Siraj, Hassen: “Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“

28

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Charakterisierung des Kapsids des Hamsterpolyomavirus

3.1.1 Reinigung und elektronenmikroskopische Charakterisierung des Hamsterpolyomavirus

Da es keine geeigneten Zellkulturen für die Vermehrung und Reinigung des HaPV gibt, erfolgte die Isolierung und Reinigung des HaPV aus Hauttumoren von HaPV-infizierten Hamstern wie unter 2.2.1. beschrieben. Die gereinigten Partikel wurden durch elektronenmikroskopische Untersuchungen charakterisiert. Mit Hilfe der Negativkontrastierung konnte gezeigt werden, daß die HaPV-Virionen einen Polyomavirus-typischen ikosaedrischen Aufbau zeigen. Der Durchmesser von HaPV beträgt ca. 45 nm (siehe Abb. 4a). Weitergehende Untersuchungen durch Schrägbedampfung offenbarten jedoch, daß das HaPV-Kapsid, im Gegensatz zu den Kapsiden anderer Polyomaviren, eine T=7-laevo Symmetrie besitzt (Abb. 4b und 4c).

Abb. 4: Elektronenmikroskopische Darstellung der gereinigten HaPV-Partikel nach Negativkontrastierung mit 1 % Uranylacetat (a), nach Schrägbeschattung (b) und Bestimmung der Virus-Symmetrie als T=7-laevo nach Schrägbedampfung (c)


29

Vergr. a, b: \|[KHgr ]\| 150,000, c: X 500,000, Aufn.: M. Özel (RKI, Berlin)

3.1.2 Analyse der Proteinzusammensetzung des HaPV-Kapsids

Zur Analyse der Proteinzusammensetzung des Viruskapsids wurden die gereinigten Partikel auf ein 15%iges SDS-PAGE aufgetragen. Im Coomassieblau-gefärbten Gel konnten Proteine mit Molekulargewichten (MG) von ca. 42, 36 und 25 kDa nachgewiesen werden (Abb. 5). Das Protein mit einem MG von ca. 42 kDa entspricht dem vorhergesagten MG des putativen VP1, während die zwei anderen Proteine wahrscheinlich die Kapsidproteine VP2 und VP3 darstellen (siehe Tab.4). Die Identität des VP1 konnte durch dessen Reaktivität mit Kaninchen-Seren, die gegen E. coli-exprimiertes verkürztes VP1 (AS 29-320 bzw. 133-320) hergestellt worden waren, belegt werden ( nicht gezeigt). Im Immunoblot mit Seren von HaPV-infizierten Z3-Hamstern konnten ebenfalls drei Proteine detektiert werden, die in ihren Molekulargewichten den vorhergesagten Proteinen VP1, VP2 und VP3 entsprechen (Abb. 6).

Durch densitometrische Analyse der Proteinzusammensetzung von gereinigten HaPV-Kapsiden konnte gezeigt werden, daß das VP1 das Hauptkapsidprotein darstellt. Das VP1 repräsentiert ca. 71 % der gesamten viralen Kapsidproteine. Neben diesen drei wahrscheinlichen Viruskapsidproteinen wurden in der SDS-PAGE Proteine mit niedrigeren Molekulargewichten (ca. 15-16 kDa) beobachtet. Diese Proteine könnten zelluläre Histone sein, die assoziiert mit der viralen DNA, in den Viruspartikeln enthalten sind (Abb.5).

Abb. 5: 15%ige SDS-PAGE von gereinigten HaPV-Partikeln.

Nach Reinigung wurden die Fraktionen, die Viruspartikel enthalten, nach steigender Konzentration der viralen Proteine auf die SDS-PAGE aufgetragen. Die viralen Kapsidproteine VP1, VP2 und VP3 sind durch Pfeile markiert.

M = Molekulargewichtsmarker


30

Tab. 4: Vorhergesagte und in der SDS-PAGE beobachtete Größen der viralen Kapsidproteine

Virale Proteine

vorhergesagte Länge

(in Aminosäuren)

vorhergesagtes MG

(in kDa)

beobachtetes MG in der SDS-PAGE

(in kDa)

VP1

384, 388*

41,8; 42,4

42

VP2

354

36,6

36

VP3

221

25,6

25

*im VP1-ORF existieren 2 in-frame Translationsinitiationsorte (siehe 3.1.4.).

Abb. 6: Nachweis der viralen Strukturproteine im Western Blot mit Seren von Hamsterpolyomavirus-infizierten Z3-Hamstern

-: Leber-Extrakt von HaPV-freien Hamstern; +: Gereinigte Viruspartikel

3.1.3 Bestimmung der N-terminalen Sequenz des viralen VP1

Die Vorhersage des VP1-ORF ergab 2 in-frame befindliche potentielle Translationsinitiationssignale (ATG), die nur durch 3 Kodonen voneinander getrennt sind (Abb.7a). Für die Klonierung und heterologe Expression des VP1 sollte deshalb zunächst die N-terminale Sequenz des authentischen viralen Proteins bestimmt werden. Die Sequenzierung des N-Terminus des viralen VP1 erfolgte nach der Methode der Edman-Degradation (siehe 2.3.6.5.). Die Sequenzierung ergab, daß die Translationsinitiation am 2. ATG des VP1-ORF erfolgt (Abb.7b). Daraus ergibt sich die Synthese eines 384 Aminosäuren langen VP1 (Abb. 7c). Interessanterweise stimmt somit die N-terminale Sequenz vom HaPV-VP1 mit der des VP1 vom murinen Polyomavirus Py überein (nicht gezeigt).


31

Abb. 7: Aminosäuresequenz des HaPV-VP1.

Aus dem Vergleich der vorhergesagten (a) und experimentell bestimmten (b) N-terminalen AS-Sequenz des VP1 wurde die komplette AS-Sequenz des VP1 abgeleitet (c).

3.1.4 Aminosäurehomologie der Kapsidproteine von HaPV zu denen anderer Polyomaviren

Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der Kapsidproteine des HaPV wurden mit denen von anderen Polyomaviren verglichen. Die VP1-Sequenz wurde als die am stärksten konservierte Sequenz zwischen den Polyomaviren gefunden (siehe Tab. 5). Diese große Aminosäuresequenzhomologie widerspiegelt wahrscheinlich die biologische Bedeutung dieses Proteins. Die stärkste Homologie zeigten die 3 HaPV-Kapsidproteine zu den jeweils entsprechenden Proteinen des murinen Polyomavirus Py (Stamm A3).

Tab. 5: Aminosäurehomologie zwischen den späten Proteinen des HaPV und denen anderer Polyomaviren (in %)

Virus

VP1

VP2

VP3

Murines Polyomavirus (A3)

65,5

44,6

45,4

LPV

57,9

36,8

41,0

BFDV

53,9

29,3

32,9

JCV

53,7

29,4

35,6

SV40

50,1

33,8

34,2


32

3.1.5 Immunologische Reaktivität der HaPV-Proteine mit Seren von HaPV-infizierten Hamstern

Die gereinigten Virusproteine wurden im Western Blot eingesetzt, um die Reaktivität von Seren HaPV-infizierter Z3-Hamster zu untersuchen. Dabei wurde als Negativkontrolle Lebergewebe aus nichtinfizierten HaP-Hamstern benutzt. Zur Untersuchung wurden zwei Gruppen von Seren herangezogen: Seren von Papillom-tragenden Z3-Hamstern und Seren von Z3-Tieren, die keine Papillome trugen (siehe 2.1.6). Mit Ausnahme des Serums I479 reagierten alle eingesetzten Seren der beiden Gruppen mit den Viruskapsidproteinen VP1, VP2 und VP3 (Tab. 6). Während das Serum I479 mit VP1 und VP3 reagierte, wurde keine Reaktivität mit dem VP2-Protein gefunden. Dagegen zeigten die Seren der nichtinfizierten HaP-Hamster keine Reaktivität mit den viralen Proteinen (nicht gezeigt).

Tab. 6: Reaktivität der Hamster-Seren mit HaPV-Strukturproteinen

Serum-Nummer

Papillom

Lebergewebe

VP1

VP2

VP3

33

mit Papillom

-

+++

+

+

I533

mit Papillom

-

+

+

+

I558

mit Papillom

-

+++

+

+

559

mit Papillom

-

+

+

+

486

mit Papillom

-

+

+

+

I479

mit Papillom

-

+

-

+

521

mit Papillom

-

+

+

+

608

mit Papillom

-

+

+

+

31

mit Papillom

-

+++

+

+

581

mit Papillom

-

+

+

+

32

ohne Papillom

-

+

+

+

I531

ohne Papillom

-

+

+

+

I555

ohne Papillom

-

+++

+

+

556

ohne Papillom

-

+++

+

+

I602

ohne Papillom

-

+++

+

+

I607

ohne Papillom

-

+++

+

+

I523

ohne Papillom

-

+++

+

+

502

ohne Papillom

-

+++

+

+

599

ohne Papillom

-

+++

+

+

600

ohne Papillom

-

+

+

+

1

ohne Papillom

-

+++

+

+

616

ohne Papillom

-

+

+

+

617

ohne Papillom

-

+

+

+

+++ = sehr starke Reaktivität
+ = starke Reaktivität
- = keine Reaktivität


33

3.2 Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln auf der Basis des VP1 vom HaPV

3.2.1 Klonierung der kodierenden Sequenzen für das authentische und ein N-terminal verlängertes VP1 des HaPV in pBacPak9

Für die Subklonierung im Baculovirus-Transferplasmid wurden die beiden Plasmide pFR36-VP1/2-12 und pFR36-VP1/2-9 ausgewählt, die das authentische bzw. das N-terminal verlängerte VP1 kodieren. Die resultierenden Baculovirus-Transferplasmide pBacPak9-VP1(2.ATG) und pBacPak9-VP1(1.ATG) enthalten eine VP1-kodierende Sequenz von 384 bzw. 388 AS, die im Fall des zweiten Plasmids am 5‘-Ende um 4 Kodonen verlängert ist.

Die VP1-kodierenden Sequenzen wurden als XbaI-Fragmente aus den genannten pFR36- abgeleiteten Plasmiden isoliert und in das XbaI-linearisierte Baculovirus-Transferplasmid pBacPak9 umkloniert (Abb.8). Die Insertion und Orientierung der eingebauten Fragmente wurde durch Spaltung mit Restriktionsenzymen anhand der Größe der entstehenden Fragmente bestimmt.

Abb. 8: Herstellung der Baculovirus-Transferplasmide, die das authentische bzw. das N-terminal verlängerte VP1 des HaPV kodieren.


34

3.2.2 Expression und Antigenität des HaPV-VP1 aus Insektenzellen

Für die Expression von Fremdgenen in Insektenzellen ist es notwendig, daß das Fremdgen durch homologe Rekombination zwischen Baculovirus-DNA und Transfervektor in das Baculovirus-Genom integriert wird. Zu diesem Zweck wurden Sf9-Zellen mittels Lipofectin-Methode mit 1,25 µg der jeweiligen Transfer-Plasmid -DNA [pBacPak9-VP1 (1.ATG) und pBacPak9-VP1 (2.ATG)] und 0,25 µg der Baculo-Gold-DNA cotransfiziert. Drei Tage nach der Infektion wurde der Zellkultur-Überstand geerntet und zur weiteren Infektion von Sf9-Zellen benutzt. Für die Überstände der mit Baculo-Gold und pBacPak9-VP1(1.ATG) bzw. pBacPak9-VP1(2.ATG) cotransfizierten Sf9-Zellen konnte ein Titer von 6x107 pfu/ml bzw. 3x107 pfu/ml ermittelt werden. In den Totallysaten der entsprechenden Zellen konnten mit Hilfe der SDS-PAGE Proteinbanden mit dem für VP1 erwarteten Molekulargewicht nachgewiesen werden (Abb. 9 Bahnen 5 und 6). Solche Proteinbanden wurden weder in nichtinfizierten Zellen noch in Baculovirus-Wildtyp-infizierten Zellen beobachtet (Bahnen 2 und 3). Im Western blot (Abb. 10a und 10b) entsprachen die Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate dem Molekulargewicht des viralen VP1 (ca. 42 kDa; Bahn 4). Die Identität der VP1-Proteinbanden wurde durch die immunologische Reaktivität mit einem Kaninchen-anti-HaPV-VP1(As 29-320)-Serum (Abb. 10a) und mit Seren von HaPV-infizierten Z3-Hamstern (Abb. 10b) belegt.

Abb. 9: SDS-PAGE zum Nachweis der HaPV-VP1-Expression in Insektenzellen.

Drei Tage nach Infektion von Sf9-Zellen mit AcNPV-WT (Bahn 3), AcNPV-VP1(2.ATG) (Bahn 5) , AcNPV-VP1 (1.ATG) (Bahn 6) wurden die Totallysate in einem 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Als Positivkontrolle diente das virale VP1 (Bahn 4), als Negativkontrolle mock-infizierte Sf9-Zellen (Bahn 2). Molekulargewichtsmarker (Bahn 1).


35

Sowohl das authentische als auch das N-terminal verlängerte VP1 zeigten eine starke Reaktivität mit Seren von Papillom-tragenden und Papillom-freien Hamstern (Tab.7). Neben der VP1-Bande des erwarteten MG wurden im Zellysat der mit AcNPV-VP1(2.ATG) (authentisches VP1) infizierten Sf9-Zellen im gefärbten Gel als auch im Western blot Proteinbanden mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet (Abb.10a bzw.10b , Bahn 4). Diese Proteine stellen wahrscheinlich Degradationsprodukte des authentischen VP1 dar. Durch die Untersuchung der Expressionskinetik konnte gezeigt werden, daß sowohl das authentische als auch das N-terminal verlängerte VP1 bereits 48 Stunden nach der Infektion im Lysat der exprimierenden Zellen vorliegen. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Expressionsrate zwischen den beiden Proteinen beobachtet (nicht gezeigt)

Abb. 10: Reaktivität der Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivate im Western blot mit Kaninchen-anti-VP1(As 29-320)-Serum (a) und einem anti-VP1-positiven Z3-Hamsterserum (b).

Totallysate von Sf9-Zellen, die mit AcNPV-WT (Bahn 2), AcNPV-VP1(2.ATG) (Bahn 4) und AcNPV-VP1(1.ATG) (Bahn 5) infiziert worden waren, sind in einem 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf Nitrocellulose geblottet worden. Als Kontrolle dienten virales VP1(Bahn 3) und mock-infizierte Sf9-Zellen (Bahn 1).


36

Tab. 7: Reaktivität der Baculovirus-exprimierten VP1-Derivate mit Seren von Papillom-tragenden und Papillom-freien Hamstern

 

 

Serum-nummer

Leber-gewebe

virales VP1

Baculovirus-exprimiertes N-terminal verlängertes VP1

Baculovirus-exprimiertes authentisches VP1

31

-

+

+

+

33

-

+

+

+

I533

-

+

+

n.t.

I558

-

+

+

+

599

-

+

+

+

486

-

+

(+)

(+)

I479

-

+

(+)

(+)

521

-

+

+

+

608

-

+

+

+

581

-

+

+

+

32

-

+

+

n.t.

I531

-

+

+

+

I555

-

+

(+)

+

556

-

+

+

+

I602

-

+

+

+

I607

-

+

+

+

I523

-

+

n.t.

n.t.

502

-

+

(+)

(+)

I598

-

+

+

+

600

-

+

+

+

1

-

+

+

+

618

-

+

+

+

+ = starke Reaktivität; - = keine Reaktivität

(+) = schwache Reaktivität; n.t. = nicht getestet


37

3.2.3 Nachweis der Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln in Insektenzellen

Die Bildung von HaPV-VP1-abgeleiteten Virus-ähnlichen Partikeln in Insektenzellen wurde mit Hilfe der Elektronenmikroskopie untersucht. Dazu wurden 3×108 Insektenzellen mit einer moi von 10 mit den rekombinanten Baculoviren infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Insektenzellen aufgeschlossen und die löslichen Proteine mit Hilfe eines Cäsiumchlorid-Gradienten fraktioniert (siehe 2.3.7.1). Sowohl für das authentische als auch für das N-terminal verlängerte VP1 konnte die Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln gezeigt werden (Abb. 11a bzw.11b). Die Virus-ähnlichen Partikel besitzen eine Größe von 45 nm und eine Dichte von 1,29-1,30 g/ml. Im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten wurden neben den Virus-ähnlichen Partikeln in geringerer Menge auch tubuläre Strukturen gefunden (siehe Abb. 11a).

Abb.11: Elektronenmikroskopische Darstellung von gereinigten Virus-ähnlichen Partikeln, die von authentischem VP1 (a) und N-terminal verlängertem VP1 (b) gebildet wurden.

Vergr.: x 60,000, Aufn.: M. Özel (RKI, Berlin)

3.2.4 Untersuchungen zur Stabilität und zu einer möglichen Kontamination der Virus-ähnlichen Partikel mit Nukleinsäure

Die Stabilität der VP1-abgeleiteten VLPs wurde durch mehrstündige Inkubation mit 10 mM EDTA/3 mM DTT bzw. 50 mM EDTA/20 mM DTT untersucht. In beiden Experimenten konnte keine Dissoziation der Partikel in Kapsomere beobachtet werden (Abb. 12a bzw. 12b). Dagegen wurden VP1-abgeleitete VLPs durch Zusatz von 50 mM EGTA und 20 mM DTT bei 37 °C für 16 Stunden partiell in Pentamere dissoziiert (Abb.12c bzw. 12d)


38

Abb.12: Elektronenmikroskopische Untersuchung der Stabilität der VP1-Partikel

a: authentisches VP1/50 mM EDTA + 20 mM DTT

b: N-terminal verlängertes VP1/50 mM EDTA+20 mM DTT

c: authentisches VP1/50 mM EGTA + 20 mM DTT

d: N-terminal verlängertes VP1 /50 mM EGTA+ 20 mM DTT

Vergr.: x 6 60,000. Pentamere sind durch Pfeile markiert. Aufn.: M. Özel (RKI, Berlin)

Zur Bestimmung einer möglichen DNA-Kontamination wurden die VP1-Partikel durch Proteinase K-


39

Behandlung aufgeschlossen, Phenol-Chloroform extrahiert und eventuell vorhandene DNA Ethanol-präzipitiert und im Agarosegel analysiert. Während in Partikeln, die vom N-terminal verlängerten VP1 gebildet wurden, keine Nukleinsäure-Kontamination nachgewiesen werden konnte, wurde in vom authentischen VP1 gebildeten Partikeln enkapsidierte Nukleinsäure mit einer Größe von ungefähr 5 kb nachgewiesen (Abb. 13 Bahn 2).

Abb.13: Untersuchung der DNA-Kontamination von gereinigten VP1-abgeleiteten Partikeln im Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel.

Es wurden VLPs, die von N-terminal verlängertem VP1 (Bahn 1) und authentischem VP1 (Bahn 2) gebildet wurden, aufgetragen.

M: Molekulargewichtsmarker lambda HindIII,

3.2.5 Kreuzreaktivität der Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivate mit gegen andere Polyomaviren gerichteten Antiseren

Für die Anwendung HaPV-VP1-abgeleiteter VLPs in Gentherapie und Vakzineentwicklung könnte deren Kreuzreaktivität mit dem VP1 anderer Polyomaviren von Bedeutung sein. Für die Untersuchung der Kreuzreaktivität des Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1 mit anderen Polyomaviren wurden Kaninchenseren verwendet, die gegen SV40 (Abb. 14), JCV-VP1 (Abb.15), LPV-VP1 und murines Polyomavirus (nicht gezeigt) hergestellt worden waren. Alle genannten Seren zeigten im Western blot eine starke immunologische Reaktivität mit beiden HaPV-VP1-Derivaten (Tab 8).


40

Abb.14: Nachweis der Kreuzreaktivität von Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1-Derivaten mit anti-SV40-Serum.

Totallysate von Sf9-Zellen, die mit AcNPV-WT (Bahn 3), AcNPV-VP1(2.ATG) (Bahn 5), AcNPV-VP1(1.ATG) (Bahn 6) infiziert worden waren, wurde in einem 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Als Kontrolle wurden aufgetragen: Lebergewebe von nichtinfizierten HaP-Hamstern (Bahn 1), HaPV-Viruslysat (Bahn 4), Baculovirus-exprimiertes LPV-VP1 (Bahn 7) und nicht-infizierte Sf9-Zellen (Bahn 2).

M: Proteinmarker

Abb.15: Western blot-Reaktivität des Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1 mit einem anti-JCV-VP1-Serum.

Totallysate von Sf9-Zellen, die mit AcNPV-WT (Bahn 2), AcNPV-VP1(2.ATG) (Bahn 4), AcNPV-


41

VP1(1.ATG) (Bahn 5) infiziert worden waren, wurde in einem 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Als Kontrolle wurden HaPV-Viruslysat (Bahn 3) und nicht-infizierte Sf9-Zellen (Bahn 1) aufgetragen.

M: Proteinmarker

Tab. 8: Kreuzreaktivität von viralem und Baculovirus-exprimiertem VP1 des HaPV mit anti-SV40, anti-JCV-VP1, anti-LPV-VP1, und anti-murines Polyomavirus-Seren

 

 



Antigene

Kaninchen
anti-SV40

Kaninchen
anti-JCV-VP1

Kaninchen
anti-LPV-VP1

Kaninchen
anti-murines
Polyomavirus

nicht-infizierte Sf9-Zellen

_

_

_

_

AcNPV-WT

_

_

_

_

Virales VP1

+

+

+

+

BaculoVP1
(2.ATG)

+

+

+

+

BaculoVP1
(1.ATG)

+

+

+

+

- = keine Reaktivität

+ = starke Reaktivität

3.2.6 Subzelluläre Lokalisation des Baculovirus-exprimierten HaPV-VP1 in Insektenzellen

3.2.6.1 Elektronenmikroskopische Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation

Im Replikationzyklus der Polyomaviren wird das Hauptkapsidprotein nach seiner Synthese im Cytoplasma zum Kern transportiert, um dort durch Enkapsidierung der viralen DNA assembliert zu werden (siehe 1.5). Zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation der in Insektenzellen exprimierten Hauptkapsidproteinderivate des HaPV wurden die Insektenzellen mit einer moi von 10 infiziert und drei Tage bei 28 °C inkubiert. Die Zellen wurden nach Fixieren mit 2% Glutaraldehyd elektronenmikroskopisch untersucht. Als Kontrollen wurden mock- und Baculovirus-(WT)-infizierte Insektenzellen in gleicher Weise behandelt und untersucht. Während in Insektenzellen, die das authentische oder das N-terminal verlängerte VP1 des HaPV exprimieren, Virus-ähnliche Partikel im Zellkern nachgewiesen werden konnten (Abb.16c und d), wurden in den Kontrollzellen solche Partikel nicht beobachtet (Abb.16a und b ).Während jedoch das N-terminal verlängerte VP1 hauptsächlich im Zellkern gefunden wurde (Abb.16d ), wurden in den Zellen, die das authentische VP1 exprimieren, nur wenige Partikel im Zellkern beobachtet (16c).


42

Abb. 16: Subzelluläre Lokalisation von HaPV-VP1 in Insektenzellen.

a: nicht-infizierte Insektenzelle

b: Wildtyp-infizierte Insektenzelle

c: AcNPV-VP1(2.ATG)-infizierte Insektenzelle

d: AcNPV-VP1(1.ATG)-infizierte Insektenzelle

VP1-Partikel sind durch Pfeile markiert. Aufn.: M. Özel (RKI, Berlin)

Vergr.: a, b: x 14,000; c, d: x 40,000


43

3.2.6.2 Zellfraktionierung zum Nachweis der subzellulären Lokalisation

Die subzelluläre Fraktionierung der Insektenzellen erfolgte nach einer Standardmethode (siehe 2.3.7.3.1). Die einzelnen Zellkompartimente (Cytoplasma und Kern) wurden anschließend im Western blot mit einem HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenserum auf das Vorhandensein von VP1 untersucht (Abb. 17). Sowohl das authentische als auch das N-terminal verlängerte VP1 des HaPV wurden in den jeweiligen nukleären Fraktionen nachgewiesen (Bahnen 5 und 7). Dagegen konnte keine Proteinbande mit entsprechendem Molekulargewicht in den cytoplasmatischen Fraktionen festgestellt werden (Bahnen 4 und 6). Als Negativkontrollen wurden cytoplasmatische und nukleäre Fraktionen von nicht-infizierten Insektenzellen (mock) verwendet (Bahnen 2 und 3).

Abb. 17 Western blot zum Nachweis der subzellulären Lokalisation des VP1 in den Insektenzellen mit Kaninchen-anti-HaPV-VP1-Serum.

C = Cytosolfraktion, N = Nuklearfraktion

In einem 15 % SDS-PAGE wurden Cytosolfraktion (C) und Nuklearfraktion (N) von nicht-infizierten (C: Bahn 2; N: Bahn3), von AcNPV-VP1(2.ATG)-infizierten (C: Bahn 4; N: Bahn 5) und von AcNPV-VP1 (1.ATG)-infizierten Sf9-Zellen (C: Bahn 6; N: Bahn 7) aufgetrennt. Als Positivkontrolle wurde HaPV-Lysat aufgetragen (Bahn 1).

M: Proteinmarker


44

3.3 Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im HaPV-VP1 durch Epitopmapping

3.3.1 Kartierung von Epitopen mit Hilfe rekombinanter HaPV-VP1-Proteine

3.3.1.1 Subklonierung der HaPV-VP1-kodierenden Fragmente in pQE-Vektoren

Für das Epitopmapping wurden zwei unterschiedliche Ansätze gewählt:

Rekombinante E. coli-exprimierte VP1-DHFR-Fusionsproteine und überlappende synthetische Peptide (siehe 3.3.2).

Das Ausgangsplasmid für die Isolierung der kompletten VP1-kodierenden Sequenz von HaPV war das Plasmid pBacPak9-VP1( 2.ATG). Durch die BglII-PstI-Spaltung wurde ein 1152bp langes DNA-Fragment (authentisches VP1) erhalten, das in das BglII-PstI-gespaltene und Phosphatase-behandelte Plasmid pQE 41 inseriert wurde.

Für die Herstellung von verkürzten Varianten von VP1 wurden 2 experimentelle Ansätze gewählt (Abb.18):

Direkte Klonierung von kürzeren VP1-kodierenden DNA-Fragmenten in pQE-Vektoren des entsprechenden Leserahmens.

Einführung von Deletionen in pQE-VP1 (As 1-384) durch die Spaltung mit Restriktionsendonukleasen und anschließende Religation.

Die Plasmide pQE-VP1 (As 133-384), pQE-VP1 (As 1-133) und pQE-VP1 (As 320-384) wurden durch direkte Klonierung der entsprechenden Fragmente konstruiert. Nach BamHI-Spaltung des Plasmids pFR36-VP1/2-12 wurde ein 397 bp großes Fragment von pQE-VP1 (As 1-133) isoliert und in den BglII-gespaltenen, Phosphatase-behandelten Vektor pQE41 inseriert. Das zu klonierende 753 bp große Fragment von pQE-VP1 (As 133-384) wurde aus dem Plasmid pFR36-VP1/2-12 durch BamHI-SalI Spaltung gewonnen und in den BglII-SalI-gespaltenen, Phosphatase-behandelten Vektor pQE40 inseriert. Das 192bp Fragment von pQE41-VP1(As 320-384) wurde aus dem Plasmid pQE-VP1(As 133-384) durch HindIII-Spaltung isoliert und in den HindIII-gespaltenen, Phosphatase-behandelten Vektor pQE41 inseriert. Das Plasmid pQE-VP1 (As 29-320) wurde freundlicherweise von Herrn Dr. Ulrich Verfügung gestellt.


45

Das Plasmid pQE-VP1 (As 133-320) wurde aus pQE-VP1 (As 133-384) durch HindIII-Spaltung und anschließende Religation hergestellt. Die Klonierung des Plasmids pQE-VP1 (As 1-320) wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurde das Plasmid pQE-VP1 (As 1-133) mit HindIII gespalten. Das zu klonierende 873 bp große Fragment wurde aus dem Plasmid pQE-VP1(As 29-320) durch HindIII-Spaltung gewonnen und in das mit HindIII- gespaltene Plasmid pQE-VP1 (As 1-133) inseriert.

Abb.18: Restriktionskarte der VP1-kodierenden Region (a) und schematische Darstellung der pQE-Expressionsvektoren mit den entsprechenden VP1-kodierenden Fragmenten (b).

3.3.1.2 Expression rekombinanter HaPV-Proteine in E. coli

Die Expression der rekombinanten Fusionsproteine wurde in E. coli-Zellen des Stammes M15pREP4 (Villarejo und Zabin, 1974) durchgeführt. Die Synthese der DHFR-VP1-Fusionsproteine wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG (Endkonzentration) in der exponentiellen Wachstumsphase der Bakterienkultur induziert. Durch Aufnahme einer Induktionskinetik konnte gezeigt werden, daß nach 5stündiger Induktion eine hohe Expression der Fusionsproteine, insbesondere für verkürzte Derivate von VP1, erreicht wurde (nicht gezeigt). Alle pQE-abgeleiteten DHFR-VP1-Fusionsproteine wurden hoch exprimiert und besaßen die erwarteten Molekulargewichte (Abb.19a, Bahnen 2-8). Als Kontrolle für die Induktion wurden pQE40-transformierte M15pREp4-Zellen verwendet (Bahn 1). Die von pQE40 synthetisierte Dihydrofolatreduktase wurde beim erwarteten Molekulargewicht von ca. 22 kd gefunden (Bahn 1). Die DHFR-Fusionsproteine der erwarteten Molekulargewichte reagierten im Western blot mit einem MRGS-His6-spezifischen monoklonalen Antikörper und dem Serum eines Papillom-tragenden Hamsters (Abb. 19b, Bahnen 2-8; Abb. 19c, Bahnen 4-10). Die Spezifität der Antikörperreaktion wurde durch die fehlende Reaktion der pQE40-exprimierten DHFR erbracht.


46

Abb.19: Nachweis der Expression der HaPV-VP1-DHFR-Fusionsproteine im gefärbten SDS-PAGE (a) und durch Western blot mit MRGS-His6-spezifischem monoklonalen Antikörper (b) und dem Serum eines HaPV-infizierten Z3-Hamsters (c).

Totallysate von M15pREP4-Zellen, die mit pQE40 (1) und den rekombinanten pQE-Plasmiden pQE-VP1 (As 1-384) (Bahn 2), pQE-VP1 (As 1-320) (Bahn 3), pQE -VP1(As 29-320) (Bahn 4), pQE-VP1 (As 133-384) (Bahn 5), pQE-VP1 (As 133-320) (Bahn 6), pQE-VP1 (As 1-133) (Bahn 7) und pQE-VP1 (As 320-384) (Bahn 8) transformiert worden sind, wurden in einer 15%igen SDS-PAGE aufgetrennt.

Die DHFR-Fusionsproteine sind durch Pfeile markiert.

M: Proteinmarker.


47

3.3.1.3 Epitopmapping im VP1 des HaPV mit Hilfe der rekombinanten Fusionsproteine

Die Untersuchungen zum Epitopmapping wurden mit Hilfe von E. coli-Totallysaten der entsprechenden Expressionsklone durchgeführt. Die Expression der rekombinanten Proteine wurde wie in Kapitel 3.2.1.2 beschrieben durchgeführt. Um mögliche durch unterschiedliche Expression der einzelnen Klone bedingte Reaktivitätsunterschiede der rekombinanten Proteine zu vermeiden, wurden die Proteinkonzentrationen angeglichen. Dazu wurde in der SDS-PAGE die Menge der Fusionsproteine verglichen und durch Einsetzen veränderter Totallysatmengen angeglichen.

Die folgenden Seren wurden für die Kartierung von Epitopen im VP1 eingesetzt.

Kaninchen-anti-VP1 (As 29-320) - und -anti-VP1 (As 133-320)-Seren

10 Seren von Papillom-tragenden Hamstern

19 Seren von Papillom-freien, anti-VP1-positiven Hamstern

3.3.1.3.1 Die Reaktivität der rekombinanten Proteine mit HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenseren

Zwei Kaninchenseren, die durch Immunisierung mit E. coli-exprimierten TrpE-VP1 (As 133-320) - und DHFR-VP1 (As 29-320)-Fusionsproteinen erhalten worden waren (Ulrich et al., 1996; Siray et al., 1998), sind für die Kartierung von Epitopen im VP1 verwendet worden (Siehe Tab. 9). Alle rekombinanten Proteine mit Ausnahme des von pQE-VP1 (As 320-384) exprimierten Proteins wurden vom Kaninchen-anti-VP1 (As 29-320)-Serum erkannt. Das anti-VP1 (As 133-320)-Serum erkannte die rekombinanten Proteine, die von pQE-VP1 (As 1-384), pQE-VP1 (As 1-320), pQE-VP1 (As 29-320), pQE-VP1 (As 133-320) und pQE-VP1 (As 133-384) synthetisiert wurden. Dagegen wurden keine Reaktivität mit den Regionen As1-133 und As 320-384 beobachtet. Somit reagierten beide Seren nur mit den Regionen, die für die Immunisierung der Kaninchen verwendet worden waren. Aufgrund des Reaktivitätsmusters des Kaninchen-anti-VP1 (As 29-320)-Serums mit den rekombinanten Proteinen konnten zwei antigene Regionen identifiziert werden: Ein Epitop liegt im N-terminalen Drittel des VP1 (As 1-133) und ein zweites Epitop liegt im zentralen Teil des VP1 (As 133-320).


48

Tab.9: Reaktivität der rekombinanten VP1-Proteine mit HaPV-VP1-spezifischen Kaninchenseren

 

Serum

Rekombinante Proteine

Kaninchen-anti-VP1
(As 29-320)

Kaninchen-anti-VP1
(As 133-320)

Lebergewebe-Kontrolle

-

-

DHFR

-

-

virales VP1

+

+

VP1(As 1-384)

+

+

VP1(As 1-320)

+

+

VP1(As 29-320)

+

+

VP1(As 133-384)

+

+

VP1(As 133-320)

+

+

VP1(As 1-133)

+

-

VP1(As 320-384)

-

-

- = keine Reaktivität

+ = starke Reaktivität

3.3.1.3.2 Die Reaktivität der rekombinanten Proteine mit Seren von HaPV-infizierten
Z3-Hamstern

Neben der Kartierung von Epitopen im VP1 war auch von Interesse, mögliche Unterschiede in der Epitopspezifität der Antikörperantwort in Papillom-tragenden und Papillom-freien HaPV-infizierten Z3-Hamstern zu untersuchen. Die Serumpools von Papillom-tragenden und Papillom-freien Z3-Hamstern reagierten mit allen rekombinanten VP1 Proteinen. Anschließend wurden die 10 Seren der Papillom-tragenden Z3-Hamster einzeln getestet (Tab.10). Alle Seren der Papillom-tragenden Z3-Hamster reagierten mit den rekombinanten Proteinen VP1 (As 1-384), VP1 (As 133-384) und VP1 (As 320-384). Dagegen wurden die N-terminalen Segmente As 1-320 und As 1-133 nur von 6 bzw. 4 der 10 getesteten Seren erkannt. Auch nur 6 der 10 Seren erkannten die mehr C-terminal lokalisierten Abschnitte As 29-320 und As 133-320.

Zur Charakterisierung der Epitopspezifität der Antikörper von Papillom-freien Z3-Hamstern wurden 14 der 19 Seren ausgewählt (Tab.11). Das komplette VP1 und seine C-terminalen Teile As 133-384 und As 320-384 reagierten mit allen 14 Seren der Papillom-freien Tiere. Die C-terminale Deletion des VP1 führte zu einer Reduktion der Reaktivität. Die rekombinanten Proteine As 1-320 und As 1-133 wurden nur durch 8 (von 12) bzw. 9 (von 14) Seren erkannt. Die zentrale Region des VP1 (As 29-320 und As 133-320) wurde von 10 bzw. 9 Seren (von 14) erkannt.


49

Tab. 10: Reaktivität der rekombinanten VP1-Proteine mit Seren von Papillom-tragenden
Z3-Hamstern

Seren

Rekombinante Proteine

33

559

479

31

486

581

608

521

I533

I558

Lebergewebe

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

DHFR

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

virales VP1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

VP1 (As 1-384)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

VP1 (As 1-320)

(+)

-

-

(+)

+

+

+

-

-

+

VP1 (As 29-320)

+

-

-

(+)

+

+

+

-

-

+

VP1 (As 133-384)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

VP1 (As 133-320)

(+)

-

-

(+)

+

+

+

-

-

+

VP1 (As 1-133)

(+)

-

-

-

(+)

(+)

-

-

-

+

VP1 (As 320-384)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ = starke Reaktivität; (+) = schwache Reaktivität
- = keine Reaktivität

Tab. 11: Reaktivität der rekombinanten Proteine mit Seren von Papillom-freien Z3 Hamstern

Seren

Rekombinante Proteine

1

502

618

523

457

555

607

531

582

602

595

556

599

617

Lebergewebe

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

virales VP1

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

DHFR

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

VP1 (As 1-384)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

VP1 (As 1-320)

+

+

n.t.

+

+

-

+

+

-

(+)

+

-

n.t.

-

VP1 (As 29-320)

+

+

+

+

+

+

+

-

-

(+)

(+)

-

+

-

VP1 (As 133-384)

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

VP1 (As 133-320)

+

+

-

+

+

-

-

(+)

-

(+)

+

-

+

+

VP1 (As 1-133)

+

+

-

+

+

-

-

+

-

+

+

-

(+)

(+)

VP1 (As 320-384 )

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ = starke Reaktivität

(+) = schwache Reaktivität

- = keine Reaktivität

n.t. = nicht getestet


50

3.3.1.3.3 Kartierung einer kreuzreaktiven Region des Polyomavirus-VP1

Zur Kartierung der kreuzreaktiven Region im HaPV-VP1 wurden SV40- und JCV-VP1- spezifische Kaninchenseren verwendet. Die rekombinanten Proteine VP1 (As 1-384), VP1 (As 133-384) und VP1 (As 320-384) wurden von beiden Kaninchen-Seren erkannt. Somit konnte eine kreuzreaktive Region am C-terminus des HaPV-VP1 (As 320-384) lokalisiert werden. Sowohl die N-terminale (As 1-133) als auch die zentrale Region des HaPV-VP1 wurden von beiden Seren nicht erkannt.

Abb. 20: Reaktivität der rekombinanten HaPV-VP1-Proteine mit Kaninchen-anti-SV40-Serum (a) und Kaninchen-anti-JCV-VP1-Serum (b).

3.3.2 Epitopmapping im VP1 des HaPV mit Hilfe von synthetischen Peptiden

Als alternative Methode der Epitopkartierung wurde eine Pepscan-Analyse verwendet. Das VP1 des HaPV, das aus 384 AS besteht, wurde mit der Methode des Pepscan unter Verwendung von 13meren Peptiden (Verschiebung um 2As) untersucht. Für die Kartierung von Epitopen im VP1 mit Hilfe der synthetischen Peptide wurden die folgenden Seren verwendet:

Kaninchen-anti-VP1(As 29-320) -Serum

Serumpool von Papillom-tragenden Hamstern

Serumpool von Papillom-freien Hamstern

Serumpool von HaPV-freien, VP1-negativen HaP-Hamstern.


51

3.3.2.1 Reaktivität der synthetischen Peptide mit Kaninchen anti-HaPV-VP1-Serum

Für diese Untersuchungen wurde ein Kaninchenserum verwendet, das durch Immunisierung mit einem rekombinanten, denaturierten VP1 (As 29-320) hergestellt worden war. Die Antikörper in diesem Serum erkannten im Pepscan die Sequenz SRSETKDIGISKPVEGT (Abb. 21). Diese Sequenz wird durch die VP1-Peptide 78 (SRSETKDIGISKP), 79 (SETKDIGISKPVE) und 80 (TKDIGISKPVEGT) repräsentiert. Als Konsensusmotiv läßt sich die Sequenz TRDIGISKP extrahieren. Diese Sequenz ist im VP1 zwischen den Aminosäuren 147 und 155 lokalisiert.

Abb. 21: Reaktivität der VP1-Peptide mit Kaninchen-anti-HaPV-VP1-Serum im Pepscan. Die kontinuierlichen B-Zell-Epitope des VP1 wurden an Cellulose gebunden synthetisiert. Die Peptide wurden mit Kaninchen-anti-VP1- Serum (1:10) und anti-Kaninchen-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.

3.3.2.2 Reaktivität der synthetischen Peptide mit Serumpools von HaPV-infizierten Z3- Hamstern

Für die Pepscan-Analyse der Seren von HaPV-infizierten Hamstern wurden 2 Serumpools aus 19 Seren Papillom-freier Tiere bzw. 10 Seren Papillom-tragender Tiere verwendet. Im Serumpool der Papillom-freien Hamster wurden Antikörper mit zwei unterschiedlichen Epitopspezifitäten beobachtet (Abb. 22): Ein reaktives Peptid mit der Sequenz AKIQLPTLNEDLT ist zwischen den Aminosäuren 101-113 des HaPV-VP1 lokalisiert. Eine zweite reaktive Region wird durch zwei überlappende Peptide repräsentiert (Aminosäuren 165-179 im VP1).

Die Antikörper im Serumpool von Papillom-tragenden Z3 Hamstern erkannten ebenfalls zwei unterschiedliche Sequenzen (Abb.23). Eine N-terminale Region wird durch 4 Peptide repräsentiert und erstreckt sich über die Aminosäuren 79-97 im VP1. Diese Region enthält die Konsensussequenz LTADEVK. Bemerkenswert ist, daß der Verlust der Aminosäuren 83 und 84 (SS) in dieser Sequenz zur drastischen Reduzierung der Reaktivität der Region führt. Demnach scheinen diese beiden


52

Aminosäuren für die Integrität des Epitops von großer Bedeutung zu sein. Die zweite Sequenz, durch zwei Peptide repräsentiert, befand sich zwischen den Aminosäuren 353 und 367 des VP1.

Abb. 22: Reaktivität der synthetischen Peptide mit dem Serumpool von Papillom-freien Z3-Hamstern. Die Peptide wurden mit dem Serumpool (1:10) und anti-Hamster-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.

#57 AKIQLPTLNEDLT

#89 AVGGEPLDLQGLV

#90 GGEPLDLQGLVQN

Abb. 23: Reaktivität der synthetischen Peptide mit dem Serumpool von Papillom-tragenden Z3-Hamstern. Die Peptide wurden mit dem Serumpool von Papillom-tragenden Hamstern (1:10) und anti-Hamster-POD-Konjugat (1:1000) inkubiert.


53

#46 IKVNSSLTADEVK

#47 VNSSLTADEVKAN

#48 SSLTADEVKANQL

#49 LTADEVKANQLPY

#183 EGTEAVPGDPDVN

#184 TEAVPGDPDVNRF

3.3.2.3 Kartierung kreuzreaktiver Epitope im HaPV-VP1

Die mit Hilfe der rekombinanten Proteine bestimmte kreuzreaktive Region (siehe 3.3.1.3.) sollte mit Hilfe der Pepscan-Methode (13mere Peptide mit einem Raster von 3As) feinkartiert werden. Für diese Untersuchungen wurden Kaninchen-anti-SV40- und -anti-JCV-VP1-Seren verwendet. Die stärksten Signale wurden für das JCV-VP1-spezifische Serum für die Peptide #114 (EGEAAQVEEVRIY), #115 (AAQVEEVRIYEGT), #116 (VEEVRIYEGTEAV) und #119 (TEAVPGDPDVNRF), #120 (VPGDPDVNRFIDK), #121(DPDVNRFIDKYGQ), #122 (VNRFIDKYGQQHT) gefunden, die im HaPV-VP1 zwischen den Aminosäuren 340-357 bzw. 355-376 lokalisiert sind.

Im SV40-VP1-spezifischen Serum wurden Antikörper nachgewiesen, die mit den Peptiden #40 (QMWEAVSVKTEVV), #54 (TYHMFAVGGEPLD), #55 (MFAVGGEPLDQG), #100 (RGLPRYFNVTLRK ), #101 (PRYFNVTLRKRWV) und mit der C-terminalen Region des HaPV-VP1( Peptide #114: EGEAAQVEEVRIY; #115: AAQVEEVRIYEGT; #116: VEEVRIYEGTEAV; #118: YEGTEAVPGDPDV; #119: TEAVPGDPDVNRF; #120: VPGDPDVNRFIDK) reagierten.


54

Abb. 24: Pepscan-Analyse der SV40-(a) und JCV-VP1-spezifischen Kaninchenseren (b).


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