Siraj, Hassen: “Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“

12

Kapitel 2. Materialien und Methoden

2.1 Biologische Materialien

2.1.1 Tumorgewebe

Das Tumorgewebe wurde von Papillom-tragenden Z3-Hamstern entnommen. Die Papillome wurden an Rücken, Bauch, Extremitäten, Kieferregion, Unter- und Oberkiefer, Kopf (Stirn, zwischen den Ohren, Nacken, Hals), Augenlidern und zum Teil auf der gesamten Körperoberfläche gefunden. Die entnommenen Papillome wurden bis zur weiteren Verwendung bei
-20°C gelagert.

2.1.2 Lebergewebe

Lebergewebe wurde von HaPV-freien HaP-Hamstern entnommen. Nach Entnahme wurde das Lebergewebe bei -20°C aufbewahrt.

2.1.3 Verwendete Plasmide

Für die Expression des HaPV-Kapsidproteins VP1 in E. coli wurden pQE-Vektoren (Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) verwendet. Sie enthalten ein optimiertes, regulierbares Promotor/ Operator-Element (E. coli-Phagen T5-Promotor, lac-Operator), eine synthetische Ribosomenbindungsstelle, einen Schwanz aus 6 Histidin-Kodonen, eine Maus-Dihydrofolatreduktase-kodierende Sequenz (Chang et al., 1978; Masters and Attardi, 1983), einen Polylinker, Translations-Stopkodonen in allen 3 Leserahmen, sowie den Replikationsorigin und das beta-Lactamase-Gen des Plasmids pBR322 (Sutcliffe, 1979).

Das mit pBacPak 9 (Clontech, CA, USA) bezeichnete Plasmid mit Polyhedrin-Promotor wurde für die Expression des HaPV-Kapsidproteins in Insektenzellen verwendet. Die Herstellung rekombinanter Baculoviren erfolgte mit Hilfe des Baculo-Gold-Systems (Pharmingen, San Diego, USA).

Die Plasmide pFR36-VP1/2-12 und pFR36-VP1/2-9 enthalten die komplette VP1-kodierende Sequenz des HaPV, beginnend mit dem authentischen (2.ATG) oder einem upstream (stromaufwärts) liegenden Translationsinitiationsssignal (1.ATG).


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2.1.4 Bakterienstämme

Alle Primärtransformationen erfolgten in den E. coli K12-Stamm XL-1Blue (supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA46 thi relA1 lac- F´[proAB lacIq lacZ DeltaM15 Tu (tetr )] ; Bullock et al., 1987).

Für die Expression der DHFR-Fusionsproteine wurden die pQE-abgeleiteten Plasmide in den Stamm M15pREP4 (Nal Str rif lac ara recA Uvr F ara gal mtl; Villarejo et al., 1974; Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) retransformiert.

2.1.5 Insektenzellen

Für die Proteinexpression im Baculovirussystem wurde die permanente Zellinie Sf9 von Spodoptera frugiperda benutzt.

2.1.6 Hamsterseren

Zur Epitopkartierung wurden Seren von HaPV-infizierten Z3-Hamstern verwendet, die durch das Vorhandensein bzw. Fehlen von Papillomen gekennzeichnet waren (Tab. 1 und 2).

Tab. 1: Übersicht über die pathologischen Befunde der untersuchten Z3-Hamster (Berlin-Buch)

Tiernummer

Geschlecht

Alter (in Tagen)

Papillom-Lokalisation

31

weiblich

268

Augenlid, Kieferregion und Ohren

33

weiblich

268

Augenlid, Kieferregion und Ohren

I533

männlich

483

Augenlid, Kieferregion und Ohren

I558

männlich

455

Kieferregion, Unter- und Oberkiefer

559

männlich

455

Unter- und Oberkiefer

486

männlich

631

auf der gesamten Körperoberfläche

I479

männlich

keine Angabe

Kieferregion, Unter- und Oberkiefer

521

männlich

keine Angabe

auf der gesamten Körperoberfläche

608

männlich

313

Kopf (Stirn, Ohren), Nacken und Hals

581

weiblich

369

Auf der gesamten Körperoberfläche


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Für die Gewinnung und Konservierung der Hamsterseren wurde das Blut in Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Das Vollblut wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt und anschließend für 5 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Überstand (Serum) wurde vorsichtig abgenommen und erneut 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Die Seren wurden in kleineren Portionen abgefüllt und bei -20 °C eingefroren.

Zur Kontrolle wurden Seren von nichtinfizierten HaP-Hamstern (2 weibliche Tiere: 78/1;78/3; 3 männliche Tiere: 78/2, 78/5,78/6) entnommen.

Tab. 2: Übersicht über die verwendeten Z3-Hamster ohne Papillombildung

Tiernummer

Geschlecht

Alter (in Tagen)

1

männlich

295

582

männlich

295

32

weiblich

268

I531

weiblich

483

I555

weiblich

455

556

weiblich

455

602

weiblich

308

607

männlich

308

456

männlich

682

457

männlich

682

523

weiblich

653

502

weiblich

232

595

männlich

317

598

weiblich

312

599

weiblich

312

600

männlich

312

616

weiblich

290

617

weiblich

290

618

weiblich

290


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2.1.7 Monospezifische Kaninchen-anti-VP1-Seren

Tab. 3: Herkunft der Kaninchen-anti-VP1-Seren

Serum

zur Verfügung gestellt von

Verdünnung

Anti-SV40

Dr. Lüke, Göttingen

1:500

Anti- JCV-VP1

Dr. Lüke, Göttingen

1:500

Anti-HaPV-VP1

Dr. Ulrich, Berlin

1:100

Anti-LPV-VP1

Dr. Pawlita, Heidelberg

1:500

Anti-Murines Polyomavirus

Dr. Pawlita, Heidelberg

1:100

2.1.8 Enzyme

2.1.9 DNA-Molekulargewichtsmarker

lambda-DNA HindIII Marker (MBI Fermentas)

Fragmente: 23130; 9416; 6557; 4361; 2322; 2027; 564; 125 bp

2.1.10 LMW Electrophoresis Calibration kit (Pharmacia,Freiburg, Deutschland)

Phosphorylase b

94 kDa

Bovines Serumalbumin

67 kDa

Ovalbumin

43 kDa

Carboanhydrase

30 kDa

Trypsininhibitor der Sojabohne

20,1 kDa

alpha-Lactalbumin

14,4 kDa


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2.2 Methoden zur Virusisolierung und Gewebeaufarbeitung

2.2.1 Reinigung von HaPV-Virionen (nach Böttger et al., 1971, modifiziert)

Zur Isolierung und Reinigung des HaPV wurden Papillome von HaPV-infizierten Z3-Hamstern verwendet. Dazu wurden 5 bis 10 g Tumorgewebe mit 30 ml PBS versetzt und 60 bis 90 min homogenisiert. Die Suspension wurde anschließend bei 10000 U/min zentrifugiert und der Überstand aufbewahrt. Das Sediment wurde erneut in 30 ml PBS aufgenommen und 10mal 5 bis 6 sec mit Ultraschall (20% Amplitude) behandelt. Dann wurde die Suspension zentrifugiert und die beiden Überstände vereinigt. Die Viruspartikel wurden bei 28000 U/min (3 Stunden bei 4 °C) pelletiert. Das Pellet wurde in 1 ml PBS aufgenommen und in einem Gradientengemisch von CsCl (Dichte: 1,46 g/ml) und Saccharose (Dichte: 1,1 g/ml) gereinigt. Die Gradientenfraktionen wurden im Western blot mit Hilfe von VP1-spezifischen Antiseren charakterisiert.

2.2.2 Herstellung von Lebergewebsproben

Als Negativkontrolle für die Analyse der HaPV-Proteine im Western Blot wurde Lebergewebe aus HaPV-freien HaP-Hamstern verwendet. Dazu wurden 2,5 g Lebergewebe mit dem Skalpell zerkleinert und in 3 ml PBS (pH 7,2) suspendiert und homogenisiert. Anschließend wurde die Suspension zentrifugiert (3000 U/min, 15 min, 4°C). Das Pellet wurde in 0,5 ml Probenpuffer suspendiert und bei 100 °C für 7 min gekocht. Nach starkem Vortexen wurde die Suspension bei 12000 U/min für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde für den Western blot eingesetzt.

2.3 Methoden der DNA-Isolierung und -Reinigung

2.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA

2.3.1.1 Mini-Präparation durch alkalische Lyse

Durch alkalische Lyse bakterieller Zellen kann die Plasmid-DNA nach Ausfällen der restlichen zelluläre Bestandteile, einschließlich chromosomaler DNA, isoliert werden (Sambrook et al., 1989).

Zu diesem Zweck wurden ausgehend von Einzelkolonien Kulturen in 2 ml LB-Medium über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Von dieser Kultur wurden dann 1,5 ml in ein Eppendorfgefäß überführt und 2 min (12000 U/min) bei Raumtemperatur sedimentiert. Das Bakteriensediment wurde durch alkalische Lyse nach einer Standardmethode von Sambrook et al., 1989 aufgeschlossen. Die DNA wurde in 20 µl Wasser mit RNase (20 µg/ml) aufgelöst und bei -20 °C gelagert


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2.3.1.2 Plasmid-Midipräparation durch Säulen-Chromatographie

Mit Hilfe dieser Methode konnten 200-250 µg Plasmid-DNA aus 50 ml Übernachtkultur gewonnen werden. Alle Arbeitsschritte erfolgten gemäß Standardprotokoll B des Herstellers (Talent, Trieste, Italien

2.3.2 Reinigung und Präzipitation von DNA

2.3.2.1 Phenol-Chloroform-Extraktion

Die Extraktion von DNA-haltigen wäßrigen Lösungen durch Phenol-Chloroform diente der Entfernung von Proteinen. Dazu wurde die DNA-haltige Lösung mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt und durch starkes Schütteln gemischt. Die wäßrige und organische Phase wurden durch Zentrifugation für 2 min bei 12000 U/min getrennt. Die wäßrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß überführt und die DNA durch Ethanolzugabe präzipitiert.

2.3.2.2 Ethanolpräzipitation

Zur Konzentrierung von DNA wurde DNA-haltige, wäßrige Lösung mit 1/10 Volumen

3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 3 Volumina 96 % Ethanol versetzt. Nach Inkubation über Nacht bei -20 °C wurde die DNA für 5 min bei 4 °C und 12000 U/min pelletiert. Das Pellet wurde mit 75 % (v/v) Ethanol gewaschen, bei Raumtemperatur getrocknet und in Wasser oder TE-Puffer aufgenommen.

2.3.2.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Zur Abschätzung der DNA-Konzentration wurde ein Aliquot der DNA-Präparation in einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt. Molekulargewichtsmarker mit bekannten Konzentrationen an DNA dienten dabei als Referenz. Zur genauen Konzentrationsbestimmung wurde die DNA-Lösung bei 260 nm spektralphotometrisch gemessen (LKB Ultrospec plus Spectrophotometer; Pharmacia, Freiburg, Deutschland).


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2.3.3 DNA-Klonierung

2.3.3.1 Restriktionsendonukleasespaltung

Zur analytischen Spaltung von Plasmid-DNA wurden 0,5-1,0 µg DNA eingesetzt; für präparative Zwecke wurden 5-10 µg DNA gespalten. Die Spaltungsansätze aus Wasser, Puffer (optimaler Puffer laut Hersteller-Protokoll), Restriktionsenzym und DNA wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.

2.3.3.2 Analytische Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Molekülen erfolgte in Abhängigkeit von den Größen der DNA-Fragmente in 0,8 bzw. 1,5 %igen Agarosegelen unter Zusatz von 0,5 µg/ml Ethidiumbromid in einer horizontalen Gelelektrophoresekammer GNA-100 in 1xTAE-Puffer. DNA-Proben wurden mit 1/6 Volumen Loadingpuffer gemischt und in die Probentaschen eingebracht. Die Elektrophorese wurde bei 80-100 V für 45-60 min durchgeführt.

2.3.3.3 Präparative Agarosegelelektrophorese und DNA-Fragment-Isolation

Die Agarosegelelektrophorese wurde auch zur Auftrennung und Reinigung von DNA-Fragmenten im präparativen Ansatz benutzt. Nach elektrophoretischer Auftrennung der Restriktionsfragmente wurde das gewünschte DNA-Fragment mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten. Die Isolierung der DNA wurde mit Hilfe des Jetsorb Gel Extraction Kit (Jetsorb Kit; Genomed, Bad Oeynhausen, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

2.3.3.4 Dephospholierung der Vektor-DNA

Zur Verhinderung der Rezirkularisierung von linearisierter Vektor-DNA wurde eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestinal phosphatase) nach folgendem Schema durchgeführt:

Spaltungsansatz

30-50 µl

10x Puffer

10 µl


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alkalische Phosphatase (1U/µl)

1 µl

Wasser auf

100µl

Der Reaktionsansatz wurde 90 min bei 37 °C inkubiert. Durch Hitzeinaktivierung (5 min bei

65 °C) wurde die Reaktion gestoppt und eine Phenolextraktion durchgeführt. Dazu wurden 500 µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) und 400 µl bidestilliertes Wasser zugesetzt und 5 min kräftig geschüttelt. Der Ansatz wurde kurz zentrifugiert. Die im Überstand enthaltene DNA wurde mit Ethanol präzipitiert. Das DNA-Pellet wurde in 20 µl TE-puffer (10 mM Tris-HCl , pH 8.0; 0,5 mM EDTA) resuspendiert.

2.3.3.5 Ligation

Zur kovalenten Verknüpfung von Vektor- und Fragment-DNA wurde nach folgendem Schema ein Ligationsansatz hergestellt:

Vektor

100 ng

Fragment

(3-5facher molarer Überschuß)

10xLigasepuffer

2 µl

T4-DNA-Ligase (1 U/µl)

0,5 µl

mit sterilem Wasser auf

20 µl

Die Reaktion fand über Nacht (18-20 Stunden) im Wasserbad bei 14-16 °C statt.

2.3.3.6 Herstellung kompetenter Zellen

Die Ein-Schritt-Präparation von kompetenten E. coli-Zellen erfolgte nach Chung et al. (1989). Fünf Kolonien der Bakterien-Stammkultur wurden von einer Agarplatte in 2 ml LB-Medium (1 % Bactrotrypton, 0,5 % Hefe-Extrakt, 0,5 % NaCl; pH 7,5) überimpft und über Nacht geschüttelt (205-220 U/min, innova TM 4330 Schüttler, New Brunswick Scientific). Die Übernachtkultur wurde anschließend 1:50 in 50 ml LB-Medium verdünnt. Beim Erreichen der logarithmischen Wachstumsphase (OD600=


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0,3-0,4) nach ca. 90 min wurden die Zellen für 10 min auf Eis inkubiert und anschließend 10 min bei 1500 U/min abzentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet vorsichtig in 5 ml 1xTSS Medium (LB-Medium pH 6,5 mit 10 % (w/v) PEG 8000, 5 % DMSO, 50 mM MgCl2) resuspendiert. Die Bakterien wurden schockgefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.

2.3.3.7 Transformation

Kompetente E. coli-Zellen wurden im Eisbad aufgetaut. Die zu transformierende DNA wurde zu 100-200 µl Zellen dazugegeben und der Ansatz dann 40 min in einem Eisbad inkubiert. Zur Kontrolle der Antibiotikawirksamkeit in den Selektionsplatten wurde ein Ansatz ohne Zugabe von DNA mitgeführt. Es folgte ein Hitzeschock für 90 Sekunden bei 42 °C und eine 2 minütige Inkubation auf Eis. Anschließend wurde der Ansatz mit vorgewärmtem SOC-Medium auf 0,5 bzw.1 ml aufgefüllt und für 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt. Nach dem Ende des einstündigen Schüttelns wurden zuerst 100 µl mit einem Drigalskispatel gleichmäßig auf Selektions-LB-Agarplatten (für XL-1Blue-Zellen mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Tetracyclin und für M15pREP4-Zellen mit 100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin) verteilt. Der Rest der Probe wurde 10 Sekunden bei 12000 U/min zentrifugiert, 300 bzw.800 µl Überstand verworfen und nach Resuspendieren im verbliebenen Medium auf eine weitere Selektionsplatte ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.

2.3.3.8 Charakterisierung der rekombinanten Klone

Die aus rekombinanten Bakterien isolierte Plasmid-DNA (siehe 2.3.1.1) wurde mit entsprechenden Restriktionsendonukleasen gespalten und damit auf Insertion eines HaPV-VP1-kodierenden Fragmentes und dessen Orientierung getestet.

2.3.4 Arbeiten mit Zellkulturen

2.3.4.1 Kultivierung der Insektenzellen

Die permanente Zellinie Sf9 von Spodoptera frugiperda (freundlicherweise von Prof. Schmidt, Institut für Immunologie und Biochemie, FU Berlin, überlassen) wurde mit TC 100-Medium mit einem Zusatz von 10% FKS in 50-ml-Kulturflaschen kultiviert. Den in den Versuchen eingesetzten Kulturen wurden 100 µg/ml Ampicillin und 100 µg/ml Streptomycin zum Medium zugegeben. Die Kulturen wurden in einem Schüttler bei 28 °C inkubiert.


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2.3.4.2 Cotransfektion von Insektenzellen

Bei der Cotransfektion wurde eine deletierte Baculovirus-DNA, Baculo-Gold (Pharmingen, San Diego, USA), eingesetzt, die ohne Rekombination mit dem Transfervektor nicht vermehrungsfähig ist, so daß alle, nach der Cotransfektion entstehenden Viren das Fremdgen tragen sollten. Die Transfektion erfolgte nach der Lipofectin-Methode. Dazu wurden 0,25 µg Baculo-Gold-DNA und 1,25 µg Transfervektor-DNA, die das klonierte Fremdgen trägt, mit

6 µl Lipofectin versetzt und gemischt. Als Negativkontrolle wurden 1,25 µg Plasmid-DNA transfiziert. In 60 mm-Kulturschalen wurden 1,6x106-Zellen ausgesät. Das Medium wurde entfernt und die DNA-Lösung dem Medium tropfenweise zugesetzt. Anschließend wurde die Kultur eine Stunde bei 28 °C inkubiert. Die Lösung wurde wieder entfernt und der Zellrasen mit 2 ml TC 100-Medium (mit 10% FKS und Antibiotika) überschichtet. Die Kulturen wurden für 3 Tage bei 28 °C inkubiert. Der Zellkulturüberstand wurde für die weitere Isolierung und Vermehrung der Viren bei 4 °C aufbewahrt. Die Zellen wurden auf Fremdproteinexpression untersucht.

2.3.4.3 Plaquereinigung rekombinanter Baculoviren

Die aus der Cotransfektion erhaltenen rekombinanten Baculoviren konnten mit Hilfe eines Plaquetests gereinigt werden. 1,6x106 Sf9-Zellen wurden zur Anheftung für 1-2 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des Mediums wurden 500 µl des Transfektionsüberstandes (1:101 bis 1:106 mit TC100-Medium verdünnt) auf den Zellrasen getropft. Die Kulturen verblieben eine Stunde bei 28 °C. Danach wurde der Überstand abgesaugt und die Kultur mit 2 ml eines halbfesten Überschichtungmediums, dem sogenannten “overlay“, aus einem Teil 2 % Sea-Plaque-Agarose in PBS und einem Teil TC 100-Medium mit 10% FKS, 100 µg/ml Ampicillin und 100 µg/ml Streptomycin überschichtet. Bis zum Erstarren der Agarose wurden die Kulturen bei Raumtemperatur belassen. Damit das Überschichtungsmedium nicht austrocknete, wurden die Kulturschalen mit Klarsichtfolie abgedeckt und so 5 bis 6 Tage bei 28 °C inkubiert. Um die durch die Virusvermehrung entstandenen Plaques sichtbar zu machen, wurden die lebenden Zellen mit Neutralrot angefärbt. Dies geschah durch Überschichten mit einer Neutralrot-Lösung (verdünnt 1:20 in PBS). Nach 6-stündiger Inkubation erschienen die Plaques als helle Bezirke im rot gefärbten Zellrasen. Mit einer sterilen Pasteurpipette wurde Zellmaterial aus diesen Plaques entnommen und in 1 ml TC100-Medium suspendiert. Aus dieser Suspension wurden Verdünnungen von 1:101 bis 1:106 in TC100-Medium hergestellt. Die beschriebene Reinigung wurde dreimal hintereinander durchgeführt.


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2.3.4.4 Virusvermehrung

Um größere Mengen von Virussuspensionen mit hohem Titer zu gewinnen, wurden in 100-ml-Kolben 1,9x108 Sf9-Zellen eingesät. Die Suspensionskultur von Sf9-Zellen wurde mit einer moi <1 der rekombinanten Baculoviren infiziert und 5 Tage bei 27 °C inkubiert. Zellkulturüberstand und Zellmaterial wurden durch 20 minütige Zentrifugation bei 2500 U/min getrennt. Der Viruspartikel-enthaltende Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C aufbewahrt. Das Zellsediment wurde nach zweimaligem Waschen mit PBS bei -20 °C eingefroren.

2.3.5 Expression des HaPV-VP1 in E. coli

2.3.5.1 Synthese von rekombinanten VP1-Proteinen mittels pQE-Vektoren

Für die Expression der rekombinanten VP1-Proteine wurden pQE-Vektoren (Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) verwendet (siehe 2.1.3). Die exprimierten Proteine tragen einen aus 6 Histidin-Resten bestehenden Schwanz am N-Terminus, wobei die schwach immunogene DHFR das Fusionsprotein während der Expression stabilisiert und seine Antigenität steigert.

Abb. 1: Schematische Darstellung der pQE-Vektoren ( nach Crowe and Henco, 1992)

Eine Einzelkolonie von pQE-Plasmid-tragenden M15pREP4-Zellen wurde in 2 ml LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin) angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Die Übernachtkultur wurde 1:4 mit LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin) verdünnt und bei 37 °C für weitere 90-120 min geschüttelt. Durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 1mM)


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wurde die Synthese der HaPV-VP1-DHFR-Fusionsproteine induziert. Zur Kontrolle der Induktion der Fusionsproteinsynthese wurden jeweils eine Positivkontrolle (pQE40-transformierte M15pREP4-Zellen mit Zugabe von 1 mM IPTG) und eine Negativkontrolle (Bakterienkultur ohne IPTG-Zugabe) mitgeführt. Durch die Entnahme von Aliquots zu unterschiedlichen Zeiten konnte eine Induktionskinetik verfolgt werden. Die Induktionszeit betrug in der Regel 4 bis 5 Stunden.

2.3.5.2 Lyse der Bakterienzellen

Die Bakteriensuspension wurde 1 min bei 4 °C (12000 U/min) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in Probenpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 6,8; 2%SDS; 5% 2-Mercaptoethanol und 10% Glycerin) resuspendiert. Nach 4-5 min Vortexen wurde das Lysat im Wasserbad bei 100 °C für 10 min gekocht. Die Proben wurden bei -20 °C aufbewahrt.

2.3.6 Proteinanalytik

2.3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Zur Analyse und Größenbestimmung wurden Proteine mittels 15%iger SDS-PAGE im diskontinuierlichen Puffersystem (Laemmli, 1970) aufgetrennt. Vor der SDS-PAGE wurden die Proben in Probenpuffer erhitzt (siehe 2.3.5.2). Nach dem Auftragen der Proben (Probenvolumen: 15-20 µl) wurden die Platten in die vertikale Elektrophoresekammer Protean IIxi (BIO-RAD, München, Deutschland) eingespannt und der Laufpuffer in die Kammer eingefüllt. Zum Einwandern der Proben in das Sammelgel wurde zunächst eine Spannung von 100V gewählt. Die Trennung der Proteine erfolgte bei 200 V ( Laufzeit 3,5-4 Stunden)

2.3.6.2 Western Blot-Analyse

Nach der SDS-PAGE wurden die Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) übertragen (geblottet). Zum Transfer der Proteine auf den Nitrocellulose-Filter wurde ein Sandwich aus mehreren in verschiedenen Puffern getränkten Filterpapier-Lagen arrangiert. Die erste Lage bestand aus zwei Kathodenpuffer (0,025 M Tris-HCl, pH 9,4; 1.1 % (w/v) Glycin, 20 % (v/v) Methanol) getränkten 3 MM-Filterpapier-Streifen, die auf die untere Elektroden-Platte des Blot-Gerätes gebracht wurden. Es folgte das in Kathodenpuffer equilibrierte Gel. Danach wurde das Gel mit einem der Größe des Gels entsprechenden Blatt Nitrocellulose, das vorher mit bidestilliertem Wasser benetzt worden war, bedeckt. Abschließend folgten zwei in Anodenpuffer I (0,3 mM Tris-HCl, pH 10,4;


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10 % Methanol) getränkte 3 MM-Filterpapier-Streifen und zwei in Anodenpuffer II (25 mM Tris-HCl, pH 10,4; 10 % (v/v) Methanol) getränkte 3 MM-Filterpapier-Streifen. Der Transfer erfolgte nach Aufsetzen der oberen Elektrodenplatte für 40 min bei 300 mA. Eine Kontrolle des Transfers war durch reversibles Anfärben der Nitrocellulose in Ponceau-S-Lösung möglich. Der Proteinmarker wurde in Amidoschwarz (40 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure, 0,01 % (w/v) Amidoschwarz) gefärbt. Um unspezifische Bindungen der Antikörper/Antiseren an die Nitrocellulose zu vermeiden, wurde die Membran nach dem Transfer 2 Stunden im Blocking-Puffer (5 % Trockenmilch, 0,01 % Natriumazid in PBS/Tween) inkubiert. Für den Nachweis von VP1-abgeleiteten Proteinen wurden polyklonale Kaninchen anti-VP1-Seren und Hamsterseren (siehe 2.1.7) verwendet. Sowohl die polyklonalen Kaninchen-anti-VP1-Seren als auch die Hamsterseren wurden entsprechend der in 2.1.7 angegebenen Verdünnungen eingesetzt und mit einem nativen E. coli-Totallysat vorinkubiert. Die Antikörper-Inkubation erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur.

Bei Verwendung der Hamsterseren wurde der Nitrozellulosefilter nach 3maligem Waschen (PBS-Tween) 4 Stunden mit einem POD-markierten anti-Hamster-Antikörper (1:250 in PBS-Tween) 4 Stunden inkubiert. Nach drei erneuten Waschschritten konnte entwickelt werden. Bei Verwendung der polyklonalen Kaninchen-anti-VP1-Seren wurde die Nitrocellulose nach 3maligem Waschen mit einem Schwein-anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert (PAP I, DAKO, Dänemark, 1:200, 2 Stunden). Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Tween erfolgte eine Inkubation mit einem Kaninchen-Peroxidase-anti-Peroxidase Komplex (PAP II, DAKO, Dänemark, 1:400, 1 Stunde). Für die Farbreaktion wurde 4-Chloro-1-Naphthol (0,3 % w/v).in Methanol (Sigma, München, Deutschland) als Chromogen in Substratlösung (0,25% v/v H2O2; 0,75% w/v NaCl; 0,0028% Triethanolamin, pH 7,5 in H2O) verwendet. Die Substratreaktion wurde durch Spülen in Wasser gestoppt.

2.3.6.3 Coomassieblau-Färbung

Zum Nachweis von Proteinbanden nach SDS-PAGE wurde das Gel für 2 Stunden in einer Färbelösung [55 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure, 0,1 % (w/v) Coomassie brillant blue G-250 geschüttelt. Anschließend wurde das Gel unter mehrmaligem Wechseln der Entfärberlösung [10 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure] über Nacht entfärbt. Zur Haltbarmachung der Gele konnten diese nach vollständiger Entfernung des überschüssigen Farbreagenz getrocknet werden. Hierzu wurden die Gele für eine halbe Stunde in einer Ethanol/Glycerin-Lösung bei Raumtemperatur äquilibriert. Zur Trocknung wurden die Gele zwischen zwei Folien auf Trockenrahmen gespannt. Die Trocknung erfolgte für 1-2 Tage bei Raumtemperatur.


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2.3.6.4 Elektronenmikroskopie

Die elektronenmikroskoskopischen Untersuchungen wurden freundlicherweise in der Arbeitsgruppe von Herrn Dr. M. Özel am Robert Koch-Institut (Berlin) durchgeführt. Die Proben wurden zur elektronenmikroskopischen Untersuchung auf dünne, kohleverstärkte Trägernetze aus Kupfer aufgebracht (Grids). Die Untersuchungen der gereinigten Viruspartikeln und der rekombinanten Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate erfolgten mittels Negativkontrastierung. Die Negativkontrastierung wurde mit 1 % Uranylacetat durchgeführt. Die Analyse der Proben erfolgte mit dem Elektronenmikroskop EM10A (Zeiss, Deutschland). Es wurden Ausschnittsvergrößerungen von bis zu 1:500000 angefertigt.

2.3.6.5 N-terminale Sequenzierung des viralen VP1

Zur N-terminalen Sequenzierung des viralen VP1 wurden die Virionen durch Zugabe von Probenpuffer denaturiert und im 8 %igen SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran transferiert. Die VP1-spezifische Proteinbande wurde mit Coomassie blue gefärbt und ausgeschnitten. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 erfolgte nach der Methode der Edman-Degradation mit einem Gasphasen- Proteinsequenzierer 473A (Applied Biosystems).

2.3.7 Charakterisierung der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate

2.3.7.1 Reinigung der rekombinanten Proteine durch Gradientenzentrifugation

Die Reinigung der HaPV-VP1-Proteine erfolgte nach einer von Kosukegawa et al. (1996) beschriebenen Methode.

Die Insektenzellen wurden 72 Stunden nach Infektion mit den rekombinanten Baculoviren durch Zentrifugation sedimentiert. Das Sediment wurde dreimal mit PBS gewaschen und in Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,9; 100 mM NaCl; 30 mM CaCl2; 2 mM PMSF) suspendiert und 3mal 4 bis 5 sec mit Ultraschall (bei einer Amplitude von 20 %) behandelt und für 20 min bei 10000 U/min (4 °C) zentrifugiert (Sorvall RC5B; SS34-Rotor). Der Überstand wurde aufbewahrt. Das Sediment wurde in DOC-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,9; 100 mM NaCl; 1 mM CaCl2; 1 % Natriumdesoxycholat, 2 mM PMSF) resuspendiert und 30 min im Eisbad inkubiert. Die Suspension wurde erneut, wie oben beschrieben, zentrifugiert. Die vereinigten Überstände der beiden Extraktionen wurden für 3 Stunden bei 28000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 2ml Aufbewahrungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,9;


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100 mM NaCl; 1 mM CaCl2) resuspendiert und erneut bei 10000 U/min für 10 min zentrifugiert. Anschließend wurden 12 ml einer 20%igen Saccharoselösung (w/v; in Aufbewahrungspuffer) mit 2 ml des Überstandes überschichtet. Die Virus-ähnlichen Partikel wurden durch 4stündige Zentrifugation bei 32000 U/min (Beckman L7-55, SW40-Rotor) sedimentiert. Das Pellet wurde in 2 ml Aufbewahrungspuffer resuspendiert, auf einen Cäsiumchloridgradienten (1,38, 1,35, 1,32, 1,29,1,26 g/ml in Aufbewahrungspuffer) geschichtet und 16 Stunden bei 32000 U/min (Beckman L7-55, SW40-Rotor) zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, in der SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Western blot auf ihre Reaktivität mit einem VP1-spezifischen Serum getestet. Der Nachweis der Partikelbildung erfolgte elektronenmikroskopisch (siehe 2.3.6.4).

2.3.7.2 Untersuchung der DNA-Kontamination von VP1-Partikeln

Zum Nachweis einer möglichen Nukleinsäure-Kontamination von gereinigten VP1-Partikeln wurden diese zuerst mit RNase und DNase bei 37 °C für 30 min inkubiert. Die Nukleasen wurden durch Inkubation bei 70 °C für 10 min inaktiviert. Die Partikel wurden in Gegenwart von 50 µg Proteinase K und 50 µl Proteinase K-Puffer aufgeschlossen. Anschließend wurde das Enzym bei 95 °C für 10 min inaktiviert. Der Ansatz wurde mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt, gut gemischt und 3 min in einer Eppendorfzentrifuge bei 12000 U/min zentrifugiert. Die mögliche DNA-Kontamination in der wäßrigen Phase wurde durch Ethanol gefällt und im 0,8 %igen Agarosegel analysiert.

2.3.7.3 Untersuchung der subzellulären Lokalisation der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate

2.3.7.3.1 mittels Zellfraktionierung

Die subzelluläre Fraktionierung der Insektenzellen wurde nach einer von Schreiber et al. (1989) beschriebenen Methode, mit kleinen Modifikationen, durchgeführt. Zunächst wurden 4x106 Insektenzellen mit einer moi von 10 infiziert. Nach 3 Tagen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und durch Zentrifugation (4000 U/min ) für 1min pelletiert. Das Pellet wurde in 350 µl Puffer A (10 mM HEPES pH 7,9; 10 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 0,1 mM EGTA; 1 mM DTT; 0,5 mM PMSF) langsam resuspendiert und 15 min in Eis inkubiert. Danach wurden 30 µl 10 % NP40 dazugegeben. Die Suspension wurde kräftig gemischt, mit Ultraschall behandelt (Amplitude bei 20%) und bei 4800 U/min für 1 min zentrifugiert. Der Überstand, der die cytoplasmatische Fraktion und RNA enthält, wurde in ein neues Eppendorfgefäß transferiert. Das nukleäre Pellet wurde in 100 µl Puffer A resuspendiert, auf 0,5 M Saccharose geschichtet und bei 4800 U/min für 15 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 µl Puffer B (20 mM HEPES pH 7,9; 0,4 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT, 1 mM PMSF) resuspendiert und 30 min stark geschüttelt. Der Kernextrakt wurde bei 4800 U/min für 5 min zentrifugiert. Der Überstand (nukleäre Fraktion) wurde in ein neues Eppendorfgefäß übertragen.


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2.3.7.3.2 mittels Elektronenmikroskopie

Die Insektenzellen wurden mit einer moi von 10 infiziert und drei Tage bei 28 °C inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS abgelöst und 1 min bei 4000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen nach Fixieren mit 2 % Glutaraldehyd in PBS elektronenmikroskopisch untersucht.

2.3.7.4 Stabilität von VP1-abgeleiteten Partikeln

Durch Inkubation mit chelatbildenden Substanzen (EDTA bzw. EGTA) und DTT werden die Kapside der Polyomaviren in subvirale Untereinheiten dissoziiert. Die Stabilität der HaPV-VP1-Partikel sollte mit unterschiedlichen Konzentrationen der chelatbildenden Substanzen und DTT untersucht und elektronenmiskroskopisch dokumentiert werden. Dazu wurden die Partikel nach Zusatz von 10 mM EDTA/3 mM DTT bzw. 50 mM EDTA/20 mM DTT bei einer Temperatur von 37 °C für 15 bzw. 16 Stunden inkubiert. Im zweiten Versuch wurden Virus-ähnliche Partikel nach Zusatz von 50 mM EGTA und 20mM DTT bei einer Temperatur von 37 °C für 16 Stunden inkubiert.

2.3.7.5 Quantitative Proteinbestimmung

Bei der quantitativen Bestimmung nach Bradford (1976) wird das sich verschiebende Absorptionsmaximum von Proteinen (von 465 bis zu 595nm) durch die Bindung an den Farbstoff Coomassie Blau ausgenutzt.

Zur Erstellung einer Eichkurve wurde eine Verdünnungsreihe von bovinem Serumalbumin (BSA) in PBS im Bereich von 5 bis 100 µg hergestellt und nach Bradford-Reaktion bei 540 nm die Absorption spektralphotometrisch gemessen. Dazu wurden 100 µl der Proteinlösung mit 900 µl Bradford-Reagenz versetzt und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Extinktionen der Proben gegen einen Leerwert (100 µl PBS + 900 µl Bradford-Reagenz) gemessen. Somit konnten die ermittelten Extinktionswerte der zu untersuchenden Proteinproben mit Hilfe der BSA-Eichkurve in die entsprechenden Proteinkonzentrationen umgerechnet werden.


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Mon Oct 7 15:38:59 2002