Siraj, Hassen: “Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“
Dissertation
“Etablierung eines neuartigen Systems zur
Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biochemiker Hassen Siraj,
geb. am 11. Juni 1969 in Addis Abeba

Präsident der Humboldt - Universität zu Berlin: Prof. Dr. Dr. h. c. Hans Meyer

Dekan der Mathematisch - Naturwissenschaftlichen Fakultät: Prof. Dr. Jürgen Rabe

Gutachter:
Prof . Dr.Med.Detlev Krüger
Prof. Dr. Siegfried Scherneck
Prof. Dr. Richard Lucius

Einreichungsdatum Dezember den 18.12.1999

Tag der mündlichen Prüfung: Mittwoch den 21.06.2000

Zusammenfassung

Das Hamsterpolyomavirus (HaPV) wurde aus Hauttumoren von HaPV-infizierten Hamstern isoliert und gereinigt. Die Virionen sind ca. 45 nm groß und sind durch einen Polyomavirus-typischen ikosaedrischen Aufbau gekennzeichnet. Im Gegensatz zu den Kapsiden anderer Polyomaviren zeigen sie jedoch eine T=7-laevo Symmetrie.

Die Analyse der Proteinzusammensetzung zeigte, daß das HaPV-Kapsid hauptsächlich aus drei Virus-kodierten Strukturproteinen (VP1, VP2 und VP3) besteht. Das VP1 repräsentiert ca. 71% des Gesamtkapsidproteins und stellt somit das Hauptkapsidprotein dar. Die Vorhersage des VP1-ORF ergab 2 in-frame befindliche potentielle Translationsinitiationssignale (ATG), die zur Synthese von VP1-abgeleiteten Proteinen von 384 und 388 Aminosäuren führen sollten. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 ergab, daß die Translationsinitiation am 2. ATG des VP1-ORF erfolgt, so daß das authentische VP1 384 Aminosäuren beinhaltet (MG: ca. 41,8 kDa).

Das authentische und das N-terminal verlängerte VP1 wurden in Insektenzellen zur Expression gebracht. Die Proteine reagierten im Western blot mit HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenseren und Seren von HaPV-infizierten Hamstern. Beide VP1-Derivate sind in der Lage, in Insektenzellen Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Diese Partikel ähneln in ihrer Dichte und Struktur leeren HaPV-Virionen. Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen und Zellfraktionierung konnte die nukleare Lokalisation der Partikel in Insektenzellen gezeigt werden. Durch Behandlung der Partikel mit EGTA/DTT lassen sich die Partikel in Pentamere dissoziieren. Möglicherweise können die Partikel durch Dissoziation und anschließende Reassoziation mit fremder Nukleinsäure beladen werden, um für gentherapeutische Anwendungen eingesetzt zu werden.

Zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 wurde die dreidimensionale Struktur des HaPV-VP1 auf der Basis verwandter Polyomaviren vorhergesagt und eine Epitopkartierung mit Hilfe in E. coli exprimierter rekombinanter VP1-Derivate und synthetischer Peptide durchgeführt. Die Vorhersage der Struktur ergab 5 oberflächenexponierte Regionen: As 81-88, As 222/223, As 244-246, As 289-294 und die C-terminale Region von VP1. Zwei der genannten Regionen (As 79-97 und die C-terminale Region von VP1) konnten bei beiden Epitopkartierungsstudien als Epitope identifiziert werden. Wahrscheinlich sind in der C-terminalen Region (As 320-384) sowohl lineare als auch mindestens ein diskontinuierliches Epitop lokalisiert. Diese Region ist auch die Ursache für die Kreuzreaktivität von HaPV-VP1 mit anti-SV40- und anti-JCV-positiven Seren. Aufgrund der wichtigen Funktion der C-terminalen Region beim Virus-Assembly kann diese Region wahrscheinlich nicht als Insertionsort für Fremdsequenzen verwendet werden, während die Region As 84-87 für die Insertion von Fremdproteinsequenzen geeignet sein sollte.

Schlagwörter:
Hamsterpolyomavirus, Vakzine, virus-ähnliche Partikel, rekombinante Proteine

Summary

Hamster polyomavirus (HaPV) particles were isolated and purified from the skin tumors of hamster polyomavirus infected hamsters. Virions were found to be approximately 45 nm in diameter. They demonstrate the typical icosahedral structure of polyomaviruses. However, in contrast to other polyomavirus capsids, they demonstrate a T=7-laevo symmetry.

The analysis of the protein composition of the virus capsid showed that it is made up of mainly three virus-coded structural proteins VP1, VP2 and VP3. The VP1 represents up about 71% of the protein mass found in the virion and is therefore the major capsid protein. The prediction of the VP1-ORF showed the existence of 2 in-frame ATG codons which should result in the synthesis of VP1 proteins of 384 or 388 amino acids. The determination of the N-terminal amino acid sequence of the virion-derived VP1 by the method of Edman degradation revealed that the second ATG codon is the initiation site for translation. Therefore the authentic VP1 contains 384 amino acid residues (m.w. 41.8 kDa).

The authentic VP1 and its N-terminal prolonged derivative were expressed in insect cells. The VP1 proteins reacted in the Western blot with HaPV-VP1-specific rabbit sera and sera of HaPV-infected hamsters. Both VP1 derivatives were able to form virus-like particles. In their density and morphology they are similar to empty HaPV virions. Electronmicroscopic investigations and cell fractionation experiments demonstrated the nuclear localization of the particles in insect cells. The treatment of particles with EGTA/DTT resulted in their dissociation in pentameric subunits. For use in gene therapy particles can be probably loaded with foreign nucleic acids by dissociation and subsequent reassociation.

In order to find out potential insertion sites for foreign sequences in VP1, the three-dimensional structure of HaPV-VP1 was predicted on the basis of the known X-ray structure of related polyomaviruses. In addition, epitopes within VP1 were mapped by means of truncated recombinant VP1 derivatives and synthetic peptides. According to structure modelling 5 surface-exposed regions exist in the HaPV-VP1: As 81-88, 222/223, 244-246, 289-294 and the C- terminal region. By epitope mapping we could show that at 2 out of these 5 regions in VP1, namely at As 79-97 and at the C-terminal part of HaPV-VP1, antigenic determinants are located. Most likely, in the C-terminal region (As 320-384) linear as well as at least one discontinuous epitope exist. This region is also responsible for the cross-reactivity of HaPV-VP1 with anti-SV40 and anti-JCV-VP1-specific sera. Because of its important function in virus Assembly, the C-terminal part of HaPV-VP1 is not allowed to be used as insertion site for foreign sequences. According to the structural predictions and epitope mapping data the region As 84-87 should allow the insertion of foreign protein segments.

Keywords:
hamsterpolyomavirus, vaccine, virus like partikel, recombinant proteins


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Inhaltsverzeichnis

Titelseite“Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Moderne Strategien der Vakzineentwicklung
1.1.1Rekombinante Proteine als Vakzine
1.1.2Virus-ähnliche Partikel als neuartige Impfstoffe
1.1.3Virus-ähnliche Partikel als Träger für fremde Epitope
1.1.4Bestimmung potentieller Insertionsorte für Fremdproteinsegmente in VLP-Trägermolekülen durch Epitopkartierung
1.2Polyomavirus-ähnliche Partikel als potentielle Vehikel für die Gentherapie
1.2.1Genomorganisation der Polyomaviren
1.2.2Frühe Proteine der Polyomaviren
1.2.3Strukturproteine der Polyomaviren
1.2.4Das Hamster-Polyomavirus
1.2.5Polyomavirus-abgeleitete Partikel als Transportersysteme in der Gentherapie
1.3Zielstellung der Arbeit
2 Materialien und Methoden
2.1Biologische Materialien
2.1.1Tumorgewebe
2.1.2Lebergewebe
2.1.3Verwendete Plasmide
2.1.4Bakterienstämme
2.1.5Insektenzellen
2.1.6Hamsterseren
2.1.7Monospezifische Kaninchen-anti-VP1-Seren
2.1.8Enzyme
2.1.9DNA-Molekulargewichtsmarker
2.1.10LMW Electrophoresis Calibration kit (Pharmacia,Freiburg, Deutschland)
2.2Methoden zur Virusisolierung und Gewebeaufarbeitung
2.2.1Reinigung von HaPV-Virionen (nach Böttger et al., 1971, modifiziert)
2.2.2Herstellung von Lebergewebsproben
2.3Methoden der DNA-Isolierung und -Reinigung
2.3.1Isolierung von Plasmid-DNA
2.3.1.1Mini-Präparation durch alkalische Lyse
2.3.1.2Plasmid-Midipräparation durch Säulen-Chromatographie
2.3.2Reinigung und Präzipitation von DNA
2.3.2.1Phenol-Chloroform-Extraktion
2.3.2.2Ethanolpräzipitation
2.3.2.3Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
2.3.3DNA-Klonierung
2.3.3.1Restriktionsendonukleasespaltung
2.3.3.2Analytische Agarosegelelektrophorese
2.3.3.3Präparative Agarosegelelektrophorese und DNA-Fragment-Isolation
2.3.3.4Dephospholierung der Vektor-DNA
2.3.3.5Ligation
2.3.3.6Herstellung kompetenter Zellen
2.3.3.7Transformation
2.3.3.8Charakterisierung der rekombinanten Klone
2.3.4Arbeiten mit Zellkulturen
2.3.4.1Kultivierung der Insektenzellen
2.3.4.2Cotransfektion von Insektenzellen
2.3.4.3Plaquereinigung rekombinanter Baculoviren
2.3.4.4Virusvermehrung
2.3.5Expression des HaPV-VP1 in E. coli
2.3.5.1Synthese von rekombinanten VP1-Proteinen mittels pQE-Vektoren
2.3.5.2Lyse der Bakterienzellen
2.3.6Proteinanalytik
2.3.6.1SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.3.6.2Western Blot-Analyse
2.3.6.3Coomassieblau-Färbung
2.3.6.4Elektronenmikroskopie
2.3.6.5N-terminale Sequenzierung des viralen VP1
2.3.7Charakterisierung der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate
2.3.7.1Reinigung der rekombinanten Proteine durch Gradientenzentrifugation
2.3.7.2Untersuchung der DNA-Kontamination von VP1-Partikeln
2.3.7.3Untersuchung der subzellulären Lokalisation der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate
2.3.7.3.1mittels Zellfraktionierung
2.3.7.3.2mittels Elektronenmikroskopie
2.3.7.4Stabilität von VP1-abgeleiteten Partikeln
2.3.7.5Quantitative Proteinbestimmung
3 Ergebnisse
3.1Charakterisierung des Kapsids des Hamsterpolyomavirus
3.1.1Reinigung und elektronenmikroskopische Charakterisierung des Hamsterpolyomavirus
3.1.2Analyse der Proteinzusammensetzung des HaPV-Kapsids
3.1.3Bestimmung der N-terminalen Sequenz des viralen VP1
3.1.4Aminosäurehomologie der Kapsidproteine von HaPV zu denen anderer Polyomaviren
3.1.5Immunologische Reaktivität der HaPV-Proteine mit Seren von HaPV-infizierten Hamstern
3.2Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln auf der Basis des VP1 vom HaPV
3.2.1Klonierung der kodierenden Sequenzen für das authentische und ein N-terminal verlängertes VP1 des HaPV in pBacPak9
3.2.2Expression und Antigenität des HaPV-VP1 aus Insektenzellen
3.2.3Nachweis der Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln in Insektenzellen
3.2.4Untersuchungen zur Stabilität und zu einer möglichen Kontamination der Virus-ähnlichen Partikel mit Nukleinsäure
3.2.5Kreuzreaktivität der Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivate mit gegen andere Polyomaviren gerichteten Antiseren
3.2.6Subzelluläre Lokalisation des Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1 in Insektenzellen
3.2.6.1Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation
3.2.6.2Zellfraktionierung zum Nachweis der subzellulären Lokalisation
3.3Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im HaPV-VP1 durch Epitopmapping
3.3.1Kartierung von Epitopen mit Hilfe rekombinanter HaPV-VP1-Proteine
3.3.1.1Subklonierung der HaPV-VP1-kodierenden Fragmente in pQE-Vektoren
3.3.1.2Expression rekombinanter HaPV-Proteine in E. coli
3.3.1.3Epitopmapping im VP1 des HaPV mit Hilfe der rekombinanten Fusionsproteine
3.3.1.3.1Die Reaktivität der rekombinanten Proteine mit HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenseren
3.3.1.3.2Die Reaktivität der rekombinanten Proteine mit Seren von HaPV-infizierten
Z3-Hamstern
3.3.1.3.3Kartierung einer kreuzreaktiven Region des Polyomavirus-VP1
3.3.2Epitopmapping im VP1 des HaPV mit Hilfe von synthetischen Peptiden
3.3.2.1Reaktivität der synthetischen Peptide mit Kaninchen anti-HaPV-VP1-Serum
3.3.2.2Reaktivität der synthetischen Peptide mit Serumpools von HaPV-infizierten Z3- Hamstern
3.3.2.3Kartierung kreuzreaktiver Epitope im HaPV-VP1
4 Diskussion
4.1Struktur und Proteinzusammensetzung des HaPV-Kapsids
4.2Virus-ähnliche Partikel auf der Basis des HaPV-VP1
4.2.1Die Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln in Insektenzellen
4.2.2Subzelluläre Lokalisation des VP1-Proteins in Insektenzellen
4.2.3Stabilität der Virus-ähnlichen Partikel
4.2.4Die Untersuchung der Nukleinsäure-Kontamination von HaPV-VP1-Partikeln
4.3Epitopmapping zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 von HaPV
4.4Ausblick
Bibliographie Literatur
Anhang A Publikationsliste
Anhang B Veröffentlichungen
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Übersicht über die pathologischen Befunde der untersuchten Z3-Hamster (Berlin-Buch)
Tab. 2: Übersicht über die verwendeten Z3-Hamster ohne Papillombildung
Tab. 3: Herkunft der Kaninchen-anti-VP1-Seren
Tab. 4: Vorhergesagte und in der SDS-PAGE beobachtete Größen der viralen Kapsidproteine
Tab. 5: Aminosäurehomologie zwischen den späten Proteinen des HaPV und denen anderer Polyomaviren (in %)
Tab. 6: Reaktivität der Hamster-Seren mit HaPV-Strukturproteinen
Tab. 7: Reaktivität der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate mit Seren von Papillom-tragenden und Papillom-freien Hamstern
Tab. 8: Kreuzreaktivität von viralem und Baculovirus-exprimiertem VP1 des HaPV mit anti-SV40, anti-JCV-VP1, anti-LPV-VP1, und anti-murines Polyomavirus-Seren
Tab.9: Reaktivität der rekombinanten VP1-Proteine mit HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenseren
Tab. 10: Reaktivität der rekombinanten VP1-Proteine mit Seren von Papillom-tragenden
Z3-Hamstern
Tab. 11: Reaktivität der rekombinanten Proteine mit Seren von Papillom-freien Z3 Hamstern

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Genomorganisation von SV40 und Maus-Polyomavirus Py. Die ausgefüllten Bereiche stellen die kodierenden Sequenzen des viralen Genoms dar. Die gespleißten Introns sind durch unterbrochene Linien dargestellt (nach Fields, 1990).
Abb. 2: Lokalisation der kodierenden Abschnitte für die frühen Proteine large T, middle T und small T und für die späten Proteine VP1, VP2 und VP3 im HaPV-Genom ( nach Delmas et al. ., 1985).
Abb. 1: Schematische Darstellung der pQE-Vektoren ( nach Crowe and Henco, 1992)
Abb. 4: Elektronenmikroskopische Darstellung der gereinigten HaPV-Partikel nach Negativkontrastierung mit 1 % Uranylacetat (a), nach Schrägbeschattung (b) und Bestimmung der Virus-Symmetrie als T=7-laevo nach Schrägbedampfung (c)
Abb. 5: 15%ige SDS-PAGE von gereinigten HaPV-Partikeln.
Abb. 6: Nachweis der viralen Strukturproteine im Western Blot mit Seren von Hamsterpolyomavirus-infizierten Z3-Hamstern
Abb. 7: Aminosäuresequenz des HaPV-VP1.
Abb. 8: Herstellung der Baculovirus-Transferplasmide, die das authentische bzw. das N-terminal verlängerte VP1 des HaPV kodieren.
Abb. 9: SDS-PAGE zum Nachweis der HaPV-VP1-Expression in Insektenzellen.
Abb. 10: Reaktivität der Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivate im Western blot mit Kaninchen-anti-VP1(As 29-320)-Serum (a) und einem anti-VP1-positiven Z3-Hamsterserum (b).
Abb.11: Elektronenmikroskopische Darstellung von gereinigten Virus-ähnlichen Partikeln, die von authentischem VP1 (a) und N-terminal verlängertem VP1 (b) gebildet wurden.
Abb.12: Elektronenmikroskopische Untersuchung der Stabilität der VP1-Partikel
Abb.13: Untersuchung der DNA-Kontamination von gereinigten VP1-abgeleiteten Partikeln im Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel.
Abb.14: Nachweis der Kreuzreaktivität von Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivaten mit anti-SV40-Serum.
Abb.15: Western blot-Reaktivität des Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1 mit einem anti-JCV-VP1-Serum.
Abb. 16: Subzelluläre Lokalisation von HaPV-VP1 in Insektenzellen.
Abb. 17 Western blot zum Nachweis der subzellulären Lokalisation des VP1 in den Insektenzellen mit Kaninchen-anti-HaPV-VP1-Serum.
Abb.18: Restriktionskarte der VP1-kodierenden Region (a) und schematische Darstellung der pQE-Expressionsvektoren mit den entsprechenden VP1-kodierenden Fragmenten (b).
Abb.19: Nachweis der Expression der HaPV-VP1-DHFR-Fusionsproteine im gefärbten SDS-PAGE (a) und durch Western blot mit MRGS-His6-spezifischem monoklonalen Antikörper (b) und dem Serum eines HaPV-infizierten Z3-Hamsters (c).
Abb. 20: Reaktivität der rekombinanten HaPV-VP1-Proteine mit Kaninchen-anti-SV40-Serum (a) und Kaninchen-anti-JCV-VP1-Serum (b).
Abb. 21: Reaktivität der VP1-Peptide mit Kaninchen-anti-HaPV-VP1-Serum im Pepscan. Die kontinuierlichen B-Zell-Epitope des VP1 wurden an Cellulose gebunden synthetisiert. Die Peptide wurden mit Kaninchen-anti-VP1- Serum (1:10) und anti-Kaninchen-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.
Abb. 22: Reaktivität der synthetischen Peptide mit dem Serumpool von Papillom-freien Z3-Hamstern. Die Peptide wurden mit dem Serumpool (1:10) und anti-Hamster-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.
Abb. 23: Reaktivität der synthetischen Peptide mit dem Serumpool von Papillom-tragenden Z3-Hamstern. Die Peptide wurden mit dem Serumpool von Papillom-tragenden Hamstern (1:10) und anti-Hamster-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.
Abb. 24: Pepscan-Analyse der SV40-(a) und JCV-VP1-spezifischen Kaninchenseren (b).
Abb. 25: Potentielle Kernlokalisierungssignale am N-Terminus des VP1 von HaPV, murinem Polyomavirus PY(A2), LPV, BFDV, JCV, SV40 und BKV.
Abb. 26. Konservierte basische Aminosäuren in der C-terminalen Region des VP1 von HaPV, SV40, LPV, murinem Polyomavirus Py, JCV und BFDV.
Abb. 30: Mögliche Calcium-bindende Domäne des VP1 von HaPV

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Mon Oct 7 15:38:59 2002