Siraj, Hassen: “Etablierung eines neuartigen Systems zur Herstellung von Virus-ähnlichen Partikeln als Träger für Fremdsequenzen“

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Struktur und Proteinzusammensetzung des HaPV-Kapsids

Das Hamster-Polyomavirus ist verantwortlich für die Entwicklung von Epitheliomen bzw. Lymphomen nach der Infektion von Syrischen Hamstern (Graffi et al., 1967, 1968, 1970; Frey et al., 1970; Scherneck und Feunteun 1990). Das HaPV-Genom kodiert für drei frühe und drei späte Genprodukte (Delmas et al., 1985). Während Genprodukte der frühen Region, die für die transformierenden Eigenschaften von HaPV verantwortlich sind (Delmas et al., 1985), intensiv studiert worden sind, sind die Proteine der späten Region, die das Viruskapsid bilden, bisher nicht untersucht worden.

Zur Etablierung des HaPV-Kapsids als neuartigem Träger für fremde Epitope, sollte zunächst das virale Kapsid charakterisiert werden. Zur Charakterisierung der Kapsidproteine des HaPV wurden Virionen aus Epitheliomen von HaPV-infizierten Z3-Hamstern gereinigt. Die Untersuchung der gereinigten Partikel mittels Elektronenmiskroskopie zeigte in Übereinstimmung mit früheren Daten (Graffi et al.,1972) sphärische Partikel mit der für Polyomaviren typischen ikosaedrischen Struktur und einem Durchmesser von ca. 45 nm. Dieser Befund stimmt mit Daten zur Struktur und Größe von anderen Polyomaviruskapsiden überein (Shah et al., 1990; Eckhart et al., 1990 und 1994). Aber im Gegensatz zur T = 7-dextro-Symmetrie von murinem Polyomavirus (Finch et al., 1974) und SV40 (Anderer et al., 1967) zeigte das HaPV-Kapsid eine T=7-laevo Symmetrie (Hassen et al., 1998). Die unterschiedliche Kapsidsymmetrie kann darauf zurückgeführt werden, daß die Bindungstelle der Kapsidproteine unterschiedlich gelagert sind (links oder rechts herum).

Durch Auftrennung von gereinigten Virionen in der SDS-PAGE konnte die Gegenwart von drei strukturellen Proteinen gezeigt werden, deren Molekulargewichte denen der vorhergesagten Proteine VP1, VP2 und VP3 entsprechen. Die Identität


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der Kapsidproteine konnte durch Western blot mit monospezifischem anti-HaPV-VP1-Serum bzw. mit Seren HaPV-infizierter Hamster gezeigt werden. Bei anderen Vertretern der Polyomaviren wurden ebenfalls drei Strukturproteine mit ähnlichen Molekulargewichten beschrieben (Cole et al., 1996). Die HaPV-Kapsidproteine zeigen eine starke Aminosäurehomologie zu den Kapsidproteinen des murinen Polyomavirus Py, was auf die evolutionäre Verwandtschaft der beiden Viren hindeutet. Das Hauptkapsidprotein VP1 des HaPV zeigt (im Vergleich zu VP2/VP3) die geringste Divergenz zum VP1 anderer Polyomaviren, was auf die besondere biologische Funktion des Proteins hinweist (Hassen et al., 1998). Das VP1 mit einem Molekulargewicht von ca. 42 kDa stellt den Hauptanteil der HaPV-Kapsidproteine dar. Durch densitometrische Analyse konnte gezeigt werden, daß es ca. 71% der gesamten viralen Strukturproteine ausmacht. Ähnliche Beobachtungen wurden auch für JCV und murines Polyomavirus beschrieben (Eckhart et al., 1990; Ou et al., 1999; Gillock et al., 1999). Neben diesen Virus-kodierten Strukturproteinen wurden in Viruslysaten auch Proteine mit niedrigeren Molekulargewichten (ca. 15-16 kDa) beobachtet. Dabei könnte es sich um Viruspartikel-assoziierte zelluläre Histone handeln. Das Vorliegen von zellulären Histonen in Polyomaviruskapsiden wurde auch für LPV und andere Polyomaviren gezeigt (Griffin et al., 1981; Mariott et al., 1985; Pawlita et al., 1996). Es wurde berichtet, daß die zellulären Histone H2A, H2B, H3 und H4 (jedoch nicht H1) mit dem viralen Genom von Polyomaviren assoziiert sind (Griffin et al., 1981).

4.2 Virus-ähnliche Partikel auf der Basis des HaPV-VP1

4.2.1 Die Bildung von Virus-ähnlichen Partikeln in Insektenzellen

In den 90er Jahren sind in Insektenzellen eine Reihe von VLPs verschiedener Viren erzeugt worden. Das Hauptkapsidprotein L1 unterschiedlicher Papillomvirus-Typen, wie HPV11 (Rose et al.,1993) und HPV 16 (Kirnbauer et al., 1992), assemblierte in Insektenzellen zu VLPs, während bei Expression in E. coli nur die Bildung von Kapsomeren beobachtet wurde (Li et al., 1997). Auch für Vertreter anderer Virusfamilien, wie Rotaviren (Redmond et al., 1991, 1993; Zeng et al., 1994), Adeno-assoziiertes Virus (Ruffling et al., 1992), Bluetongue Virus (French und Roy, 1990) und Retroviren (Rasmussen et al., 1990), konnte nach heterologer Expression der


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Kapsidproteine in Insektenzellen die Bildung von VLPs gezeigt werden. Während die Expression des VP1 von murinem und aviärem Polyomavirus in E. coli nur zur Bildung von Kapsomeren führte (Salunke et al., 1986; Rodgers et al., 1994), konnte kürzlich gezeigt werden, daß die VP1-Expression von JCV und HaPV in E. coli-Zellen das Assembly von VLPs erlaubt (Ou et al., 1999; Voronkova et al., in Vorbereitung).

Das Baculovirus/Insektenzell-Expressionssystem ist zur Charakterisierung der Polyomavirus- Strukturproteine erfolgreich eingesetzt worden (Montross et al., 1991; Delos et al., 1993; Forstova et al., 1993). Insbesondere wurden mit Hilfe dieses eukaryontischen Systems Untersuchungen zu Protein-Protein-Interaktionen der Strukturproteine (Delos et al., 1993; Forstova et al., 1993), zur Rolle der posttranslationalen Modifikationen der Strukturproteine (Li et al., 1995), zum Transport und der subzellulären Lokalisation der Kapsidproteine (An et al., 1999b) und zur DNA-Enkapsidierung der Kapsidproteine (Pawlita et al., 1996; Gillock et al., 1997) durchgeführt. Außerdem konnte gezeigt werden, daß in Insektenzellen gebildete VP1/VP2-VLPs des murinen Polyomavirus in der Lage sind, die Infektion von 3T6-Zellen durch murines Polyomavirus effektiv zu verhindern (An et al., 1999b).

Nachdem das VP1 als Hauptstrukturprotein des HaPV-Kapsids identifiziert und dessen AS-Sequenz verifiziert worden war, sollte in der vorliegenden Dissertation das Protein in Insektenzellen heterolog exprimiert, gereinigt und auf seine Assemblierungsfähigkeit untersucht werden.

Wegen des Vorliegens von 2 in-frame Translations-Initiationskodonen wurden 2 Konstrukte hergestellt, die die Synthese des authentischen VP1 (384 AS) und eines N-terminal verlängerten VP1 (388 AS) erlauben. Die Reinigung der beiden VP1-Derivate aus Insektenzellen mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation ergab erste Hinweise auf das Assembly von VLPs. Der Hauptpeak der VP1-Antigenität wurde in Fraktionen gefunden, die eine Dichte von 1,29-1,30g/cm3 besitzen. Diese Dichte entspricht der, die für leere, d.h. DNA-freie, Polyomaviruspartikel und für VP1-abgeleitete VLPs beschrieben wurde (Chang et al., 1996; Chang et al., 1997; Cole et al., 1996). Dagegen besitzen infektiöse


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Polyomavirionen eine Dichte von 1,34g/ml (Shah et al., 1990; Böttger und Scherneck, 1985). Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen wurden die VP1-enthaltenden Fraktionen auf die Bildung Virus-ähnlicher Partikel untersucht: Sowohl das authentische VP1 als auch sein N-terminal verlängertes Derivat lagerten sich in Insektenzellen spontan zu VLPs zusammen. Diese Partikel besitzen einen Durchmesser von ca. 45 nm. Diese Ergebnisse stimmen nicht nur mit Daten zum in Hefe exprimierten VP1 des HaPV (Sasnauskas et al., 1999) sondern auch mit Daten zu in Insektenzellen exprimierten VP1-Partikeln von murinem Polyomavirus, JCV, LPV und SV40 überein (Montross et al., 1991; Chang et al., 1997; Pawlita et al. .,1996; Kosukegawa et al., 1996). Allerdings wurde im Hefe-Expressionssystem eine Größenheterogenität der HaPV-VP1-abgeleiteten VLPs beobachtet (Sasnauskas et al., 1999). Neben den ikosaedrischen Virus-ähnlichen Partikeln, die in Form und Struktur HaPV-Partikeln entsprechen, wurden in den Insektenzellen auch tubuläre Strukturen gefunden. Ähnliche tubuläre Strukturen mit einem Durchmesser von 60-70nm sind auch in einer Metrizamidgradienten-gereinigten LPV-VP1-Präparation gefunden worden (Pawlita et al., 1996).

Offensichtlich kann das HaPV-VP1 wie auch das VP1 anderer Polyomaviren, trotz Fehlen der Kapsidproteine VP2 und VP3 und Fehlen der viralen DNA, in Insektenzellen spontan zu VLPs assemblieren. So führte die Co-Expression des VP1 von murinem Polyomavirus oder SV40 und VP2/VP3 dieser Viren zu keinen signifikanten Unterschieden in Größe und Morphologie der gebildeten VP1-abgeleiteten VLPs (An et al., 1999; Kosukegawa et al., 1996), obwohl durch Co-Expression von VP2 die posttranslationale Modifikation von VP1 beeinflußt wird (An et al., 1999).

4.2.2 Subzelluläre Lokalisation des VP1-Proteins in Insektenzellen

Für eine Nutzung von VLPs für die Gentherapie ist deren Transport zum Zellkern eine wichtige Voraussetzung. Deshalb wurde die subzelluläre Lokalisation des HaPV-VP1 in Insektenzellen durch elektronenmikroskopische Verfahren und subzelluläre Fraktionierung untersucht. Mit Hilfe beider Methoden konnte gezeigt


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werden, daß sowohl authentisches als auch N-terminal verlängertes VP1 im Zellkern lokalisiert sind. Diese Ergebnisse belegen, daß im HaPV-VP1 ein intaktes Kernlokalisierungssignal (KLS) vorhanden ist. Im allgemeinen kann ein KLS an einer beliebigen Stelle im Protein liegen. Es besteht aus einem kurzen Peptid, das reich an den positiv geladenen Aminosäuren Lysin und Arginin ist und gewöhnlich auch Prolin enthält (Wychowski et al., 1987). Solche Signale wurden zuerst am large T-Antigen des SV40 nachgewiesen (Kalderon et al., 1984). Der Nachweis des HaPV-VP1 im Zellkern von Insektenzellen zeigt, daß dieses Protein ohne Cotransport-Funktionen anderer viraler Proteine in den Zellkern transportiert wird. Bei anderen Vertretern der Polyomaviridae, z. B. LPV, SV40, JCV, BFDV und murinem Polyomavirus, wurde ein KLS am N-Terminus des VP1 nachgewiesen (Montross et al., 1991; Chang et al., 1992; Pawlita et al., 1996; Ishii et al., 1996; Chang et al., 1997).

Das VP1 des HaPV besitzt zwei Regionen mit einer Abfolge basischer Aminosäuren, die als KLS dienen könnten. Eine befindet sich am N-Terminus, eine andere am C-Terminus (AS 290-314). Beide Regionen sind bei den Polyomaviren stark konserviert (siehe Abb. 24 und 25).

Abb. 25: Potentielle Kernlokalisierungssignale am N-Terminus des VP1 von HaPV, murinem Polyomavirus PY(A2), LPV, BFDV, JCV, SV40 und BKV.

Die experimentell bestimmten Kernlokalisierungssignale von murinem Polyomavirus Py (Chang et al., 1992) und SV40 (Wychowski et al., 1986 ) sind eingerahmt.


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Abb. 26. Konservierte basische Aminosäuren in der C-terminalen Region des VP1 von HaPV, SV40, LPV, murinem Polyomavirus Py, JCV und BFDV.

Vergleich der Proteinsequenzen des VP1 von HaPV (AS 290-314) (Delmas et al., 1985; Hassen et al., 1998), SV40 (AS 275-297) (Buchmann et al., 1981), LPV (AS 297-319) (Pawlita et al., 1985), murinem Polyomavirus Py (AS 295-317) (Griffin et al., 1981), JCV (AS 275-296 ) (Frisque et al., 1984) und BFDV-1 (AS 265-287) (Rott et al., 1988). Konservierte basische Aminosäuren sind im Fettdruck dargestellt.

Überraschenderweise unterschieden sich die beiden HaPV-VP1-Varianten bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen in ihrer subzellulären Lokalisation. Das N-terminal verlängerte VP1 wurde hauptsächlich im Kern beobachtet. Dagegen war das authentische VP1 weniger im Kern lokalisiert. Diese unterschiedliche Kernlokalisation könnte dadurch erklärt werden, daß zwei der drei zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren im N-terminal verlängerten VP1, insbesondere die basischen Aminosäuren Arginin und Lysin, den Kerntransport verstärken. Es könnte auch sein, daß durch die zusätzlichen Aminosäuren eine Konformationsänderung am N-Terminus stattfindet, wodurch der N-terminale Teil vom VP1 eine bessere Oberflächenexposition erfährt und damit stärkere Wechselwirkungen mit Proteinen, die den Kerntransport fördern, ermöglicht werden. Solche cytoplasmatischen Faktoren, die den Kerntransport eines Proteins fördern, wurden bereits beschrieben (Chang et al., 1992). Auch bei der Expression der beiden Varianten des HaPV-VP1 im Hefesystem wurde das N-terminal verlängerte VP1 des HaPV effizienter zum Kern transportiert als das authentische VP1 (Sasnauskas et al., 1999). Eine cytoplasmatische Assemblierung der Kapsidproteine der Polyomaviren in


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Insektenzellen wurde bisher nicht beschrieben ( Gillock et al., 1998; An et al., 1999a). Als Ursache dafür wird die im Cytoplasma im Vergleich zum Kern sehr niedrige Ca2+-Konzentration angenommen. Im Gegensatz zu den elektronenmikroskopischen Untersuchungen wurden beide HaPV-VP1-Derivate bei der Zellfraktionierung ausschließlich in den jeweiligen Kernfraktionen nachgewiesen. Möglicherweise sind diese unterschiedlichen Befunde auf die im Vergleich zum Western blot höhere Empfindlichkeit der Elektronenmikroskopie zurückzuführen.

Der überraschende Befund im Insekten- und Hefezellsystem, daß authentisches HaPV-VP1 im Vergleich zum N-terminal verlängerten VP1 mit geringerer Effizienz zum Zellkern transportiert wird, ist möglicherweise auf Unterschiede der Expressionssysteme zur Virus-infizierten Zelle zurückzuführen. So ist zwar das Besetzen eines Kernlokalisierungssignals ein notwendiges aber nicht ausreichendes Kriterium für den Kerntransport (Chang et al., 1992). Die Aktivität des KLS kann durch die Gegenwart einiger aromatischer Aminosäuren oder struktureller Domänen und durch posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, beeinflußt werden (Jans et al., 1996; Schwemmle et al., 1999). Desweiteren kann die Wechselwirkung von VP1 mit VP2/VP3 den Kerntransport befördern. So wurde ein effektiver Kerntransport des VP1 in Insektenzellen durch Co-Expression mit VP2 erreicht (Delos et al., 1993). Es wurde auch berichtet, daß VP2 und VP3 von SV40, unabhängig von VP1, die Fähigkeit zum Kerntransport besitzen (Clever et al., 1991; Wychowsky et al., 1987; Gharakhanian et al., 1990). Für SV40 und Polyomavirus konnten die Kernlokalisierungssignale der Strukturproteine VP2 und VP3 in einer konservierten Region am Carboxyterminus nachgewiesen werden (Wychowsky et al., 1987; Clever et al., 1991; Gharakhanian et al., 1987; Fattaey et al., 1989). Sowohl SV40- als auch murines Polyomavirus-VP3 besitzen Domänen, die mit VP1 eine Wechselwirkung eingehen (Barouch et al., 1994; Gharakhanian et al., 1988). Chang et al. (1993a) konnten zeigen, daß sich in cos-Zellen exprimiertes VP2 des murinen Polyomavirus im Zellkern befindet. Durch separate Expression von VP3 des Polyomavirus in Insektenzellen konnte gezeigt werden, daß einige VP3-Moleküle zum Zellkern transportiert werden (Delos et al., 1993). Durch Deletion der ersten 11 N-terminalen Aminosäuren des murinen Polyomavirus-VP1 wurde gezeigt, daß sich das entsprechende Protein in den Insektenzellen nur im Cytoplasma befindet. Die


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Co-Expression dieses Proteins mit VP2 und VP3 führte dazu, daß das deletierte VP1 im Kern gefunden wurde (Gillock et al., 1998). Frühere Untersuchungen haben auch gezeigt, daß VP2 und VP3 für den Kerntransport des VP1 notwendig sind (Chen et al., 1998; Schmidt et al., 1999; An et al., 1999a). Vermutlich benötigt das authentische VP1 des HaPV für den effektiven Kerntransport die Anwesenheit der kleinen Strukturproteine VP2 und/oder VP3.

4.2.3 Stabilität der Virus-ähnlichen Partikel

Für eine Anwendung von VP1-VLPs in der Gentherapie ist deren Beladung mit der “therapeutischen“ Nukleinsäure eine entscheidende Voraussetzung. Deshalb ist die Untersuchung der Dissoziations-Eigenschaften der VLPs von großer Wichtigkeit. In früheren Untersuchungen ist gezeigt worden, daß Polyomaviren durch chelatbildende und reduzierende Substanzen in subvirale Partikeln dissoziiert werden können (Brady et al., 1977).

Versuche zur Dissoziation der HaPV-VP1-abgeleiteten VLPs wurden durch einen Zusatz von EDTA oder EGTA und DTT bei gleicher Inkubationstemperatur durchgeführt. Die VLPs zeigten eine ungewöhnlich hohe Stabilität gegenüber EDTA und DTT: Die Inkubation der VLPs mit 10 mM EDTA /3 mM DTT und mit 50 mM EDTA/20 mM DTT bei 37 °C für 16 Stunden zeigte keine Wirkung auf die Partikel; alle Partikel blieben intakt. Unter gleichen Versuchsbedingungen (37 °C, 16 Stunden) wurde bei Zugabe von 50mM EGTA/20mM EDTA eine partielle Dissoziation beobachtet. Im Vergleich zu EDTA besitzt EGTA eine höhere Affinität für Calcium-Ionen. Diese könnte der Grund für die reduzierte Stabilität der VLPs gegenüber EGTA sein. Während die Inkubation von HaPV-VP1-abgeleiteten VLPs aus Hefezellen mit 10mM EDTA/3mM DTT für 16 Stunden bei 4°C keine signifikante Veränderung der VLPs verursachte, führte die Inkubation der VLPs bei gleicher Konzentration von EDTA/DTT und gleicher Dauer (16 Stunden) jedoch erhöhter Temperatur ( 37°C) zur Dissoziation von 60-80% der Partikel in Pentamere.


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Die Notwendigkeit von Calcium für die Kapsidbildung wurde für verschiedene Viren, einschließlich SV40 und murines Polyomavirus, beschrieben (Haynes et al., 1993; Liddington et al., 1991). Für SV40 und murines Polyomavirus konnte gezeigt werden, daß Calcium-Ionen an das virale Kapsid gebunden sind (Salunke et al., 1986, Liddington et al., 1991). Diese Assoziation des Kapsids mit Calcium-Ionen wird durch das VP1 vermittelt (Haynes et al., 1993). Salunke et al. (1989) konnten zeigen, daß das in E. coli synthetisierte VP1 des Polyomavirus auch die Fähigkeit besitzt, Calcium-Ionen zu binden. Die carboxyterminale Region des Polyomavirus-VP1 wurde als Bindungsstelle für Calcium-Ionen identifiziert (Ludlow et al., 1987; Haynes et al., 1993). In dieser Region wurden Calcium-Ionen-bindende Strukturmotive, wie Helix-Loop-Helix und EF-hand Motive, nachgewiesen (Haynes et al., 1993). Diese strukturellen Motive kommen auch bei typischen Calcium-bindenden Proteinen, wie Calmodulin, vor (Watterson et al., 1980). Das VP1 des HaPV besitzt ebenfalls eine Domäne, deren Aminosäuresequenz eine starke Homologie zu der von Calcium-bindenden Motiven anderer Proteine besitzt (Abb. 30).

Abb. 30: Mögliche Calcium-bindende Domäne des VP1 von HaPV

Vergleich der Proteinsequenzen von HaPV (AS 269-280 ) (Delmas et al., 1985, Hassen et al., 1998), SV40 (AS 247-258) (Buchmann et al., 1981) , murinem Polyomavirus Py (AS 266-277) (Haynes et al., 1993), BFDV (AS 237-248) (Rodgers et al., 1994) und Calmodulin 2 (AS 56-67) (Watterson et al., 1980).


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4.2.4 Die Untersuchung der Nukleinsäure-Kontamination von HaPV-VP1-Partikeln

Für eine Anwendung von Polyomavirus-abgeleiteten VLPs zum Gentransfer sollte zunächst eine Kontamination mit zellulärer DNA ausgeschlossen werden. Deshalb wurden in dieser Arbeit die von authentischem und N-terminal verlängertem VP1-abgeleiteten VLPs auf eine mögliche Nukleinsäurekontamination untersucht.

Überraschenderweise wurde in den vom authentischen VP1 abgeleiteten VLPs eine Nukleinsäure-Kontamination von ca. 5Kb beobachtet; dagegen wurde in VLPs von N-terminal verlängertem VP1 keine Nukleinsäureenkapsidierung gefunden. In der Literatur existieren unterschiedliche Befunde zur Nukleinsäure-Kontamination von im Baculovirus-System exprimierten Polyomavirus-Kapsidproteinen. Montross et al. (1991), Kosukegawa et al. (1996) und Forstova et al. (1993) haben gezeigt, daß die Kapsidproteine von verschiedenen Polyomaviren in Insektenzellen zu leeren, d.h. DNA-freien, VLPs assemblieren. Im Gegensatz zu diesen Beobachtungen konnten andere Autoren zeigen, daß das Kapsidprotein VP1 (ohne VP2 und VP3) in der Lage ist, ca. 5 Kb große DNA zu enkapsidieren (Pawlita et al., 1996; Gillock et al., 1997; An et al., 1999b). Die Autoren konnten zeigen, daß die DNA-Enkapsidierungsfähigkeit der Kapsidproteine in den Insektenzellen von zwei Faktoren, der Multiplizität der Infektion und der Infektionsdauer, abhängig ist. Die Größe der unspezifisch verpackten DNA kommt durch die Fragmentierung der zellulären DNA während der späten Phase der Infektion, die durch eine Baculovirus (AcNPV)-Nuklease-Aktivität vermittelt wird, zustande (Gillock et al., 1997). Die in dieser Arbeit beobachteten Unterschiede der Nukleinsäureenkapsidierung zwischen den beiden HaPV-VP1-Derivaten wurde wahrscheinlich durch die unterschiedliche Infektionsdauer (authentisches VP1 5 Tage; N-terminal verlängertes VP1 3 Tage) und nicht durch die Infektionsmultiplizität verursacht.


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4.3 Epitopmapping zur Ermittlung potentieller Insertionsorte für Fremdsequenzen im VP1 von HaPV

Die Ermittlung potentieller Insertionsorte im VP1-VLP-Trägerprotein kann einerseits durch experimentelle Kartierung von (linearen) Epitopen im HaPV-VP1 und anderseits durch Vorhersage von Oberflächen-exponierten Regionen auf der Basis der experimentell ermittelten Röntgenstruktur von murinem Polyomavirus (Griffith et al., 1992) und SV40 (Liddington et al., 1991) erfolgen.

Die experimentelle Kartierung von (linearen) Epitopen im VP1 wurde mit Hilfe in E. coli exprimierter rekombinanter Proteine und synthetischer Peptide durchgeführt. Die Expression der rekombinanten HaPV-VP1-Derivate konnte über die Analyse der E. coli-Totallysate in der SDS-PAGE und im Western blot mit monoklonalem anti-His6-Antikörper nachgewiesen werden. Die rekombinanten Proteine entsprachen den erwarteten Molekulargewichten. Beim kompletten VP1 wurde zusätzlich zum erwarteten DHFR-VP1-Protein (ca. 67 kDa) sowohl im Western blot als auch im gefärbten SDS-PAGE eine kleinere Bande beobachtet. Das Auftreten dieser zusätzlichen Bande mit niedrigerem Molekulargewicht könnte auf einen proteolytischen Abbau des Fusionsproteins zurückzuführen sein. Im Vergleich zu den verkürzten Varianten von VP1 zeigten das komplette VP1 und das C-terminal verkürzte Derivat (aa 1-320) eine deutlich geringere Expression. Ein Grund für die geringere Expression dieser Proteine könnte deren geringere Stabilität sein. Um durch unterschiedliche Proteinkonzentration bedingte Reaktivitätsunterschiede der Fusionsproteine mit Seren zu vermeiden, wurden die Menge der Fusionsproteine in der SDS-PAGE verglichen und durch Einsatz veränderter Totallysatmengen angeglichen.

Für die Epitopkartierung im HaPV-VP1 wurden in dieser Arbeit Kaninchen-anti-VP1-Seren und Seren von HaPV-infizierten Hamstern verwendet. Alle für die Epitopkartierung eingesetzten Seren zeigten eine starke Reaktivität sowohl mit viralem als auch Baculovirus-exprimiertem VP1.

Durch Verwendung des kompletten VP1 und N-terminal deletierter VP1-Derivate konnte eine immundominante Region am C-Terminus von VP1 zwischen den


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Aminosäuren 320 und 384 kartiert werden. Alle Seren, sowohl von Papillom-tragenden als auch von Papillom-freien Hamstern, zeigten eine starke Reaktivität mit dem rekombinanten DHFR-VP1-Protein (aa 320-384). Die verminderte Reaktivität der C-terminal deletierten Derivate von VP1 stimmte mit der vorherigen Beobachtung überein, daß das rekombinante Protein aa 29-320 nur von 50 % der HaPV-VP1-positiven Hamsterseren erkannt wurde (Ulrich et al., 1996). Durch Pepscan-Analyse konnte in der C-terminalen Region zwischen den AS 353-367 ein lineares Epitop lokalisiert werden. Allerdings reagierte nur der Serumpool von Papillom-tragenden Tieren mit diesem Peptid. In Übereinstimmung mit diesen Daten konnten Voronkova et al. (in Vorbereitung) zeigen, daß frCP-VP1-Fusionproteine (aa 305-351/ 351-374/ 364-384) mit der Mehrzahl der getesteten Seren von HaPV-infizierten Z3-Hamstern reagieren. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Untersuchungen zur Kreuzreaktivität von anti-SV40 und anti-JCV-VP1-positiven Kaninchenseren erhalten. Beide Seren reagierten mit der C-terminalen Region des HaPV-VP1 (aa 320-384). Die Pepscan-Analyse zeigte für beide Seren mehrere C-terminal lokalisierte, reaktive Peptide. Zusammenfassend zeigte das Epitopmapping, daß in der immundominanten Region am C-Terminus des HaPV-VP1 (aa 320-384) sowohl mindestens ein diskontinuierliches und mehrere lineare Epitope lokalisiert sind. In der C-terminalen Region von SV40-VP1 konnte mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers ebenfalls ein lineares, Oberflächen-exponiertes Epitop kartiert werden (Babe et al., 1989). Interessanterweise unterscheiden sich JCV-Typen in der C-terminalen Region des VP1 an drei Aminosäure-Positionen (Agostini et al., 1997).

Zusätzliche Epitope wurden in der N-terminalen (aa 1-133) und zentralen Region (aa 133-320) vom HaPV-VP1 kartiert. Jedoch wurden diese Epitope jeweils nur durch einige Hamsterseren erkannt. Beide Regionen wurden auch durch das gegen denaturiertes HaPV-VP1 (aa 29-320) gewonnene Kaninchen-anti-VP1-Serum erkannt. Mit Hilfe synthetischer Peptide konnten die N-terminalen Epitope im Bereich aa 79-97 (Serumpool von Papillom-tragenden Hamstern) und aa 101-113 (Serumpool von Papillom-freien Hamstern) genauer lokalisiert werden. Interessanterweise überlappt die Region (aa 79-97) mit einer hochvariablen Region von BKV-Serotypen (Jin et al., 1993) und einer vorhergesagten Epitopregion in JCV-VP1 (Chang et al., 1996), die sich zwischen einzelnen JCV-Typen und -Subtypen


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unterscheidet (Agostini et al., 1997, 1998a,b). Ein weiteres Epitop, in der zentralen Region von VP1, wurde zwischen den Aminosäuren 165 und 179 (Serumpool von Papillom-freien Hamstern) kartiert.

Aufgrund der hohen Aminosäurehomologie zwischen VP1 von HaPV und murinem Polyomavirus wurde die dreidimensionale Struktur von HaPV-VP1 auf der Basis der bekannten Röntgenkristallstruktur des murinen Polyomavirus vorhergesagt. Diese Strukturvorhersage zeigte die Aminosäurebereiche 81-88, 222/223, 244-246, 289-294 und die C-terminale Region des HaPV-VP1 als Oberflächen-exponierte Regionen.

Aus den Untersuchungen konnten insbesondere zwei Regionen im HaPV-VP1 als potentielle Insertionsorte für Fremdsequenzen abgeleitet werden: eine Region zwischen aa 79-97 und die C-terminale Region aa 320-384. Die C-terminale Region (aa 320-384) kann wahrscheinlich nicht als Insertionsort verwendet werden, da diese Region an der Pentameren-Wechselwirkung beteiligt ist (Garcea et al., 1987; Liddington et al., 1991). So führte die Deletion der C-terminalen Region vom VP1 des murinen Polyomavirus zum Verlust der Assembly-Fähigkeit (Garcea et al., 1987). Möglicherweise könnte diese Region jedoch trotzdem für kurze Insertionen verwendet werden. Die erstgenannte Region wurde inzwischen erfolgreich für die Insertion einer Pentapeptidfremdsequenz verwendet (Gedvilaite et al., eingereicht).

4.4 Ausblick

In weiteren Untersuchungen soll geklärt werden, ob die in dieser Arbeit ermittelten Insertionsorte in der Lage sind, die Insertion und Oberflächenexposition von Fremdproteinsequenzen unterschiedlicher Länge zu tolerieren. Für die Anwendung der VP1-abgeleiteten VLPs in der Gentherapie soll ein Dis-Assembly/Re-Assembly-Verfahren entwickelt werden, das zur Eliminierung unerwünschter Nukleinsäurekontaminationen führt. Weiterführende Untersuchungen sollen zeigen, inwieweit VLPs aus VP1 und VP2/VP3 einen besseren Kerntransport und eine Co-Expression von Fremdsequenzen ermöglichen.


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