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3  Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Art und Herkunft, Fang und Schlachtung der Fische

Zur Feststellung des Hygienestatus und der Frischebeurteilung ausgenommener und unausgenommener Süßwasserfische wurden als Modellfische Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) und Zander (Sander lucioperca) gewählt. Die Regenbogenforellen stammten aus einer brandenburgischen Forellenwirtschaft. Bei den Zandern handelte es sich nicht um ausschließlich im Süßwasser lebende Tiere, sondern um Fische aus Boddengewässern. Als Bodden bezeichnet eine seichte, unregelmäßig geformte Bucht mit enger Öffnung zum Meer, die durch Überflutung entstanden und typisch für die Ostseeküste Mecklenburg-Vorpommerns ist. Das Wasser des Boddens ist schwach salzhaltiges Mischwasser aus Süß- und Salzwasser (Brackwasser).

3.1.1.1 Zander

Zwischen November 2000 und April 2001 wurden insgesamt 5 Gruppen von Ostsee-Zandern aus jeweils einem Fang untersucht (siehe Tabelle 8). Die Fische der Gruppen 1, 2, 3 und 5 stammten aus dem Achterwasser und den Boddengewässern rings um Usedom und wurden von verschiedenen Booten nach der Anlandung zentral im Fischgroßhandel Birnbaum & Kruse in Lassan gesammelt. Zander der Gruppe 4 wurden nach einem schweren Oststurm im Boddengewässer bei Ribnitz-Damgarten gefangen, waren aber für diese Region untypisch groß, so dass vermutet werden kann, dass es sich um Fische des Freiwassers handelte, die in den Bodden gedrückt wurden.

Die Gruppen 1 und 2 dienten als Vorversuchsfische. An ihnen sollten mikrobiologische Techniken erprobt, zu erwartende Keimzahlen festgestellt sowie die Sensorik mit Frischegrad (FG)- und Sensorikbewertung entwickelt werden. An der Gruppe 3 vom Januar 2001 wurde im Hauptversuch der mikrobiologische Verderb und die Entwicklung von TVB-N untersucht. Die Gruppen 4 und 5 wurden für die Hauptversuche der Sensorik-Prüfung (Frischegrad und Kochprobe) auf Unterschiede [Seite 49↓]zwischen ausgenommenen und nicht ausgenommen gelagerten Fischen herangezogen. Von allen 5 Gruppen wurden die Eingeweide sowie Bauchlappen- und zum Teil Rückenmuskulatur auf das Vorkommen von Nematodenlarven geprüft.

Tabelle 8: Eigenschaften der fünf untersuchten Zandergruppen

Gruppe

Fangdatum

Untersuchung

leer / rund

Fischzahl

Länge [cm]

Fanggewicht [g]

Schlachtgewicht [g]

Schlachtverlust %

Geschlecht

w

m

u

1

06.11.00

Vorversuch Mikrobiologie+

FG/Sensorik

leer

16

47 +/- 5

1118 +/- 368

1029+/- 332

8

4

4

8

rund

29

48 +/- 5

1278 +/- 417

1169 +/- 332

9

3

6

20

2

06.12.00

Vorversuch Mikrobiologie+

FG/Sensorik

leer

14

52 +/- 2

n.b.

1566 +/- 208

 

5

2

7

rund

20

54 +/- 3

1746 +/- 244

1537 +/- 180

12

11

5

4

3

15.01.01

Hauptversuch

Mikrobiologie

leer

25

53 +/- 3

1831 +/- 269

1624 +/- 215

11

14

7

4

rund

30

53 +/- 3

1754 +/- 194

1522 +/- 168

13

14

16

0

4

23.03.01

Hauptversuch

FG/Sensorik

leer

9

65 +/- 3

3057 +/- 549

2651 +/- 462

13

5

4

 

rund

12

63 +/- 4

2935 +/- 548

2525 +/- 548

14

7

5

 

5

02.04.01

Hauptversuch

FG/Sensorik

leer

20

57 +/- 5

n.b.

1714 +/- 459

 

n.b

  

rund

20

58 +/- 5

2230 +/- 621

1918 +/- 519

14

11

9

 

Gewicht und Länge: arithmetisches Mittel und Standardabweichung
Schlachtverlust: Eingeweidegewicht bezogen auf Fanggewicht
FG = Frischegrad; w = weiblich, m = männlich, u = unbestimmbar, n.b.: nicht bestimmt,
leer = ausgenommen, rund = nicht ausgenommen

Sie wurden nicht unmittelbar nach der Anlandung ausgenommen, sondern gelangten unter Eis gelagert als Vollfische in das Institut, wo sie spätestens 24 Stunden nach dem Fang ausgenommen wurden.

Der Fütterungszustand der Fische war von Gruppe zu Gruppe unterschiedlich. Die Fische der Vorversuchsgruppen wiesen mehrheitlich einen leeren Magen und Darm auf. Die Fische der vierten und fünften Gruppe zeigten fast alle einen gefüllten Magen, während der Darm meist leer war. Das Fanggewicht lag im Schnitt bei [Seite 50↓]1660 g, die Fische der Gruppe 4 waren mit ca. 3000 g wesentlich schwerer als Fische der anderen Gruppen. Der Schlachtverlust lag bei 8 bis 14 Prozent.

3.1.1.2 Regenbogenforellen

An den Regenbogenforellen wurden bakteriologische und sensorische Untersuchungen in verschiedenen Zeiträumen des Forschungsprojektes durchgeführt. Dabei stammten die Versuchsfische zum Teil aus einer Forellenwirtschaft mit einer Rinnenanlage in Treuenbrietzen in Brandenburg (Forellenwirtschaft Steinmühle der GBR Binnenfischerei Potsdam), zum Teil aus der Kreislaufanlage (KA) des Versuchsgutes des BgVV. Fangdatum, Untersuchungsart, Gewichte der Fische und weitere Einzelheiten sind in der Tabelle 9 zusammengestellt.

Tabelle 9: Eigenschaften der untersuchten Regenbogenforellengruppen

Untersuchung

Fangdatum

Untersuchung

Anzah Versuchs-durchgänge

Herkunft

ausgenommen amk

rund vmK

Fischzahl

Länge [cm]

Fanggewicht [g]

Schlachtgewicht [g]

Schlachtverlust %

I

09.-12.

1999

Mikrobiologie von Haut und Filetmuskel, Frischegrad

4

FA

amk

132

30

ca. 378

  

vmk

132

II

09.-11.

2000

Frischegrad und Sensorik

3

KA

amk

45

25

248 +/- 40

228 +/- 38

8 %

vmk

45

II

06.-08.

2001

Mikrobiologie von Bauchlappen und Darm

3

FA

amk

85

30

385 +/- 44

336 +/- 37

13 %

vmk

145

Gewicht und Länge: arithmetisches Mittel und Standardabweichung:
Schlachtverlust: Eingeweidegewicht bezogen auf Fanggewicht; leeres Feld: nicht gemessen;
FA =Forellenanlage, KA =Kreislaufanlage des Institutes

Die Tiere für die Untersuchungen im Winter 1999 und für die bakteriologischen Untersuchungen im Sommer 2001 kamen aus der Forellenanlage in Brandenburg. Die Anlage verfügt über Betonrinnen, in denen die Fische nach Alter sortiert gehalten werden. Die Rinnen werden mit Oberflächenwasser gespeist und ständig im offenen [Seite 51↓]Kreislauf durch die Rezirkulation des Wassers belüftet. Die Fütterung der Fische mit handelsüblichem Pelletfutter wurde je nach Versuchsanforderung ca. 3 bis 7 Tage vor dem Schlachten eingestellt, um die Fische zum Zeitpunkt der Schlachtung vollkommen nüchtern zu haben. Zum Teil erhielten sie noch bis 24 Stunden vor der Schlachtung Futter. Ein Teil der Versuchsfische lagerte in Eis als Vollfisch, der andere Teil als ausgenommener Frischfisch. In diesem Falle wurden Eingeweide und Niere der Fische vollständig entfernt. Die Schlachtkörper wurden nach dem Ausnehmen im Institut gewaschen.

Die Untersuchungen im Winter 1999 erfolgten in 4 Durchgängen. Insgesamt kamen 264 Regenbogenforellen, 132 ausgenommene und 132 nicht ausgenommene, für die bakteriologische und die Frischegrad-Untersuchung zum Einsatz. Dabei wurden 120 Forellen für die mikrobiologischen Untersuchungen, 144 für die Frischegraduntersuchung verwendet. Sie besaßen ein Körpergewicht zwischen 310 g und 525 g (x = 378 g).

Die „Winterforellen“ im ersten Zeitraum der Untersuchung waren vor Ort in der Zuchtanlage mit zwei verschiedenen, zur Zeit für Salmoniden zulässigen Betäubungsverfahren (Kopfschlag und CO2-Betäubung) in einen Zustand der Empfindungslosigkeit versetzt und unmittelbar danach durch einen Schnitt ins Herz und vollständiger Entblutung oder durch Ausnehmen getötet worden. Im Folgenden werden unter "leer" ausgenommene und unter "voll" bzw. "rund" nicht ausgenommene Fische verstanden. Die Temperatur des Teichwassers wurde zu allen Zeitpunkten gemessen und war aufgrund der unterschiedlichen Witterungsverhältnisse im Winter um wenige Grad Celsius (+ 5°C bis + 9,5°C) verschieden.

Die Regenbogenforellen für die Sensorik-Untersuchungen im Herbst 2000 ("Herbstforellen") stammten aus der Kreislaufanlage des Institutes. Insgesamt wurden 90 Fische 7 Tage vor der Schlachtung in ein Durchflussbecken (ca. 13°C Wassertemperatur) umgesetzt. Bei einem Teil der Untersuchungsfische wurde die Fütterung zu diesem Zeitpunkt eingestellt (genüchtert), die restlichen Tiere erhielten bis 24 Stunden vor der Schlachtung noch Futter (gefüttert). Die Betäubung erfolgte durch Kopfschlag, die Tötung durch einen Schnitt hinter dem Kiemenbogen und [Seite 52↓]Ausbluten (beidseitige Durchtrennung der Vena cardialis anterior) bzw. durch das unmittelbare Ausnehmen der Fische nach der Betäubung.

Die Regenbogenforellen für die bakteriologische Untersuchung im Sommer 2001 („Sommerforellen“) stammten ebenfalls aus dem erwähnten Zuchtbetrieb in Brandenburg. Zur bakteriologischen Beurteilung der Bauchhöhle fanden 3 Durchgänge statt. Insgesamt wurden 230 Fische zu diesem Zweck untersucht. Ein Teil dieser Fische wurde nach dem Betäuben durch Kopfschlag und dem Entbluten durch Kiemenschnitt nicht vor Ort in der Anlage sondern erst im Institut ausgenommen und unter Leitungswasser gewaschen. Diese Fische dienten für Untersuchungen zur Beurteilung der Schlachthygiene. Die Temperatur des Anlagenwassers betrug im Sommer 2001 zum Zeitpunkt der Untersuchungen ca. + 14°C.

3.1.2 Medien für bakteriologische Untersuchungen

Für die bakteriologischen Untersuchungen kamen nichtselektive und selektive Nährmedien und Verdünnungsmedien sowie im Anschluss an die Kultivierung Medien für biochemische Differenzierungsreaktionen der Gattungs- und Speziesdifferenzierung zum Einsatz. Die Tabellen 3 und 4 zeigen die Medien in der Übersicht. Die vollständigen Rezepturen finden sich im Anhang.

Folgende Reagenzien wurden für biochemische Bestätigungsreaktionen verwendet:

Tabelle 10: Verwendungszweck und Nährmedien zum Mikroorganismennachweis

Verwendungszweck/Erreger

Nährmedium

 

Nichtselektives Nährmedium

Verdünnungsmedien

0,1 % Peptonkochsalzlösung

 

0,1 % Peptonkochsalzlösung +0,75 %-Agar, abgefüllt in Verdünnungsröhrchen

 

0,1 % Peptonkochsalzlösung +0,75 %-Agar + 1 % NaCl, abgefüllt in Verdünnungsröhrchen

Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl

PC-Agar (OXOID CM 325): Plate Count Agar

 

Nährmedien mit Selektiveigenschaften

Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl und Shewanellen

Standard-I-Eisen-III-Citrat-Agar mit Natriumthiosulfatzusatz für SSO (specific spoilage organism- als sulfitreduzierende Shewanellen definiert) bei Zandergewebe

Pseudomonaden

GSP-Agar (MERCK 1.10230): Glutamat-Stärke-Phenolrot-Agar, Pseudomonaden-Aeromonaden-Selektivagar nach Kielwein

Vibrionen

 

Voranreicherung

Alkalisches Peptonwasser + 2 % NaCl

Selektive Anreicherung

Galle-Pepton-Bouillon zur selektiven Anreicherung

Selektivagar

TCBS-Cholera-Agar (OXOID CM 333) Thiosulfate citrate bile salt nach Nakanishi (1962), modifiziert von Kobayashi et al. (1963),

Aeromonaden

Ryan-Agar (OXOID CM 833)

 

Blutagar Nr.2 (OXOID CM 271) zur weiteren Ausdifferenzierung

Enterobacteriaceae

 

Selektivagar

VRBG-Agar (MERCK 10275): Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar nach Mossel

Anreicherung für MPN nur bei Zandergewebe

gepufferte Brillantgrün-Gallesalz-Lactose-Lösung (OXOID CM 31) zur Anreicherung im MPN-verfahren

Clostridien

 

Anreicherung nur bei

Zandergewebe

Hirn-Herz-Glucose-Bouillon (BHI-Bouillon) (OXOID CM 225) mit Eisensulfit bei Zanderdarmgewebe

Selektivagar

SCA-Agar (OXOID CM 587): Sulfit-Cycloserin-Azid-Agar bei Forellen

Listeria monocytogenes

 

Selektive Anreicherung

Fraser-Listeria-Selektiv-Anreicherungsbouillon (MERCK 1.10398)

Fraser-Listeria-Supplement (MERCK 1.10399)

Selektivagar zur Identifizierung

Oxford-Agar (MERCK 1.07004)

 

Palcam-Agar (MERCK 1.11755)

Salonellen

 

Voranreicherung

1 % gepuffertes Peptonwasser

Selektive Anreicherung

Rappaport Vassiliades (RV)-Anreicherungslösung (OXOID CM 669) Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium

Selektivagar zur Identifizierung

BPLS (MERCK 1.07237): Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar

 

XLD (MERCK 1.05287): Xylose-Lysin-Desoxycholat-Agar

Tabelle 11: Verwendungszweck und Nährmedien für biochemische Tests der Gattungs- und Speziesdifferenzierung

Verwendungszweck/Erreger

Nährmedien

Listerien

 

Anreicherung von Listeria spp.

TSYEB: Trypton-Soja-Hefe-Extrakt-Bouillon, Listeria-Anreicherungsmedium Basis, (OXOID CM 862) und Listeria-Anreicherungs-Selektiv-Supplement (OXOID SR 141)

Identifizierung von Listeria spp.

TSYEA: Trypton-Soja-Hefe-Extrakt-Agar, TSYEB plus Agar

Hämolysetest und CAMP-Test

Blutagar Nr.2 (OXOID CM 271)

Prüfung der Beweglichkeit

Beweglichkeitsmedium

Kohlenhydratabbau

Kohlenhydratbouillon (Xylose und Rhamnose)

Clostridien

 

Kultivierung von Clostridien

Blutagar Nr.2 (OXOID CM 271)

Aeromonaden

 

Kultivierung von Aeromonaden

Blutagar Nr.2 (OXOID CM 271)

Gattungsdifferenzierung

 

Oxidation/Fermentation von Kohlenhydraten

O/F-Agar-Basis mit Glucose (OXOID CM 883)

Oxidation von Mannit und Innosit, Ornithin- decarboxylaseaktivität

AHM: Aeromonas-hydrophila-Medium

Speziesdifferenzierung

 

Äskulinhydrolyse

Äskulinbouillon

Gas aus Glucose, Salicinfermentation und L-Arabinoseabbau

Hottinger-Bouillon

Lysin-Decarboxylaseaktivität

Ornithindecarboxylase- Arginindihydrolase-Testbouillon (Basis) (MERCK 1.06934) mit Lysinzusatz

Vibrionen

 

Kultivierung der Vibrionen

Columbia-Agar-Basis (OXOID CM 331) und Blutagar Nr.2 (OXOID CM 271)

Oxidation/Fermentation von Kohlenhydraten

O/F-Agar-Basis mit Glucose (OXOID CM 883)

Eisen-2-Zuckertest (Glucose-Lactosefermentation)

Kligler-Eisen-Nährboden (OXOID CM 33)

ONPG, β-Galactosidase-Aktivität

ONPG-Scheiben (OXOID DD 13)

Wachstum in Peptonwasser unterschiedlicher Salzkonzentration

1 %-iges Peptonwasser mit 0 %, 1 %, 3 %, 6 %, 8 %, 10 % NaCl

Arginin-Dihydrogenase-Aktivität

Ornithindecarboxylase- Arginindihydrolase-Testbouillon (Basis) (MERCK 1.06934) mit Argininzusatz (MERCK 1.01543.0050

Ornithin-Decarboxylaseaktivität

mit Ornithinzusatz (MERCK 1.06906.0025)

Lysin-Decarboxylaseaktivität

Ornithindecarboxylase- Arginindihydrolase-Testbouillon (Basis) (MERCK 1.06934) mit Lysinzusatz


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3.1.3  Reagenzien für die Untersuchung auf Nematoden

Zur Herstellung der Pepsinlösung wurde in einem 10 l PE-Kanister 62,5 ml 32 %-ige HCl-Lösung (MERCK 1.00313) mit 50 g Pepsin vermischt und mit lauwarmen Wasser auf 10 Liter aufgefüllt.

3.1.4 Reagenzien für die Untersuchung auf TVB-N (Methode L 10.00-3, §35 LMBG)

(c = Stoffmengenkonzentration, ó = Massenkonzentration, σ = Volumenkonzentration)

3.1.5 Teststämme als Kontrollstämme

Folgende Kontrollstämme wurden bei der bakteriologischen Untersuchung der Fische eingesetzt:

Aeromonas hydrophila ATCC 7966, Aeromonas caviae (Feldstamm)

Staphylococcus aureus DSMZ 1104 für die Durchführung des CAMP-Tests

Rhodococcus equi (Feldstamm) für die Durchführung des CAMP-Tests

Listeria monocytogenes (Feldstamm), Listeria innocua (Feldstamm), Listeria ivanovii (Feldstamm)

Enterobacter L8 (Feldstamm)

Clostridium perfringens ATCC 13124

Pseudomonas fluorescens (Feldstamm)


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Vibrio parahaemolyticus DSMZ 10027 (=ATCC 17802), Vibrio alginolyticus ATCC 17749, Vibrio vulnificus DSMZ 10143 (=ATCC 27562)

3.1.6 Geräte, Instrumente, Zubehör bakteriologische und sensorische Untersuchungen

Scherbeneisautomat (Fa. Maja) und Temperaturschreiber (Fa. Philipps)

80 x 55 x 45 cm isolierbare Transportkiste zum Transport der Fische ins Institut

55 x 30 x 25 cm Kunststoffkisten mit Abfluss zur Aufbewahrung der Fische in Eis

55 x 20 x 15 cm Styroporkisten mit Abfluss zur Aufbewahrung der Fische in Eis

Walkgerät zum Homogenisieren von Proben (Stomacher 400 der Fa. Seward)

Sterile Stomacherbeutel (Fa. Bagpage®)

Brutschränke, eingestellt auf + 25°C, + 30°C, + 37°C, + 44°C (Fa. Heraeus)

Kühlschränke (+ 7°C, + 2°C, - 20°C)

Reagenzglasschüttler (Fa. Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik)

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Fireboy der Fa. Tec No Mara)

Einwiegewaage (Fa. Sartorius)

Grobzerkleinerungsgerät (für TVB-N-Bestimmung), Ultra-Turrax (für TVB-N-Bestimmung)

UV-Lichtgerät (für Nematodenuntersuchung)

Mikroskop Axioskop (Fa. Zeiss), Plattenmikroskop (Fa. Zeiss) und weiße Lichtquelle

Folienschweißgerät (Fa. Werner Bonk, Bochum)

Anaerobiertöpfe, sterile 250 ml-Erlenmeyerkolben, Petrischalen, Reagenzgläser, 100 ml-Messkolben

Kunststoffbeutel aus sterilisierfestem Material zur Kochprobe (Kobusch Folien GmbH, Warburg)

Skalpelle, Schere, Pinzetten, Graduierte Pipetten (1 ml, 5 ml, 10 ml), Impfösen, Impfnadeln; Schablone für die Entnahme von Haut- und Muskelproben, 2 x 5 cm

250 ml verschließbare Kunststoffflaschen aus HDPE, (Fa. Nalge Nunc International, No. 2114-0008).


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3.2  Methodik

3.2.1 Transport und Lagerungsbedingungen der Fische

3.2.1.1 Ostseezander

Nach dem Anlanden wurden die Zander innerhalb einer Stunde in eisgefüllte temperaturisolierte Transportkisten verpackt und vom Fischgroßhandel ins Institut nach Berlin transportiert. Am Morgen nach dem Fang (entsprechend der 24-Stundenregelung bei Tagesfängen in § 4 FischHV) wurden den als ausgenommen bezeichneten Tieren die Bauchhöhlenorgane und das Nierengewebe entfernt und die Fische innen und außen mit Trinkwasser abgespült. Die rund zu lagernden Fische blieben ungewaschen. Die Eingeweide der ausgenommenen Fische wurden im Anschluß an das Ausnehmen für die parasitologische Untersuchung verwendet. Die Lagerung der Fische über ca. 14 Tage erfolgte, nach Gruppen getrennt, in mit Eis gefüllten, übereinander gestapelten Styroporkisten mit Wasserablauf bei + 2°C im Kühlraum der Fleischtechnologie des BgVV. Dabei waren die Fische vollständig mit Eis bedeckt. Bei Bedarf wurde geschmolzenes Eis ersetzt.

3.2.1.2 Regenbogenforellen

Der Transport der runden und z.T. vor Ort ausgenommenen Fische von der Rinnenanlage zum Institut erfolgte in mit Scherbeneis gefüllten isolierbaren Transportkisten mit einem Eis-zu-Fisch-Verhältnis von 1:1. Ohne Unterbrechung der Kühlkette wurden die Fische nach ihrer Ankunft im Institut in Styroporkisten umgepackt, vollständig mit Eis bedeckt und in einem Eis-zu-Fisch-Verhältnis von 1:1 unter schmelzendem Eis gelagert. Der Temperaturverlauf im Kühlraum der Fleischtechnologie und des Fischfleisches wurde mittels eines Temperaturschreibers kontinuierlich erfasst. Die Raumtemperatur betrug + 2°C, die Temperatur im Fischmuskel + 0,2-0,9°C.


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3.2.2  Sensorische Untersuchungen durch Frischegrad-Bestimmung und Kochprobe

3.2.2.1 Überblick

Das EU-Qualitätsklassifizierungsschema für Seefische nach der EG-Verordnung Nr.2406/96 über gemeinsame Vermarktungsnormen für Fischereierzeugnisse, (Stand: Februar 1997), Anhang I, A. Magerfische (siehe Literaturübersicht) lässt sich nicht ohne weiteres auf jede Fischart, insbesondere nicht auf die Süßwasserfische anwenden. In Anlehnung an dieses Schema wurden für eisgelagerte Regenbogenforellen und Zander Kriterien für äußere und innere Merkmale gesammelt und bewertet. Anhand der Einzelkriterien wurde dann ein Gesamteindruck gebildet, und die Fische wurden in Qualitätsklassen von E wie "Extra" bis C "verdorben" eingestuft. Die Klasse BC galt als Grenze der Verkehrsfähigkeit. Zur weiteren rechnerischen und graphischen Gestaltung und Interpretation der Ergebnisse wurden die Klasseneinteilungen in eine Punktebewertung von 9 bis 4 übersetzt. Unterhalb von 4 Punkten galt der Fisch als verdorben.

Bei jeder Fischart gingen den Hauptversuchen mehrere Vorversuche voran, in denen die unterschiedlichen Kriterien entwickelt und festgelegt und das Prüfpersonal geschult wurde. Ebenso wurde beim Kochprobenschema vorgegangen. Nach einigen Durchgängen, in denen die Prüfer Begriffe für Geschmack, Geruch, Textur und Aussehen der Fischfilets sammelten und definierten, wurden die Schemata für den Kochprobenvergleich in den Hauptversuchen herangezogen. Die Entwicklung des Schemas erfolgte in Anlehnung an ein für Kabeljau bereits bestehendes Verfahren in der Bundesforschungsanstalt für Fischerei in Hamburg.

3.2.2.2 Frischegrad-Bestimmung und Kochprobe bei Regenbogenforellen

Frischegrad: In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass das für Seefische vorhandene Schema für Regenbogenforellen modifiziert werden muss, da sich Süßwasserfische in einigen Punkten von Seefischen aufgrund der Lebensumstände wie Wassertemperaturen oder -beschaffenheit, des Nahrungsangebotes und der Körperzusammensetzung unterscheiden. In Vorversuchen wurden von einem Team [Seite 59↓]von 5-10 Prüfern Begriffe zu den einzelnen äußerlichen Merkmalen von Regenbogenforellen, wie der Beschaffenheit der Haut, Augen und Kiemen, dem Geruch der Kiemen und der Farbe und Konsistenz des Fleisches sowie zu den inneren Merkmalen, wie der Färbung der Bauchhöhle, der Festigkeit des Peritoneums und dem Geruch der offenen Bauchhöhle, definiert und gesammelt. Nach der Begriffsammlung wurden die Beschreibungen in eine zeitliche Abfolge gebracht und mit einer Klassen- bzw. Punktebewertung versehen. Die Begriffsbestimmung reichte z.B. bei der Beschreibung von Kiemenfarbe, -schleim und -form von rot, ohne Schleim, glatte Kontur über blass, viel Schleim, fransige Kontur bis hin zu braun, dicker Schleim und sehr fransige Kontur.

Bei den Regenbogenforellen wurden folgende Unterschiede zu den Seewasserfischen beschrieben, die sich in den Voruntersuchungen als Bewertungskriterien durchsetzten und in den Hauptversuchen zur Anwendung kamen:

Die Entwicklung der Hautfarbe während der Lagerung ist bei Regenbogenforellen kein eindeutiges Kriterium für den Frischeverlust. Entscheidender ist die Veränderung der Schleimbeschaffenheit auf der Haut. Das Peritoneum bei Seefischen ist dunkel und fest und lässt sich im Laufe der Lagerung zunehmend leichter mechanisch abreiben. Bei Regenbogenforellen ist es sehr dünn und durchsichtig und verliert im Laufe der Zeit an Festigkeit. Zur Prüfung der Festigkeit des Peritoneums werden die Seiten der Bauchwände gebogen, das Peritoneum zerreißt und die Gräten springen hervor. Bei Forellen stellt die Verfärbung der Bauchhöhle entlang der Mittelgräte ein gutes Frischegradkriterium dar. Kurz nach der Schlachtung und in den Tagen danach ist die Muskulatur entlang der Mittelgräte hell und glänzend, später wird sie dunkler und bräunlicher. Diese Entwicklung verläuft kontinuierlich, ist gut erkennbar und zeitlich einordbar.

Das Muskelfleisch von Regenbogenforellen wird während der Lagerung nicht so matt und stumpf wie das der Seefische. Veränderungen im Zuge der Lagerung sind kaum erkennbar. Abweichungen in der Farbe der Muskulatur können auch geschlechts-, alters- und fütterungsabhängig sein. Hier werden Veränderungen nur taktil (d.h. durch Druck spürbare Veränderungen der Muskulaturkonsistenz) wahrgenommen. Ein weiterer entscheidender Unterschied zu den Seefischen ist die Entwicklung des Geruches von Kiemen und Bauchhöhle. Regenbogenforellen können beim Verderb fruchtig und süß riechen. Ölige und schimmelige Gerüche sowie der durch NH3 und [Seite 60↓]TMA hervorgerufene fischige Geruch bei Seefischen können bei Regenbogenforellen nicht festgestellt werden. Insbesondere bei den runden Fischen stellen spezifische Geruchsentwicklungen ein wichtiges Frischekriterium dar. Tabelle 12 zeigt das fertige modifizierte Schema für die Klasseneinteilung bei der Frischegradbestimmung von Regenbogenforellen.

Tabelle 12: Modifiziertes Schema für die Bestimmung des Frischegrades von Regenbogenforellen in Anlehnung an das EU-Qualitätsklassifizierungsschema nach der EG-Verordnung Nr.2406/96 über gemeinsame Vermarktungsnormen für Fischereierzeugnisse.

  

Frischeklassen

  
 

Extra

A

B

C

  

Aussehen

  

Haut

Kräftig glänzend,

Schleim wasserklar

Matt,

Schleim trüb

Matt,

Schleim milchig

Matt,

Schleim bräunlich trüb

Augen

Glänzend,

konvex,

durchsichtig schwarz

Konvex mit eingesunkener Mitte, leichte Trübung

Flach, Pupille trüb

Eingesunken, Hornhaut milchig, Pupille trüb

Kiemen

Leuchtende Farbe ohne Schleim

Blassere Farbe, etwas klarer Schleim

Blass mit fleckiger Färbung, trüber Schleim

Blass oder fleckig, viel rötlicher bis brauner Schleim, Struktur-Auflösung

Färbung Peritoneum und

Bauchhöhle

Ohne Verfärbung

Leichte Verfärbung im vorderen Bereich

Gelbliche bis rosafarbene Färbung bis zum Grätenende

Dunkle, bräunliche Färbung

  

Beschaffenheit

  

Festigkeit Peritoneum

Fest anliegend

Anliegend

Ablösbar, zerreißt bei starkem Druck

Leicht ablösbar, Gräten springen bei Aufbiegen der Leibeshöhle vor

Muskelfleisch

Fest elastisch

Bauch und Rücken

Verminderte Elastizität, v.a. im Bauchbereich, Eindrücke verschwinden verzögert

Leicht weich, Eindrücke verschwinden nicht vollständig,

auch am Rücken auf Druck nachgebend und in großen Stücken zerfallend

Weich,

Eindrücke bleiben,

Muskel musig

Geruch Kiemen,

Geruch Leibeshöhle

Frisches Teichwasser

Neutral

Leicht abweich-ender, aber nicht unangenehmer Geruch: sauer, fruchtig, bitter stechend

Geruch blutig, fischig, stechend, verwesend, parfümig

Eine Stunde vor der Beurteilung des Frischegrades wurden die Regenbogenforellen aus dem Eis genommen und bei Raumtemperatur (+ 20°C) zur Untersuchung bereitgestellt. Ein Team von 4 bis 5 Personen beurteilte anhand des in den [Seite 61↓]Vorversuchen entwickelten Klassifizierungsschemas die äußere und innere Beschaffenheit der Versuchsfische. Als Kriterien der äußeren Beschaffenheit wurde das Aussehen der Augen (Turgor, Hornhauttrübung), der Haut (Farbe und Schimmer, Konsistenz und Farbe des Schleimes) und der Kiemen herangezogen, als Kriterien der inneren Beschaffenheit die Konsistenz des Muskels (Elastizität und Farbe) und der Kiemen (Farbe und Schleim) sowie der Geruch von Kiemen und Leibeshöhle. In den einzelnen Testreihen füllte jeder Prüfer ohne Absprache mit den anderen Prüfpersonen einen Bewertungsbogen aus. Die Merkmalskriterien wurden einzeln bewertet und dann aufgrund des Gesamteindrucks zu einer Gesamtbewertung zusammengefasst. Das Prüfverfahren war eine "Beschreibende Prüfung", wie sie in L 00.90-1 und L 00.90-6 der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG beschrieben ist. Aufgrund der Ergebnisse konnte anschließend ein spezifischer Bewertungsbogen zur Bestimmung des Frischegrades von Regenbogenforellen (Tabelle 13) erstellt werden. Bei der Klasseneinteilung bedeutet die Klasse E Extra-Qualität, A ist gute Qualität, B ist akzeptable Qualität, und in die Klasse C wurden die Fische eingeordnet, die nicht mehr als verkehrsfähig einzustufen sind. Abweichend vom EU-Schema wurden Zwischenstufen verwendet, um auch kleinere Unterschiede zwischen leeren und vollen Fischen erfassen zu können. Anschließend wurden die Ergebnisse der Qualitätsklassifizierung in Punktzahlen umgewandelt, um die Daten rechnerisch auswerten zu können. Die Klassen erhielten folgende Punktzahlen:

Klasse

E

EA

A

AB

B

BC

C

Punkte

9

8,25

7,5

6,75

5

4

3

Die Klasse BC mit 4 Punkten bildete die Grenze der "Verkehrsfähigkeit". Ab diesem Zeitpunkt ist der Fisch noch verzehrsfähig, es besteht aber keine Restlagerzeit mehr und der Fisch darf nicht mehr zum Verkauf angeboten werden. Ab 3 Punkten wurde die Grenze der "Verzehrsfähigkeit" überschritten, und der Fisch als "Substandard" bezeichnet.

Tabelle 13: Bewertungsbogen für die Bestimmung des Frischegrades von Forellen, Herbst 2000.

  

leer

    

voll

    
 

Fisch

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

Gewicht

           

Gewicht 2*

           

Geschlecht

           

Schleim

klar

          
 

leicht trüb

          
 

trüb

          
 

trüb verfärbt

          

Augen

konvex / schwarz

          
 

flach / schwarz

          
 

flach / leicht trüb

          
 

flach / trüb

          
 

eingesunken / trüb

          
 

eingesunken/ milchig

          

Kiemen Farbe / Schleim

leuchtend rot / ohne

          

blasser / klar

          

blutrot od. fleckig /trüb

          

Auflösung / verfärbt

          

Muskel Elastizität Rücken

fest elastisch

          

elastisch

          

weich

          

sehr weich

          

Muskel Elastizität Bauch

fest

          

weicher

          

sehr weich

          

Kiemen Geruch

frisch

          

neutral

          
 

leicht abweichend

          
 

unangenehm

          

Bauchhöhle Geruch

frisch

          

neutral

          
 

leicht abweichend

          
 

unangenehm

          

Bauchhöhle Verfärbung

ohne, leuchtend

          

bräunlich, matt

          
 

fleckig, intensiv

          
 

ausgedehnt, intensiv

          

Muskel / Peritoneum Festigkeit

nicht zerreißbar

          

schwer zerreißbar

          

leicht zerreißbar

          

löst sich von selbst

          

GESAMT Punkte 0-9

9 - 8: frisch

          

7 - 5: akzeptabel

          

4 : eßbar, keine Reserve

          

3 – 0: verdorben

          


[Seite 63↓]

Für die Frischegradbestimmung wurden bei den "Winterforellen" 1999 insgesamt 72 runde und 72 ausgenommene Fische untersucht. Im Herbst 2000 wurde die Bestimmung des Frischegrades an weiteren 90 Regenbogenforellen aus der Kreislaufanlage des BgVV wiederholt. Hierbei sollte neben dem Kriterium des Ausnehmens auch der Einfluss der Fütterung auf den Frischegrad und die sensorischen Eigenschaften der Fischfilets durch eine Kochprobe untersucht werden. Zur Untersuchung standen jeweils 4 bis 5 Prüfer zur Verfügung. Die Frischegrad-Beurteilung (visuell, olfaktorisch und taktil) der äußeren und inneren Beschaffenheit der gelagerten Forellen erfolgte folgendermaßen:

Tabelle 14: Sensorische Untersuchungen (Frischegradbestimmung und Kochprobe) bei Regenbogenforellen, Winter 1999 und Herbst 2000

Versuch

Untersuchungstag

Anzahl Fische pro Tag

  

leer

rund

1999 Winter Gruppe 1 bis 4

1, 3, 7, 10, 13, 15

3

3

2000 Herbst Gruppe 1-nüchtern

4, 7, 9, 11

5

5

2000 Herbst Gruppe 2-nüchtern

7, 9

5

5

2000 Herbst Gruppe 3-gefüttert

1, 4, 7

5

5

In den Herbstuntersuchungen diente ein 2 bis 3 Tage zuvor geschlachteter und ausgenommen gelagerter genüchterter „Referenzfisch“ als Bezugsgröße.

Kochprobe: Als Erweiterung zu den Untersuchungen im Winter 1999 wurde neben der Frischegradbestimmung auch eine sensorische Beurteilung der Filets durch eine Kochprobe durchgeführt. Dazu wurden alle Fische filetiert, die Filets in hitzefeste Kunststoffbeutel eingeschweißt, kodiert und bei + 90°C im Wasserbad in etwa 10 Minuten gegart.

In Vorversuchen, sog. "Kochproben-Seminaren" erfolgte analog zu der Entwicklung eines Frischegradschemas die Definierung und Sammlung von geeigneten Begriffen zur Beschreibung von Geruch, Geschmack, Textur und Aussehen der gegarten Filets. Die Prüfer ermittelten gemeinsam die am besten zutreffenden Begriffe und übten das Er-Schmecken und Er-Riechen der feinen Unterschiede. Das entwickelte Kochprobenschema (Tabelle 15) diente in den Hauptversuchen als Bewertungsgrundlage.

Tabelle 15: Kochprobenschema Forellen Herbst 2000

Punkte

Empfindung

Geruch

Aussehen

Geschmack

Mundgefühl

Punkte

100

.

.

90

.

.

80

.

.

70

.

.

.

60

.

.

.

.

50

.

.

.

40

.

.

.

.

<30

angenehm

Aromatisch,

frischer Fisch /

Teich

glatt, glänzend,

elastisch,

aromatisch,

frischer Fisch

saftig,

elastisch-fest,

100

.

.

90

.

.

80

.

.

70

.

.

.

60

.

.

.

.

50

.

.

.

40

.

.

.

.

< 30

 

süßlich,

gekochte

Kartoffeln

Myomere

deutlich

getrennt

süß, gekochte

Kartoffel, mild

weniger saftig,

neutral

brotig, nussig

bis neutral

weicher,

feuchter

neutral, buttrig,

nussig

fester, faserig

leicht abweichend

Dumpf,

abgestandenes

Wasser, Tang

weich,

Flüssigkeit tritt

aus,

fade,

etwas fremd

zart,

weich, etwas

wäßrig

 

säuerlich,

schwach bitter

und tranig

geronnenes

Eiweiß auf der

Oberfläche

dumpf,

säuerlich, bitter,

etwas tranig

Strukturverlust,

wenig faserig

deutlich abweichend

modrig,

metallisch,

stechend,

deutlich fremd

gummiartig,

deutlich grau

oder braun,

schleimig

deutlich fremd

stark wäßrig,

klebrig,

krümelig

nicht eßbar

sauer, stark

stechend und

abweichend,

faulig

 

hohl,

stark bitter,

stark tranig,

stark abweichend

breiig,

strukturlos,

mehlig

     

Die Verkostung erfolgte durch 5 Prüfer. Geruch, Aussehen, Mundgefühl und Geschmack der Filets wurden bewertet. Die Prüfung verlief folgendermaßen: Die in den Kunststoffbeuteln gegarten Filets wurden zum Ablauf des Wassers in einen Fritiersieb geschüttet und nach dem Abtropfen der Flüssigkeit auf einen Teller gelegt. Jeder Prüfer nahm sich ein ca. 3 cm langes Stück. Nach der Beurteilung des Geruches und des Aussehens der Filetproben wurde diese anschließend verkostet, um Geschmack und Mundgefühl zu beurteilen. Neben den Einzelbewertungen vergaben die Prüfer eine Gesamtnote, um die subjektive Gewichtung der Einzelkomponenten zu erfassen. Fangfrische Fische wurden mit 100 Punkten bewertet, die Grenze der Verzehrsfähigkeit war mit 30 Punkten unterschritten.


[Seite 65↓]

Auswertung von Frischegradbestimmung und Kochprobe:

Die einzelnen Prüferbewertungen je Fisch und untersuchtem Merkmal wurden für die Auswertung der Frischegrad-Prüfung zusammengefasst. Aus diesen je 3 bzw. 5 Fischbewertungen wurden dann der Mittelwert der Gruppe „ausgenommen“ bzw. „rund“ sowie die Standardabweichungen errechnet und mit Hilfe des Student-t-Testes für verbundene Stichproben (zweiseitig, p < 0,05) auf Unterschiedlichkeit geprüft.

Um einen möglichen Einfluss des Nüchterungsgrades auf die Frischegrad- und Kochprobenergebnisse zu untersuchen, wurden bei den Untersuchungen im Herbst 2000 die Mittelwerte der Tage 4 und 7 der Gruppe „nüchtern“ bzw. „gefüttert“, jeweils für ausgenommene und nicht ausgenommene getrennt, miteinander verglichen. Da die Prüfung der beiden Gruppen nicht gleichzeitig, sondern im Abstand von 14 Tagen stattfand, kam hier der t-Test für unabhängige Stichproben (zweiseitig, p <  0,01) bei beiden Untersuchungen zur Anwendung.

3.2.2.3 Frischegrad-Bestimmung und Kochprobe bei Zander

Die Frischegrad- und Kochproben-Prüfung beim Zander wurde mehrfach verschoben, da im Fanggebiet vor der Insel Usedom, woher die Fische für die Vorversuche und für die mikrobiologischen Untersuchungen stammten, keine Zander in ausreichender Zahl gefangen wurden. Aus diesem Grunde wurde eine Gruppe aus einem anderen Fanggebiet (Darßer Bodden bei Ribnitz/Damgarten) mit 21 Fischen von erheblichem Gewicht gekauft (Gruppe 4). Die Fische waren beim Eintreffen schon drei Tage unausgenommen gelagert worden und wiesen zu diesem Zeitpunkt bereits Veränderungen in der Bauchhöhle durch Autolyse auf. Je Untersuchungstag standen nur 3 ausgenommene und 3 runde Fische zur Verfügung.

Der Versuch wurde einen Monat später wiederholt, diesmal wieder mit Fischen aus dem Bodden bei Usedom (Gruppe 5). Es standen je 5 ausgenommene und runde Fische pro Untersuchungstag zur Verfügung. Diese wurden am Tag des Fanges nach Berlin in Eis transportiert und am nächsten Morgen ausgenommen und gewaschen.

Sowohl das Frischegradschema als auch der Beurteilungskatalog für die Kochprobenbeschreibungen wurden ebenso wie bei den Forellen in Vorversuchen [Seite 66↓]entwickelt. Begriffe wurden gemeinsam von allen Prüfern gesammelt und für die einzelnen Kriterien festgelegt.

Im Unterschied zum Frischegradschema für Forellen wurden einige Kriterien weiter aufgeteilt. So wurde bei der Beurteilung der Augen in Augapfel und Hornhaut unterschieden, da Veränderungen bei Augapfel und Hornhaut getrennt auftreten konnten und zu unterschiedlichen Lagerungszeiten beobachtbar und bewertbar waren. Eine Schwierigkeit ergab sich hierbei bei der Feststellung der Augentrübung durch die reflektierende Netzhautschicht ("Tapetum lucidum"). Auch ein Einsinken der Augäpfel durch die Schwerkraft beim oberen Auge führte zu unterschiedlichen Bewertungen der beiden Augen eines Fisches. Farbe und Schleimbeschaffenheit der Kiemen wurden in zwei Bewertungskategorien eingeteilt, da die Entwicklung des Kiemenschleimes im Laufe der Lagerung unabhängig von der Kiemenfarbe verlief. In den ersten Tagen der Lagerung galt auch die Festigkeit der Schuppen als Frischekriterium. Ein weiterer grundlegender Unterschied zwischen Forellen und Zandern ergab sich am Peritoneum, welches beim Zander grauer, dicker und fester als bei der Forelle war. Die Ablösbarkeit des Peritoneums stellte hier neben der damit einhergehenden Farbveränderung der Bauchlappen (Graugelbfärbung) ein besseres Kriterium dar als bei der Forelle.

Die Frischegraduntersuchung erfolgte in beiden Versuchsgruppen durch drei bis vier Prüfer anhand des in Tabelle 16 aufgeführten Schemas. Analog zu der Frischegradbewertung bei den Forellen wurde die Gesamtnote in Punkten von 3 bis 9 verteilt, fangfrische Fische erhielten 9 Punkte, und 4 Punkte stellten die Grenze der Verkehrsfähigkeit dar.

Zusätzlich wurden Kriterien wie das Geschlecht, die Füllung und der Zustand des Darmes sowie die Bildung von Flüssigkeit im Bauchraum beobachtet.

Tabelle 16: Bewertungsbogen für die Bestimmung des Frischegrades von Zander

  

ausgenommen

rund

  

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

Haut

Schuppen fest ja/nein

          

Schleim

klar

          

Farbe

leicht trüb

          
 

milchig

          
 

flockig / verfärbt

          

Augapfel

prall

          
 

noch konvex

          
 

hlach

          
 

eingesunken

          

Hornhaut

klar

          
 

matt, bläulich

          
 

milchig

          

Kiemen

blutig ja / nein

          
 

Fremdstoffe ja / nein

          

Kiemen

rot

          

Farbe

blaß

          
 

gelb / fleckig

          
 

stark verfärbt

          

Kiemen

ohne

          

Schleim

etwas klar

          
 

leicht trüb / rötlich

          
 

stark getrübt

          
 

verfärbt / dick

          

Kiemen

frisch, Tang

          

Geruch

neutral

          
 

leicht abweichend

          
 

unangenehm

          
 

stinkend

          

Elastizität

elastisch

          
 

weicher

          
 

sehr weich

          

Organe/

intakt

          

Fett

angedaut

          
 

aufgelöst

          

Bauch

frisch, Tang

          

Geruch

neutral

          
 

leicht abweichend

          
 

unangenehm

          
 

stinkend

          

Peritoneum

fest anliegend

          
 

ablösbar

          
 

leicht ablösbar

          

Bauchlap-

rosa

          

pen

grauweiß

          

Farbe

gelblich / wächsern/ fleckig

          

Gesamtnote

9-8: sehr frisch

          
 

7-5: tauglich

          
 

4: grenzwertig

          
 

3-0: verdorben

          


[Seite 68↓]

Da es sich um verbundene Stichproben mit ordinalen Daten handelt (ein Prüfer beurteilte beide Gruppen), wurden die Mittelwerte für die jeweilige Gruppe je Prüfer gebildet und die mittlere Bewertung aller Prüfer pro Gruppe sowie jeweils die Differenzen zwischen ausgenommenen und runden Fischen pro Prüfer errechnet.

Für die Kochprobe der Filets wurden die Zander im Anschluss an die Frischegrad-Beurteilung filetiert. Ein ausreichend großes Stück des Rückenfilets wurde in einen kochfesten Folienbeutel eingeschweißt und in 10 bis 12 Minuten bei + 90°C im Wasserbad gegart. In den Vorversuchen entstand nach einigen Runden der Begriffssammlung der in Tabelle 17 wiedergegebene Bewertungsbogen, mit dessen Hilfe die Beurteilung durch 4 bis 7 Prüfer in verdeckter Bewertung mit kodierten Proben erfolgte.

Tabelle 17: Bewertungsbogen für die Bestimmung der Filetbeschaffenheit von Zandern durch die Kochprobe

Punkte

Geruch

Aussehen

Mundgefühl

Geschmack

Punkte

100

Fisch, Seewasser, schwach süß

weiß/elfenbein,

fest-elastisch,

Myomer zusammenhängend

fest, trocken

Seewasser, schwach Fisch

100

80

Muscheln, grüne Pflanzen, Stärke, Kartoffel

elastisch-fest,

saftig

mild aromatisch, Stärke, Kartoffel

80

70

neutral

weicher, Myomer teilt sich

trocken,

weniger fest

sahnig, buttrig, neutral

70

60

gekochtes Gemüse, würzig

Flüssigkeit tritt auf Druck aus

zart

fade, gemüsig

60

50

dumpf, säuerlich

sehr weich, geronnenes Eiweiß

weich,

etwas wäßrig

dumpf, leicht sauer/bitter

50

40

muffig, sauer, fruchtig süßlich, leicht bitter /metallisch/ stechend

gelblich-grau,

musig,

viele kleine Fasern

sehr weich,

wäßrig

schal, muffig,

deutlich abweichend

40

30

stark sauer, bitter, metallisch, stechend

gelb, grau, braun, glasig, matschig

musig,

stark wäßrig

sauer, bitter, metallisch

30

 

bittere Nüsse

    

0

seifig, faulig, Kohl

 

breiig

faulig, seifig

0

Kriterien

angenehm

neutral

unangenehm

Farbveränderung,

Verlust Faser-zusammenhalt

Verlust Wasserbindung, Festigkeit

angenehm

neutral

unangenehm

 


[Seite 69↓]

Der Geruch wurde im Laufe der Lagerung mit Begriffen ausgehend von Fisch und Seewasser über gekochtes Gemüse und dumpf säuerlich bis hin zu muffig, bitter-nussig und seifig, faulig, kohlartig beschrieben. Ähnliche Begriffe ließen sich für den Geschmack finden, von Seewasser über fade, gemüsig bis zu bitter, metallisch und faulig. Das Aussehen entwickelte sich von weiß/elfenbeinfarben und fest-elastisch über weich mit geronnenem Eiweiß bis zu einem grauen, braunen und glasigen Aussehen und matschiger Konsistenz. Das Mundgefühl veränderte sich von fest-trocken über zart, weich-wäßrig zu einem musigen und breiigen Empfinden beim Kauen. Für ausgenommene und runde Fische wurden die Mittelwerte je Prüfer gebildet und verglichen.

3.2.3 Probenentnahme für bakteriologische, chemische und parasitologische Untersuchungen

3.2.3.1 Probenentnahme bei Zandern

Die bakteriologischen Untersuchungen erfolgten an den Versuchsfischen der Gruppe 3. An den Lagerungstagen 1, 3, 7, 11 und 14 wurden jeweils 5 leere und 5 volle Fische den Eislagerkisten entnommen. Es wurden Proben von der Haut, der Rückenmuskulatur und bei vollen Fischen vom Darm genommen. Tabelle 18 zeigt das Probenentnahmeschema sowohl für die mikrobiologischen als auch für die parasitologischen und chemischen Untersuchungen.

Tabelle 18: Probenentnahmeschema der Untersuchungen an Ostsee-Zander, Gruppe 3 (Januar 2001), BU- Bakteriologische Untersuchung (GKZ, SSO, Pseudomonaden)

 

Untersuchung

Tag

ListeriaVibrio

Aerom.

BU Haut

BU Darm

BU Muskel

Clostridien

(in Darm und Bauchlappen)

Enterobac-teriaceae Haut/Darm

TVBN

Anisakis Einge-weide

Anisakis Musku-latur

0

x

        

1

 

x

x

x

x

 

x

x

x

3

   

x

   

x

x

7

 

x

x

x

 

x

x

x

x

8

    

x

  

x

x

11

 

x

x

x

  

x

x

x

14

 

x

  

x

 

x

x

x


[Seite 70↓]

Zur Entnahme der Hautprobe wurde eine sterile Papierschablone mit 10 cm² Fläche craniolateral der Rückenflosse auf die Haut gelegt, mit sterilem Besteck umschnitten und abgezogen. Die Papiervorlage ging zusammen mit der Hautprobe in die weitere Probenaufbereitung mit ein.

Zur Entnahme der Muskelprobe wurde die Haut auf der Rückenoberseite hinter dem Kopf großflächig aufgeschnitten, abgezogen und in 0,5 cm Abstand von den Schnittstellen 10 g Muskelgewebe entnommen. Es wurde besonders darauf geachtet, nicht die Schnittfläche von der Hautentnahme einzubeziehen.

Zur Entnahme der Darmprobe wurde der Bauch der vollen Fische halbkreisförmig aufgeschnitten und nach unten aufgeklappt (Abbildung 3), so dass eine Darmprobe leicht entnommen werden konnte, ohne Organe und Bauchhöhle zu kontaminieren. Ein Teil des Enddarmes wurde von dem restlichen Darm und den Eingeweiden abgeschnitten, davon 10 g eingewogen und für die Untersuchung herangezogen. Die Proben dienten dem quantitativen Nachweis von aerober GKZ, Shewanellen, Pseudomonaden und Enterobacteriaceae.

Abbildung 3: Runder Bauchschnitt bei der Entnahme der Darm- und der Bauchlappenproben, Schnittstelle (.......)

Für qualitative Untersuchungen auf die humanpathogenen Keime Listerien, Vibrionen und Aeromonaden wurde die Haut der Fische auf eine mögliche äußerliche Keimbelastung mit Hilfe von Tupferproben untersucht. Diese Untersuchungen erfolgten nur am ersten Tag. Unmittelbar nach dem Umladen der Fische in die Transportkisten wurde von 10 Fischen ein Hautabstrich mit einem Wattetupfer genommen für den Nachweis von Aeromonaden und Vibrionen. Mit einem weiteren Tupfer wurde ebenso bei der Listerienbestimmung vorgegangen.

Ein Vorhandensein von anaeroben humanpathogenen Clostridien wurde qualitativ geprüft im Bauchraum und im Darm der Fische, um festzustellen, ob Clostridien im [Seite 71↓]Bauchraum vorkommen können und ob während der Lagerung eine Vermehrung stattfinden kann. An den Untersuchungstagen 1, 8 und 14 wurden nach dem Aufschneiden des Bauches der 5 vollen Fische je 2 Tupferproben der Bauchlappeninnenwände und je 2 x 1 g des Enddarms (Gewebe + Darminhalt) entnommen.

Nach der Entnahme der Haut-, Darm- und Rückenmuskelproben und der Bauchlappenmuskel-Tupferproben für die bakteriologische Untersuchung wurden zur parasitologischen Untersuchung der gesamte Magen-Darm-Trakt entnommen sowie die enthäuteten Filets und die Bauchlappen. Ferner gingen komplette enthäutete Rückenfilets in die Untersuchung auf den TVB-N-Gehalt ein.

3.2.3.2 Probenentnahme bei Regenbogenforellen

Die Orte der Probenentnahme sowie die Probenmatrizes bei den Regenbogenforellen variierten während des gesamten Untersuchungszeitraumes. Beim ersten Versuchsabschnitt im Winter 1999 wurden Hautproben und Muskelproben des vorderen Rückenmuskels genommen. Bei den späteren Versuchen mit Forellen im Sommer 2001 wurde die Haut, der Darm und das Bauchlappenmuskelgewebe untersucht, um gezielt die Vorgänge im runden Fisch zu beobachten.

Für die bakteriologischen Untersuchungen im Winter 1999 wurden in 4 Durchgängen insgesamt 60 volle und 60 leere Fische untersucht. Pro Versuchsdurchgang kamen 15 leere und 15 volle Fische zum Einsatz. Die Keimbelastung der ausgenommenen und nicht ausgenommenen Fische wurde an den Lagerungstagen 0, 7, 10, 13, 15 ermittelt. An jedem Beprobungstag wurden 5 ausgenommene und 5 nicht ausgenommene Fische untersucht. Dabei konnte aus einem Fisch an 2 aufeinanderfolgenden Versuchstagen jeweils eine Probe entnommen werden.

Mit Hilfe einer sterilen Schablone mit einer eingestanzten rechteckigen Öffnung (5 x 2 cm) aus Metall, sterilem Skalpell und Pinzette wurden vorsichtig 10 cm2 Haut abpräpariert und 10 g des darunter liegenden Muskelgewebes aus dem vorderen Teil der Rückenmuskulatur des Fisches entnommen. Die auf diese Weise gewonnenen Proben dienten dem Nachweis von Gesamtkeimzahl, Pseudomonaden, Aeromonaden, Enterobacteriaceae, Clostridien.


[Seite 72↓]

Für den qualitativen Listeriennachweis wurde an den Lagerungstagen 0 und 15 mit einem sterilen Wattetupfer bei jeweils 5 runden und 5 leeren Fischen eine 10 cm² große Hautoberfläche betupfert und an den Lagerungstagen 7, 10, 13 und 15 jeweils 10 g Gewebe mit der oben beschriebenen Methode entnommen. Darüber hinaus wurden in der Teichwirtschaft Tupferproben von Beckenrändern, Arbeitsplatte und Geräten zum Ausnehmen der Fische genommen, um eine Kontamination der Umgebung mit Listerien zu überprüfen.

Für den Salmonellennachweis wurde ebenfalls am 0. und 15. Tag der Lagerung eine Tupferprobe der Haut und eine Muskelprobe gezogen, um festzustellen, ob die Fische am Anfang der Untersuchung Salmonellen enthielten und ob diese sich während der Lagerungsdauer vermehren konnten.

Für die bakteriologischen Untersuchungen an den „Sommerfischen“ im Sommer 2001 wurden in 3 Durchgängen Proben vom Darmgewebe und von der Bauchlappenmuskulatur genommen. Hierbei ging es in erster Linie darum, mikrobielle Vorgänge im Bauchraum zu beobachten. Zusätzlich wurde beim ersten Durchgang eine 2 x 5 cm große Hautprobe aus dem vorderen Dorsalbereich geschnitten, um die äußerliche Bakterienbelastung der Sommerfische mit der Belastung der Winterfische vergleichen zu können. In der Tabelle 19 sind die Einzelheiten der Untersuchungen und die unterschiedlichen Fragestellungen der 3 Durchgänge aufgeführt.

Für die Entnahme der Darm- und Bauchlappenproben wurde wie bei der Entnahme der Darmproben bei den Zandern vorgegangen. Der Bauch des Fisches wurde durch einen Rundschnitt steril eröffnet. Der gesamte Darm ging in die Untersuchung ein. Im Durchschnitt wogen die untersuchten Därme 4,1 +/- 1,17 g. Nach der Entfernung der Eingeweide wurde ca. 2 bis 3 Gramm Muskelgewebe unterhalb des hinteren Darmabschnittes aus dem Bauchlappen steril entnommen. Bei den bereits ausgenommenen Fischen wurde der obenliegende Bauchlappen entfernt, so dass die Liegeseite des Fisches nach Entfernung der Gräten beprobt werden konnte.

Der qualitative Listeriennachweis erfolgte anhand von 10 Hauttupfern als Eingangsuntersuchung nach der Ankunft der Fische im Institut. Ebenso wurden für den Salmonellennachweis an jedem Probenentnahmetag von 5 Fischen mit Tupfern Hautabstriche gemacht sowie Darmproben 5 voller Fische gepoolt.


[Seite 73↓]

Tabelle 19: Bakteriologische Untersuchungen an Regenbogenforellen im Sommer 2001, Probenahme und Untersuchungen in 3 Durchgängen

Versuch

Fragestellung

Anzahl Fische

Proben-entnahme-tage

Fische pro

Untersuchung

Untersuchungs-spektrum, Keime

leer

rund

I

Juni 2001

Ermittlung des Keimstatus im Sommer im Vergleich zur Winterbelastung

25

25

1, 4, 7, 11, 13

5 leere, 5 volle;

Haut, Darm, Bauchlappen

GKZ, Listeria,

Pseudomonaden, Enterobacteriaceae,

Salmonella,

II

Juli 2001

Ermittlung des genauen Übertritts von Keimen aus dem Darm in Bauchhöhle

-

80

0, 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8

10 runde; Darm, Bauchlappen

GKZ

III

August 2001

Einfluss der Schlachthygiene auf die Keimbelastung der Bauchhöhle

40 (+20)

60

(20)

0, 3, 6, 9

10 runde, 10 leere

10 rund-leere an Tag 6 und 9; Darm, Bauchlappen

GKZ

Durchgang III: als rund-leer werden Fische bezeichnet, die erst 6 Tage rund lagerten, dann ausgenommen wurden und als leere Fische an den Probenahmetagen 6 und 9 untersucht wurden, als Zahlen in Klammern dargestellt

3.2.4 Mikrobiologische Untersuchungen

Die mikrobiologischen Untersuchungen dienten einerseits der Erfassung von Verderbniserregern und deren Entwicklung auf Fischgewebe, andererseits der Ermittlung des Vorkommens einiger humanpathogener Keime und Indikatorkeime auf der Haut, in der Muskulatur und im Darm von gelagerten Fischen.

Tabelle 20 zeigt das Keimspektrum, welches bei den unterschiedlichen Versuchsgruppen und Fischarten untersucht worden ist. Dabei wird in einen qualitativen und einen quantitativen Nachweis unterschieden. Einige Keimarten wie die Clostridien und die Aeromonaden wurden je nach Fischart entweder qualitativ oder quantitativ nachgewiesen.

Tabelle 20: Keimspektrum bei der Untersuchung von Regenbogenforelle und Zander

 

quantitativ

qualitativ

 

GKZ

Pseudo-

monaden

Shewanel-len

Entero-

bacteriaceae

Aeromo-naden

Clostridien

Salmonel-

len

Listerien

Vibrionen

Aeromo-naden

Clostridien

Winterforelle

H

x

x

 

x

x

x

x

x

   

RM

x

x

 

x

x

x

x

x

   

Sommer-forelle

H

x

x

 

x

  

x

x

   

BL

x

x

 

x

       

D

x

x

 

x

  

x

    

Zander

H

x

x

x

x

   

x

x

x

 

RM

x

x

x

        

D

x

x

x

x

      

x

BL

          

x

H = Haut, RM = Rückenmuskel, BL = Bauchlappengewebe, D = Darm, GKZ = aerobe Gesamtkeimzahl

Zur Feststellung des Keimstatus von Regenbogenforellen in den Sommermonaten im Vergleich zu den Winterfischen umfasste das Keimspektrum im ersten der drei Durchgänge neben den Verderbsparametern aerobe Gesamtkeimzahl und Pseudomonaden auch die Enterobacteriaceae und humanpathogene Keime wie Salmonellen und Listerien.

In der Tabelle 21 ist das Untersuchungsspektrum für den ersten Durchgang der Untersuchungen im Sommer 2001 zusammengefasst.

Tabelle 21: Untersuchungsspektrum der qualitativen und quantitativen Keimerfassung bei Regenbogenforellen, Durchgang Nr. 1 im Sommer 2001

Tag der Lagerung

Tag 1

Tag 4

Tag 6

Tag 8

Tag 11/12

Qualitativ

Listerien (H)

Salmonellen (H,D)

Salmonellen (H,D)

Salmonellen (H,D)

Salmonellen (H,D)

Salmonellen (H,D)

Quantitativ

(H, D, BL) aerobe GKZ, Pseudomonas, Enterobacteria-ceae

(H, D, BL) aerobe GKZ, Pseudomonas, Enterobacteria-ceae

(H, D, BL) aerobe GKZ, Pseudomonas, Enterobacteria-ceae

(H, D, BL) aerobe GKZ, Pseudomonas, Enterobacteria-ceae

(H, D, BL) aerobe GKZ, Pseudomonas, Enterobacteria-ceae

H = Haut, D = Darm, BL = Bauchlappen, GKZ= Gesamtkeimzahl


[Seite 75↓]

3.2.4.1  Probenaufbereitung für die mikrobiologische Untersuchung

Die Probenaufbereitung und -untersuchung verlief für den jeweiligen Mikroorganismennachweis bei allen Untersuchungen ähnlich; Abweichungen werden für die jeweilige Versuchsgruppe einzeln erwähnt.

Die Probenaufbereitung der Haut-, Darm- und Muskelproben für die Bestimmung von GKZ, Shewanellen, Pseudomonaden, Enterobacteriaceae und bei den Forellen der Winteruntersuchung außerdem auch für die Clostridien und die Aeromonaden erfolgte nach dem amtlichen Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, L 06.00-16. Nach einer 1:9- Erstverdünnung der Haut-, Muskel- und Darmproben mit 0,1 %-igem Peptonwasser wurden die Proben in sterile Stomacherbeutel gegeben und 2 Minuten in einem Beutel-Walkmischgerät homogenisiert. Aus 1 ml der so erhaltenen Erstverdünnung wurde eine dezimale Verdünnungsreihe hergestellt für die weitere Keimzahlbestimmung nach unterschiedlichen Methoden. Das Peptonwasser für die Dezimalverdünnungen beim Zandergewebe enthielt zusätzlich 1 % NaCl, da die untersuchten Organismenarten z.T. zum Wachstum eine Mindest-Salzkonzentration benötigen.

Die Probenaufbereitung für den qualitativen Nachweis für Listerien bei beiden Fischarten fand nach der Methode DIN EN ISO 11290-1 statt. Die Tupferproben der Haut wurden in Röhrchen mit 10 ml des ersten selektiven Anreicherungsmediums 1/2-Fraser-Bouillon gegeben und 10 g des Forellenmuskelgewebes in 90 ml des Anreicherungsmediums gelegt und 24 Stunden bei + 30°C bebrütet. Nach Ablauf der ersten Bebrütung wurde das zweite Anreicherungsmedium Fraser-Bouillon mit vollständiger Konzentration an selektiven Agentien mit 0,1 ml der ersten Anreicherung beimpft und 48 Stunden bei + 37°C bebrütet.

Für die Probenaufbereitung des Salmonellennachweises bei den Forellen der Sommer- und der Winterdurchgänge wurden die Tupferproben der Haut, die gepoolte Darmprobe und die 10 g Muskelprobe gemäß § 35 LMBG, L 00.00-20 aufbereitet. Es erfolgte eine Voranreicherung in 90 ml gepuffertem 1 %-igem Peptonwasser, die 16 bis 20 Stunden bei + 37°C bebrütet wurde. Im Anschluss wurde das selektive Anreicherungsmedium Magnesiumchlorid-Malachitgrün-Medium mit 0,1 ml der bebrüteten Kultur beimpft und 24 Stunden bei + 42°C bebrütet.[Seite 76↓]

3.2.4.2 Quantitativer Nachweis der Verderbniserreger

Der Nachweis der Verderbniserreger (aerobe Gesamtkeimzahl, Pseudomonaden, Shewanellen) in den Haut-, Darm- und Muskelproben erfolgte aus den Dezimalverdünnungen in Peptonwasser. Dabei wurde bei den Haut- und Darmproben beider Fischarten und bei den Muskelproben der Forellen nach Methoden der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 vorgegangen. Es kam das Spatelplattenverfahren (L 06.00-18: Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl bei + 30°C in Fleisch und Fleischerzeugnissen) und das Tropfplattenverfahren (L 06.00-19: Bestimmung der aeroben Keimzahl bei + 30°C in Fleisch und Fleischerzeugnissen) zur Anwendung.

Die beiden amtlichen Methoden schreiben vor, dass bei der Auswertung der Kolonienzahl die Sektoren bzw. Platten mindestens einer Verdünnungsstufe zwischen 5 und 50 (eventuell bis 100, falls gut auszählbar) Kolonien beim Tropfplattenverfahren bzw. 20 und 300 Kolonien beim Spatelplattenverfahren aufweisen müssen. Aus den Kolonienzahlen der niedrigsten und der nächsthöheren auswertbaren Verdünnungsstufe wird der gewichtete Mittelwert c errechnet. Die Anzahl der Mikroorganismen pro g oder cm² wurde nach folgender Zahlenwertgleichung berechnet:

Es bedeuten:

c =

gewichteter Mittelwert der Koloniezahlen,

Xi =

Summe der Kolonien aller Sektoren bzw. Platten, die zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nächst höhere auswertbare Verdünnungsstufe);

n 1 =

Anzahl der Sektoren bzw. Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe;

n 2 =

Anzahl der Sektoren bzw. Platten der nächsthöheren auswertbaren Verdünnungsstufe;

d =

Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verdünnungsstufe (auf n 1 bezogen).

Da beim Tropfplattenverfahren die Plattenimpfmenge von 0,05 ml einer weiteren Verdünnung des Röhrcheninhalts von 1:20 entspricht, wird c mit 20 multipliziert, beim Spatelplattenverfahren mit einer Impfmenge von 0,1 ml analog mit 10.


[Seite 77↓]

Die Keimzahl je g oder cm² der Probe wird durch Multiplikation des c-Wertes mit dem Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verdünnungsstufe erhalten.

Die Berechnung der Keimzahl unterliegt einigen Einschränkungen. Die Angaben für das Spatelplattenverfahren stehen in Klammern hinter denen für das Tropfplattenverfahren:

  1. Haben sich auf den mit der größten Probenmenge beimpften Doppelsektoren jeweils weniger als 5 (20) Kolonien gebildet, lautet das Ergebnis bei verdünnten homogenisierten Proben:
    "Weniger als 1,0 * 10³ (2,0 * 10³) KbE/g oder cm²"
    In die Berechnungen gingen diese Werte in der logarithmischen Form mit log 3 (log 3,3) KbE/g oder cm² ein. Dieser Wert stellt die Quantifizierungsgrenze dar, oberhalb der erst präzise Angaben über den tatsächlichen Keimzahlwert gemacht werden können.
  2. Haben sich auf den mit der größten Probenmenge beimpften Doppelsektoren keine Kolonien gebildet, lautet das Ergebnis bei verdünnten homogenisierten Proben:
    "Weniger als 2,0 * 10² (1,0 * 10²) KbE/g oder cm²".
    In die Berechnungen gingen diese Werte in der logarithmischen Form mit log 2,3 (log 2) KbE/g oder cm² ein. Dieser Wert stellt die Nachweisgrenze dar.

Da durch diese methodisch festgelegten Einschränkungen keine Nullwerte auftreten können, liegen die Mittelwerte der Stichproben immer über log 2,3 (log 2,0), auch wenn beispielsweise bei 3 von 5 Proben keine Kolonien auf den Doppelsektoren gewachsen sind.


[Seite 78↓]

3.2.4.2.1  Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl (GKZ)

Bei der Bestimmung der aeroben GKZ auf der Haut und im Muskelgewebe der „Winterforellen“ 1999 wurde das Tropfplattenverfahren angewendet. Mit einer sterilen Pipette wurden Teilmengen von 0,05 ml der Erstverdünnung und der weiteren Verdünnungsstufen im Doppelansatz auf die auf der Plattenunterseite markierten Sektoren des PC-Nährbodens aufgetropft, bebrütet wurde bei + 25°C 48 bis 72 Stunden. Gezählt wurden alle Kolonien, die auf PC-Agar gewachsen waren.

Im Gegensatz dazu wurde bei der Bestimmung der Gesamtkeimzahl der Bauchlappenmuskelproben der „Sommerforellen“ und der Haut- und Darmproben sowohl der Forellen als auch der Zander das Spatelplattenverfahren mit einer größeren Beimpfungsmenge angewendet. Zudem wurde beim Zander für die Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl und der spezifischen Verderbskeime anstelle des PC-Agars ein modifizierter Standard-I-Eisen-III-Citrat-Agar verwendet, auf dem die spezifischen Verderbniskeime (v.a. Shewanella putrefaciens) durch Bildung von H2S schwarze Kolonien formen. Mit sterilen Pipetten wurde aus den Verdünnungsreihen jeweils 0,1 ml der entsprechenden Verdünnung im Doppelansatz auf Agarplatten gegeben und mit sterilen Glasspateln gleichmäßig auf der Oberfläche verteilt. Die Platten wurden 48 Stunden bei + 25°C bebrütet, die Kolonien anschließend gezählt.

Abweichend vom Spatelplattenverfahren wurden die Keimzahlen der Muskelproben bei Zandern nach einem 5-tube-MPN-Verfahren bestimmt. Hierbei wurden die Muskelproben ebenso wie die Haut- und Darmproben im Verdünnungsmedium homogenisiert und dezimal bis 10-3 verdünnt. Anschließend wurden von jeder Verdünnungsstufe 5 Tropfen (je 50 µl) auf je eine Standard-I-Eisen-III-Citrat-Agar-Platte getropft. Nach 48 Stunden Bebrütung bei + 25°C erfolgte die Auswertung mit Hilfe einer "five-tube-MPN" Tabelle (FDA Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition /Revision A/1997; Appendix 2: Most Probable Number from Serial Dilutions, Wallace E. Garthright). Alle Sektoren mit gewachsenen Kolonien wurden für die Bestimmung der GKZ gezählt, einschließlich der schwarzen Kolonien der spezifischen sulfitreduzierenden Verderbsorganismen SSO. Der Code sollte möglichst immer mit einer in allen Sektoren positiven Verdünnungsstufe beginnen.


[Seite 79↓]

Für die Auswertung wurde aus drei zusammenhängenden Verdünnungsstufen ein Zahlencode, bestehend aus der Zahl der bewachsenen Sektoren pro Verdünnungsstufe, gebildet. Dieser Zahlencode wurde in der 5-tube-MPN-Tabelle in eine "Höchstwahrscheinliche Keimzahl" übersetzt, mit 20 multipliziert, um das tatsächlich aufgetropfte Inoculum von 0,005 g pro Tropfen auf das für die Berechnung notwendige Inoculum von 0,1 g zu bringen, und anschließend pro 1 g oder 1 cm² angegeben.

Dieses Verfahren wurde ebenfalls beim Durchgang 3 der „Sommerforellen“ aufgrund der zu erwartenden niedrigen Keimzahlen auf den Bauchlappen unausgenommener Fische verwendet, da es mit einer Nachweisgrenze von < 40 KbE/g (log 1,6) empfindlicher als das Spatelplattenverfahren nach § 35 ist.

3.2.4.2.2 Nachweis der Pseudomonaden

Für die Bestimmung der Pseudomonaden-Keimzahl wurde GSP-Agar (Pseudomonaden-Aeromonaden-Selektivagar mit Penicillin nach Kielwein, Merck Art-Nr.1.10230.0500) verwendet. Dabei wurde in den verschiedenen Versuchsgruppen und Fischarten wie bei der Gesamtkeimzahl vorgegangen. Pseudomonaden wachsen hier als rosa Kolonien mit einem Durchmesser von 2-3 mm. Die Morphologie kann unterschiedlich sein, rauhe oder glatte Ränder bilden sich je nach Pseudomonas-Art aus. Die Berechnung der Keimzahl erfolgte auf die gleiche Weise wie die Berechnung der aeroben Gesamtkeimzahl.

3.2.4.2.3 Nachweis der Shewanellen bei Zandern

Zu den spezifischen sulfitreduzierenden Verderbsorganismen (SSO), die auf Standard-I-Eisen-III-Citrat-Agar schwarze, meist glänzende Kolonien bilden, wurde hauptsächlich die Gruppe der Shewanellen gezählt. Die Bestimmung erfolgte gleichzeitig mit der Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl auf dem selben Selektivmedium.


[Seite 80↓]

3.2.4.3  Nachweis von potentiell humanpathogenen Keimen und Indikatorkeimen

3.2.4.3.1 Nachweis von Enterobacteriaceae

Die Keimzahl an Enterobacteriaceae wurde bei den "Winterforellen" und dem ersten Durchgang der "Sommerforellen" nach den Methoden der amtlichen Sammlung nach § 35 LMBG, L 06.00-24 bzw. -25 (Untersuchung von Lebensmitteln - Bestimmung von Enterobacteriaceae in Fleisch - Spatelverfahren bzw. Tropfplattenverfahren) bestimmt. Nach dem Tropfplatten- und dem Spatelplattenverfahren wurde VRBG-Nährmedium, ein Enterobacteriacea-selektiver Nähragar, mit 0,05 bzw. 0,1 ml des Inoculums beimpft. Bebrütet wurde anaerob in einem Anaerobiertopf 48 Stunden bei einer Temperatur von + 30°C. Enterobacteriaceae bilden auf VRBG-Agar rote Kolonien mit Präzipitationshöfen. Gezählt wurden auch kleinere Kolonien ohne Präzipitationshöfe. Die Keimzahl wurde auf die gleiche Weise wie die aerobe Gesamtkeimzahl berechnet.

Beim Zander wurde das MPN-Verfahren nach ISO 21528-2: 2000 (E) - Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae. Part 2: Detection and MPN technique without pre-enrichment-, gewählt, da aufgrund der Vorversuche von einer geringen Keimzahl ausgegangen wurde. Diese MPN-Technik wird empfohlen, wenn eine Koloniezahl von 1 bis 100 pro ml oder g der Probe erwartet wird.

Die Bestimmung des Gehaltes an Enterobacteriaceae erfolgte nur am Tag 7 der Lagerung. Untersucht wurde ein Vorhandensein von Enterobacteriaceae in Haut- und Darmproben.

Eine Anreicherung der Proben erfolgte in je 9 Röhrchen mit gepufferter Brillant-Grün-Gallesalz-Glucose-Bouillon bei + 37°C über 24 Stunden. Anschließend wurde aus jedem Röhrchen auf VRBG-Agar ausgestrichen und ebenfalls 24 Stunden bei + 37°C bebrütet. Von jeder Platte wurden 5 typische rosa oder rote oder auch farblose mucoide Kolonien abgenommen und nach einer Subkultivierung auf Blut- oder Nutrient-Agar für weiterführende biochemische Differenzierungsreaktionen verwendet. Die Anreicherung erfolgte in Medien unterschiedlicher Konzentration:

Verdächtige Kolonien auf VRBG-Agar wurden nach der Subkultivierung auf ihre Oxidaseaktivität und auf die Fähigkeit, Glucose fermentativ abzubauen, überprüft. Die Bestimmung der MPN erfolgt nach folgenden Kriterien:

Wenn eine der typischen Kolonien der Subkultur oxidase-negativ und glucose-positiv ist, wird das Röhrchen, aus dem die Subkultur stammt, als positiv betrachtet. Röhrchen jeder Verdünnungsstufe mit positiven Ergebnissen werden gezählt. Die Anzahl Enterobacteriaceae-positiver Röhrchen der verschiedenen Verdünnungsstufen bildet den MPN-Index. Mit Hilfe einer MPN-Tabelle wird die Anzahl MPN/g bzw. KbE/g ermittelt. Diese ist identisch mit dem MPN-Index bei festen Proben. Bei der Interpretation der Daten ist die Beachtung des 95 %-igen Konfidenzintervalls notwendig.

3.2.4.3.2 Nachweis von Salmonellen

Aus der selektiven Anreicherung wurden zwei feste Selektivmedien (Brillantgrün-Phenolrot-Lactose-Saccharose-Agar und XLD-Agar) beimpft und 18 bis 24 Stunden bei + 37° C bebrütet. Waren keine Salmonellen gewachsen, wurden die Platten einen weiteren Tag lang bebrütet. Auf Brillantgrün-Phenolrot-Agar (BPLS-Medium) gewachsene Kolonien verursachen eine Farbänderung des Nährbodens von rosa nach rot. Die Kolonien sind rosa und haben einen roten Hof. Auf dem XLD-Medium erscheinen Kolonien von Salmonella farblos und transparent und können ein schwarzes Zentrum bilden. Mit jeder verdächtigen oder typischen Kolonie soll laut Norm eine Bestätigung durchgeführt werden. Bei der Auswertung wird die Anwesenheit oder Abwesenheit von Salmonellen in einer Probenmenge von x Gramm (untersuchte Menge) des Produktes angegeben.


[Seite 82↓]

3.2.4.3.3  Nachweis von Vibrionen und Aeromonaden

Bei den Forellen erfolgte der quantitative Nachweis von Aeromonas spp. mit dem Tropfplattenverfahren nur bei den Untersuchungen im Winter 1999. Nach einer 48-stündigen Bebrütung von Ryan-Agar bei + 25°C erscheinen typische Kolonien flach, matt, hellgrün mit einem dunklen Punkt in der Mitte. Verdächtige Kolonien wurden abgenommen und auf Blutagar Nr. 2 einen Tag lang bei + 30°C kultiviert. Eine Gattungsdifferenzierung und eine anschließende Speziesdifferenzierung erfolgte mittels des in der Tabelle 22 aufgeführten Differenzierungsschemas für Aeromonas spp.

Tabelle 22: Differenzierungsschema für Aeromonas spp. (nach Bockemühl 1992, Mikrobiologische Diagnostik, S. 102; Schubert et al., 1990; Janda, 1991; Jeppensen, 1995; Siesenop und Böhm, 2000).

 

Aeromonas

hydrophila

Aeromonas

caviae

Aeromonas

sobria

Aeromonas

veronii

Aeromonas

ichthiosmia

Hämolyse

++

+/-

++

+

+

Oxidase

+

+

+

+

+

Katalase

+

+

+

+

+

OF-Test

+

+

+

+

+

AHM

+

+

+

+

+

Spezies-differenzierung

     

Äsculin

+

+

-

+

-

Gas aus Glucose

+

-

+

+

+

Salicinfermen-tation

+

+

-

+

-

L-Arabinose

+

+

-

-

-

Voges-Proskauer

+

-

V

+

+

Lysin-Decarboxylase

+

-

+

+

-

++: starke, deutliche positive Reaktion, +: positive Reaktion, -: keine Reaktion, V: variabel, unterschiedliche Reaktion

Die detaillierten Beschreibung der Differenzierungsreaktionen von Aeromonaden sind im Anhang in Tabelle A M-1 nachzulesen.

Nachweis von Vibrionen bei Zandern:

Die Tupfer der Hautabstriche der Zander wurden in Röhrchen mit 10 ml alkalischem Peptonwasser gegeben und 24 Stunden bei + 37°C bebrütet.


[Seite 83↓]

Nach dieser ersten Anreicherung wurde auf TCBS-Agar, einem für Vibrionen selektiven Nährmedium, und auf Ryan-Agar ausgestrichen und 24 Stunden bei + 37°C bebrütet. Zusätzlich wurde 1 ml der ersten Anreicherung in 100 ml einer zweiten Anreicherung, Galle-Pepton-Bouillon, gegeben und 24 Stunden bei + 37°C bebrütet, anschließend auf TCBS- und auf Ryan-Agar ausgestrichen. Verdächtige Kolonien beider Anreicherungen wurden auf Columbia-Agar und auf Schafblutagar zur weiteren Differenzierung subkultiviert. Die Tabelle 23 zeigt ein Differenzierungsschema für Vibrio spp.

Tabelle 23: Biologische Merkmale von Vibrionaceae aus klinischem Material (nach Baumann et al. 1984, Bockemühl 1992, Mikrobiologische Diagnostik, S. 102)

 

Vibrio

cholerae

Vibrio

alginolyticus

Vibrio

vulnificus

Vibrio

fluvialis

Vibrio

parahaemo-lyticus

TCBS-Agar

gelb

gelb

grün

gelb

grün

Oxidasetest

+

+

+

+

+

Lysin-Decarboxylase

+

+

+

-

+

Ornithin-Decarboxylase

+

d

d

-

+

Arginin-Dehydrogenase

-

-

-

+

-

Gas aus Glucose

-

-

-

-

-

Saccharose

+

+

d

+

-

Salicin

-

-

+

-

-

Arabinose

-

-

-

+

d

Mannit

+

+

d

+

+

ONPG β-Galacto-sidase-Aktivität

+

-

d

d

-

Voges-Proskauer

d

+

-

-

-

Indol

+

d

+

d

+

Zitrat

+

-

d

+

-

O-129 10µg

s

r

s

r

r

O-129 150µg

s

s

s

s

s

Nitrat

+

+

+

+

+

PW mit 0 % NaCl

+

-

-

-

-

PW mit 1 % NaCl

+

+

+

+

+

PW mit 8 % NaCl

-

+

-

d

d

PW mit 10 % NaCl

-

+

-

-

-

+ = Wachstum; - = fehlendes oder sehr schwaches Wachstum, d = unterschiedliches Wachstum mit gelben oder grünen Kolonien, O-129 Vibriostatikum (2,4-Diamino-6,7-diisopropyl-pteridin-Phosphat) Blättchentest mit 10 bzw. 150 µg; r = resistent, s = sensitiv, PW = Peptonwasser

Folgende Untersuchungen und biochemische Tests wurden herangezogen. Den Medien wurde 1 % NaCl zugegeben, um die Wachstumsbedingungen für halophile [Seite 84↓]Vibrionen zu erleichtern: Aussehen auf Blutagar, Koloniemorphologie und Hämolysefähigkeit, Gramfärbung, Oxidasetest, Kligler (Eisen-2-Zucker-test, Glucose- und Lactosefermentation), Glucose-Oxidation und -Fermentation (O/F-Test), Beweglichkeit, ONPG (β-Galactosidase-Aktivität), Wachstum in Peptonwasser unterschiedlicher Salzkonzentrationen (0 %, 1 %, 3 %, 6 %, 8 %, 10 %), Arginindehydrogenase-Aktivität (ADH), Ornithindecarboxylase-Aktivität (ODC), Lysindecarboxylase-Aktivität (LDC), Voges-Proskauer (VP), API 20 E. Die detaillierten Beschreibung der Differenzierungsreaktionen für Vibrionen finden sich im Anhang in Tabelle A M-2.

3.2.4.3.4 Nachweis von Clostridien

Bei den "Winterforellen" 1999 erfolgte die Untersuchung auf Clostridien nach der Methode L 06.00-39 in der amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 (Untersuchung von Lebensmitteln - Bestimmung von mesophilen sulfitreduzierenden Clostridien in Fleisch und Fleischerzeugnissen - Plattengußverfahren).

Im Doppelansatz wurden 1 ml der Erstverdünnung und wenn nötig der weiteren Verdünnungen in leere Petrischalen überführt und mit 20 ml des geschmolzenen SCA-Nährbodens im Gussplattenverfahren vermischt. Bebrütet wurde 48 Stunden unter anaeroben Bedingungen bei + 37° C. Sulfitreduzierende Clostridien wachsen als schwarze Kolonien im Nährboden.

Bei den Zandern wurde ein qualitativer Nachweis mit Anreicherung der Proben in eisensulfithaltiger Hirn-Herz-Bouillon gewählt. Die Tupferproben der Bauchlappeninnenwände und die Enddarmproben wurden in Röhrchen mit 6 ml Hirn-Herz-Bouillon (BHI) mit Eisensulfit gegeben, mit einem Paraffin-Vaseline-Stopfen luftdicht verschlossen und 72 Stunden bei + 37° C bebrütet. Die Bouillon wurde vor der Beimpfung 10 Minuten gekocht, um sie vollkommen zu entgasen.

Als Wachstumskriterien für Clostridien in der BHI-Bouillon gelten die Trübung und die Schwärzung (bei sulfitreduzierenden Clostridien) des Mediums und Gasbildung. Aus jedem verdächtigen Röhrchen wurde doppelt auf Blutagar und PC-Agar ausgestrichen und aerob und anaerob 48 Stunden bei + 30°C bebrütet.

Ausschließlich anaerob gewachsene katalase-negative Kolonien wurden erneut subkultiviert und aerob und anaerob bebrütet. Reinkulturen, die nur anaerob [Seite 85↓]wuchsen, katalase-negativ waren und in der Gramfärbung als gram-positive Stäbchen erschienen, wurden als Clostridien angesehen.

3.2.4.3.5 Nachweis von Listerien

Aus der ersten (Halb-Fraser-Bouillon) und aus der zweiten selektiven Anreicherung (Voll-Fraser-Bouillon) wurde nach 48 Stunden auf den beiden Selektivmedien Oxford- und Palcam-Agar ausgestrichen und 24 bzw. 48 Stunden bei + 37°C bebrütet.

Typische, 24 Stunden auf Oxford-Agar gewachsene Kolonien von Listeria spp. sind klein (1 mm), gräulich und von Schwärzungshöfen umgeben. Die nach 48 Stunden erhaltenen Kolonien sind dunkler, möglicherweise mit einem grünlichen Schimmer, etwa 2 mm im Durchmesser, mit Schwärzungshöfen und eingesunkenen Zentren.

Auf Palcam-Agar wächst Listeria spp. nach 24 Stunden Bebrütung in kleinen gräulich-grünen oder olivgrünen Kolonien, 1,5 mm bis 2 mm im Durchmesser, manchmal mit schwarzen Zentren, aber immer mit Schwärzungshöfen. Nach 48 Stunden erscheinen Listerien als grüne Kolonien, 1,5 mm bis 2 mm im Durchmesser, mit eingesunkenen Zentren und mit Schwärzungshöfen.

Zur Bestätigung von Listeria spp. wurden von jeder Platte Oxford- und Palcam-Agar fünf verdächtige Kolonien genommen, auf TSYE-Agarplatten (Trypton-Soja-Hefe-Extrakt-Agar) ausgestrichen und 24 Stunden bei + 37°C bebrütet. Typische Kolonien haben einen Durchmesser von 1 mm bis 2 mm, sind farblos, konvex, opak und haben einen vollständigen Rand. Beim Beleuchtungstest nach Henry im schrägen Durchlicht (45°) erscheinen Listerienkolonien bläulich und durchscheinend. Zur weiteren Identifizierung und Differenzierung konnten die Kolonien direkt von den TSYE-Agarplatten abgenommen werden. Folgende Untersuchungen sind nach der Methode DIN EN ISO 11290-1 als Bestätigung von Listeria spp. durchzuführen: Katalasetest, Gramfärbung und Beweglichkeitsprüfung.

Zeigten die untersuchten Kulturen in diesen Tests die für Listeria spp. typischen Reaktionen, wurden weitere Untersuchungen zur Bestätigung von L. monocytogenes durchgeführt. Die Kulturen wurden für die Bestätigungsreaktionen in TSYE-Bouillon [Seite 86↓]übertragen und auf eine positive Hämolyse-Reaktion, auf den Abbau von Rhamnose und Xylose, sowie auf ihr Verhalten im CAMP-Test untersucht.

3.2.5 Untersuchungen auf Nematoden bei Ostseezandern

3.2.5.1 Verdau der Eingeweide

Die kompletten Eingeweide aller Fische sowie beide Bauchlappen und je ein Filet der runden Fische wurden auf Nematoden untersucht. Die Eingeweide wurden in 1 Liter eines Pepsin-HCl-Gemisches bei + 37°C durch Rühren auf einem Magnetrührgerät 1 bis 2 Stunden verdaut. Nach dem Verdau wurde die Lösung durch ein feinmaschiges Sieb gegossen. Vorhandene Nematoden verblieben unbeschädigt im Rückstand, wurden in eine gläserne Petrischale gegeben und vor einem dunklen Hintergrund ausgezählt. Bei ca. 100 Larven wurden lichtmikroskopisch in einer 20fachen Vergrößerung die morphologischen Kriterien von Anisakis spp. überprüft (verdickter Ventrikel ohne Blindsäcke am Ösophagus und Darm).

3.2.5.2 Fluoreszenzmethode bei Fischfilets und Bauchlappen

Die Fische wurden filetiert, die Filets und die Bauchlappen in PE-Beutel gelegt. Die Muskulatur (1 Filet und beide Bauchlappen pro Fisch) der Fische wurde mit Hilfe einer Presse zu einer ca. 2 mm dünnen Schicht gequetscht und eingefroren. Nach 2 Tagen Tiefgefrieren bei -  20°C wurden die Muskelschichten wieder aufgetaut und unter UV-Licht untersucht. Durch den Gefrierprozess werden Nematoden unter UV-Licht als blau fluoreszierende Fäden sichtbar.

3.2.6 Untersuchung der Filets auf flüchtige Basenstickstoffe (TVB-N)

3.2.6.1 Aufschluss der Muskelproben mit 6 %-iger Perchlorsäure (saurer Extrakt)

Der Verderbsgrad von Fischen und Fischprodukten lässt sich in vielen Fällen anhand des Gehaltes an flüchtigen Basenstickstoff - totale volatile basic nitrogen (TVB-N) abschätzen. Der Gehalt von TVB-N wurde nach der Methode L 10.00-3 (Bestimmung des Gehaltes von flüchtigen stickstoffhaltigen Basen (TBV-N) in Fischen und [Seite 87↓]Fischerzeugnissen Referenzverfahren) der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 bestimmt.

Jeweils ein Filet von insgesamt 18 leeren und 17 runden Fischen der 3. Zandergruppe wurde an den Lagerungstagen 1, 7, 11 und 14 für die Bestimmung des TVB-N-Gehaltes untersucht. Die Fischfilets wurden mechanisch in einem Grobzerkleinerungsgerät zerkleinert. 20 g der homogenisierten Masse wurde mit 180 ml einer 6 %-igen HClO4-Lösung (Perchlorsäure) versetzt. Das Homogenisat wurde mit der Perchlorsäure 2 Minuten durch ein hochtouriges Zerkleinerungsgerät (Ultraturrax) mit einer Drehzahl von 8000 min-1 bis 45 000 min-1 homogenisiert und extrahiert, über Filterpapier filtriert und das Filtrat anschließend eingefroren.

3.2.6.2 Bestimmung des TVB-N-Gehaltes der Proben durch Wasserdampf-destillation

Die Wasserdampfdestillation zur Bestimmung des TVB-N-Gehaltes des Extraktes erfolgte in der Bundesforschungsanstalt für Fischerei in Hamburg. Die Vorschrift in der Methode L 10.00-3 lautet folgendermaßen:

"50,0 ml des Extraktes werden in eine zur Wasserdampfdestillation geeignete Apparatur gegeben. Zur späteren Kontrolle für die ausreichende Alkalisierung des Extraktes werden einige Tropfen Phenolphthalein zugegeben. Nach Zugabe von einigen Tropfen Silikon-Entschäumer werden dem Extrakt 6,5 ml Natriumhydroxid-Lösung zugesetzt, und die Wasserdampfdestillation wird sofort begonnen.

Der Wasserdampferzeuger wird so eingestellt, dass innerhalb von 10 Minuten etwa 100 ml Destillat erhalten werden. Das Destillationsauslaufrohr taucht in eine Vorlage aus 100 ml Borsäure-Lösung, der 3 bis 5 Tropfen Indikatorlösung zugesetzt wurden. Nach 10 Minuten wird die Destillation beendet, das Destillationsauslaufrohr aus der Vorlage entfernt und mit Wasser nachgespült. Die in der Vorlage aufgefangenen Amine werden durch Titration mit Salzsäure-Maßlösung von grün nach blau bestimmt." Parallel wird ein Blindversuch durchgeführt.

Auswertung:

Durch Titration der Vorlage mit Salzsäure-Maßlösung wird der TVB-N-Gehalt nach folgender Gleichung berechnet:


[Seite 88↓]

Dabei sind:

V1 =

Verbrauch Salzsäure-Maßlösung in ml bei der Untersuchungsprobe,

V0 =

Verbrauch Salzsäure-Maßlösung in ml bei der Blindversuchsprobe,

c =

Stoffmengenkonzentration der Salzsäure in mol/l,

F =

Faktor der Salzsäure-Maßlösung,

m =

Einwaage der Probe in g.


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20.11.2003