Siraj, Hassen: “Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Moderne Strategien der Vakzineentwicklung

1.1.1 Rekombinante Proteine als Vakzine

Impfungen gegen Infektionskrankheiten haben eine lange Tradition, weit länger als unsere Kenntnis der entsprechenden Krankheitserreger. Zur Bekämpfung der Infektionskrankheiten werden verschiedene Arten von Vakzinen verwendet.

Attenuierte Lebendvakzinen enthalten replikationsfähige Erreger, die sich in der geimpften Person vermehren können. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtypvirus verursachen sie jedoch eine begrenzte oder abgeschwächte Infektion. Aufgrund der intrazellulären Replikation induzieren Lebendvakzinen sowohl neutralisierende Antikörper als auch cytotoxische T-Lymphocyten. Die meisten Lebendvakzinen wurden durch Adaptierung eines Wildtyp-Virusstammes an einen neuen Wirt (meist in der Zellkultur) entwickelt. Leider replizieren manche humanpathogene Viren, darunter der Erreger der Hepatitis B und Papillomviren, nicht in der Zellkultur. Desweiteren besteht bei der Verwendung attenuierter Viren das Risiko, daß sie im Verlauf der abgeschwächten Infektion zum Wildtyp rückmutieren (Brennan et al., 1999).

Bei inaktivierten Vakzinen, sogenannten Totimpfstoffen, erfolgt nach Applikation keine Virusvermehrung. Sie werden durch Inaktivierung der Infektiosität bei Behandlung mit bestimmten Chemikalien hergestellt und induzieren überwiegend Antikörperreaktionen. Die Ausbildung einer cytotoxischen T-Zellantwort ist aufgrund des Ausbleibens einer aktiven Proteinsynthese selten.

Mit der Entwicklung der Gentechnik ist es möglich geworden, rekombinante Vakzinen in großen Mengen biotechnologisch herzustellen und dabei deren Risikopotential dramatisch zu verringern. Rekombinante Proteine können durch heterologe Expression von viralen Proteinen in Bakterien, Hefen, Insekten- und Säugerzellen und in transgenen Pflanzen hergestellt werden (Ulrich et al., 1998). Für eine Vielzahl viraler Erreger konnte gezeigt werden, daß rekombinante Proteine in der Lage sind, nicht nur eine cytotoxische T-Zell-Antwort und / oder eine Antikörperantwort zu induzieren, sondern auch Tiere vor einem nachfolgenden Viruschallenge zu schützen. So war ein in Salmonella exprimiertes Influenza-Nukleoprotein in der Lage, eine cytotoxische Immunantwort zu induzieren (Gao et al., 1992). In Insektenzellen exprimierte Oberflächenproteine des Cytomegalievirus führten in der Maus zur Bildung von Virus- neutralisierenden Antikörpern und Virus-spezifischen cytotoxischen T-Zellen (Britt et al., 1995). Im Rind und anderen Versuchstieren konnte durch Immunisierung mit einem


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Fusionsprotein aus beta-Galaktosidase und VP1 des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) die Bildung Virus-neutralisierender Antikörper induziert werden (Broekhuijsen et al., 1987). Agterberg et al. (1990) konnten zeigen, daß ein chimäres Fusionsprotein aus PhoE und FMDV-VP1 in der Lage ist, Schweine vor einer tödlichen FMDV-Infektion zu schützen. Die rekombinante Proteine aus Nukleoprotein und Glycoprotein-2 des lymphocytären Choriomeningitisvirus können Mäuse vor einer letalen lymphocytären Choriomeningitisvirus Infektion schützen (Weidet et al., 1994).

Bis heute ist eine große Anzahl verschiedener viraler Vektoren für die Konstruktion von rekombinanten Lebendvakzinen und für die eukaryontische Expression von Virusantigenen eingesetzt worden. Als virale Expressionssysteme sind Vakzinia-Virus-, Adenovirus-, Herpes-simplex-Virus- und Papovavirus-abgeleitete virale Vektoren verwendet worden (Perkas et al., 1996). Ein rekombinantes Vakzinia-Virus, das das Glycoprotein des Tollwutvirus exprimiert, ist als Lebendvakzine erfolgreich bei der Eliminierung der Fuchstollwut in Belgien eingesetzt worden (Brochier et al., 1994). Das Oberflächenprotein VP1 des Maul- und Klauenseuche-Virus, das im Picornavirus-Expressionssystem exprimiert wurde, ist in der Lage, Schweine vor einer tödlichen FMDV-Dosis zu schützen (Reider et al., 1994). Die mit Hilfe viraler Vektoren exprimierten und gereinigten Hüllproteine des SIV (gp160) schützten die immunisierten Tiere gegen eine nachfolgende SIV-Infektion (Hu et al., 1992 ). Allerdings sind solche rekombinanten Proteine allein gering immunogen und müssen in der Regel mit Adjuvantien appliziert werden.

1.1.2 Virus-ähnliche Partikel als neuartige Impfstoffe

Für eine Reihe von viralen Kapsid- und Hüllproteinen konnte gezeigt werden, daß sie sich in heterologen Wirtszellen spontan zu Partikeln zusammenlagern, die sich strukturell und in ihren immunologischen Eigenschaften nicht oder nur gering von den authentischen Viren unterscheiden (Ulrich et al., 1998). Deshalb werden diese multimeren Aggregate als Virus-ähnliche Partikel (VLPs) bezeichnet. Für die Bildung solcher VLPs sind weder weitere virale Proteine noch virale Nukleinsäure notwendig. Damit bieten VLPs den Vorteil, daß sie nicht infektiös sind. VLPs sind aufgrund ihrer multimeren Struktur und des Vorhandenseins von T- Helfer-Zell-Epitopen (Th) hochimmunogen (Ulrich et al., 1998). Außerdem werden beim Assembly von Partikeln durch Wechselwirkung der einzelnen Protein-Untereinheiten konformationsabhängige Epitope ausgeprägt. Solche Epitope führen oft zur Induktion einer Immunantwort, die die Infektiosität des Virus neutralisieren kann (Ulrich et al., 1998). Verschiedene VLPs sind auch in der Lage, eine cytotoxische T-Zell-Antwort zu induzieren (Schirmbeck et al., 1994 und 1996; Layton et al., 1993).

So basiert der erste, auf gentechnischem Weg hergestellte und lizensierte Impfstoff auf in Hefe exprimierten, HBsAg-abgeleiteten VLPs (Schirmbeck et al., 1994). Partikelbildende Strukturproteine


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von Papillom- und Rotaviren werden gegenwärtig auf ihre Eignung als Vakzine untersucht (Ellis et al., 1996). So konnten im Tiermodell nach Immunisierung mit in Insektenzellen exprimierter VLPs des Kapsidproteins L1 eines menschlichen Papillomvirus Virus-neutralisierende Antikörper induziert werden (Christensen et al., 1994). Breitbrud et al., (1995 ) konnten zeigen, daß heterolog exprimierte VLPs des Kaninchen-Papillomvirus in der Lage sind, Kaninchen vor einer tödlichen Virusinfektion zu schützen. VLPs auf der Basis eines in Insektenzellen synthetisierten Kapsidproteins des Rotavirus schützten Mäuse vor einer Virusinfektion (O‘Neal et al., 1997). Für eine Reihe weiterer VLPs konnte die Induktion von Virus-neutralisierenden Antikörpern und zum Teil einer protektiven Immunantwort in Tiermodellen gezeigt werden. Murmeltiere konnten durch Immunisierung mit VLPs, die durch spontanes Assembly von in E. coli exprimiertem Murmeltier-Hepatitisvirus-Coreprotein gebildet wurden, vor einer Infektion durch Murmeltier-Hepatitisvirus (WHV) geschützt werden (Roos et al., 1989). Das gp160 von HIV aggregierte in Insektenzellen spontan zu VLPs, die in Meerschweinchen die Bildung neutralisierender Antikörper induzierten (Rovinski et al., 1995). Das in Insektenzellen exprimierte Kapsidprotein des Norwalkvirus bildete VLPs, die in Mäusen eine systemische und mukosale Immunantwort induzierten ( Ball et al., 1998).

1.1.3 Virus-ähnliche Partikel als Träger für fremde Epitope

Synthetische Peptide und monomere rekombinante Proteine sind in der Regel nur gering immunogen. In den vergangenen Jahren sind gentechnische Methoden eingesetzt worden, um die Immunantwort gegen Peptide durch Herstellung von Fusionsproteinen zu stimulieren (siehe 1.1). Eine besonders hoffnungsvolle Möglichkeit ist die gentechnische Verknüpfung von Proteinabschnitten mit VLPs. Die so hergestellten sogenannten ,,chimären“ VLPs können als effektive Träger für B-Zell-und T-Zell-Epitope benutzt werden. Die VLPs enthalten mehrere Kopien des VLPs-Trägerproteins und somit mehrere Kopien jedes zugefügten Antigens (Ulrich et al., 1996). Die zugefügten Antigene (Proteine oder Peptide) nehmen mit großer Wahrscheinlichkeit die geleiche dreidimensionale Struktur an, die sie im ursprünglichen Virus hatten. Als Teil der chimären VLPs werden diese fremden Proteinabschnitte dem Immunsystem in partikulärer Form präsentiert. Einige VLPs-Trägerproteine, wie z.B. das HBcAg, besitzen Th-Epitope, die eine starke Immunantwort sowohl gegen das HbcAg als auch das fremde Epitop induzieren (Clarke et al., 1990). Neben den Insert-spezifischen Antikörpern können chimäre VLPs auch cytotoxische T-Zellen induzieren (Griffiths et al., 1993). Bevorzugte Träger für Fremdepitope sind HBcAg (Schödel et al., 1994) und HBsAg des Hepatitis B-Virus (Michel et al., 1993) , das Hefe-Retrotransposon Ty-Protein p1 (Adams et al., 1994), lentivirale Gag-Proteine (Wagner et al., 1994) und Phagencoatproteine (Mastico et al., 1993). Das HBcAg ist einer der am meisten verwendeten VLP-Träger für Fremdepitope (Ulrich et al., 1998). Mit Hilfe chimärer Corepartikel des Hepatitis B Virus konnte die Bildung virusneutralisierender Antikörper (Chambers et al., 1996) und z.T. eine protektive Immunantwort in Tiermodellen induziert werden (Clarke et al., 1987; Boulter et al., 1995; Ulrich et al., 1998). Humorale und zellvermittelte Immunantworten wurden durch Corepartikel induziert, die Circumsporozoite-Antigen von Plasmodium falciparum und P. berghei (Schödel et al.,


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1994b) tragen. Vor kurzem wurde auch über die Verwendung genetisch veränderter Pflanzenviren als Träger für Fremdepitope berichtet (Brennan et al., 1999).

1.1.4 Bestimmung potentieller Insertionsorte für Fremdproteinsegmente in VLP-Trägermolekülen durch Epitopkartierung

Das systematische Abtasten eines Proteins durch Antipeptid- und Antiprotein-Antikörper bezeichnet man als Epitopkartierung, wobei überwiegend kontinuierliche B-Zellepitope erfaßt werden (Günther et al., 1992). Typischerweise besitzen Makromoleküle mehrere Determinanten, die jede per Definition von einem Antikörper gebunden werden kann (Weiss et al., 1997).

In einem Proteinantigen gibt es hauptsächlich zwei Arten von Epitopen (Lenstra et al., 1990): Lineare (sequentielle) und konformationelle (assemblierte). Bei Proteinen werden Epitope, die sich aus der primären Aminosäuresequenz ergeben, lineare Determinanten genannt. Man nimmt an, daß bei einem Proteinantigen die maximale Länge von linearen Determinanten, die Kontakt mit einem spezifischen Antikörper aufnehmen können, nicht mehr als 8 Aminosäuren beträgt (Geysen et al., 1986). Lineare Determinanten können im nativ gefalteten Protein für Antikörper erkennbar sein, falls sie auf der Oberfläche oder in einer ausgestülpten Region lokalisiert sind. Lineare Determinanten sind jedoch oft in der nativen Proteinkonformation nicht zugänglich und werden erst im denaturierten Protein erkannt. Im Gegensatz dazu werden konformationelle Determinanten nicht durch nebeneinander liegende Aminosäuren der linearen Sequenz ausgebildet, sondern durch solche, die erst durch die Proteinfaltung in Nachbarschaft kommen. Manchmal kommt es, daß ein Teil eines konformationellen Epitops durch synthetische Peptide imitiert wird. Solche Epitope werden Mimotop genannt (Geysen et al., 1986). Die meisten Epitope eines nativen Proteinantigens sind komformationsabhängig.

Verschiedene Methoden sind zur Kartierung von konformationellen und linearen Epitopen entwickelt worden. Die Auswahl der Methoden zur Epitopkartierung ist von verschiedenen Faktoren abhängig. Neben der mengenmäßigen Verfügbarkeit des Proteinantigens, spielen auch die Art der verwendeten Antikörper und die Ziele der Kartierung eine wichtige Rolle. Die chemische (Morris et al., 1996) und enzymatische Proteinfragmentierung (Maria et al., 1996; Rawling et al., 1995) sowie die Subklonierung des entsprechenden Gens (Lenstra et al., 1990) zählen zu den häufig benutzten Methoden der Epitopkartierung. Neben diesen genannten Methoden werden auch die Methoden des Protein foot printing (Jemmersen et al., 1986), der Expression von Peptiden unterschiedlicher Länge auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen (Kishchenko et al., 1994) und die simultane multiple Peptidsynthese (Maeji et al., 1995) für die Kartierung von linearen B-Zell Epitopen eingesetzt.

Eine vielversprechende Methode für die Vorhersage von Oberflächen-exponierten Regionen eines Proteins ist das Homology-modelling. Diese Methode beruht auf der Annahme, daß stark homologe Primärsequenzen zur Ausbildung ähnlicher Strukturen führen. Aus bekannten Kristallstrukturdaten und


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der abgeleiteten dreidimensionalen Struktur eines Proteins und aus der bekannten Primärstruktur eines homologen, zu untersuchenden Proteins konnten durch Homology-modelling die wahrscheinliche Raumstruktur und damit Oberflächen-exponierte Bereiche vorhergesagt werden (Rost et al., 1993; Schneider et al., 1996).

1.2 Polyomavirus-ähnliche Partikel als potentielle Vehikel für die Gentherapie

1.2.1 Genomorganisation der Polyomaviren

Die Polyomaviren bilden eine Subfamilie innerhalb der Familie der Papovaviridae (Cole et al., 1996). Sie lassen sich grob in zwei Gruppen einteilen: zum einen SV40 und SV40-ähnliche Viren - hierzu zählen auch die humanpathogenen BK- und JC-Viren, zum anderen die eigentlichen Polyomaviren, wobei das der Maus bisher am besten untersucht ist. Die tumorerzeugenden Eigenschaften des Mauspolyomavirus wurden 1953 von Ludwik Gross entdeckt. Er fand, daß Zellextrakte von an Leukämie erkrankten Mäusen nach Übertragung auf gesunde Tiere verschiedene Typen von Tumorerkrankungen, nämlich Leukämien und Tumoren der Speicheldrüse, hervorrufen können. Die Isolierung des Polyomavirus der Maus gelang Stewart und Eddy 1957/1958 (Cole et al., 1996). Der Name Polyoma leitet sich von der Eigenschaft dieser Viren ab, in verschiedenen Organen Tumoren erzeugen zu können (Yi et al., 1998). Bis heute sind die kompletten Nukleotidsequenzen von 12 Vertretern der Polyomavirinae ermittelt worden (James et al., 1994). Vergleiche der Nukleotidsequenzen zeigten, daß alle Polyomaviren eine ähnliche Genomorganisation und Strategie der genomischen Replikation und Expression besitzen.

Polyomaviren besitzen ein kovalent geschlossenes und somit zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Genom mit einer Länge von ca. 5200 bp [5243 bp bei SV40 (Stamm776), 5130 bp bei JCV (Mad1), 5153 bp bei BKV (Dun) und 5297 bp beim murinen Polyomavirus Py (A2)]. Das Polyomavirion mißt 40-45nm im Durchmesser, hat eine Dichte von 1.34-1.35 g/cm3 (Barbanti-Brodano et al., 1998; Cole et al., 1996) und ein Molekulargewicht von 27×106 ( Tooze et al., 1981). Das ikosaedrische Kapsid der Polyomaviren besteht aus 72 Kapsomeren in T=7d Symmetrie (Finch et al., 1974).

Das DNA-Genom läßt sich nach dem Zeitpunkt der Genexpression in zwei Bereiche einteilen. Der frühe Bereich kodiert drei Proteine, welche man als Tumor (T)-Antigene bezeichnet. Während das murine Polyomavirus (Py) und das Hamsterpolyomavirus (HaPV) drei T-Antigene (large, middle, small) kodieren, kodiert die frühe Region von SV40, BKV, JCV und anderen Polyomaviren nur zwei T-Antigene (large T und small T; Barbanti-Brodano et al., 1998). Der späte Genombereich kodiert für die viralen Strukturproteine VP1, VP2 und VP3 (siehe 1.6). Neben den T-Antigenen und den Kapsidproteinen ist bei SV40, BKV und JCV ein kleines basisches Protein beobachtet worden. Es wird


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vermutet, daß dieses basische Protein (Agnoprotein) beim viralen Zusammenbau und der Prozessierung der späten mRNA eine Rolle spielt (Alwine et al., 1982; Ng et al., 1985). Beim murinen Polyomavirus Py werden die drei viralen Strukturproteine von 3 verschiedenen mRNAs translatiert. Dagegen werden bei SV40 nur 2 unterschiedliche mRNAs für die Expression der drei späten Proteine synthetisiert (Grass et al., 1987; Hay et al., 1982). Zwischen den Ausgangspunkten für die Transkription der frühen und späten Regionen liegt ein nicht-kodierender Bereich von 400bp. Dieser Bereich enthält regulatorische Sequenzen: den Replikationsursprung, die Promotoren für frühe und späte Region und eine Enhancer-Region zur Regulation und Verstärkung der Transkription (Tooze et al., 1981).

Abb. 1: Genomorganisation von SV40 und Maus-Polyomavirus Py. Die ausgefüllten Bereiche stellen die kodierenden Sequenzen des viralen Genoms dar. Die gespleißten Introns sind durch unterbrochene Linien dargestellt (nach Fields, 1990).

1.2.2 Frühe Proteine der Polyomaviren

Die Produkte der frühen Region der Polyomaviren sind für die Induktion und Erhaltung der Transformation verantwortlich (Yi et al., 1998). Die Tumorinduktion durch SV40 und murines Polyomavirus Py ist mit einem nicht produktiven Infektionszyklus verbunden (Cole et al., 1996). Das large T von SV40 und Mauspolyomavirus Py besitzt die Fähigkeit zur Induktion einer Zellimmortalisierung (Colby et al., 1982; Tevethia et al., 1998). Die transformierende Wirkung des large T basiert auf der Bindung an zelluläre Proteine, die zu den Tumorsuppressorproteinen oder Antionkogenen gehören (Yi et al., 1998; Chen et al., 1998). Das large T von Mauspolyomavirus, von SV40, BKV und JCV bilden einen Komplex mit dem Retinoblastoma-Protein (pRb 105/107) , das die Transkription bestimmter zellulärer Gene beeinflußt (Decaprio et al. 1988; Dyson et al., 1990). Außerdem haben die large T der genannten Viren die Fähigkeit, an das zelluläre Tumorsuppressorprotein p53 (Barbanti-Brodano et al., 1998) zu binden, das an der Regulation der Zellteilung beteiligt ist. Durch die Interaktion mit dem viralen Protein werden die Tumorsuppressorproteine inaktiviert und damit die Regulation der Zellteilung gestört (Chen et al.,


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1998). Chen et al. (1998) konnten zeigen, daß das SV40-large T in immortalisierten menschlichen Epithelzellen Apoptose induzieren kann. Es wird vermutet, daß das middle T des Mauspolyomavirus zusammen mit dem large T-Antigen die Zelltransformation induziert. Biochemische und genetische Untersuchungen haben gezeigt, daß das middle T-Antigen einen Komplex mit dem zellulären Protoonkogen pp60src (Courtneidge et al.; 1983 und 1985; Kornbluth et al., 1987) und mit zwei weiteren zellulären Proteinen, nämlich Phosphatidylinositol-3 (PI-3)- Kinase (Auger et al., 1992) und Phosphatase 2A (Walter et al., 1990), bildet. Das small T der Polyomaviren ist nicht essentiell für die virale Replikation, fördert aber in bestimmten Situationen die Akkumulation der viralen DNA (Berger et al., 1986 ). Wie das middle T bildet auch das small T einen Komplex mit der zellulären Phosphatase 2A (Pallas et al., 1990)

1.2.3 Strukturproteine der Polyomaviren

Die späten Proteine der Polyomaviren werden als VP1, VP2 und VP3 bezeichnet. Das ikosaedrische Kapsid der Polyomaviren ist aus 72 Pentameren aufgebaut. Somit enthält das Kapsid 360 Kopien des monomeren Hauptkapsidproteins VP1 (Rayment et al., 1982). Im viralen Kapsid sind die kleineren Strukturproteine (VP2/VP3) in geringerer Menge vorhanden. Es wird vermutet, daß ein Molekül von VP2 oder VP3 (oder beide) mit einem VP1-Pentamer assoziiert sind (Tooze et al., 1981; Lin et al., 1984). Wahrscheinlich sind sie im Inneren der VP1- Pentamere lokalisiert (Liddington et al., 1991; Griffith et al., 1992; Barouch et al., 1994). Das VP1 stellt das Hauptstrukturprotein des viralen Kapsids dar. Es bildet 75%-80% der gesamten Kapsidproteinmenge (Gillock et al., 1998). Als äußeres Kapsidprotein ist das VP1 auch für die Bindung der Polyomaviren an zelluläre Rezeptoren verantwortlich (Marriott et al., 1985; Li et al., 1994). Für Partikel des Mauspolyomavirus PyA2 existiert eine hochauflösende Röntgenkristallstruktur im Komplex mit zwei Sialyl-oligosaccharid-Fragmenten, die Bestandteil der zellulären Rezeptoren sind (Haun et al., 1993; Hermann et al., 1995; Stehle et al., 1997). Für LPV-VP1 wird vermutet, daß alpha-2,6-Sialylsäure als essentieller Bestandteil im zellulären Rezeptor vorkommt (Haun et al., 1993). Die hämagglutinierende Eigenschaft der meisten Polyomaviren ist auf die Wechselwirkung des VP1 mit den Rezeptoren auf der Erythrozytenoberfläche zurückzuführen (Tooze et al., 1981). Die Hämagglutination kann durch VP1-spezifische Antikörper gehemmt werden (Bolen et al., 1981). Für das murine Polyomavirus konnte gezeigt werden, daß ein Aminosäureaustausch im VP1 zur Entstehung von Virusisolaten mit unterschiedlichen Tumor-induzierenden Eigenschaften führt (Li et al., 1994).Sowohl für SV40 als auch für das murine Polyomavirus konnte gezeigt werden, daß die Strukturproteine, insbesondere das Hauptstrukturprotein VP1, die Fähigkeit besitzen, DNA in sequenzunspezifisch zu binden (Soussi et al., 1986; Moreland et al., 1991; Chang et al., 1993; Dean et al., 1995). Im Gegensatz zu VP2/VP3 von SV40 (Clever et al., 1993) binden VP2/VP3 des murinen Polyomavirus keine DNA (Chang et al.,1992 und 1993). Eine DNA-bindende Region ist am N-Terminus des VP1 von Polyomaviren lokalisiert worden, die mit einem Kernlokalisierungssignal überlappt (Gillock et al., 1998).Die Strukturproteine der Polyomaviren sind unterschiedlich posttranslational modifiziert. Das Hauptstrukturprotein VP1 ist beim murinen Polyomavirus und SV40 phosphoryliert und acetyliert (Bolen et al., 1981; Anders et al., 1983; Garcea et al., 1985; Fattaey et al., 1989). Für das murine Polyomavirus wurde gezeigt, daß dessen VP1 Hydroxyprolin enthält (Ludlow et al., 1989). Bei Co-Expression der Strukturproteine in Insektenzellen


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konnte gezeigt werden, daß die Modifikation des Hauptstrukturproteins VP1 von VP2 beeinflußt wird (Forstova et al., 1993). Das VP2 des Mauspolyomavirus trägt am N-terminalen Glycin-Rest eine Myristylierung (Streuli et al., 1989). Diese Modifikation am VP2 ist für eine effiziente Infektion von Mauszellen durch Mauspolyomavirus notwendig (Krauzewicz et al., 1990; Forstova et al., 1993). Die genannten Modifikationen finden sehr wahrscheinlich vor dem eigentlichen Virusassembly statt (Leavitt et al., 1985).

1.2.4 Das Hamster-Polyomavirus

Das Hamster-Polyomavirus (HaPV) wurde erstmals von Graffi (Graffi et al., 1967 und 1968) als ätiologisches Agens spontan auftretender papillomatöser Tumoren der Haut beschrieben, die in einer in Berlin-Buch geführten Goldhamsterzucht (Z3/Bln) beobachtet wurden. Bei 5-10 % der 6-9 Monate alten Tiere entwickelten sich multiple papillomatöse Wucherungen im Bereich des Unterkiefers, die sich innerhalb weniger Wochen über den gesamten Körper des Tieres ausbreiteten. Die Tumoren gehen von Zellen des Haarwurzelepithels aus. Als Ursache des gehäuften Auftretens der Geschwülste wurde eine Aktivierung und Anreicherung eines im Hamsterembryonen-Material latent vorhandenen Papovavirus angenommen, da im tumorösen Gewebe ein im Durchmesser ca. 45nm großes, pseudokristallin angeordnetes Virus nachgewiesen werden konnte (Graffi et al., 1967). Aus den Epitheliomen konnten große Mengen an Viruspartikeln isoliert werden (Graffi et al., 1969).Die Virionen sind sphärisch mit einem Durchmesser von ca. 45nm und enthalten ein zirkuläres ds-DNA-Molekül mit einem Molekulargewicht von rund 3,1x106 (Scherneck et al., 1987). Nach subkutaner Injektion von HaPV in neugeborene Hamster aus einer anderen, in Potsdam gezüchteten Hamsterkolonie (HaP-Hamster) ergab sich ein überraschender Befund. In 60-80% der behandelten Tiere wurden nach einer Latenzperiode von 4-6 Wochen Lymphome induziert (Graffi et al., 1968). Im Unterschied zu den Epitheliomen, in denen reife HaPV-Partikel produziert werden, werden in Lymphomen große Mengen extrachromosomaler HaPV-DNA akkumuliert, ohne daß Viruspartikel nachgewiesen werden können (Scherneck et al., 1987; Prokoph et al. 1996., und 1997). Ein ähnlicher Verlauf der Tumorentstehung wurde auch in Hamsterkolonien in den USA beschrieben (Courtneidge et al., 1991). Für das Genom des HaPV transgene Mäuse entwickelten auch Epitheliome und Lymphome (Courtneidge et al., 1991). Die extrachromosomale HaPV-DNA in den Lymphomen enthält charakteristische Deletionen, von denen die regulatorische Region und benachbarte kodierende Sequenzen der späten Region des HaPV-Genoms betroffen sind (Scherneck et al., 1987). Diese Deletionen in der späten Region könnten die Ursache dafür sein, daß in HaPV-induzierten Lymphomen keine Viruspartikel gebildet werden können (Scherneck et al., 1987). Die HaPV-vermittelte Induktion von Lymphomen in HaP-Hamstern wird möglicherweise durch die Wechselwirkung des middle T mit p59fyn (Tyrosin-Kinase in Lymphocyten) vermittelt (Courtneidge et al., 1991). Obgleich die Induktion von Lymphomen und Leukämien in hemopoietischen Zellen und Epitheliomen in undifferenzierten Keratinozyten einzigartig unter den Polyomaviren ist (de la Roche Saint Andre et al.,1990 und 1993), wurde ein Lymphotropismus auch für andere Polyomaviren beschrieben. So kann SV40 bei intravenöser Injektion in Syrische Hamster ein breites Spektrum von hemopoietischen Tumoren induzieren (Diamandopoulos et al., 1972). Das aus B-Lymphoid-Zelllinien von Affen isolierte lymphotrope Papovavirus LPV kann nur in hemopoietischen Zellen replizieren (Pawlita et al., 1985).


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Das DNA-Genom des Hamsterpolyomavirus ist aus Virionen, die aus einem Pool von Epitheliomen isoliert wurden, in einen E. coli-Vektor kloniert (Zimmermann et al., 1984) und sequenziert worden (Delmas et al., 1985). Das virale Genom ist ein doppelsträngiges zirkuläres DNA-Molekül mit einer Länge von 5,366 bp (Scherneck et al., 1987). Das virale Genom von HaPV ist ähnlich wie das Genom des murinen Polyomavirus Py aufgebaut. Nach dem Zeitpunkt der Genexpression ist das Genom von HaPV in zwei Regionen gegliedert: Die frühe Region kodiert 3 Proteine, large T-, middle T- und small T- Antigen, die für Immortalisierung (large T) und Transformation (middle T, small T) verantwortlich sind (Gouterbroze et al., 1992). Die späte Region kodiert die 3 Strukturproteine VP1, VP2 und VP3. Zwischen später und früher Region ist die regulatorische Region mit Origin, Promotoren für frühe und späte Region und Enhancer-Elementen lokalisiert (Delmas et al., 1985).

Untersuchungen zur evolutionären Verwandtschaft des Hamster-Polyomavirus zu anderen Polyomaviren (murines Polyomavirus Py, BKV, JCV ) über Sequenzvergleiche und Hetero-duplex-Analysen ergaben besonders auffällige Homologien vor allem in kodierenden Bereichen für das Hauptkapsidprotein VP1 und für das large T, was auf die besondere Bedeutung dieser Genprodukte für die Replikationsfähigkeit der Polyomaviren hinweist. Sowohl die VP1 als auch die large T-Antigen-kodierende Sequenz stehen unter hohem Selektionsdruck im Hinblick auf die Zusammensetzung des viralen Kapsids und der spezifischen Funktion des T-Antigens für die virale DNA-Replikation (Vogel et al., 1986).

Abb. 2: Lokalisation der kodierenden Abschnitte für die frühen Proteine large T, middle T und small T und für die späten Proteine VP1, VP2 und VP3 im HaPV-Genom ( nach Delmas et al. ., 1985).

Die nicht-kodierenden Bereiche sind durch einfache Linien; durch differenziertes Spleißen der prä-mRNA ausgeschnittene Introns sind durch Wellenlinien angedeutet.


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1.2.5 Polyomavirus-abgeleitete Partikel als Transportersysteme in der Gentherapie

Als Somatische Gentherapie werden alle Verfahren bezeichnet, die die Korrektur eines genetischen Defektes ausschließlich in somatischen Zellen (Körperzellen) zum Ziel haben. Die dadurch entstandenen genetischen Veränderungen können daher nicht an die nächste Generation weitergegeben werden. Praktisch laufen alle Therapieansätze darauf hinaus, ein intaktes Gen in genetisch defekte Zellen einzuschleusen und dort in einer Weise zur Expression zu bringen, daß die Fehlfunktionen des defekten Gens ausgeglichen werden (Crystal et al., 1995). Das erste gentherapeutische Experiment bei einer monogen bedingte Erbkrankheit wurde 1990 mit der Behandlung eines jungen Mädchens, das an Adenosindesaminase-Mangel litt, in den USA begonnen (Anderson et al., 1992; Morgen et al., 1993). Weltweit werden gegenwärtig viele verschiedene gentherapeutische Ansätze in Kliniken durchgeführt. Bisher ist es jedoch mit keiner der angewendeten Methoden gelungen, einen signifikanten und dauerhaften Heilungsprozeß einzuleiten. Das gegenwärtige Hauptproblem der Gentherapie ist das Erreichen einer möglichst hohen Aufnahmerate des genetischen Materials durch die Empfängerzelle. Zur Einschleusung von DNA in Zellen stehen grundsätzlich zwei Verfahren zur Verfügung: der virale und der nicht-virale Gentransfer (Schofield et al., 1995).

Bei viralen Transfermethoden werden genetisch modifizierte Viren (virale Vektoren) als Transportvehikel genutzt (Klein et al., 1997). Besonders geeignet dafür sind Viren, die ihr Genom im Verlauf des viralen Replikationszyklus stabil in die Chromosomen der Wirtszelle integrieren. Die stabile Integration könnte somit eine dauerhafte Expression des Fremdgens ermöglichen. Der DNA-Transfer mit Hilfe viraler Systeme ist grundsätzlich effektiver als der Transfer mit physikalisch-chemischen Methoden. Als Transportersysteme für die gentherapeutisch wirksamen Nukleinsäuren wurden bisher vor allem Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren verwendet (Klein et al., 1997). Ein großer Vorteil der retroviralen Vektoren in der Gentherapie ist deren hocheffiziente Transfektion von teilungsfähigen Zellen, die Integration der retroviralen Vektoren in das Wirtsgenom und die daraus resultierende stabile Expression der Fremdgene. Die Hauptnachteile der retroviralen Vektoren liegen in deren Unfähigkeit, nicht-teilungsfähige Zellen zu infizieren, und ihrer Inaktivierung durch das Komplementsystem. Desweiteren sind bei Virusvermehrung nur geringe Titer zu erreichen (Wickham et al., 1997). Eine Gefahr bei in vivo-Anwendungen retroviraler Vektoren ist das Rearrangement des viralen genetischen Materials zu replikationsfähigen Viruspartikeln und die Insertionsmutagenese (Crystal et al., 1995). Adenoviren können als Transportvehikel genutzt werden, um in vivo-Gentherapien auch an nicht-replizierenden Zellen durchzuführen (Short et al., 1994). Weil Adenoviren jedoch nicht in das Genom der Wirtszellen integriert werden, wurde nur eine instabile Genexpression der transferierten DNA beobachtet (Mulligan et al., 1993). Neben dem bereits erwähnten Risiko der Entstehung infektiöser Viruspartikel ist ein weiterer entscheidender Nachteil viraler Vektorsysteme ihre starke Immunogenität (Crystal et al., 1995). Dadurch können die Virusvektoren nach mehrmaliger Applikation relativ schnell durch das Immunsystem eliminiert werden (Short et al., 1994). Darüber hinaus weisen die bisher verwendeten Viren eine geringe Zellspezifität auf (Klein et al., 1997). Neben Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierten Viren konnten auch Baculoviren als Transportvehikel in der Gentherapie eingesetzt werden, die jedoch in humanen Zellen nicht repliziert werden (Shoji et al., 1997; Hofmann et al., 1995).


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Als Alternative sind nicht-virale Transfermethoden entwickelt worden (Morgan et al., 1993). Im Gegensatz zu den viralen Transfermethoden wird bei nicht-viralen Transfermethoden kein unerwünschtes genetisches Material in die Zellen eingeschleust (Morgen et al., 1993). Nicht-virale Transfermethoden sind insbesondere für den in vivo-Einsatz geeignet. Der Nachteil des nicht-viralen Gentransfers ist die fehlende Integration des transferierten DNA-Fragments in den Zellen (Morgen et al., 1993). Deshalb konnten stabile Expressionsraten des transferierten

Gens über längere Zeiträume noch nicht erzielt werden. Als nicht-virale Gentransfermethoden sind insbesondere kationische Liposomen, direkte DNA-Injektion und ein rezeptorvermittelter Gentransfer eingesetzt worden (Schofield et al., 1995). Die Wirksamkeit des rezeptorvermittelten Gentransfers wurde erfolgreich an Leberzellen (Hepatocyten) gezeigt (Wagner et al., 1992; Engelhardt et al., 1994; Perales et al., 1994).

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) insbesondere auf der Basis von Polyomavirus-Kapsiden, stellen eine neue Entwicklung bei den gentherapeutischen Transportsystemen dar (Forstova et al., 1995; Strayer et al., 1996; Sandalon et al., 1997; Soeda et al., 1998; Stokrova et al., 1999; Braun et al., 1999). Diese Partikel enthalten keine virale Nukleinsäure und sind deshalb nicht infektiös. Das VP1 verschiedener Polyomaviren assemblierte nach heterologer Expression in Insektenzellen zu VLPs (Montross et al., 1991; Forstova et al., 1993; Kosukegawa et al., 1996). In E. coli exprimiertes VP1 des murinen und aviären Polyomavirus bildete Kapsomere, die anschließend in vitro assembliert werden konnten (Salunke et al.,1986 und 1989; Rodgers et al., 1994).

Die gereinigten VP1-abgeleiteten VLPs können in vitro sehr einfach in die einzelnen Komponenten (Kapsomere) zerlegt und anschließend wieder zusammengesetzt werden. Die Möglichkeit während des Reassoziationsschrittes DNA in die VLPs zu verpacken, macht sie zu einem attraktiven Transportsystem für die Gentherapie. Die DNA-Verpackung erfolgt im Rahmen einer Abfolge von Dissoziations- und Reassoziationschritten. In verschiedenen Zelltests wurden keine bzw. nur sehr geringe toxische Nebeneffekte beobachtet, eine grundsätzliche Voraussetzung für den möglichen Einsatz als Transportersystem. In weiteren Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß die verpackte DNA mittels der VLPs effizient in verschiedene Zellinien eingeschleust werden kann (Goldmann et al., 1999).

1.3 Zielstellung der Arbeit

Ziel dieser Promotionsarbeit war die Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) als Träger für Fremdproteinsequenzen (zur Anwendung in der Vakzineentwicklung) und für fremde Nukleinsäure (in der Gentherapie). Die VLPs sollten auf der Basis des Kapsidproteins VP1 des Hamsterpolyomavirus hergestellt werden. Dazu sollte das VP1 in Insektenzellen synthetisiert, gereinigt und seine Assemblierung untersucht werden. Durch Vorhersage und Kartierung von Epitopen sollten potentielle Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1-Träger bestimmt werden.


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Mon Oct 7 15:38:59 2002