient 2. Fragmentlängenanalyse der Tumorzellen (A), Mimotop-spezifischen CTL (B), virus-spezifschen CTL (E), Tumorzellen vor der Inkubation zusammen mit Mimotop-spezifschen CTL (C) und mit Virus-spezifischen CTL (F), Tumorzellen nach der Inkubation mit Mimotop-spezifischen CTL (D), mit Virus-spezifschen CTL (G) und mit Virus-spezifischen CTL in Gegenwart vom CMV-Peptid (H). Das rote Pfeil ist ein Kalibrierungsmarker, d.h. ein Oligonukleotid mit 245 bp.

• Abbildung 22: Spezifische Lyse der Tumorzellen im peripheren Blut des Patienten 2 durch Mimotop-spezifische CTL oder als Kontrolle CMV-spezifische CTL. Die Referenzwerte (in Prozent) für das Tumor-spezifische Signal mit Mimotop-spezifischen CTL (A) und mit Virus-spezifische CTL (B) vor der Inkubation (0°C) und nach der 4 h Inkubation (37°C), bzw. nach 4h bei 37°C in Gegenwart des CMV-Epitops (37°C mit Peptid).