7 Methoden

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Zur Beantwortung der oben umrissenen Fragestellungen wurde die neuronale Aktivität im visuellen Kortex wacher sich verhaltender Katzen untersucht. Hierzu wurden vier Katzen (Felis catus) ausgewählt und in einem visuellen Stimulationsparadigma trainiert. Anschließend wurden bis zu 17 Mikroelektroden chronisch intrakortikal im primären visuellen Kortex (Area 18) der Versuchstiere implantiert. Über diese Elektroden wurde unter kontrollierter visueller Stimulation in dem zuvor trainierten Versuchsparadigma simultan die neuronale Aktivität an bis zu 17 kortikalen Positionen abgeleitet.

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In der Analyse der abgeleiteten Daten wurde sowohl das LFP als Summationssignal, als auch die MUA als direktes Maß der Aktivität von Aktionspotentialen untersucht. Für die Analyse der Synchronisation neuronaler Aktivität wurden verschiedene spektrale Analyseverfahren wie die Berechnung von Power- oder Kohärenzspektren eingesetzt. An Hand eines objektiven Kriteriums, welches auf die Orientierungsspezifität neuronaler Antworten im primären visuellen Kortex rekurriert, konnten für kurz- und langreichweitige Synchronisationsphänomene funktionelle Frequenzbänder definiert werden.

7.1 Experimenteller Aufbau

Alle elektrophysiologischen Messungen wurden in dem in Abbildung 19 dargestellten experimentellen Aufbau durchgeführt. Die Versuchstiere wurden in einer für diese Experimente entworfenen und als faradayscher Käfig konstruierten Box plaziert. Die Box hatte die Ausmaße 80 x 30 x 30 cm (Länge x Breite x Höhe) und war vollständig schwarz lackiert. Die Versuchstiere wurden in der Box nicht fixiert und konnten sich frei bewegen.

An der Stirnseite der Box befand sich ein transparenter elektromagnetischer Schirm. Hinter diesem bedeckte ein Computermonitor, auf dem die visuellen Stimuli präsentiert wurden, die gesamte Stirnseite der Box (Sony MultiScan 17seII, 105 Hz vertikale Bildwiederholrate).

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Direkt vor dem Stimulusmonitor wurde im aufklappbaren Deckel der Box eine kleine CCD-Kamera (Conrad Elektronik, Hirschau, Deutschland) angebracht. Diese wurde auf den Kopf des Versuchstieres ausgerichtet und mit einem Videomonitor verbunden. Zwischen der CCD-Kamera und der Katze wurde ein gekippter halbdurchlässiger Spiegel installiert. Durch diesen wurde das Bild des Kopfes des Versuchstieres mit der Reflektion des auf dem Monitor dargebotenen visuellen Stimulus überlagert. So konnte über die Dauer des Experimentes kontinuierlich das Verhalten des Versuchstieres, dessen Blickrichtung und der dargebotene Stimulus überwacht werden.

Abbildung 19 : Schematische Darstellung des verwendeten experimentellen Aufbaus zum Training und zur elektrophysiologischen Ableitung am visuellen Kortex wacher sich verhaltender Katzen.

Direkt vor dem halbdurchlässigen Spiegel befand sich ein kleiner Futternapf, der über eine Bohrung im Boden und ein Schlauchsystem mit einer pneumatischen Pumpe außerhalb der Box verbunden war. Über diese Pumpe wurde zur Belohnung des Versuchstieres mittels eines Fußtasters eine definierte Menge verflüssigten Katzenfutters in den Futternapf gepumpt.

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In den Deckel der Box wurde der Vorverstärker des Aufnahmesystems integriert. Der Vorverstärker wurde mit dem kortikalen Implantat des Versuchstieres über einen Mikrostecker am Ende eines hochflexiblen abgeschirmten Kabels verbunden. Die Versuchstiere wurden somit durch die Aufnahmeelektronik in ihrer Bewegungsfreiheit so wenig wie möglich eingeschränkt. Vom Vorverstärker wurden die analogen Meßsignale über ein weiteres abgeschirmtes Kabel zu dem Hauptverstärker und A/D-Wandler geleitet. Hierfür wurde ein integriertes Multikanal-System (SynAmps Amplifier, NeuroScan Laboratories, Sterling, VA, USA) verwendet, welches die simultane Aufnahme aller elektrophysiologischen Signale bei 20kHz Abtastrate ermöglichte. Zusätzlich wurde der Hauptverstärker über eine Schnittstellenkarte mit dem Stimulationscomputer verbunden, so daß gemeinsam mit den elektrophysiologischen Daten entsprechende Triggersignale über die Stimuli, den zeitlichen Ablauf des Experiments und Codes zur Klassifikation des Verhaltens der Versuchstiere aufgezeichnet werden konnten.

Bedient wurde der gesamte Versuchsaufbau über zwei Computer. Der Aufnahmecomputer wurde über eine SCSI-Schnittstelle direkt mit dem Hauptverstärker verbunden und für die Speicherung der elektrophysiologischen Meßdaten und Triggersignale genutzt. Zudem konnten an diesem Computer in Echtzeit ständig alle aufgenommenen Signale beurteilt werden. Der zweite Computer steuerte die Präsentation der visuellen Stimuli und war direkt mit dem Stimulationsmonitor verbunden. Über diesen Computer wurde zudem interaktiv der Ablauf einer Aufnahmesitzung gesteuert. So wurde z.B. durch entsprechende Tastencodes das Verhalten der Katze klassifiziert, einzelne Versuchswiederholungen abgebrochen oder die nächste Versuchswiederholung gestartet.

Für die verschiedenen Trainingsphasen und die experimentelle Stimulation wurden in der objektorientierten Entwicklungsumgebung Metacard (Metacard Corportation, CO, USA) mehrere interaktiv bedienbare Stimulationsprogramme neu erstellt. Die verwendeten visuellen Stimuli wurden in der Entwicklungsumgebung Matlab (MathWorks Inc., MA, USA) berechnet.

7.2 Verhaltenstraining und visuelle Stimulation

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Das Verhaltenstraining der Versuchstiere erfolgte in mehreren Phasen, die in ihrer Dauer und Durchführung jeweils auf den individuellen Charakter jeder einzelnen Katze abgestimmt wurden. Die vier verwendeten Katzen wurden durch intensive Beschäftigung mit den Tieren nach den Kriterien Aggressivität, Kooperationsbereitschaft und motorischer Aktivität ausgewählt.

Zunächst wurden die Tiere über etwa eine Woche täglich an die Laborumgebung und die Aufnahmebox gewöhnt. Die Tiere konnten sich unter Aufsicht fei im Labor bewegen und dieses erkunden. Gleichzeitig wurden sie in der Aufnahmebox gefüttert, zunächst mit konventionellem Futter später unter Einsatz der pneumatischen Futterpumpe und des verflüssigten Tierfutters. Sobald die Versuchstiere an die Futterpumpe und den Verschluß der Box während der Fütterung gewöhnt waren, begann das Training für die visuelle Stimulation.

Zunächst wurden einfache, saliente Stimuli wie z.B. ein kurz aufblitzender heller Kreis auf dem ansonsten einfarbig grauen Stimulusmonitor präsentiert. Richtete die Katze ihren Blick auf diese Stimuli, wurde sie mit einer Portion Futter belohnt. Bei Nichtbeachtung erfolgte keine Belohnung.

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Im nächsten Schritt wurde das Versuchtier trainiert, einen sich bewegenden Zielstimulus auf dem Stimulusmonitor möglichst lange visuell zu verfolgen. Sobald die Katze den Monitor betrachtete, wurde als Zielstimulus ein kleiner weißer Kreis (Durchmesser: 1,1°) auf grauem Hintergrund präsentiert. Dieser Zielstimulus bewegte sich gleichförmig in einer zufälligen Richtung (Geschwindigkeit: 16.3 +/- 7.2 °/s, +/- SD). Die Katzen verfolgten diesen Stimulus durch Blickrichtungsänderung und wurden nur dann belohnt, wenn sie den Zielstimulus solange verfolgten, bis dieser plötzlich seine Form in ein weißes Quadrat änderte. Verfolgten sie den Stimulus nicht bis zu dieser Änderung der Form, erfolgte keine Belohnung. Das Zeitintervall vom Erscheinen des Zielstimulus bis zum Umschalten der Form wurde nun stetig verlängert, bis die Versuchstiere mit großer Zuverlässigkeit länger als drei Sekunden den Zielstimulus verfolgten.

Abbildung 20 : Schematische Darstellung der zeitlichen Abfolge einer Versuchswiederholung. Über der Zeitachse sind entsprechende Bilder des Stimulusmonitors abgebildet. Die verwendeten Analysefenster für das Prästimulus- und Stimulusintervall sind an der Zeitachse rot markiert.

In der nächsten Phase des Trainings wurden die visuellen Stimuli, welche die zu untersuchende Aktivität im visuellen Kortex der Versuchstiere induzierten, in das Versuchsprotokoll eingeführt. Als Stimuli wurden sinusoidale Gratings zwölf unterschiedlicher Orientierungen verwendet (Raumfrequenz 0.44 cycles/°). Diese wurden als statischer Hintergrund nicht weniger als eine Sekunde nach Erscheinen des Zielstimulus hinter diesem eingeblendet und blieben bis zum Ende einer Versuchswiederholung unverändert präsentiert. Mit dem Ende einer Versuchswiederholung, welches durch das Umschalten des Zielstimulus definiert wurde, wurden diese Gratings wieder ausgeblendet und durch einen einförmig grauen Hintergrund gleicher mittlerer Luminanz ersetzt. Die Abfolge der verschiedenen Orientierungen der Stimuli erfolgte in pseudorandomisierter Abfolge um die Wiederholung gleicher Orientierungen in aufeinanderfolgenden Versuchswiederholungen zu vermeiden.

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Der zeitliche Ablauf einer vollständigen Versuchswiederholung und entsprechende Bilder der visuellen Stimulation sind schematisch in Abbildung 20 dargestellt: Sobald das Versuchstier den Stimulusmonitor beachtet, wird der Zielstimulus mit einer zufälligen Bewegungsrichtung eingeblendet. Nach wenigstens einer Sekunde wird hinter dem von der Katze verfolgten Zielstimulus ein statisches Grating zufälliger Orientierung präsentiert. Nach wenigstens einer weiteren Sekunde markiert das Umschalten des Zielstimulus zu einem Quadrat das Ende der Versuchswiederholung und die Katze wird belohnt. Wird der Zielstimulus nicht bis zum Umschalten auf das Quadrat vom Versuchstier verfolgt, so erfolgt keine Belohnung und die Versuchswiederholung wird abgebrochen. Durch entsprechende Trigger wurden solche fehlerhafte Versuchswiederholungen bei der weiteren Datenanalyse nicht berücksichtigt. In der Abbildung sind unter der Zeitachse die beiden für die Datenanalyse gewählten Zeitfenster markiert.

7.3 Das visuelle System der Katze

Etwa 30 % des Kortex der Katze und 60 % des Kortex von Primaten dient der Verarbeitung visueller Information (Felleman und Van Essen, 1991;Orban, 1984). Innerhalb dieses großen Anteils am gesamten Kortex finden sich zahlreiche als kortikale Areale bezeichnete distinkte Repräsentationen des Gesichtsfeldes mit unterschiedlichen funktionellen Charakteristika.

Die Verarbeitung visueller Information beginnt in der Retina mit der Übersetzung von Lichtimpulsen in elektrische Signale. Durch laterale Verschaltung der verschiedenen retinalen Zellpopulationen wird eine Kontrastverstärkung erreicht und der dynamische Arbeitsbereich stark erweitert, um eine differenzierte Signalverarbeitung unter stark unterschiedlichen Helligkeitsbedingungen zu ermöglichen. Die Axone der als Ganglienzellen bezeichneten Ausgangszellpopulation der Retina bilden den Nervus opticus, über welchen die visuelle Information in das Corpus geniculatum laterale als nächste Schaltstation weitergeleitet wird. Nach ihren unterschiedlichen Antworteigenschaften werden die Ganglienzellen in drei funktionelle Klassen X, Y und W eingeteilt. Ganglienzellen vom X-Typ reagieren auf visuelle Reize mit tonischen Antworten, besitzen eine hohe räumliche Auflösung und dienen vorwiegend der Formwahrnehmung. Ganglienzellen vom Y-Typ zeichnen sich dagegen durch phasische Antworten und eine schlechtere räumliche Auflösung aus. Diese Zellklasse dient vorwiegend der Bewegungs- und Kontrastwahrnehmung. Ganglienzellen vom W-Typ bevorzugen langsame Bewegung und zeigen sowohl phasische als auch tonische Antworten. Die Axone dieser verschiedenen Ganglienzellklassen projizieren in distinkte retinotop organisierte Schichten des Corpus geniculatum laterale. Durch laterale Interaktion erfolgt hier eine weitere Kontrastverstärkung und Polarisierung der rezeptiven Felder. Die Neurone des Corpus geniculatum laterale projizieren über die Radiatio optica in die im Okzipitallappen gelegenen kortikalen Areale 17, 18 und 19. Jedes dieser Areale beinhaltet eine vollständige retinotope Repräsentation des Gesichtsfeldes. Die Projektionen des X- und Y-Systems in diese primären visuellen Areale sind unterschiedlich gewichtet. Während Area 17 primär synaptische Eingänge aus dem X-System erhält, terminieren in Area 18 vorwiegend Projektionen des Y-Systems. Da die drei Areale 17, 18 und 19 über direkte Eingänge vom Corpus geniculatum laterale verfügen, werden diese Areale des visuellen Systems der Katze als gemeinsamer Komplex primärer visueller Areale interpretiert (Felleman und Van Essen, 1991). Ähnlich den retinalen Zellen und Neuronen im Corpus geniculatum laterale besitzt jedes Neuron in den primären visuellen Arealen ein sogenanntes rezeptives Feld, welches dem Ausschnitt des visuellen Feldes entspricht, in welchem Stimuli eine Antwort des entsprechenden Neurons induzieren. Im Gegensatz zu den Zellen subkortikaler Strukturen zeigen die Antworteigenschaften der Neurone in den Arealen 17, 18 und 19 eine deutliche Spezifität für Eigenschaften wie Stimulusorientierungen, Bewegungsrichtungen und Bewegungsgeschwindigkeiten (Hubel und Wiesel, 1962). Die Verteilung der Spezifität kortikaler Neurone für solche Stimuluseigenschaften zeigt eine graduelle Änderung über die Kortexoberfläche, so daß sich für unterschiedliche Stimuluseigenschaften sogenannte kortikale Karten definieren lassen. Diese Karten werden von vertikalen Kolumnen gebildet, wobei Neurone einer Kolumne ähnliche Spezifitäten aufweisen. Ausgehend von den primären visuellen Arealen 17, 18 und 19 wird die visuelle Information in höhere Areale wie etwa Area 21 oder PMLS, die eine weitere funktionelle Spezialisierung aufweisen weitergeleitet.

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Die hier vorgestellten elektrophysiologischen Untersuchungen wurden alle in dem oben beschriebenen Areal 18 durchgeführt. Dieses primäre visuelle Areal der Katze gehört zu den am besten charakterisierten kortikalen sensorischen Systemen (Hubel und Wiesel, 1962;Hubel und Wiesel, 1965;Kandel und Schwartz, 2000). Die Antworten der Neurone dieses Areals zeigen neben einer Spezialisierung auf verschiedene andere Stimuluseigenschaften eine deutliche Spezifität für die Orientierung bewegter Konturen. Diese funktionelle Spezialisierung wurde für die Entwicklung eines objektiven Kriteriums, welches die Ableitung eines optimalen Frequenzbandes neuronaler Synchronisation ermöglichte, eingesetzt.

7.4 Elektrodenimplantation

Nach Abschluß des Verhaltenstrainings wurde die chronische Implantation der Mikroelektroden vorgenommen. Die Elektroden wurden einzeln aus Teflon-isolierten Platin-Iridium Drähten mit 50 µm Durchmesser angefertigt. Die Impedanz der Elektroden wurde durch definiertes Abglühen und Ätzung auf eine Impedanz von etwa 300 k bei 1 kHz justiert. Jeweils vier oder fünf solcher Elektroden wurden durch einen Teflonring zu einem Elektrodenbündel zusammengefaßt und verklebt. Die Längen der einzelnen Elektroden wurden hierbei so abgestuft, daß die Elektrodenspitzen nach der Implantation gleichverteilt in supragranulären, granulären und tiefen kortikalen Schichten plaziert wurden. Die Elektroden und zwei zusätzliche Silberdrähte mit Silberkugeln, die als Referenzelektroden dienten, wurden abschließend mit einem Mikrostecker verlötet, über welchen die Verbindung zum Aufnahmesystem hergestellt wurde.

Die Implantation der Elektroden erfolgte unter Gebrauch eines Operationsmikroskops unter sterilen Bedingungen. Die Anästhesie der Katzen wurde mit Ketaminhydrochlorid (15 mg/kg, i.m, Narketan, Chassot, Bern, Schweiz) und Xylazinhydrochlorid (1,1 mg/kg, i.m., Bayer, Leverkusen, Deutschland) eingeleitet. Danach erfolgten die intratracheale Intubation der Tiere und die Anlage eines intravenösen Zugangs. Die Anästhesie wurde als Inhalationsanästhesie fortgesetzt (70 % N2O, 30 % O2, 0.5–1.5 % Isofluran). Arterielle Sauerstoffsättigung, Endexpiratorischer CO2, Körpertemperatur, Elektrokardiogramm und arterieller Blutdruck wurden kontinuierlich überwacht und im entsprechenden physiologischen Parameterbereich gehalten. Es erfolge die kontinuierliche Infusion einer physiologischen Vollelektrolytlösung („Ringer-Laktat-Lösung“, 40 ml/h).

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Die Katzen wurden in einem stereotaktischen Rahmen (Narishige Instruments, Japan/USA) in sternaler Lage fixiert. Es erfolgte die mediane Inzision der Kopfschwarte und vollständige Freipräparation des Kraniums sowie Entfernung des Periosts. Die beabsichtigte Position der Kraniotomie wurde an Hand des stereotaktischen Rahmens und eines stereotaktischen Atlas auf dem Knochen markiert (Area 18, linke Hemisphäre, AP -3 mm, L 2 mm). Sechs bis acht Titan-Knochenschrauben wurden in der Umgebung dieser Markierung über Vorbohrungen in den Schädelknochen eingebracht. Anschließend erfolgte die Kraniotomie (ca. 2 x 7 mm in annähernd paramedianer Ausrichtung) und Darstellung der Dura mater. Diese wurde mit einem feinen Präparationshaken angehoben und im gesamten Bereich der Kraniotomie exzidiert. Über einen am stereotaktischen Rahmen befestigten Mikromanipulator und einen speziell angefertigten Elektrodenhalter wurden die Elektroden einzeln in den Kortex eingebracht und der entsprechende Teflonring jeweils auf der Kortexoberfläche mit Histoacryl fixiert. Insgesamt wurden so bis zu 17 Elektroden (2 Katzen mit 16 Elektroden, 2 Katzen mit 17 Elektroden) nahe der Repräsentation des vertikalen Meridians des unteren Hemifeldes im Areal 18 der linken Hemisphäre implantiert. Zusätzlich wurden zwei Silberkugeln über gesonderte Bohrungen als Referenz- und Erdungselektrode in epiduraler Lage plaziert.

Nach erfolgter Implantation der Elektroden wurde der Mikrostecker über einen zweiten Manipulator frei über der Kraniotomie plaziert. Die Kraniotomie wurde mit Silikonöl aufgefüllt und der Mikrostecker mit den zuvor eingebrachten Knochenschrauben in schnell aushärtendem Acrylzement fixiert. Abschließend wurden die Inzisionsränder mit resorbierbarem Nahtmaterial in intrakutaner Nahttechnik dicht um das aufgebaute Implantat adaptiert. Die vollständige Operationszeit betrug in etwa 5 Stunden.

Die Implantation der Elektroden erfolgte unter antibiotischer Abschirmung. Die Antibiose wurde gemeinsam mit der postoperativen Analgesie bis zum Begin der experimentellen Ableitungen fortgesetzt. 5 bis 7 Tage post operationem wurde nach Erholung der Versuchstiere mit den elektrophysiologischen Messungen gemäß des zuvor trainierten experimentellen Protokolls begonnen.

7.5 Datenanalyse

7.5.1 Lokales Feldpotential und Multi-Unit-Aktivität

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Abbildung 21 : Ableitung von LFP und MUA aus dem Rohsignal. A : Ausschnitt eines typischen Datenabschnitts des Rohsignals. B : Durch Tiefpaßfilterung bei 200 Hz wird aus dem Rohsignal das LFP abgeleitet. C : Die MUA wird durch Hochpaßfilterung bei 500 Hz und Anwendung eines Schwellenwertes abgeleitet. Über dem hochpaßgefilterten Rohsignal sind die durch Anwendung des Schwellenwertes abgeleiteten Zeitpunkte der Aktionspotentiale dargestellt. Der Schwellenwert ist als durchgezogene Linie markiert.

Alle von den implantierten Elektroden abgeleiteten Rohsignale wurden mit einer Abtastrate von 20 kHz digitalisiert und aufgezeichnet. Aus diesen Rohsignalen wurden an eine Versuchssitzung anschließend das lokale Feldpotential (LFP) und die Multi-Unit-Aktivität (MUA) abgeleitet. Die entsprechenden Schritte sind in Abbildung 20 dargestellt. Das LFP entspricht dem tieffrequenten Anteil des abgeleiteten Rohsignals und kann als ein dem EEG ähnliches intrakortikales Summationspotential interpretiert werden. Entsprechend wurde das LFP durch Tiefpaßfilterung (Schwellenfrequenz: 200 Hz) und Wiederabtastung bei 400 Hz abgeleitet. Die MUA stellt die Zeitpunkte von Aktionspotentialen einer kleinen Anzahl von Neuronen in der unmittelbaren Umgebung der Elektrodenspitze dar. Für die Ableitung der MUA wurde das Rohsignal hochpaßgefiltert (Schwellenfrequenz: 500 Hz). Die Zeitpunkte, an denen die Amplitude dieses hochpaßgefilterten Signals einen manuell plazierten Schwellenwert überschritt, wurden als Aktionspotentiale registriert. Die Zeitpunkte dieser Aktionspotentiale wurden mit einer zeitlichen Auflösung von einer Millisekunde gespeichert.

7.5.2 Analyseintervalle

Um die neuronale Aktivität während visueller Stimulation mit der Aktivität ohne Stimulation zu vergleichen und die durch die visuelle Stimulation induzierte Synchronisation neuronaler Aktivität von der Synchronisation ohne Stimulation zu dissoziieren, wurden für die Datenanalyse zwei unterschiedliche Zeitfenster definiert (siehe Abbildung 20). Das Prästimulusintervall reichte von 500 ms vor bis zum Erscheinen des Gratings. Das Stimulusintervall reichte von 200 ms bis 700 ms nach dem Erscheinen des Gratings. Die ersten 200 ms nach Erscheinen des Stimulus wurden nicht berücksichtigt, da die neuronale Aktivität in diesem Zeitbereich durch transiente Komponenten mit konstanter Phasenlage relativ zum Erscheinen des Stimulus dominiert wird. Diese Komponenten werden deutlich in den sliding-window Analysen dargestellt, welche für die Power- und Kohärenzspektren des LFP zusätzlich zu der Analyse der beschriebenen Zeitfenster durchgeführt wurden. Für diese sliding-window Analysen wurde iterativ ein 100 ms langes Hanning-Fenster mit 1 ms Schrittweite über die Daten geschoben.

7.5.3 Kurzreichweitige Synchronisation

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Zur Untersuchung der kurzreichweitigen Synchronisation neuronaler Aktivität im Bereich weniger Hundert Mikrometer wurde das Powerspektrum des LFP berechnet. Ähnlich dem EEG stellt das LFP ein Summationspotential neuronaler Aktivität in der Nähe der Elektrodenspitze dar. Große Amplituden im LFP sind auf synchrone Aktivität in der direkten Umgebung der Elektrode zurückzuführen, da zeitlich unkorrelierte Aktivität durch den Summationseffekt gegen das Nullpotential gemittelt wird. Das Powerspektrum des LFP stellt somit ein geeignetes Maß zur Beurteilung der Frequenzverteilung zeitlicher Synchronisation neuronaler Aktivität im Bereich weniger Hundert Mikrometer dar (Abeles, 1982;Engel et al., 1990). Die Powerspektren des LFP wurden gemäß dem Algorithmus nach Welch unter Verwendung von 100 ms Hanning-Fenstern berechnet (Press, 1997).

Für die relativen Antworten der kurzreichweitigen Synchronisation wurden die LFP-Powerspektren über alle Stimulusorientierungen gemittelt und die Spektren des Stimulusintervalls durch die Spektren des Prästimulusintervalls dividiert. Die Signifikanz der relativen Antworten wurde durch Vergleich der LFP-Power im Prästimulusintervall mit der LFP-Power im Stimulusintervall mit dem Wilcoxon-Test (p = 0.01) bei der Frequenz der maximalen relativen Antwort getestet.

7.5.4 Langreichweitige Synchronisation

Die langreichweitige Synchronisation neuronaler Aktivität wurde durch Berechnung der Kohärenz zwischen zwei simultan an verschiedenen Mikroelektroden gemessenen LFPs untersucht. Die Kohärenz zweier Signale x und y wurde als Funktion der Frequenz f gemäß (5) berechnet:

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(5)

P xy ( f ), P xx ( f ) und P yy ( f ) sind die Cross- bzw. Autospektren der Signale x und y. Diese Cross- und Autospektren wurden entsprechend den Powerspektren des LFP gemäß dem Algorithmus nach Welch berechnet. Die Kohärenz liegt zwischen 0 und 1 und beschreibt die Konstanz der Phasenlage zweier Signale als Funktion der Frequenz. Sind die Frequenzkomponenten zweier Signale perfekt phasenkonstant so beträgt die Kohärenz der Signale für die entsprechende Frequenz 1. Ist im umgekehrten Fall die Phasenlage vollständig unkorreliert so beträgt die Kohärenz 0. Für die relativen Antworten der langreichweitigen Synchronisation wurden die LFP-Kohärenzspektren über alle Stimulusorientierungen gemittelt und die Spektren des Prästimusintervalls von denen des Stimulusintervalls subtrahiert. Die Signifikanz der relativen Antworten wurde durch Vergleich der LFP-Kohärenz im Prästimulusintervall mit der LFP-Kohärenz im Stimulusintervall mit dem Wilcoxon-Test (p = 0.01) bei der Frequenz der maximalen relativen Antwort getestet.

Die vertikale Bildwiederholfrequenz des Stimulusmonitors bedingte einen technischen Artefakt der in den Spektren zu einem scharfen Peak bei 105 Hz führte. Dieses Artefakt stellte sich in der Größenordnung von etwa 2 % der totalen Power während des Prästimulusintervalls dar. Trotz dieses sehr kleinen Effekts, führte dieses Artefakt zu einer starken Beeinflussungen der abhängigen Parametrisierungen wie der Kohärenz, den relativen Antworten oder dem im folgenden vorgestellten Tuning Index. Daher wurde die durch dieses Artefakt beeinträchtigten Frequenzen durch Interpolierung der benachbarten Frequenzen von der Analyse ausgeschlossen.

7.5.5 Variabilität über Versuchsbedingungen

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Um die Variabilität der relativen Antworten über verschiedene Versuchsbedingungen zu quantifizieren, wurden sowohl die über Wiederholungen gemittelten, als auch die einzelnen Antwortspektren mit einer Gauß-Funktion durch 2 Minimierung optimal angenähert. Zum Vergleich der Verteilung der Breite der Peaks in den Antworten einzelner Versuchswiederholungen mit der Breite des Peaks in der gemittelten Antworten wurde die Verteilung der Standardabweichungen der gefitteten Gaus-Funktionen gegen die entsprechende Standardabweichung der angenäherten Funktion der gemittelten Antwort getestet (Wilcoxon-Test, p = 0.01).

7.5.6 Harmonische Effekte

Zur Untersuchung möglicher harmonischer Effekte wurde die Phasenkopplung zwischen einzelnen Frequenzkomponenten innerhalb eines Signals analysiert. Hierzu wurde die Bikohärenz der Frequenzen f 1 und f 2 des Signals x gemäß (6) berechnet:

(6)

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P x ( f 1 , f 2 ) und P x ( f ) sind die Bi- bzw. Powerspektren des Signals x. Die Bikohärenz reicht von 0 bis 1 und beschreibt die Konstanz der Phasenlage zweier Frequenzkomponenten eines Signals. Die Bi- und Powerspektren wurden wie oben beschrieben berechnet.

7.5.7 Tuning-Index

Um die Synchronisation neuronaler Aktivität an Hand eines objektiven und funktionalen Kriteriums zu parametrisieren, wurde ein sogenannter Tuning-Index entwickelt, der das Signal-Rausch-Verhältnis neuronaler Synchronisation in Bezug auf das Orientierungstuning beschreibt. Die Berechnung dieses Tuning-Index erfolgte gemäß (7).

(7)

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N ist die Anzahl der Stimulusorientierungen . r( ) ist die Antwort eines Signals bei der Orientierung .

Abbildung 22 : Exemplarische Darstellung der Berechnung des Tuning-Index. A : Eine typische kortikale Antwort mit Orientierungstuning (+/- Varianz). B : Darstellung der kortikalen Antworten in Polarkoordinaten, nachdem alle Orientierungen mit 2 multipliziert wurden. Der gemittelte Antwortvektor ist in rot dargestellt.

Abbildung 22 veranschaulicht exemplarisch die Berechnung des Tuning-Index. Die Antworten werden zunächst in Vektorschreibweise dargestellt, wobei der Betrag des Vektors der Antwort des Signals und seine Orientierung der mit 2 multiplizierten Orientierung des entsprechenden Gratings entsprechen. Diese Vektoren werden gemittelt. Der Betrag des gemittelten Vektors ist somit eine Funktion des Orientierungstunings der Antworten. Bei gleichen Antworten auf alle Stimulusorientierungen ergibt sich ein Betrag von 0. Gleiche Antworten auf orthogonale Orientierungen werden durch die Multiplikation der Orientierung mit 2 ebenfalls auf 0 gemittelt. Findet sich nur bei einer Orientierung eine Antwort ungleich 0 so entspricht der Betrag dieser Antwort. Der Tuning-Index wird schließlich als das Verhältnis des Betrags des gemittelten Antwortvektors zur mittleren Varianz aller Antworten berechnet. Dieser Tuning-Index wurde sowohl als Funktion der Frequenz, als auch als Funktion aller möglichen Frequenzbänder berechnet. Für Frequenzbänder wurden die Antworten aller Frequenzen f , für die f start < f < f stop gilt, vor der Berechnung des Tuning-Index gemittelt.

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Sucht man in diesen Funktionen des Tuning-Index nach dem globalen Maximum, erhält man die Frequenz oder das Frequenzband mit maximalem Signal-Rausch-Verhältnis in Bezug auf das Orientierungstuning des untersuchten Signals. Lokale Maxima des Tuning Index sowohl für einzelne Frequenzen als auch für Frequenzbänder spiegeln separate Frequenzbereiche mit Orientierungstuning des Signals wider, die nicht notwendig in dem optimalen Frequenzband enthalten sind oder mit diesem überlappen. Der Tuning-Index wurde sowohl für die LFP-Power als auch für die LFP-Kohärenz als Funktion der Frequenz und Funktion aller möglichen Frequenzbänder berechnet. Die Signifikanz des Orientierungstuning wurde durch Vergleich der Antwort auf die optimale Orientierung mit der Antwort auf die entsprechend orthogonale Orientierung getestet (Wilcoxon-Test, p = 0.01).

7.5.8 Synchronisation zwischen Aktionspotentialen und LFP

Die Synchronisation zwischen einzelnen Aktionspotentialen und dem LFP wurde durch Berechnung des spike-trigerred-average (STA) und der spike-field-coherence (SFC) an unterschiedlichen Elektroden simultan abgeleiteter LFP und MUA analysiert.

Der STA einer Zeitserie x von Aktionspotentialen und einem simultan aufgenommenen LFP y wird durch das Kreuzkorrelogramm von x und y definiert. Der STA entspricht somit dem mittleren LFP in y in der zeitlichen Umgebung eines Aktionspotentials in x. Das Powerspektrum des STA ist unabhängig von der Feuerrate in x. Änderungen der Power im LFP y jedoch gehen direkt in die Berechnung des STA ein, so daß auch ohne eine Änderung der Synchronisation zwischen Aktionspotentialen und LFP unterschiedliche STAs resultieren können. Normalisiert man das Powerspektrum des STA mit dem Powerspektrum des verwendeten LFP y so erhält man die SFC als Funktion der Frequenz f. Diese SFC ist durch die vorgenommene Normalisierung sowohl von der Feuerrate, als auch von der Power des LFPs unabhängig. Die SFC liegt zwischen 0 und 1 und beschreibt als Funktion der Frequenz f den Anteil der Aktionspotentiale in x mit konstanter Phasenlage zur Frequenzkomponente f des LFPs in y.

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Abbildung 23 : Exemplarische Berechnung von STA und SFC an Hand von Testdaten. A : Ausschnitt der artifiziell generierten Testdaten von MUA und LFP. B : Powerspektrum des LFP. C : Das Kreuzkorrelogramm von LFP und MUA ergibt den STA. D : Powerspektrum des STA. E : Durch Normalisierung des Powerspektrum des STA mit dem Powerspektrum des LFP ergibt sich die SFC, welche anschaulich die Synchronisation zwischen Aktionspotentialen und LFP im Frequenzbereich darstellt.

Die Berechnung der SFC wird in Abbildung 23 exemplarisch an artifiziellen Testdaten veranschaulicht. Das LFP von 10 Sekunden Länge wurde als Summe einer Sinusschwingung von 20 Hz, einer Sinusschwingung von 50 Hz und von normalverteiltem weißem Rauschen konstruiert. Die Amplitude der Schwingung von 50 Hz betrug ein Drittel der Amplitude der Schwingung von 20 Hz. Die entsprechend 10 Sekunden langen Testdaten der MUA wurden so konstruiert, daß 20 % der Aktionspotentiale zur 20 Hz-Schwingung des LFP phasengekoppelt waren. 50 % der Aktionspotentiale waren zur 50 Hz-Schwingung des LFP phasengekoppelt. Die restlichen 50 % der Aktionspotentiale wiesen keine zeitliche Korrelation zu dem LFP auf. Der STA verdeutlich die Phasenkoppelung der MUA und des LFP. Obwohl der größte Anteil an Aktionspotentialen zur 50 Hz-Komponente des LFP phasengekoppelt ist, wird der STA und das Powerspektrum des STA wegen der größeren Amplitude der 20 Hz-Komponente im LFP, von dieser 20 Hz Komponente dominiert. Da die SFC jedoch mit dem Powerspektrum des LFP normalisiert ist, stellt sich hier der Anteil der phasengekoppelten Aktionspotentiale unabhängig vom LFP-Powerspektrum korrekt dar. Die SFC beträgt entsprechend 0,2 (20 %) und 0,5 (50 %) bei 20 Hz und 50 Hz.

Die Powerspektren von LFP und STA wurden wie oben beschrieben gemäß dem Algorithmus nach Welch berechnet. Relative Antworten der SFC wurden durch Subtraktion der SFC im Prästimulusintervall von der SFC im Stimulusintervall berechnet. Die SFCs wurden hierfür über alle Stimulusorientierungen gemittelt. Die Signifikanz der relativen Antworten wurde mit dem Wilcoxon-Test (p = 0.01) bei der Frequenz der maximalen relativen Antwort getestet.

7.5.9 Implementation

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Sämtliche Datenanalysen wurden in der Entwicklungsumgebung Matlab für Linux (MathWorks Inc., MA, USA) neu implementiert. Hierfür wurde eine große Anzahl an Funktionen und Skriptdateien erstellt. Die Analysen wurden zum Teil verteilt in einem Linux-Cluster berechnet.


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