Smolinka, Kai: Biomimetische Studien an Arzneistoffen mit Benzilsäure- oder Estrogenstruktur

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Kapitel 3. Untersuchungen und Ergebnisse

3.1 Allgemeine Methodik der biomimetischen Umsetzungen basischer Benzilsäurederivate, Produktisolierung und -identifizierung

Die Umsetzungen der Substrate erfolgten im wässrigen und nichtwässrigen Milieu mit verschiedenen Katalysatoren, Co-Katalysatoren und Sauerstoffdonatoren. Als Lösungsmittel wurden, soweit nicht anders angegeben, ein Dichlormethan-Acetonitril-Gemisch (im Verhältnis 1 : 1) oder Wasser (pH-Wert = 6 - 8) eingesetzt. Für die Reaktionsansätze im sauren Milieu wurde der Ansatz mit Salzsäure angesäuert (pH-Wert = 1).

Alle Produkte wurden schichtchromatographisch isoliert, dc und hplc charakterisiert und ms und soweit möglich nmr sowie durch Verwendung von Vergleichssubstanzen in ihrer Struktur aufgeklärt.

Die Reaktionsansätze wurden zur Abtrennung des Überschusses an Ausgangsverbindung mittels präparativer Schichtchromatographie unter Verwendung von Fließmittelgemisch II fraktioniert. Die Fraktionen wurden anschließend dc und hplc untersucht. Zur Charakterisierung basischer Derivate wurden die Fließmittelgemische II und III verwendet. Reaktionsprodukte mit sauren Eigenschaften sind in den sauren Fließmittelgemischen IV (für die Denaverinabkömmlinge) und VI eindeutig zuzuordnen, während für die neutralen Derivate (Benzophenone und Methylester) Fließmittelgemisch V zur Anwendung kam. Zur Detektion wurden die Fluoreszenslöschung im UV-Licht bei 254 nm (Detektionsmittel A = Dm A) und die Färbung mit konzentrierter Schwefelsäure mit anschließendem zehnminütigen Erhitzen auf der Heizplatte bei 120 °C (Dm B) genutzt. Während Benzophenonderivate mit Dm B eine Gelbfärbung zeigen, geben Benzilsäurederivate in Abhängkeit von den Substituenten am Aromaten typische Färbungen. An den Aromaten unsubstituierte Benzilsäurederivate färben sich rotviolett. Die 3,4-Dimethoxystruktur führt zu bläulichen und die 3,3’-Dimethoxy-substitution zu grauvioletten Färbungen. Der Reaktionsmechanismus der Färbungen ist nicht geklärt. Stickstoffhaltige Reaktionsprodukte lassen sich mit Dragendorffs Reagenz (Dm C) orange anfärben. Zur Unterscheidung der phenolischen Produkte wird die oxidative Kupplung von 3-Methylbenzothiazolin-2-on-hydrazon (MBTH) im alkalischen Milieu, mit Kaliumhexa-cyanoferrat(III) als mildem Oxidationsmittel, genutzt (Dm D). Bei der zugrundeliegenden


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Reaktion gibt MBTH zwei Elektronen und ein Proton ab. Das gebildete Kation reagiert mit dem vorliegenden Phenolat in einer elektrophilen Substitutionsreaktion. Je nach Stellung der phenolischen OH-Gruppe führt die anschließende Oxidation zu roten, violetten oder blauen Produkten (siehe Schema 25) [99] .

Schema 25: Reaktion von MBTH-Reagenz mit Phenolen

In den hier vorgestellten Untersuchungen wurden mit Dm D auch rote bis violette Färbungen von an den Aromaten chlorierten Benzilsäurederivaten ohne phenolische Gruppe beobachtet.

Für die Produktspektren der jeweiligen Ausgangsverbindungen wurden verschiedene RP-HPLC-Methoden (I - IV) entwickelt. Die Detektion erfolgte mit einem DAD bei 280 nm bzw. 230 nm.

Für quantitative Aussagen wurden die Mengenverhältnisse von Produktspektren oder Produkten dc nach der Fleckengröße und hplc nach der Fläche abgeschätzt, sofern keine weiteren Angaben zur quantitativen Methode gemacht werden.

3.2 Biomimetische Umsetzungen von am Aromaten substituierten Benzilsäurederivaten und verwandten Verbindungen

Die für die biomimetischen Untersuchungen ausgewählten Substrate, die substituierten Benzilsäurederivate, wurden als potentielle, neue Wirkstoffe zur Therapie des Morbus Parkinson synthetisiert [100] . Im Gegensatz zu den bisher biomimetisch umgesetzten Derivaten sind sie


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zweifach an den aromatischen Ringen substituiert und zwar in 3- und 4-Position eines Ringes oder an beiden Ringen in 3- und 3’-Position. Damit sollte ein Beitrag zur weiteren Optimierung und zur Erprobung des erarbeiteten biomimetischen Systems geleistet werden. Zudem sollen die Ergebnisse neben der Erarbeitung der analytischen Methoden vor allem erste Aussagen über mögliche Metabolisierungswege ermöglichen. In die Untersuchungen wurde
3,4-Dimethoxybenzophenon (8) einbezogen, das ein potentielles Biotransformationsprodukt der genannten Verbindungen repräsentiert.

3.2.1 Biomimetische Umsetzungen mit 3,4-Dimethoxybenzophenon (8)

3,4-Dimethoxybenzophenon (8) wurde aus Veratrol und Benzoylchlorid synthetisiert (siehe 4.2.2.1) und als Modellsubstrat disubstituierter Diphenylmethanderivate mit verschiedenen biomimetischen Systemen umgesetzt. Bisherige systematische Untersuchungen an substituier-ten Benzophenonen beschränkten sich auf die an einem aromatischen Ring monosubstituierten Derivate.

Tabelle 1: Biomimetische Umsetzungen von 8

Katalysator

Co-Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Reaktionprodukte

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

9, 10, 11

MnTPFPPCl

Pyridin

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

9, 10, 11

MnTPFPPCl

Imidazol

Iodosylbenzen

Dichlormethan/ Acetonitril

9, 10

MnTPFPPCl

Imidazol

tert-Butylhydroperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

9, 10

-

-

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

10

FeTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

10

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

9, 10

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

10

Die Zusammensetzung der verschiedenen Reaktionsansätze und die entstandenen Produktspektren sind in Tabelle 1 zusammengefasst.


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Insgesamt ließen sich drei Produkte isolieren. In allen Reaktionsansätzen ist 3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon (10) nachweisbar, in den Vergleichsansätzen ohne Katalysator in wesentlich geringeren Mengen. Hauptumsetzungsprodukt der Ansätze mit Manganporphyrinkatalysatoren ist 2-Hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenon (9). Zusätzlich wurde aus den biomi-metischen Systemen MnTPFPPCl/Imidazol/Wasserstoffperoxid und MnTPFPPCl/Pyridin/
Wasserstoffperoxid 4-Hydroxy-3-methoxy-benzophenon (11) isoliert. Das gesamte Produkt-spektrum ist in Schema 26 dargestellt.

Schema 26: Produktspektrum der biomimetischen Studie mit 8

Die dc Trennung der Produkte erfolgte mit Fließmittelgemisch V. Mit Dm D als Phenolreagenz geben 8 eine Gelb-, 9 und 10 eine Rotviolett- und 11 eine Blaufärbung. Die für Benzophenonderivate von Fröhlich entwickelte HPLC-Methode II ist nur bedingt anwendbar, da die Stellungsisomeren mit je einer Hydroxy- und Methoxygruppen gemeinsam eluieren. Bes


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ser geeignet ist die HPLC-Methode IV. Sie erlaubt eine Trennung aller Reaktionsprodukte. Vergleichssubstanzen standen nicht zur Verfügung.

Schema 27: Fragmentierungsverhalten von 8 und Derivaten


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Im EI-MS zeigen Benzophenonderivate Molekülionenpeaks in moderaten Intensitäten, so dass die molekulare Zusammensetzung ms leicht ermittelbar ist. Die weitere Fragmentierung entspricht der von Benzilsäuren und ist in Schema 27 für die Verbindungen 8 - 11 dargestellt.

Im EI-MS von 9, dem trisubstituierten Benzophenon, treten zusätzlich die nach formaler Sauerstoffabspaltung um 16 Masseeinheiten verminderten Fragmente a’ und b’ mit den Massenzahlen m/z 165 und m/z 137 auf. Ein weiterer Unterschied der Fragmentierung von 9 zu den anderen Benzophenonderivaten besteht in der bevorzugten Abspaltung des trisubstituierten Phenylringes. Die Fragmente des unsubstituierten Phenylringes c und d treten mit hohen Intensitäten auf. Im EI-MS der disubstituierten Benzophenone zeigen die substituierten Phenylfragmente a und b hohe Intensitäten. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Fragmente der Verbindungen 8 - 11.

Tabelle 2: Übersicht der Fragmente von 8 - 11 im EI-MS

Fragment

8

m/z (Intensität)

9

m/z (Intensität)

10

m/z (Intensität)

11

m/z (Intensität)

[M+]

242 (26)

258 (23)

228 (26)

228 (26)

a

165 (100)

181 (15)

151 (100)

151 (100)

b

137 (12)

153 (3)

123 (15)

123 (30)

c

105 (29)

105 (81)

105 (26)

105 (16)

d

77 (52)

77 (100)

77 (31)

77 (37)

zusätzliche Fragmente

-

165 (21), a’

137 (23), b’

-

-

Für die Zuordnung der 1H- und 13C-Signale in den NMR-Spektren wurden ein empirisches Inkrementsystem, die Kopplungskonstanten, die Aufspaltung von Signalen im 1H-NMR aufgrund von Kernkopplungen und die 1H-13C-korrelierten zweidimensionalen Spektren verwendet. Mit dem empirischen Inkrementsystem kann die 13C-Verschiebung von substituierten Benzolen abgeschätzt werden. Dabei wird bei mehreren Substituenten ein additives Verhalten vorausgesetzt. Tabelle 3 zeigt beispielhaft die berechneten, nach [101] , und die gemessenen Werte von 8.

Mit größeren Abweichungen der Verschiebungswerte ist dann zu rechnen, wenn die Substitutionseffekte aufgrund sterischer oder elektronischer Wechselwirkungen nicht additiv sind. Daher wurde das System vor allem zur Festlegung der relativen Lage der Signale untereinander benutzt.


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Die Zuordnung im 13C-NMR wird durch die Aufspaltung der Protonensignale im 1H-NMR bestätigt. Für die Zuordnung der Signale des substituierten Ringes wurden die Kopplungskonstanten im Protonenresonanzspektrum ermittelt. Das Proton in 5-Stellung koppelt über drei Bindungen mit dem Proton in 6-Stellung. Das Protonensignal erscheint daher als Dublett mit einer Kopplungskonstante von 8,5 Hz. Das Proton in 6-Stellung koppelt mit einer Kopplungskonstante von 8,5 Hz mit dem benachbarten Proton und über 4 Bindungen mit einer Kopplungskonstante von 2 Hz mit dem Proton in 2-Stellung. Das Signal erscheint als Dublett vom Dublett. Das Proton in 2-Position zeigt ein Dublett mit der annähernd gleichen Kopplungskonstante von 1,9 Hz.

Abbildung 3: Nummerierung von 8

Tabelle 3: Berechnete und gemessene 13C-Verschiebungen (ppm) von 8

C-Atom

1

2

3

4

5

6

1’

2’/6’

3’/5’

4’

berechnet

130,6

114,6

145,0

149,0

114,6

121,5

137,8

128,7

128,7

132,7

gemessen

131,6

113,8

150,9

155,5

111,9

127,3

140,1

131,1

129,8

133,6

Die Signale der entsprechenden C-Atome wurden aus dem zweidimensionalen Spektrum abgeleitet (siehe Abbildung 4). Die Signale der Substituenten liegen für 8 für die C=O-Gruppe bei 198 ppm, für die Methoxygruppen bei 3,78 und 3,82 ppm bzw. bei 56,8 und 56,9 ppm. Eine Zuordnung eines Protonensignals zu einem 13C-Signal der Methoxygruppen war im zweidimensionalen Spektrum aufgrund der geringen Unterschiede in den Verschiebungen nicht möglich. Auf die Zuordnung der Substitutionsstelle der einzelnen CH3O-Signale, z. B. über ein 13C-13C-korreliertes, zweidimensionales Spektrum wurde verzichtet.


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Die 13C-Verschiebungen der Substitutionsstellen (siehe Tabelle 3) wurden in DEPT-Experimenten als quartäre Kohlenstoffatome erkannt und mit Hilfe des Inkrementsystems den einzelnen Stellungen zugeordnet. Mit der DEPT-Technik lassen sich gezielt, nach Signalmultiplizität selektierte Teilspektren aufnehmen. Dabei erscheinen die Signale von CH3- und CH-Gruppen in gewohnter Weise, während die CH2-Signale negativ erscheinen und die quartären C-Signale verschwinden.

Abbildung 4: 1H-13C-korreliertes, zweidimensionales Spektrum von 8 (Ausschnitt)

Auf der Grundlage der Spektren von 8 ließen sich die Derivate 9 - 11 eindeutig Strukturen zuordnen.

Verbindung 9 ist nach dem MS am substituierten Ring monohydroxyliert. Der Molekülionenpeak und die Fragmentionen unterscheiden sich im Vergleich mit denen von 8 um 16 Masseeinheiten (siehe Tabelle 2). Im 1H-NMR zeigt 9 stark tieffeldverschoben das Singulettsignal eines Protons bei 12,53 ppm, ein charakteristisches Merkmal von 2-Hydroxybenzophenonen. Ursache der Tieffeldverschiebung sind intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen. Die


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zwei Protonen des substituierten Ringes treten hochfeldverschoben als Singulettsignale bei 6,9 und 6,5 ppm auf. Daraus lässt sich Position 6 als Hydroxylierungsstelle ableiten. Im
13C-NMR ist in Übereinstimmung mit den berechneten Verschiebungen das Signal von C5 auf 100,7 ppm hochfeldverschoben, während die C2-Resonanz tieffeldverschoben bei 114,4 ppm auftritt. C6 zeigt, durch die Substitution am weitesten ins tiefe Feld verschoben, bei 141,6 ppm Resonanz. Die weiteren Signale im Protonen- und Kohlenstoffresonanzspektrum sind weitgehend unverändert. Die analytischen Daten stimmen mit den Literaturdaten überein [102] . Nach IUPAC ergibt sich mit der zusätzlichen Hydroxygruppe eine neue Zählweise der Kohlenstoffatome. Die korrekte Bezeichnung von Verbindung 9 lautet 2-Hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenon.

Die Verbindungen 10 und 11 haben nach dem MS eine Hydroxymethoxybenzophenonstruktur (siehe Tabelle 2 und Schema 27). Sie entstehen durch oxidative Methyletherspaltung jeweils einer Methoxygruppe. Die Signale der Protonen und Kohlenstoffatome wurden über die Aufspaltung der Protonensignale und die 1H-13C-korrelierten zweidimensionalen Spektren zugeordnet. Für 10 sind im 13C-NMR im Vergleich zu 8 das C2-Signal stark tieffeldverschoben und das C3-Signal hochfeldverschoben. Das Signal des C5-Atoms zeigt nur eine geringe Verschiebung (- 0,3 ppm), ebenso das dazugehörige Proton. Das Proton der OH-Gruppe zeigt im Protonenresonanzspektrum bei 5,75 ppm Resonanz. Nach den Inkrementen ist die starke C2-Verschiebung bei vergleichsweise geringer Änderung des C5-Signals für die 3-Hydroxy-4-methoxyverbindung typisch. Die abgeleitete Struktur wurde durch Literaturdaten bestätigt [103] . Für 11 muss demnach der 4-Methylether gespalten worden sein, so dass es sich um die 4-Hydroxy-3-methoxyverbindung handelt.

3.2.2 Umsetzungen mit N-Methyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (1)

3.2.2.1 Biomimetische Reaktionen

Eine Übersicht der Reaktionsansätze und der jeweiligen Produktspektren gibt Tabelle 4. Für die nichtwässrigen Ansätze wurde die freie Base 1 und für die wässrigen Ansätze das Hydrochlorid 1-HCl verwendet.

Die gefundenen Produktspektren entsprechen im Wesentlichen den Funktionalisierungsreaktionen Esterspaltung (12), N-Oxidation (13), N-Dealkylierung (14), C-Oxidation (15), Decar


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boxylierung (8) und aromatische Oxygenierung (9). Das Produktspektrum ist in Schema 28 in der Übersicht dargestellt. Es unterscheidet sich für die einzelnen Ansätze z. T. in Art und Menge der Reaktionsprodukte.

Tabelle 4: Übersicht der biomimetischen Umsetzungen mit 1

Katalysator

Co-Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Reaktionsprodukte

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17

MnTPFPPCl

Pyridin

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

MnTPFPPCl

Imidazol

Iodosylbenzen

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

MnTPFPPCl

Imidazol

tert-Butylhydroperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

FeTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

-

-

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 16, 17

-

-

Iodosylbenzen

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 13, 16, 17

-

-

tert-Butylhydroperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 13, 16, 17

FeTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

8, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

8, 12, 13, 14, 15, 16, 17

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

16, 17, 19, 20

In den Vergleichsansätzen ohne Katalysator treten in sehr kleinen Mengen 8, 12 und 13 auf. Als Artefakte finden sich Produkte von Um- oder Veresterung (16) und Chlorierung (17) in Spuren in allen untersuchten Systemen. Im wässrigen Milieu wurde im sauren pH-Bereich zusätzlich eine Reihe von Produkten in höheren Ausbeuten isoliert, die durch Veretherung (18), Chlorierung (19) oder Chlorierung und Etherspaltung (20) gebildet wurden. Die chlorierten Produkte werden auch ohne Katalysatorzusatz in geringen Ausbeuten erhalten. Sie stellen Artefakte dar. Die höchsten Umsetzungen wurden mit den Systemen MnTPFPPCl/Imidazol oder Pyridin/Wasserstoffperoxid erreicht (siehe 3.2.2.2).

Zur Charakterisierung und Trennung siehe 3.1.


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Schema 28: Produktspektrum der biomimetischen Umsetzungen mit 1


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Die Fragmentierung im EI-MS entspricht dem Verhalten anderer Benzilsäurederivate. Im Gegensatz zu den unsubstituierten Derivaten, siehe z. B. Denaverin unter 3.3.1, sind die Molekülionenpeaks mit geringen Intensitäten im MS vorhanden. Zusätzliche ms Untersuchungen mit sogenannten weichen Ionisierungstechniken waren daher nicht notwendig. Beispielhaft ist in Schema 29 das Fragmentierungsverhalten von 1 dargestellt.

Schema 29: Fragmentierung von 1 im EI-MS

In den NMR-Spektren lassen sich alle Signale bestimmten Strukturen zuordnen. Die Methylengruppen des Piperidinringes zeigen im Protonenresonanzspektrum bei 1,66 ppm und 1,81 ppm zwei Multipletts, welche mit den 13C-Signalen bei 30,3 ppm und 30,4 ppm korrelieren. Die dem Stickstoffatom benachbarten Methylengruppen treten im Protonenresonanzspektrum bei 2,15 ppm und 2,25 ppm als Multipletts und im 13C-Spektrum bei 52,1 ppm mit einem Signal auf. Die Protonenmultipletts werden zudem von dem Singulett der N-Methyl-


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gruppe bei 2,1 ppm überlagert. Im Kohlenstoffresonanzspektrum tritt diese bei 46,1 ppm auf. Die O-Methingruppe ist bei 4,9 ppm bzw. 72,0 ppm zu finden. Die Singuletts der Methoxygruppen bei 3,7 ppm und 3,8 ppm im Protonenresonanzspektrum korrelieren mit den 13C-Signalen bei 55,83 ppm und 55,86 ppm. Die Zuordnung der aromatischen Protonen erfolgte analog der von 8 über die Aufspaltungen der einzelnen Signale. Die entsprechenden Resonanzen des substituierten Ringes liegen bei 6,75 ppm und 110,2 ppm für die Position 5; bei 6,89 ppm und 119,9 ppm für die Position 6 und für die 2-Position bei 6,93 ppm und 110,7 ppm. Die quartären Kohlenstoffatome zeigen bei 142,2 ppm; 148,5 ppm und 148,7 ppm für die Positionen 1, 4 und 3 Resonanz. Der unsubstituierte Phenylring ist durch die Protonensignale von 7,19 - 7,37 ppm in Korrelation mit den 13C-Signalen bei 127,4 ppm; 127,96 ppm und 128,0 ppm gekennzeichnet. Die Substitutionsstelle zeigt bei 134,4 ppm Resonanz. Weitere Signale zeigen sich im 13C-NMR bei 80,7 ppm für das zentrale C-Atom, bei 174,0 ppm für die Carboxylgruppe und im Protonenresonanzspektrum bei 4,3 ppm für die Hydroxygruppe. Letzteres ist nicht in allen Spektren der Derivate erkennbar.

Die freie Säure 12 ist dc im Fließmittelgemisch VI identifizierbar. Hplc ist sie mit Methode IV erkennbar, jedoch von der Demethylverbindung 14 nicht basisliniengetrennt. Die Trennung ist mit verändertem Gradientenverlauf möglich, allerdings unter verschlechterten Trenn-ergebnissen der anderen Derivate. Die NMR-Spektren sind durch die fehlenden Signale des Piperidinringes gekennzeichnet, während die Signale der aromatischen Ringe, der Methoxysubstituenten und des zentralen C-Atoms im Vergleich zu 1 nur leicht verschoben sind. Die Carbonsäure tritt zum tiefen Feld verschoben bei 177,7 ppm auf. Die Protonen der Hydroxy- und der Säuregruppe geben im Protonenresonanzspektrum ein sehr breites Signal von 4,7 ppm bis 6,3 ppm. Im MS ist der Molekülionenpeak als [M+]-Peak mit der Massenzahl m/z 288 mit geringer Intensität vorhanden. Als weitere Fragmente treten a - e mit vergleichbaren Intensitäten zu 1 auf (siehe Schema 29). Die Fragmente f - i des Piperidinringes fehlen.

Das N-Oxid von 1 (13) liegt in zwei isomeren Formen, mit axialem oder äquatorialem Sauerstoff, vor (siehe Abbildung 5). Sie sind dc im Fließmittelgemisch III und hplc mit Methode IV sowie nmr unterscheidbar. Das Protonensignal der N-Methylgruppe liegt für trans-13 im Vergleich zu cis-13 im tieferen Feld. Nach dc Abschätzung der Fleckengröße und Farbintensität mit Dm C liegt das cis-Isomere im Überschuss vor. Dies steht im Gegensatz zu Untersuchungen mit 1-Alkyl-4-tert-Butylpiperidin-N-oxiden. Diese liegen bevorzugt in der trans-Form mit axialem Sauerstoff vor [104] . Die 13C-Signale der N-Methylgruppe und der N-Methylen-gruppen (delta = 59,9/58,6 ppm und delta = 60,4/64,1 ppm) sind als Folge der Entschirmung durch das Sauerstoffatom im Vergleich zu 1 (delta = 46,1 ppm und delta = 52,1 ppm) stark ins tiefe Feld


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verschoben (um 13,8/12,5 ppm und 8,3/12,0 ppm). Die Methylengruppensignale des Piperidinringes sind dagegen aufgrund des gamma-Effektes um 5 ppm bzw. 6 ppm ins hohe Feld verschoben. Die Methingruppe zeigt bei 66,6 ppm (- 5) bzw. bei 69,1 ppm (-3) Resonanz. Die Effekte sind ebenfalls im 1H-NMR erkennbar. Die N-Methyl- und N-Methylengruppensignale finden sich im tiefen Feld bei 2,80/2,89 ppm (+ 0,7/0,8) bzw. 2,45/2,66 ppm (+ 0,3/0,4) und 2,9/3,1 ppm (+ 0,8/0,9). Die Protonensignale der Methylen- und Methingruppen sind bei 1,60/2,45 ppm; 1,64/2,24 ppm hochfeldverschoben und bei 5,1/4,7 ppm (± 0,2) zu finden. Die weiteren Signale der Protonen und Kohlenstoffatome sind nur geringfügig verändert. Das Signal der Hydroxygruppe war nur für die cis-Verbindung als breites Signal bei 4,2 ppm vorhanden. Die Fragmentierung im normal aufgelösten EI-MS ist von der von 1 nicht unterscheidbar. Die Fragmente a - i (siehe Schema 29) treten mit ähnlichen Intensitäten auf. Der Molekülionenpeak ist nicht erkennbar. Im hochaufgelösten EI-MS lässt sich der M+-Peak bei der Massenzahl m/z 401,1843 in Übereinstimmung mit der isotopenreinen, theoretischen Massenzahl m/z 401,1831 für C22H27NO6 nachweisen.

Abbildung 5: Isomeren von 13

Die N-Demethylverbindung 14 ist im Fließmittelgemisch III und mit Dm C detektierbar. Strukturbeweisend sind im Vergleich mit den spektralen Daten von 1 der Molekülionenpeak mit der Massenzahl m/z 371 sowie die um 14 Masseeinheiten verringerten Fragmente des Piperidinringes f - i. In den NMR-Spektren fehlen die Signale der N-Methylgruppe. Das
13C-Signal der N-Methylengruppen ist im Vergleich zu 1 um 2 ppm hochfeldverschoben. Die Protonensignale sind um 0,5 ppm tieffeldverschoben. Die weiteren Signale sind nur leicht verschoben oder unverändert. Das Protonensignal der NH-Gruppe ist in deuteriertem Chloroform oder Methanol nicht erkennbar.

Das N-Formylderivat 15 ist dc in den Fließmittelgemischen II und VI und mit Dm A, Dm B (hellblau) und Dm C (orange) detektierbar. Im MS ist das Fragment f mit der Massenzahl m/z 113 strukturbeweisend. Die weiteren Fragmente des Piperidinringes g - i fehlen (vergleiche Schema 29). Der Molekülionenpeak erscheint in sehr geringer Intensität (< 0,5) bei der


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Massenzahl m/z 399. Die Fragmente a - e entsprechen in ihren Massenzahlen und Intensitäten denen von 1. Daraus lässt sich zunächst nur eine zusätzliche Ketofunktion am Piperidinring ableiten. Die Oxidation der N-Methylgruppe wird in den NMR-Spektren nachgewiesen. Im tiefen Feld tritt bei 161,0 ppm ein zusätzliches Carbonylsignal für den Formylrest auf. Das Signal der N-Methylgruppe ist nicht mehr vorhanden. Im Protonenresonanzspektrum ist die N-Formylgruppe als Singulettsignal bei 7,9 ppm erkennbar.

Für die N,N-Dialkylformamidstruktur sind zwei Konformere möglich (siehe Abbildung 6).

Abbildung 6: Konformationsisomere von 15

Die Methylen- und die N-Methylengruppen sind nicht mehr chemisch äquivalent. Im 13C-NMR erhält man für jedes C-Atom ein Doppelsignal (siehe Abbildung 7). Die N-Methylen-gruppe in cis-Stellung zum Formylsauerstoff ist zur trans-Stellung hochfeldverschoben [105] . Die Signale der N-Methylengruppen sind im Gegensatz zur Ausgangsverbindung 1 um 10 bzw. 14 ppm ins hohe Feld verschoben. Die Protonensignale erscheinen tieffeldverschoben bei 3,16 ppm und 3,45 ppm (+ 1 ppm). Die weiteren Signale liegen unverändert und nur im 13C-NMR zum großen Teil als Doppelsignale vor.

Da die Alkylsubstituenten am Stickstoffatom übereinstimmen, erhält man für die N-Methy-lengruppen in cis- und trans-Stellung der (E)- und der (Z)-Verbindung identische Signale in den 1H- und 13C-NMR. Eine Ableitung des Verhältnisses der (E)- zur (Z)-Verbindung ist daher nicht möglich. Erwartungsgemäß zeigen die 1H- und 13C-Resonanzen der N-Methylengruppen annähernd gleiche Signalintensitäten.


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Abbildung 7: 13C-Spektrum von 15

Der als Artefakt auftretende Methylester 16 zeigt hohe RF-Werte in allen verwendeten Fließmittelgemischen. In der HPLC eluiert 16 bei 14,4 min (Methode IV) nach den anderen Benzilsäurederivaten, vor den Benzophenonen. Die NMR-Spektren zeigen für die Aromaten mit Substituenten, das alpha-C-Atom, die Carboxyl- und Hydroxygruppe mit 1 übereinstimmende Signale. Zusätzlich tritt im Protonenresonanzspektrum zwischen den Signalen für die Meth-oxygruppen ein Singulett (3H) des Methylesters bei 3,78 ppm auf. Im 13C-NMR zeigt die Methylgruppe, im höheren Feld als die Methoxygruppen, bei 53,2 ppm Resonanz. Das MS unterscheidet sich von dem von 1 durch die fehlenden Piperidinfragmente und den Molekül-ionenpeak bei der Massenzahl m/z 302. Alle weiteren Fragmente stimmen in ihren Massenzahlen und Intensitäten mit denen von 1 überein (vergleiche Schema 29).

Aus den wässrigen Ansätzen im sauren Milieu wurde Verbindung 18 isoliert. Sie lässt sich dc sowohl mit Dm B hellblau, als auch mit Dm C orange anfärben, woraus ein basischer 3,4-Di-methoxybenzilsäureester als Grundstruktur abgeleitet werden kann. Im MS ist der Molekül-ionenpeak, um 14 Masseeinheiten zur Ausgangsverbindung erhöht, bei der Massenzahl m/z 399 zu finden. Als Basispeak tritt Fragment a bei m/z 257 (+ 14) auf, während die Frag


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mente b - i in ihren Massenzahlen denen von 1 entsprechen (vergleiche Schema 29). Als Struktur wird daher N-Methyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxy-O-methylbenzilat vorgeschlagen (siehe Abbildung 8). Bestätigt wird dies durch ein zusätzliches Signal für eine Methoxygruppe bei 3,1 ppm im Protonenresonanzspektrum. Alle weiteren Signale stimmen mit denen von 1 überein. Es wird kein Signal einer OH-Gruppe gefunden.

Abbildung 8: Strukturvorschlag für 18

Für eine Reihe weiterer isolierter Verbindungen waren aufgrund der geringen Mengen nur ms Untersuchungen möglich.

Aus den nichtwässrigen Ansätzen wurde dc bei RF = 0,43 ein in sehr geringen Mengen vorliegendes Substanzgemisch 17 isoliert, welches mit Dm B eine Hellblau-, mit Dm C eine Orange- und mit Dm D eine Rotviolettfärbung gibt. Da die einzelnen Substanzen nur in Spuren vorliegen, wurde auf die Isolierung einzelner Verbindungen verzichtet und das Gemisch ms untersucht. Aus den Fragmenten lassen sich mehrere Grundstrukturen ableiten (vergleiche Schema 29). Die Fragmente f - i waren für den N-Methylpiperidin- (m/z 99, 98, 97, 96) und den N-unsubstituierten Ring (m/z 85, 84, 83, 82) vorhanden. Die auftretenden Massenzahlen bei m/z 277 und 199 sprechen für eine Monochlorsubstitution des 3,4-Dimethoxy-phenylringes. Sie werden von den Isotopenpeaks bei m/z 279 und 201 begleitet und stellen die Fragmente a und b dar. Ein Hinweis auf eine monochlorierte Verbindung mit einer phenolischen und einer Methoxygruppe ist die Massenzahl m/z 185 (Fragment b), begleitet vom Isotopenpeak bei m/z 187. Das entsprechende Fragment a bei m/z 263/265 war nicht vorhanden. Strukturbeweisend für eine O-Demethylierung sind die gefundenen Massenzahlen m/z 229, m/z 151 und m/z 123, die den Fragmenten a - c eines Hydroxymethoxybenzilsäurederivates entsprechen. Hinweise auf eine Substitution des freien Phenylringes gibt es nicht. Die Fragmente d und e treten mit den Massenzahlen m/z 105 und m/z 77 auf. Da die Verbindungen in


56

den Fließmittelgemischen II und III einen höheren RF-Wert als 12 aufweisen, wird der intakte Ester angenommen. Die ableitbaren Strukturen sind in Abbildung 9 zusammengefasst. Die Strukturbestätigung steht noch aus.

Abbildung 9: Nachweisbare Strukturelemente des Substanzgemisches 17

Aus dem wässrigen Ansatz im sauren Milieu wurden ebenfalls chlorierte Produkte isoliert. Mit einem höheren RF-Wert als 1 im Fließmittelgemisch II wurde das Substanzgemisch 19 isoliert. Es lässt sich mit Dm B hellblau anfärben und reagiert positiv mit Dm C.

Abbildung 10: Struktur der monochlorierten Verbindungen in 19

Im MS sind die Fragmente a - i der monochlorierten Ausgangsverbindungen, begleitet von den jeweiligen, um zwei Masseeinheiten erhöhten Isotopenpeaks, erkennbar (vergleiche Schema 29). Der entsprechende Molekülionenpeak bei m/z 420/422 ist nicht vorhanden.


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Basispeak ist Fragment d des unveränderten Phenylringes. Neben den bekannten Fragmenten tritt eine Reihe weiterer Massenzahlen mit moderaten Intensitäten auf, die keinen Struktur-elementen zugeordnet werden konnten. Hplc sind mehrere Peaks mit Retentionszeiten zwischen 13,0 und 15,0 min unterscheidbar. Es kann sich bei 19 um die Stellungsisomere der monochlorierten Verbindung oder um bisher unbekannte Derivate handeln. Abbildung 10 gibt die Struktur der monochlorierten Ausgangsverbindung wieder.

Abbildung 11: Nachweisbare Strukturen in 20

Unter 20 werden mehrere chlorierte Verbindungen zusammengefasst. Sie unterscheiden sich z. T. in ihren RF- und RT-Werten, sind jedoch nicht eindeutig zuzuordnen. Neben der Hellblaufärbung mit Dm B und der Orangefärbung mit Dm C zeigen sie rotviolette bis violette Färbungen mit Dm D, ein Hinweis auf phenolische Strukturen. Aus dem MS sind drei Grundstrukturen ableitbar (siehe Abbildung 11): eine Methoxygruppe der Ausgangsverbindung wurde gespalten und der substituierte Aromat einfach oder zweifach chloriert. Die monochlorierten Verbindungen liegen als N-Methyl-4-piperidinylester vor. Für die dichlorierten
Verbindungen ist zusätzlich der 4-Piperidinylester möglich. Durch das Auftreten des Mole-külionenpeaks bei m/z 439 ist die Dichlorierung und die Spaltung einer Methoxygruppe nachgewiesen. Das charakteristische Isotopenmuster zweier Chloratome zeigt sich bei Fragment a mit den Massenzahlen m/z 297, 299 und 301 mit den Intensitätsverhältnissen von 10 : 7 : 1. Die Fragmente b und d - i sind vorhanden. Fragment c fehlt (vergleiche Schema 29). Die Fragmente f - i des N-demethylierten Piperidinrestes mit m/z 85, 84, 83 und 82 lassen sich ebenso nachweisen. Für die entsprechenden monochlorierten Verbindungen ist nur der N-Methylpiperidinrest nachweisbar. Neben dem Molekülionenpeak bei m/z 405/407 treten Fragment a bei m/z 263/265, Fragment b bei m/z 185/187 und die Fragmente d - i auf. Fragment c wird nicht gebildet. Das Verhältnis der Intensitäten der Isotopenpeaks monochlorhaltiger Fragmente ist 10 : 3.


58

Zur Struktur und den analytischen Eigenschaften der Benzophenonderivate 8 und 9 siehe unter 4.2.2.1.

3.2.2.2 Quantitative Bestimmungen

Neben der qualitativen Erfassung sollen für einen Teil der verwendeten Systeme die Umsetzungen quantifiziert und verglichen werden. Da für die meisten Reaktionsprodukte keine Vergleichssubstanzen in gesicherter Qualität, hinsichtlich Reinheit und Gehalt, vorlagen, wurde die Umsetzung über die Abnahme des Gehaltes an Ausgangsverbindung 1 im Reaktionsansatz verfolgt. Dies hat zudem den Vorteil, dass eine Trennung der Derivate von dem Überschuss an Ausgangssubstanz nicht nötig ist und eine mögliche Fehlerquelle ausgeschlossen wird. Die Quantifizierung erfolgte über die Flächen des Substanzpeaks in der HPLC mit Methode IV. Die Bestimmungsmethode wurde validiert (siehe 4.5.4).

Abbildung 12: Prozentuale Abnahme der Fläche des Peaks von 1 a) bei sofortiger Zugabe und b) bei zeitlich gestaffelter Zugabe des O-Donators

Vor der Zugabe des Wasserstoffperoxids wurden je zwei Proben entnommen, ihre Flächen doppelt bestimmt und der Durchschnittswert gleich 100 % gesetzt. Die durchschnittliche
prozentuale Abnahme der Flächen, berechnet aus den Doppelbestimmungen zweier Proben,


59

wurden als Maß der Umsetzung benutzt. In Vorversuchen wurde der zeitliche Ablauf der Umsetzungen bei sofortiger, vollständiger Zugabe des Sauerstoffdonators (Bolus-Methode) und bei zeitlich gestaffelter Zugabe der gleichen Gesamtmenge erfasst. Die Umsetzungen sind in Abbildung 12 zu verfolgen. Es ist erkennbar, dass bei sofortiger Zugabe bereits nach der ersten Minute die Umsetzung abgeschlossen ist. Bei der Zugabe von Teilmengen ist nach jeder Zufuhr eine weitere Abnahme der Fläche zu beobachten, unter Zunahme der Flächen aller Umsetzungsprodukte. Der Katalysator ist also noch aktiv und nicht zerstört worden.

Insgesamt wurde eine höhere Umsetzung bei gleicher Menge an Wasserstoffperoxid erreicht. Der weitere Verlauf bei portionsweiser Zugabe höherer Mengen wurde nicht verfolgt. Möglicherweise bietet sich hier jedoch eine Möglichkeit zur Steigerung der Umsetzungsraten.

Tabelle 5: Prozentuale Umsetzung von 1 in biomimetischen Systemen (a in Dichlormethan/ Acetonitril 1 : 1, b in Acetonitril, c in Acetonitril/Methanol 1 : 1, d in Wasser pH-Wert = 7 - 8, e in Wasser pH-Wert = 1)

Biomimetisches System

Prozentuale

Flächen der Reaktionsprodukte

 

Umsetzung

12 und 14

13

15

8

MnTPFPPCl/Imidazol a

45,2 %

678,4

770,4

1111,0

137,2

MnTPFPPCl/Imidazol b

43,9 %

671,6

705,1

812,9

108,3

MnTPFPPCl/Imidazol c

48,9 %

1034,4

719,9

638,9

208,1

MnTPFPPCl/Pyridin b

48,3 %

420,0

762,3

963,9

108,3

FeTPFPPCl/Imidazol b

14,9 %

0

90,2

270,3

0

- b

0,7 %

0

0

0

0

MnTPFPS4PCl/Imidazol d

23,2 %

353,0

0

374,1

456,4

MnTPFPS4PCl/Imidazol e

7,9 %

76,2

0

0

76,9

FeTPFPS4PCl/Imidazol d

10,7 %

47,4

0

0

112,1

- d

2,5 %

0

0

0

0

- e

0 %

0

0

0

0

In Tabelle 5 sind die prozentualen Umsetzungen von 1 unter den Bedingungen der Bolus-Methode in ausgewählten Systemen dargestellt. Beispielhaft werden für je eine Bestimmung die Flächen der Reaktionsprodukte aufgeführt, um den Einfluss der Parameter auf die einzel


60

nen Reaktionen zu verdeutlichen. Aus dem Vergleich der Umsetzungen lässt sich in Übereinstimmung mit anderen Arbeiten ableiten, dass Manganporphyrine eine höhere Aktivität als die entsprechenden Eisenporphyrine zeigen und Pyridin als Co-Katalysator stärker wirksam als Imidazol ist. Im nichtwässrigen Milieu zeigt die Zusammensetzung des organischen
Lösungsmittels einen geringen Einfluss auf den Gesamtumsatz. Mit steigender Polarität des Lösungsmittels werden jedoch vermehrt 12 und 14 gebildet. Verbindung 15 entsteht in geringerem Ausmaß. Erstmals wurden Umsetzungen im wässrigen Milieu quantifiziert. Sie liegen in diesen Untersuchungen deutlich unterhalb der effektivsten Systeme im nichtwässrigen Milieu, vergleichbar der Katalyse mit dem Eisenporphyrin.

Das wasserlösliche Eisenporphyrin zeigt eine deutlich geringere Aktivität als das entsprechende Manganporphyrin. Die Verringerung des pH-Wertes führt zu einer Abnahme der Umsetzungen. Dc ist eine vermehrte Bildung von chlorierten Nebenprodukten mit abnehmendem pH-Wert zu beobachten.

3.2.2.3 Untersuchungen zur oxidativen Esterspaltung

In den letzten Jahren gelang der Nachweis, dass in vivo eine oxidative Esterspaltung möglich ist [31] [32] . Da in biomimetischen Ansätzen die Esterspaltung im Gegensatz zu den
Vergleichsansätzen wesentlich erhöht ist, sollte der Reaktionsmechanismus hinsichtlich hydrolytischer oder oxidativer Spaltung untersucht werden.

Schema 30: Mögliche Reaktionswege der Esterspaltung

Eine Unterscheidung ist über die Erfassung der Reaktionsprodukte möglich. Auf hydrolytischem Weg entsteht neben der Säure das N-Methylpiperidinol. Die oxidative Spaltung führt zum entsprechenden Piperidonderivat (siehe Schema 30).


61

Es wurde eine GC-MS-Methode erarbeitet, die eine Trennung des N-Methyl-4-piperidons vom N-Methyl-4-piperidinol ermöglicht. Zusätzlich wurde 4-Piperidinol in die Untersuchungen mit einbezogen, da die Esterspaltung von 14 ebenfalls möglich ist. In Abbildung 13 ist das Chromatogramm einer Lösung von N-Methyl-4-piperidon und N-Methyl-4-piperidinol in Acetonitril nach Extraktion mittels Festphasenmikroextraktion (solid phase micro extraction, SPME) zu sehen. 4-Piperidinol zeigt die gleiche Retention wie N-Methyl-4-piperidinol.

Abbildung 13: Gaschromatogramm einer Vergleichslösung von N-Methylpiperidin-4-ol
(RT = 5,00 min) und -4-on (RT = 4,77 min)

Mittels der erarbeiteten Methode wurden in dem biomimetischen System MnTPFPPCl/Imidazol/Wasserstoffperoxid nach der Umsetzung von 1 N-Methyl-4-piperidon und N-Methyl-4-piperidinol in etwa gleichen Mengen über die RT-Werte und die Massenspektren nachgewiesen. Die Spaltung des Esters erfolgt zu etwa gleichen Teilen auf hydrolytischem und oxidativem Weg. In Vergleichsansätzen mit N-Methyl-4-piperidol wurde die Bildung des N-Methyl-4-piperidons durch Oxidation des Alkohols ausgeschlossen.

Die charakteristischen Fragmente des MS von 4-Piperidinol waren nicht vorhanden. Damit kann die Bildung von 12 aus 14 ausgeschlossen werden.

Zum Vergleich verschiedener Systeme sollten die Piperidinderivate quantifiziert werden. Da die direkte Aufgabe der Proben eine zu hohe Probenbelastung der GC-Trennsäule darstellt, war die Isolierung der Piperidinderivate aus dem Ansatz notwendig. Eine Trennung mittels DC führte nicht zu reproduzierbaren Ergebnissen. Da die Verbindungen eine geringe Mol-masse und einen niedrigen Schmelzpunkt aufweisen, schien eine Extraktion mittels SPME erfolgversprechend. Mit einer Polyacrylatfaser gelang in der Headspace-Technik die selektive


62

Extraktion der Piperidinderivate in ausreichender Menge. Problematisch war die Wahl des verwendeten Lösungsmittels, da chlorierte Verbindungen die Faser irreversibel zerstören. Unter 3.2.2.2 wurde nachgewiesen, dass die Verwendung von reinem Acetonitril an Stelle des Dichlormethan-Acetonitril-Gemisches zu qualitativ und quantitativ vergleichbaren Umsetzungen führt. Bei Verwendung von Acetonitril-Methanol-Gemischen sind geringe Beeinflussungen der Umsetzungen zu erkennen, insbesondere wurden vermehrt 12 und 14 gebildet. Für die zu untersuchenden Ansätze wurde daher Acetonitril als Lösungsmittel gewählt. Ein weiteres Problem lag darin, dass die gefundenen Konzentrationen der Piperidinderivate unter der geschätzten Konzentration an 12 lagen und die Mengenverhältnisse nicht plausibel in Übereinstimmung zu bringen waren. Untersuchungen mit Lösungen, die einen definierten Gehalt an N-Methyl-4-piperidinol und N-Methylpiperidon enthielten, und die reinem Acetonitril oder dem Ansatz vor und nach Zugabe des Wasserstoffperoxids zupipettiert wurden, zeigten, dass die Wiederfindungsraten der Piperidinderivate in den biomimetischen Ansätzen dramatisch abfallen. Da dies unabhängig von einer möglichen Oxidation durch Wasserstoffperoxid ist, wird eine irreversible Bindung der Piperidine, möglicherweise an den Katalysator, angenommen. Eine Quantifizierung ist daher auf diesem Weg nicht möglich. Die Bestimmung der entstandenen Säure war ebenfalls nicht erfolgreich, da 12 nicht in ausreichender Reinheit synthetisiert werden konnte und zudem in Lösungen instabil ist.

3.2.3 Umsetzungen mit N-Methyl-3-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (2)

Die biomimetischen Umsetzungen von 2 erfolgten in verschiedenen, in Tabelle 6 zusammengefassten Reaktionsansätzen. Die Produktspektren sind ebenfalls in Tabelle 6 aufgeführt. Für die wasserfreien Ansätze wurde die freie Base verwendet, im wässrigen Milieu das Hydrochlorid.

Die Reaktionsprodukte werden durch die Funktionalisierungsreaktionen N-Oxidation,
N-Demethylierung, C-Oxidation, Esterspaltung und Decarboxylierung gebildet. Das Produktspektrum ist in Schema 31 in der Übersicht dargestellt. In den Vergleichsansätzen ohne Katalysator konnten neben der Ausgangssubstanz keine weiteren Produkte nachgewiesen werden, mit Ausnahme des als Artefakt in allen Ansätzen nachgewiesenen Substanzgemisches 24 (siehe unten). Im nichtwässrigen Milieu wurde zusätzlich in Spuren das N-Oxid 22 detektiert. Insgesamt wurde in den biomimetischen Reaktionsansätzen im Vergleich zu den Untersuchungen mit 1 wesentlich weniger Ausgangsverbindung katalytisch umgesetzt.


63

Schema 31: Biomimetisches Produktspektrum der Umsetzungen von 2


64

Tabelle 6: Übersicht der biomimetischen Umsetzungen mit 2

Katalysator

Co-Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Reaktionsprodukte

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

8, 12, 16, 21, 22, 23, 24

-

-

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

22, 24

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

8, 21, 22, 24

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

8, 21, 24

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

24

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

24

Die Fragmentierung im EI-MS entspricht der anderer Benzilsäurederivate. Unterschiedlich zu den Fragmentierungen von 1 oder Propiverin ist der Zerfall des Piperidinringes. Während für 4-Piperidinylringe Fragment f die höchste Intensität zeigt, ist dies bei 3-Piperidinylringen Fragment h, welches für 2 sogar den Basispeak bildet. In Schema 32 ist die Fragmentierung von 2 dargestellt.

Mittels ein- und zweidimensionaler NMR-Techniken lassen sich die Strukturelemente von 2 und seinen Derivaten eindeutig nachweisen. Für 2 zeigen die Methylenprotonen bei 1,32/1,75 ppm bzw. 1,47/1,62 ppm Resonanz und korrelieren mit den 13C-Signalen bei 28,4 ppm bzw. 22,3 ppm. Die N-Methylenprotonen treten bei 2,11/2,36 ppm bzw. 2,11/2,59 ppm als Multipletts zusätzlich mit dem Signal der N-Methylgruppe bei 2,13 ppm auf. Im Kohlenstoffresonanzspektrum lassen sich die Signale bei 58,6 ppm bzw. 55,1 ppm den N-Methylengruppen und bei 46,1 ppm der N-Methylgruppe zuordnen. Die Methingruppe des Piperidinylringes ist bei 4,9 ppm als Multiplett im 1H-NMR und im 13C-NMR bei 72,1 ppm zu finden. Die aromatischen Methoxygruppen treten als zwei Singuletts bei 3,7 ppm bzw. 3,8 ppm im 1H-NMR auf und korrelieren mit den Kohlenstoffsignalen bei 55,79/55,84 ppm. Die Zuordnung der Aromatensignale erfolgte analog der von 8 und 1. C5 zeigt ein Protonensignal bei 6,73 ppm in Korrelation zum 13C-Signal bei 110,2 ppm. Für C2 liegen die Signale bei 6,98 ppm und 110,7 ppm, für C6 bei 6,94 ppm und 119,7 ppm. Die quartären Kohlenstoffatome zeigen Resonanz bei 142,4 ppm für C1, bei 148,5 ppm für C4 und bei 148,6 ppm für C3. Die Resonanzen des unsubstituierten Ringes liegen bei 7,19 - 7,32 ppm und 127,3/127,9/128,0 ppm, für das quartäre C-Atom bei 134,5 ppm. Weitere Kohlen


65

stoffsignale bei 80,7 ppm und 173,7 ppm lassen sich dem zentralen C-Atom und dem Carboxyl-C-Atom zuordnen. Die OH-Gruppe ist als sehr breites Signal bei 4,6 ppm erkennbar.

Schema 32: Fragmentierung von 2 im EI-MS

Die N-Demethylverbindung 21 wurde dc im Fließmittelgemisch III mit Dm C und hplc mit Methode IV bei einem RT = 12,3 min charakterisiert. Im EI-MS ist der Molekülionenpeak nur mit schwachen Intensitäten erkennbar. Strukturbeweisend sind die Piperidinylfragmente mit den um jeweils 14 Masseeinheiten erniedrigten Massenzahlen m/z 85, 84, 83 und 82, wobei Fragment h eine wesentlich geringere Intensität als beim Zerfall von 2 aufweist. Die weitere Fragmentierung entspricht der von 2 (vergleiche Schema 32). Basispeak ist Fragment d. In den NMR-Spektren fehlen die Signale für die N-Methylgruppe. Starke Verschiebungen im Vergleich zu 2 treten nur für die N-Methylengruppen auf. Ihre Protonensignale sind ins tiefe


66

Feld auf 2,57 ppm bzw. 2,72/2,82 ppm verschoben. Die 13C-Signale finden sich im hohen Feld bei 45,4 ppm (+ 9,7) bzw. 49,1/49,2 ppm (+ 9,5). Leicht verschoben sind auch die Signale der Methingruppe bei 4,8 ppm (- 0,1) im Protonenresonanzspektrum und 71,3 ppm (+ 0,8) im 13C-NMR. Die weiteren Signale sind unverändert. Einige 13C-Signale treten als Doppelsignale auf. Die Signale der OH- oder NH-Gruppe sind nicht erkennbar.

Für das N-Oxid 22 zeigt sich dc (Fließmittelgemisch III) mit Dm C und hplc (Methode IV) jeweils nur ein Peak. In den NMR-Spektren treten einige Signale als Doppelsignale auf, was auf zwei isomere Formen des N-Oxids oder die unterschiedlichen Diastereomerenpaare hinweisen kann. Die Intensitätsunterschiede sind sehr verschieden und reichen von 1 : 2 bis 2 : 1 für jeweils unterschiedliche Signale sowohl im 1H- als auch im 13C-NMR. Strukturbeweisend treten die Signale des Piperidinringes im Vergleich mit den spektralen Daten von 2 stark verschoben auf. Die N-Methylgruppe zeigt am stärksten tieffeldverschoben bei 2,93/2,97 ppm (+ 0,8) und 59,48/59,54 ppm (+ 13,3) Resonanz. Die Signale der N-Methylengruppen sind weniger stark verschoben. Die N-Methylengruppe in 6-Position des Piperidinringes tritt bei 2,88/3,06 ppm (+ 0,8) im Protonenresonanzspektrum und bei 66,1 ppm (+ 11,0) im 13C-NMR auf. Die Signale der N-Methylengruppe in 2-Position liegen für beide Isomere bei 3,60 ppm (+ 1,5/0,8) und bei 67,3 ppm (+ 8,7). Die dem Stickstoff näherliegende Methylengruppe in Position 5 ist im Protonenresonanzspektrum bis zu + 0,5 ppm auf 1,52/2,11 ppm und im Kohlenstoffresonanzspektrum um - 3,8 ppm auf 18,52/18,55 ppm verschoben. Ähnlich sind auch die Resonanzen der Methingruppe auf 5,4 ppm (+ 0,5) und 68,32/68,36 ppm (- 3,7) verschoben. Für die Methylengruppe in 4-Position des Heterozyklus finden sich die Protonensignale bei 1,23/1,88 ppm und die 13C-Signale bei 26,95/27,05 ppm (- 1,4). Nur geringfügig haben sich die Resonanzen der anderen Atome geändert. Im 13C-NMR treten sie doppelt auf, ebenso die Signale der aromatischen H-Atome des substituierten Ringes im Protonenresonanzspektrum. Das Signal der OH-Gruppe ist nicht vorhanden. Die Massenspektroskopie ist zur Strukturklärung von 22 nicht geeignet. Im EI-MS treten der Molekülionenpeak und das nach Abspaltung des Sauerstoffs vom N-Oxid zu erwartende Fragment mit der Massenzahl m/z 385 nicht auf. Die erkennbaren Fragmente a - e entsprechen dem Zerfallsmuster von
3,4-Dimethoxybenzilsäurederivaten, mit Fragment d als Basispeak (siehe Schema 32). Als Schlüsselbruchstück des N-Methyl-3-piperidinylrestes ist Fragment h mit hoher Intensität im MS vorhanden.

Die Menge an isolierbarer Verbindung 23 war für NMR-Untersuchungen zu gering. Zur Struktursicherung waren deshalb nur die ms Daten verwendbar. Im EI-MS tritt der Molekül-ionenpeak bei der Massenzahl m/z 399 auf, dem die Summenformel C22H25NO6 entspricht.


67

Die Fragmente a - e entsprechen der Fragmentierung des 3,4-Dimethoxybenzilsäurerestes (siehe Schema 32). Das Fragment mit der Massenzahl m/z 113 stellt möglicherweise das um 16 Masseeinheiten erhöhte Fragment f dar (vergleiche Schema 29). Als Struktur wird eine
N-Formylgruppe angenommen (siehe Abbildung 14).

Abbildung 14: Postulierte Struktur von 23

Es ist alternativ eine Lactamstruktur denkbar. Dc hat die Substanz im Fließmittelgemisch VI einen RF-Wert von 0,63. Ihr RT-Wert mit Methode IV ist 12,9 min.

Auf die analytische Untersuchung des Substanzgemisches 24 wurde verzichtet, da es sich hierbei um durch Artefakte gebildete Substanzen handelt, die in allen Ansätzen in Spuren nachgewiesen wurden. Das Gemisch ist dc durch den RF-Wert von 0,53 im Fließmittelgemisch II und die Färbung mit Dm B (hellblau) und Dm D (rotviolett) gekennzeichnet. Ähnliche Substanzgemische wurden bei den biomimetischen Umsetzungen mit 1 und 3 detektiert und in ihren Strukturen untersucht. In Analogie zu diesen Untersuchungen werden auch für 24 an den Aromaten chlorierte Verbindungen angenommen.

Zur Struktur und analytischen Charakterisierung von 12, 8 und 16 siehe unter 4.2.2.1.

3.2.4 Umsetzungen mit N-Methyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxybenzilat (3)

Die Zusammensetzung der Reaktions- und Vergleichsansätze und die gefundenen Produkte der Umsetzungen mit 3 sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Im nichtwässrigen Milieu werden die Produkte durch Katalyse der Funktionalisierungsreaktionen Esterspaltung (25), N-Oxi-dation (26), N-Dealkylierung (27), C-Oxidation (28) und oxidative Decarboxylierung (29) gebildet. Weiterhin traten Produkte von Um- oder Veresterung (30), Methylierung (31) und in


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Spuren von unbekannten Reaktionen auf. Hauptumsetzungsprodukte im nichtwässrigen Milieu sind 26, 27 und 28.

Tabelle 7: Biomimetische Reaktionsansätze mit 3

Katalysator

Co-Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Produkte

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

25, 26, 27, 28, 29, 30, 31

-

-

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/ Acetonitril

25, 26, 29

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

25, 26, 27, 28, 29, 32, 33

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

25, 28, 33, 34, 35

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 6 - 8

25, 33, 34

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser

pH-Wert = 1

33, 34

-

-

-

Wasser

pH-Wert = 1

33

Im Vergleichsansatz ohne Katalysator sind in geringerem Umfang N-Oxidation (26), Esterspaltung (25) und Decarboxylierung (29) zu beobachten. Eine Übersicht der katalysierten Reaktionen und ihrer Produkte gibt Schema 33. In den wässrigen Umsetzungen sind, in geringerer Ausbeute und in Abhängigkeit vom pH-Bereich, analoge Produktspektren nachweisbar. Im neutralen pH-Bereich können mit Ausnahme von 30 und 31 alle Produkte isoliert werden. Hauptumsetzungsprodukte sind jedoch 25 und 28. Zusätzlich tritt in Spuren ein am aromatischen Ring monohydroxyliertes Produkt auf (32). Es konnte jedoch nur im Gemisch mit
einem nach Methoxygruppenspaltung entstehenden Derivat (33) isoliert werden.

Verbindung 33 lässt sich in allen wässrigen Ansätzen nachweisen und ist daher als ein Artefakt anzusehen, der nicht durch die Reaktion mit dem Katalysatorsystem oder Wasserstoffperoxid entsteht. Im Vergleichsansatz im neutralen pH-Bereich ohne Katalysator lässt sich wenig freie Säure 25 und in Spuren neben 33 auch monochloriertes 33 (34) nachweisen. Im sauren Milieu ist die Umsetzungsrate nochmals vermindert. Neben wenig 25 und 28 wurden in Spuren nach Methyletherspaltung 33 und nach Methyletherspaltung und Chlorierung
mono- und dichlorierte Derivate (34, 35) identifiziert. Letztere traten im Vergleichsansatz ebenfalls auf.


69

Schema 33: Biomimetisches Produktspektrum von 3 im nichtwässrigen Milieu


70

Zur hplc Charakterisierung wurde eine Methode neu entwickelt. Die Trennung aller Derivate war mit einer RP 18-select B-Säule als stationäre Phase und einem Acetonitril-Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,50)-Gemisch als mobile Phase im Gradientenverlauf möglich (Methode III). Es eluieren zuerst Derivate mit sauren Eigenschaften, dann neutrale Produkte und abschließend basische Verbindungen.

Schema 34: Zerfallsschema von 3 im EI-MS

Die Ausgangsverbindung 3 zeigt im EI-MS den Molekülionenpeak [M+] mit der Massenzahl m/z 385 in geringer Intensität. Als strukturbeweisende Fragmente treten auf (siehe Schema 34): Fragment a bei m/z 243 für die Benzilsäurestruktur; Fragment b bei m/z 135 und Fragment c bei m/z 107 für die Methoxyphenylringe. Fragment d bei m/z 92 stellt möglicherweise


71

ein durch Abspaltung eines Methylradikals von c entstehendes Zerfallsprodukt des methoxylierten Ringes dar. Der Piperidinylrest zerfällt zu den Fragmenten f - i mit den Massenzahlen m/z 99, 98, 97 und 96 (vergleiche Schema 29 und 32).

Die Zuordnung der Signale der aromatischen Kohlenstoffatome im 13C-NMR erfolgte nach den mit Hilfe eines Inkrementsystems berechneten [101] Verschiebungen (siehe Tabelle 8).

Abbildung 15: Nummerierung von 3

Tabelle 8: Berechnete und gemessene Verschiebungen von 3

C-Atom

1, 1’

2, 2’

3, 3’

4, 4’

5, 5’

6, 6’

berechnet [ppm]

151,5

110,1

159,4

110,4

129,0

117,1

gemessen [ppm]

143,5

113,4

159,3

113,4

128,9

119,9

Protonensignale [ppm]

-

6,95

-

6,76

7,16

6,94

Aus dem zweidimensionalen 1H-13C-korrelierten Spektrum lassen sich die Protonensignale entsprechenden Strukturelementen zuordnen. Die Methylengruppen des Piperidinylringes zeigen im Protonenresonanzspektrum zwei Multipletts bei 1,64 ppm und 1,79 ppm in Korrela-tion zu dem Signal bei 30,3 ppm im Kohlenstoffresonanzspektrum. Das Multiplett der
N-Methylengruppe zeigt Resonanz bei 2,2 ppm und korreliert mit dem Signal bei 52,0 ppm. Die N-Methylgruppe zeigt Verschiebungen von 2,1 ppm bzw. 46,0 ppm, die Methingruppe von 4,9 ppm bzw. 72,2 ppm. Die Methoxygruppen sind bei 3,7 ppm und 55,2 ppm zu finden. Ein weiteres Signal bei 4,5 ppm ist das Resonanzsignal der freien OH-Gruppe. Die Verschiebungen bei 80,7 ppm und 173,6 ppm sind dem alpha-C-Atom und dem Carboxyl-C-Atom zuzuordnen.

Die freie Säure 25 ist durch ihren RF-Wert von 0,55 im Fließmittelgemisch VI und die Violettgraufärbung mit Dm B bei gleichzeitig fehlender Anfärbbarkeit mit Dm C gekennzeichnet.


72

In der HPLC eluiert sie mit Methode III bei 3,8 min. Im EI-MS ist der strukturbeweisende Molekülionenpeak als [M+]-Peak bei der Massenzahl m/z 288 gezeigt. Die weiteren Fragmente a - e entsprechen in ihren Massenzahlen und Intensitäten denen von 3 (siehe Schema 34). Die Piperidinringfragmente sind nicht vorhanden. Basispeak ist Fragment b. In den NMR-Spektren fehlen die Signale der basischen Seitenkette. Die Resonanz der Carboxylgruppe im 13C-NMR ist einer freien Carbonsäure entsprechend im tiefen Feld bei 177,6 ppm zu finden. Im Vergleich zu Verbindung 3 ist das Signal der 1-Position der Aromaten ins hohe Feld auf 142,4 ppm (- 1,1) verschoben. Deutlich getrennt sind die Kohlenstoffsignale der C2/C2’- und C4/C4’-Atome bei 113,2 ppm und 113,8 ppm. Die Zuordnung ist über ein zweidimensionales, 1H-13C-korreliertes Spektrum möglich. Das Protonensignal des C4/C4’ ist aufgrund der benachbarten Protonen an C5/C5’ in ein Dublett aufgespalten. Es zeigt bei 6,80 ppm Resonanz. Die Protonensignale der C2/C2’- und C6/C6’-Gruppen fallen bei 6,98 ppm zusammen. Die Gruppen sind jedoch im 13C-NMR unterscheidbar. Alle weiteren Signale sind nur geringfügig verschoben. Die Protonen der freien Säure- und Hydroxylgruppe sind unter den gewählten Bedingungen nicht messbar.

Für das N-oxid 26 lassen sich hplc bei RT = 8,3 und 8,7 min zwei Isomere, in Analogie zu den N-Oxiden von 1 (13) (siehe Abbildung 5), detektieren. Sie wurden dc im Fließmittelgemisch II getrennt und ms und nmr untersucht. Im EI-MS lassen sie sich von 3 nicht unterscheiden. Sie zeigen keinen Molekülionenpeak. Das Fragment mit der höchsten Massenzahl tritt nach Abspaltung des Sauerstoffs bei m/z 385 mit geringer Intensität, dem Molekülionenpeak von 3 entsprechend, auf. In den NMR-Spektren unterscheiden sich die Isomere deutlich. Die Protonensignale der N-Methylgruppe des trans-Isomers sind zu denen des cis-Isomers tieffeldverschoben. In Übereinstimmung mit Verbindung 13 stellt das Isomer mit äquatorialem Sauerstoff von 26 die stabilere Verbindung dar. Im Vergleich zu den Spektren von 3 sind die Kohlenstoffresonanzen der N-Methylgruppe um 13,8 ppm bzw. 12,7 ppm und die der
N-Methylengruppe um 8,4 ppm bzw. 12,1 ppm tieffeldverschoben. Die entsprechenden Protonensignale verschieben sich auf 2,81/3,05 ppm für die N-Methyl- und auf 2,61 - 2,81/
3,22 - 3,25 ppm für die N-Methylengruppen. Die Resonanzen der Methylengruppe treten kaum verändert bei 1,58/1,79 ppm und 2,42/2,42 ppm bzw. 24,4/25,8 ppm auf. Die Resonanzen der Methingruppe sind auf 5,0/4,8 ppm (± 0,1) bzw. 66,5/69,3 ppm (- 5,7/2,9) verschoben. Die Signale der Protonen und Kohlenstoffatome des Benzilsäurerestes treten nur leicht verändert und für beide Isomere auf. Die Signale der Hydroxygruppe sind in den Spektren nicht erkennbar.


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Die N-Demethylverbindung 27 lässt sich mit Dm A, Dm B (violettgrau) und Dm C (orange) im Fließmittelgemisch III von anderen Produkten differenzieren. In der HPLC eluiert sie bei 14,7 min (Methode III) nach allen anderen bekannten Derivaten. Im EI-MS beweisen die im Vergleich zu 3 um jeweils 14 Masseeinheiten verringerten Massenzahlen des Molekülionenpeaks [M+] bei m/z 371und der Fragmente f - i bei m/z 85, 84, 83 und 82 die Struktur (siehe Schema 34). Die weiteren Fragmente unterscheiden sich nicht von 3. In den 13C- und 1H-NMR fehlen die Signale der N-Methylgruppe. Das 13C-Signal der N-Methylengruppen ist in Folge der Entschirmung durch die im Vergleich zu 3 fehlende N-Methylgruppe stark ins hohe Feld auf 43,4 ppm (- 8,6) verschoben. Die zugehörigen Protonen sind um 0,5 ppm tieffeldverschoben und in zwei Multipletts bei 2,6 ppm und 2,8 ppm aufgespalten. Deutlich unterscheidbar sind die Signale der C2/C2’- und C4/C4’-Kohlenstoffatome bei 113,2 ppm und 113,4 ppm. Die Resonanzen der weiteren Protonen und C-Atome sind wenig verändert. Für die OH- und NH-Protonen sind keine Signale vorhanden.

Für Verbindung 28 wurde eine N-Formylstruktur nachgewiesen. Sie lässt sich dc mit Dm A, Dm B (violettgrau) und Dm C (orange) detektieren. Im EI-MS fehlen die Piperidinfragmente bei den Massenzahlen m/z 99, 98, 97 und 96. Es tritt jedoch mit hoher Intensität Fragment f bei m/z 113 auf, typisch für den N-Formylpiperidinring. Der entsprechende Molekülionen-peak fehlt im Spektrum. Die Fragmente a - e entsprechen in ihren Massenzahlen und Intensitäten denen von 3 (vergleiche Schema 34). Den Beweis der N-Formylstruktur liefern die NMR-Spektren. Das N-Formylsignal findet sich im 13C-NMR mit den Signalen der C3/C3’-Gruppen bei 159,4 ppm, das entsprechende Protonensignal bei 7,9 ppm. Aufgrund der zwei möglichen Konformeren (siehe auch Abbildung 6) treten die Signale der C-Atome des
Heterozyklus doppelt auf. Die Methylengruppensignale erscheinen bei 29,3/30,7 ppm in Korrelation mit dem Multiplett von 1,6 - 1,8 ppm. Die N-Methylengruppen geben aufgrund der zusätzlichen Formylgruppe hochfeldverschobene Signale im 13C-NMR bei 35,8/42,0 ppm
(- 16,2/10,0). Die Resonanzen der Protonen sind ins tiefe Feld auf 3,1/3,5 ppm verschoben. Die größeren Verschiebungen ins hohe Feld zeigen die Kohlenstoffatome in cis-Stellung zum Formylsauerstoff. Da die Signale der Konformere deckungsgleich sind, lässt sich das Verhältnis der (E)- zur (Z)-Verbindung aus den Signalintensitäten nicht ableiten, sowohl die
13C-Signale der Methylen- als auch die der N-Methylengruppen zeigen erwartungsgemäß annähernd gleiche Signalintensitäten. Die weiteren Signale sind im 1H- und 13C-NMR kaum verändert, zum Teil treten Kohlenstoffsignale doppelt auf.

3,3’-Dimethoxybenzophenon (29) gibt im Gegensatz zu den anderen isolierten Derivaten mit Dm B eine Gelbfärbung. Mit der HPLC-Methode III hat die Verbindung einen RT-Wert von


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11,3 min. Im EI-MS ist der Molekülionenpeak mit der Massenzahl m/z 242 in moderaten Intensitäten zu finden. Die weitere Fragmentierung entspricht, mit Ausnahme des fehlenden Fragmentes a, der des entsprechenden 3,3’-Dimethoxybenzilsäurerestes (vergleiche Schema 34). Basispeak ist Fragment b. Die Signale der Methoxygruppen finden sich bei 55,4 ppm im Kohlenstoff- und bei 3,8 ppm im Protonenresonanzspektrum. Von den aromatischen Protonen zeigen nur die Protonen am C4/C4’ ein Dublett bei 7,05 ppm, während die restlichen Protonen ein Multiplett von 7,25 - 7,32 ppm bilden. Die dazugehörenden Kohlenstoffsignale liegen für C2/C2’ bei 114,3 ppm, für C4/C4’ bei 118,8 ppm, für C6/C6’ bei 122,8 ppm und für C5/C5’ bei 129,2 ppm. Die Resonanzen der quartären C-Atome in Position 1 und 1’ treten bei 138,9 ppm auf. Die der methoxygruppensubstituierten C-Atome C3 und C3’ liegen bei 159,5 ppm. Die größte 13C-Verschiebung zeigt die alpha-Carbonylgruppe mit 196,2 ppm.

Der Methylester (30) zeigt dem Benzophenon 29 ähnliche chromatographische Eigenschaften. Im Fließmittelgemisch V hat er einen RF-Wert von 0,58 und ist mit Dm B violettgrau anfärbbar. Mit der HPLC-Methode III eluiert die Verbindung nach 10,2 min. Im EI-MS ist der
Molekülionenpeak mit geringer Intensität gezeigt. Die Fragmente a - e sind bei übereinstimmenden Massenzahlen in ihren Intensitäten denen von 3 (siehe Schema 34) vergleichbar. Die Piperidinringfragmente fehlen im MS. In den 1H- und 13C-NMR treten neben den Signalen der Methoxygruppen bei 3,7 ppm bzw. 55,2 ppm die Signale einer weiteren Methylgruppe bei 3,8 ppm bzw. 53,6 ppm auf. Die restlichen Resonanzen entsprechen, bis auf die fehlenden Signale des Piperidinrestes, den Spektren von 3. Das Protonensignal der freien OH-Gruppe ist hochfeldverschoben bei 4,1 ppm zu finden.

Für die folgenden Derivate konnten aufgrund der geringen Substanzmengen keine NMR-Untersuchungen durchgeführt werden.

Verbindung 31 konnte aus den nichtwässrigen Ansätzen isoliert werden. Sie lässt sich dc mit Dm A, Dm B (violettgrau)und Dm C (orange) detektieren. Im EI-MS tritt strukturbeweisend Fragment a um 14 Masseeinheiten erhöht bei m/z 257 (a’) auf (siehe Abbildung 16), welches nach Abspaltung der CH2-Gruppe nochmals bei m/z 243 erscheint. Der weitere Zerfall führt zu den Fragmenten b - e. Die Fragmente f - i treten mit den Massenzahlen des N-Methyl-4-piperidinylrestes m/z 99, 98, 97 und 96 auf (siehe Schema 34). Basispeak ist ein Fragment mit der Massenzahl m/z 105, für das keine Zusammensetzung oder Struktur bekannt ist. Aufgrund der anderen Fragmente wird für Verbindung 31 die in Abbildung 16 dargestellte Struktur des N-Methyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxy-O-methylbenzilates angenommen. Der Molekülionenpeak der postulierten Struktur ließ sich im EI-MS jedoch nicht nachweisen. Der Strukturbeweis steht noch aus.


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Abbildung 16: Postulierte Struktur von 31 und strukturbeweisendes Fragment a’

In den wässrigen Ansätzen trat mit einem RF-Wert von 0,30 im Fließmittelgemisch II ein Substanzfleck auf, der sich mit Dm B grauviolett, mit Dm C orange und mit Dm D violett bis rotviolett anfärben ließ. Die ms Untersuchungen zeigten, dass es sich hierbei um Gemische phenolischer Substanzen (32 - 35) unterschiedlicher Zusammensetzung handelt.

Abbildung 17: Strukturen der Derivate 32 und 33

Verbindung 32 wurde im Gemisch mit Verbindung 33 aus dem wässrigen Ansatz im neutralen pH-Bereich isoliert. Im EI-MS sind die Molekülionenpeaks einer zusätzlich monohydroxylierten Verbindung (32) und des nach Methyletherspaltung entstehenden 3-Hydroxy-3’-Methoxybenzilsäurederivates (33), jeweils mit N-Methyl-4-piperidinol verestert, zu erkennen. Die entsprechenden Fragmente a - i treten für beide Strukturen auf, wobei die Fragmente b und c für jede Verbindung doppelt, für den zusätzlich substituierten und den unveränderten Ring auftreten (vergleiche Schema 34). Gemeinsam ist beiden Strukturen das Fragment b als Basispeak mit m/z 135, Fragment c mit m/z 107, Fragment d, Fragment e und die Piperidinylfragmente f - i mit den Massenzahlen m/z 99, 98, 97 und 96. Für 32 liegen die zusätzlichen Fragmente a bei m/z 259, b bei m/z 151 und c bei m/z 123. Für 33 haben die Fragmente


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die Massenzahlen m/z 229 (a), m/z 121 (b) und m/z 93 (c). Die Strukturen der Verbindungen zeigt Abbildung 17.

In dem entsprechenden Vergleichsansatz ohne Katalysator wurden 33 und 34 detektiert. Die Struktur der monochlorierten Verbindung 34 wird im EI-MS durch den Molekülionenpeak bei m/z 405 begleitet von dem Isotopenpeak bei m/z 407 bewiesen. Da die Fragmente b und c auch mit den Massenzahlen m/z 135 bzw. 107 auftreten, muss das zusätzliche Chloratom am phenolischen Ring substituiert sein. Dies wird durch die Massenzahlen der Fragmente a - c bei m/z 263, m/z 155 und m/z 127 bestätigt. Sie werden von den um zwei Masseeinheiten erhöhten Isotopenpeaks mit ca. einem Drittel der Intensität begleitet. Die Peaks mit den Massenzahlen m/z 99, 98, 97 und 96 beweisen den intakten N-Methylpiperidinylester. Die Fragmente d und e sind im MS vorhanden. Zur Struktur der Verbindung siehe Abbildung 18.

Abbildung 18: Strukturen der chlorierten Verbindungen 34 und 35

Aus den wässrigen Ansätzen im sauren pH-Bereich wurden neben den Verbindungen 33 und 34 eine weiteres Derivat (35) isoliert. Dieses zeigt im EI-MS einen Molekülionenpeak mit der Massenzahl m/z 439. Aus den Fragmenten a - c mit den Massenzahlen m/z 297, m/z 189 und m/z 161, den Fragmenten b - e eines unveränderten 3-Methoxyphenylringes sowie den Fragmenten f - i mit den Massenzahlen m/z 99, m/z 98, m/z 97 und m/z 96 (vergleiche
Schema 34) lässt sich die in Abbildung 18 dargestellte Struktur des N-Methyl-4-piperidinyl 2,4,5 oder 6-dichlor-3-hydroxy-3-methoxybenzilates ableiten. Das typische Verhältnis der Isotopenpeaks von dichlorierten Verbindungen von 10 : 7 : 1 ist nur bei dem in moderaten Intensitäten auftretenden Fragment b mit den Massenzahlen m/z 189, m/z 191 und m/z 193 gegeben.

Überraschenderweise konnten aus dem Vergleichsansatz ohne Katalysator- und ohne Sauerstoffdonatorzusatz nach der Aufarbeitung (siehe unter 4.3 für wässrige Ansätze) die Ver


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bindungen 33 und 34 nachgewiesen werden, obwohl die Ausgangsverbindung 3 nicht mit diesen verunreinigt ist. Die Verbindungen stellen Artefakte durch die Aufarbeitung dar.

Die ms Untersuchungen erlauben keine Aussagen zur Stellung der einzelnen Substituenten. Es ist daher möglich, dass es sich in den einzelnen Ansätzen um die Derivate der gleichen Grundstruktur, jedoch um unterschiedliche Stellungsisomere handelt. Darauf weisen die
unterschiedlichen Retentionszeiten der separierten Fraktionen hin, lediglich für 33 war eine Zuordnung möglich. Die Substanz eluiert nach 11,5 min.

3.3 Umsetzungen mit Denaverin (4)

Denaverinhydrochlorid (Hydrochlorid des 2-Dimethylaminoethyl O-(2-ethylbutyl)-benzilates, 4-HCl) ist ein muskulotropes Spasmolytikum, welches vor allem zur Behandlung von spastischen Schmerzen des Urogenital- und Gastrointestinaltraktes eingesetzt wird. Obwohl es seit über 25 Jahren in der Therapie verwendet wird, sind nur wenige Daten zur Biotransformation am Menschen bekannt. Eine der Ursachen liegt in der geringen Wiederfindungsrate von unter 1 % im Urin nach peroraler Applikation [106] . Daher sind neue Methoden nötig, mit denen eventuell neue, unbekannte Metabolisierungswege erkannt werden können.

3.3.1 Biomimetische Untersuchungen

Die unterschiedlichen Reaktionsansätze und ihre Produkte sind in Tabelle 9 zusammengefasst. Zur Durchführung der Versuche und Isolierung der Reaktionsprodukte siehe 3.1 und 4.3 - 4.5.

Im nichtwässrigen Milieu lassen sich nach der Umsetzung von 4 fünf Derivate nachweisen, welche Produkte der Funktionalisierungsreaktionen Esterspaltung (36), N-Demethylierung (37), N-Oxidation (38) und C-Oxidation (39, 40) sind. Eine Übersicht gibt Schema 35. Ohne Katalysatorzusatz werden 38 und 36 mit sehr geringen Ausbeuten gebildet. Der Austausch von Acetonitril gegen Methanol im Lösungsmittelgemisch hat keinen Einfluss auf Art und Menge der Produkte. Der Einsatz von Iodosylbenzen als Sauerstoffdonator verhindert jede Reaktion. Die Verwendung von Pyridin als Co-Katalysator erhöht die Umsetzung von 4, aufgrund der einfacheren Handhabbarkeit wurde jedoch zumeist Imidazol verwendet.


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Tabelle 9: Biomimetische Umsetzungen von 4

Katalysator

Co-Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Reaktionsprodukte

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/

Acetonitril

36, 37, 38, 39, 40

MnTPFPPCl

Imidazol

Iodosylbenzen

Dichlormethan/

Acetonitril

-

MnTPFPPCl

Pyridin

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/

Acetonitril

36, 37, 38, 39, 40

MnTPFPPCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/

Methanol

36, 37, 38, 39, 40

FeTPFPPCl

Pyridin

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/

Acetonitril

36, 37, 38, 39, 40

_

Pyridin

Wasserstoffperoxid

Dichlormethan/

Acetonitril

36, 38

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 1

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, (44)

MnTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 6-8

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, (44)

MnTPFPS4PCl

-

-

Wasser,

pH-Wert = 1

-

FeTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 1

36, 37, 38, 39, 40

FeTPFPS4PCl

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 6-8

36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, (44) , 45, 46

-

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 1

-

-

Imidazol

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 6-8

36, 38, 41, (44)

-

-

Wasserstoffperoxid

Wasser,

pH-Wert = 6-8

-

Die höchste Ausbeute wird mit dem System MnTPFPPCl/Pyridin/Wasserstoffperoxid erzielt. Der Einsatz des Eisenporphyrinsalzes führt zu geringeren Ausbeuten. Es bestehen je nach eingesetztem System sowohl Unterschiede in der Gesamtausbeute als auch im Verhältnis der verschiedenen Produkte zueinander. Die Hauptumsetzungsprodukte sind jedoch immer 39, 36 und 38.

Die Produkte 36 - 40 werden auch bei den Umsetzungen von 4 im wässrigen Milieu nachgewiesen. Weitere Derivate entstehen in Abhängigkeit vom verwendeten Katalysator und vom pH-Wert (siehe Tabelle 9). So lassen sich bei Verwendung des wasserlöslichen Manganpor-phyrins, unabhängig vom pH-Wert, drei weitere Umsetzungsprodukte isolieren: Benzophenon (41) sowie die Methylester der Benzilsäure (42) und der O-(2-


79

Ethylbutyl)benzilsäure (43), womit auch das Entstehen der unsubstituierten Benzilsäure (44) indirekt nachgewiesen ist (siehe 3.4.1).

Schema 35: Biomimetische Reaktionsprodukte von 4 im nichtwässrigen Milieu

Ersetzt man im neutralen wässrigen Milieu das Manganporphyrin durch das entsprechende Eisensalz, entstehen neben 36 - 43 zwei weitere Derivate, 2-Hydroxybenzophenon (45) und 2-Dimethylaminoethyl 2-(2-Ethylbutoxy)-2-(2-hydroxyphenyl)-2-phenylacetat (46). Das Produktspektrum im wässrigen Milieu ist in Schema 36 zusammengefasst.


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Schema 36: Biomimetisches Produktspektrum von 4 im wässrigen Milieu


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Im Gegensatz zu dem weiten Produktspektrum im neutralen Milieu wird 4 im sauren Milieu von FeTPFPS4PCl/Imidazol/Wasserstoffperoxid nicht umgesetzt. In den Vergleichsansätzen ohne Katalysatorzusatz lassen sich im neutralen Milieu in geringen Mengen 38, 36 und 41 nachweisen. Im sauren Milieu sowie im Vergleichsansatz mit Katalysator ohne Sauerstoffdonator findet keine Umsetzung statt. Eine Reaktion mit Luftsauerstoff ist ausgeschlossen.

Hplc ist mit der mobilen Phase I die Trennung aller bei der Umsetzung von 4 entstandenen Derivate möglich.

Im MS zeigen mit Ausnahme der Benzophenone alle Umsetzungsprodukte das für Benzilsäuren typische Fragmentierungsmuster (siehe Schema 37). Bei Elektronenbeschuss zeigen sie eine geringe Stabilität. Die Molekülradikalionen treten nicht oder nur mit geringen Intensitäten auf, daher ist die Verwendung sogenannter weicher Ionisierungsmethoden notwendig. Als geeignet erweisen sich die Elektrospray-Ionisierung (ESI) und die Fast-atom-bombardment-Technik (FAB), wobei im ESI-MS der Molekülionenpeak als [M + H]+-Peak, im FAB-MS im Allgemeinen als [M + Na]+-Peak auftritt.

Ein Fragmentierungsweg ist die alpha-Spaltung am zentralen C-Atom, wobei sich das Oxonium-ion a bildet. Die Abspaltung der 2-Ethylbutylkette durch Oniumreaktion führt zum relativ stabilen Kation b, aus welchem durch weitere Fragmentierung c entsteht. Ein weiterer, nur mit geringen Intensitäten auftretender Zerfall, beginnend mit der Alkoxyabspaltung der Etherseitenkette, ist durch das Fragment d charakterisiert. Auf beiden Wegen ist die Bildung des Phenylkations f möglich. Die Fragmente g und h stellen die Schlüsselbruchstücke der
2-Dimethylaminoethylstruktur der Esterseitenkette dar. Sie treten mit hoher Intensität auf, wobei h den Basispeak bildet (siehe Schema 37).

Die NMR-Spektren zeigen die Signale in den erwarteten Bereichen. Für die Phenylringe treten die entsprechenden Protonensignale im Bereich von 7,33 - 7,44 ppm als Multiplett und die 13C-Signale bei 128,5 ppm, 128,7 ppm, 128,8 ppm und 140,7 ppm für die Substitutionsstelle auf. Für die Etherseitenkette zeigen sich die 1H- bzw. 13C-Signale bei 0,79 bzw. 11,5 ppm für die CH3-Gruppen. Die CH- und CH2-Gruppen geben im Protonenresonanzspektrum ein Multiplett bei 1,37 ppm, lassen sich jedoch im 13C-NMR bei 23,8 ppm den CH2-Gruppen und bei 42,1 ppm der CH-Gruppe zuordnen. Die O-CH2-Gruppe ist bei 3,38 bzw. 67,2 ppm zu finden. Die N-Methylgruppen zeigen 1H- bzw. 13C-Signale bei 2,63 bzw. 43,2 ppm; die N-Methylengruppe bei 3,2 bzw. 56,2 ppm und die O-Methylengruppe bei 4,51 bzw. 59,7 ppm. Das Resonanzsignal des zentralen C-Atoms liegt bei 87,1 ppm und das der Carboxylfunktion bei 172,0 ppm.


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Schema 37: Fragmentierung von 4 im EI-MS

Die freie Säure 36 konnte mittels Vergleichssubstanz dc (Fließmittel IV, Dm B) und hplc (mobile Phase I) nachgewiesen werden. Im EI-MS zeigt 36 die Fragmente a, b, c und f bei den entsprechenden Massenzahlen (siehe Schema 37). Im ESI-MS mit negativem Aufnah


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memodus ist der Molekülionenpeak [M - H]- bei m/z 311 nachweisbar. In den 1H- und
13C-NMR sind sowohl die Signale für die aromatischen Atome als auch die der Etherseitenkette erkennbar. Das alpha-C-Atom gibt im 13C-NMR bei 86,8 ppm ein Signal, das Carbonsäure-C-Atom bei 173,1 ppm. Das H-Atom der freien Säure ist aufgrund des schnellen Protonenaustausches nicht erkennbar.

Die N-Demethylverbindung 37 lag ebenfalls als Vergleichssubstanz vor. Sie lässt sich dc im Fließmittel III mit Dm C detektieren. Im EI-MS treten strukturbeweisend die Fragmente a bei m/z 267 und g bei m/z 57 auf (vergleiche Schema 37). Der Molekülionenpeak [M + H]+ lässt sich im ESI-MS bei m/z 370 nachweisen. Im 1H-NMR ist das Signal nur einer N-Methyl-gruppe mit drei Protonen bei einer Verschiebung von 2,5 ppm vorhanden. Im 13C-NMR sind die Signale der N-Methyl- und N-Methylengruppe um ca. 10 ppm, die der anderen Atome nur leicht hochfeldverschoben.

Die Fragmente im EI-MS des N-Oxids 38 unterscheiden sich nur geringfügig in ihren Intensitäten von dem Spektrum von 4. Lediglich im ESI- und FAB-MS lässt sich das N-Oxid durch das Auftreten des Molpeaks [M + H]+ bei m/z 400 nachweisen. Das 13C-NMR zeigt im
Vergleich zu 4 eine deutliche Tieffeldverschiebung um 13 bzw. 11 ppm der Signale der
N-Methyl- und N-Methylengruppe, während die Signale der O-Methylengruppe der Esterstruktur aufgrund des gamma-Effekts um 2 ppm hochfeldverschoben sind. Im 1H-NMR sind die Effekte ebenfalls erkennbar. Das Signal der N-Methylengruppe liegt bei 3,87 ppm (+ 0,67), der N-Methylgruppen bei 3,08 ppm (+ 0,45) und der O-Methylengruppe ebenfalls tieffeldverschoben bei 4,63 ppm (+ 0,12). Von 4 lässt sich 38 dc eindeutig im Fließmittel III unterscheiden, detektierbar ist 38 mit Dm A, B und C.

In der HPLC zeigt 39 einen Doppelpeak mit Retentionszeiten von 15,1 und 15,6 min (mobile Phase I). Dc verhält sich die Substanz ähnlich 4, der RF-Wert ist im Fließmittel I etwas höher als der von 4. Sie ist mit konzentrierter Schwefelsäure und Dragendorffs Reagenz detektierbar. Im MS sind die Fragmente a und b mit den Massenzahlen m/z 267 und 183 vorhanden, so dass die Aromaten und die Etherseitenkette unverändert vorliegen. Zusätzlich tritt bei m/z 86 ein Fragment auf, welches der Summenformel C4H8NO entspricht (vergleiche Schema 37, Fragment g). Mit dem [M + H]+-Peak von m/z 398 im ESI-MS wird die Summenformel C24H31NO4 bestätigt. Im 1H-NMR treten zwei Singulett-Signale mit einer Verschiebung von 7,6 und 7,8 ppm (je 1H) und im 13C-NMR zwei Carbonylsignale mit 163,0 und 163,1 ppm zusätzlich auf. Deutlich hochfeldverschoben und ebenfalls doppelt treten die 13C-Signale der N-Methyl- (30,0 und 35,6 ppm, je nur 3H), und der N-Methylengruppe (43,6 und 48,5 ppm) auf, während die Signale der O-Methylengruppe (62,0 und 63,2 ppm) tieffeldverschoben sind.


84

Im 13C-NMR treten zum Teil auch weitere Signale doppelt auf. Daraus lässt sich eine
N-Formylstruktur ableiten, wobei zwei Konformationsisomere auftreten (siehe Schema 38).

Schema 38: Konformationsisomere von 39 mit charakteristischen ä-Werten des 1H-NMR-Spektrums

Nach nmr Untersuchungen von Stewart und Siddall treten die Protonen des trans-Isomers, es entspricht nach der heute gültigen Nomenklatur dem E-Isomer, hochfeldverschoben zu denen des cis-Isomers auf [105] . Sie untersuchten weiterhin das Verhältnis der Isomere zueinander und fanden die raumfordernden Substituenten bevorzugt in trans-Stellung zum Carbonylsauerstoff. Aus den relativen Intensitäten der N-Formyl- und N-Methylprotonen im 1H-NMR lässt sich für 39 ein E/Z-Verhältnis von 2 : 1 bis 1 : 1 ermitteln. Dies steht in guter Übereinstimmung mit dem ermittelten cis/trans-Verhältnis von 40 : 60 für N-Ethyl-N-methylform-amid [105] . Die Unterschiede der ermittelten Verhältnisse für 39 können ihre Ursache in unterschiedlichen Konzentrationen der jeweiligen NMR-Proben haben. Für Formanilid wurde eine Konzentrationsabhängigkeit demonstriert. Mit sinkender Konzentration stieg der Anteil an dem E-Isomer [107] . Nach dem Chromatogramm in der HPLC ist jedoch ein 2 : 1-Verhältnis plausibel, wenn man übereinstimmende Extinktionskoeffizienten zugrunde legt.

Das EI-MS von 40 zeigt lediglich die Fragmentionen a und b mit den Massenzahlen m/z 267 und 183 für die unverändert vorliegenden Aromaten und Etherseitenkette (siehe Schema 37). Im FAB-MS ist der Molekülionenpeak [M + Na]+ mit der Massenzahl m/z 393 erkennbar. Im CI-MS tritt das Molekülionenradikal nach Wasserabspaltung ([M + H - H2O]+ mit m/z 353 auf. Die Molmasse beträgt demnach 370 g/mol. Dc verhält sich die Substanz ähnlich den
Säuren 36 und 44 (vergleichbare RF-Werte). Sie lässt sich nicht mit Dragendorffs oder MBTH-Reagenz detektieren. Im 13C-NMR tritt ein zusätzliches Signal eines Carboxyl-C-


85

Atoms bei einer Verschiebung von 168 ppm auf, während im 1H-NMR lediglich zwei isolierte Methylenprotonensignale für die O-Methylengruppen bei einer Verschiebung von 3,1 und 4,2 ppm erkennbar sind. Die Signale der N-Methyl- und N-Methylengruppen sind nicht vorhanden. Die Ethylstruktur der Esterseitenkette ist also noch vorhanden, wobei ein C-Atom Teil einer Carboxylfunktion ist. Für 40 kann demnach die in Abbildung 19 angegebene Struktur postuliert werden.

Abbildung 19: Struktur von 40

Für die folgenden Substanzen war eine Strukturabsicherung durch NMR aufgrund der geringen Mengen an isolierten Derivaten nicht möglich.

Benzophenon (41) zeigt im EI-MS einen Molekülionenpeak [M]+ bei der Massenzahl m/z 182, welcher eine Masseeinheit unter dem Benzilsäurefragment b liegt und damit eine eindeutige Zuordnung zur Grundstruktur erlaubt. Die weiteren Fragmente entsprechen den Fragmenten c und f der Benzilsäurefragmentierung (siehe Schema 37). Benzophenone lassen sich ebenfalls über ihre UV-Spektren von Benzilsäuren unterscheiden. Letztere zeigen eine starke Phenylabsorption < 230 nm und eine sehr schwache Absorption bei ca. 260 nm. Substanz 41 absorbiert unter den gleichen Bedingungen ebenfalls bei < 230 nm und zusätzlich bei 254 nm mit hoher Intensität. Dc ist 41 im Fließmittel V und durch die Gelbfärbung mit Dm B identifizierbar.

Die Methylester 42 und 43 sind dc ebenfalls in Fließmittel V und durch ihre Rotviolettfärbung mit Dm B charakterisiert. Ihre Strukturen wurden durch ihre FAB-MS und mittels synthetisierter Vergleichssubstanzen dc und hplc abgesichert. Sie zeigen im FAB-MS ein zu den
anderen Benzilsäurederivaten verändertes Fragmentierungsverhalten. Neu ist das Auftreten der Alkoxyabspaltung ohne Wasserstoffwanderung mit hohen Intensitäten, so dass ein zu Fragment d um eine Masseeinheit verringertes Fragment i mit m/z 225 entsteht. Typisch für die Methylester scheint das neue Fragment k mit der Massenzahl m/z 197 zu sein (Struktur


86

vorstellungen siehe Abbildung 20). Die Molekülionenpeaks erscheinen als [M + Na]+ bei m/z 265 bzw. 349. Basispeak ist jeweils Fragment b mit m/z 183.

Abbildung 20: Strukturen der Fragmente i und k im FAB-MS von 42 und 43

2-Hydroxybenzophenon (45) wurde im EI-MS durch den [M]+-Peak bei m/z 198 und das
zusätzliche Auftreten von den um jeweils 16 Masseeinheiten erhöhten Massenzahlen der Fragmente c und f als Hydroxybenzophenon charakterisiert. Durch dc Vergleich mit den möglichen Stellungsisomeren 2-Hydroxy-, 3-Hydroxy- und 4-Hydroxybenzophenon konnte im Fließmittel V die 2-Position der OH-Gruppe gesichert werden. Mit Dm D lässt sich 45 rot anfärben. Das UV-Spektrum (mobile Phase I, DAD, UV-Bereich von 190 - 400 nm) zeigt zwei charakteristische Maxima bei 262 und 330 nm.

Das ringhydroxylierte Denaverinderivat 46 wurde ebenfalls über das EI-MS als phenolisches Produkt charakterisiert. Die Biphenylfragmentionen a, b, d und g treten mit um jeweils 16 Masseeinheiten erhöhten Massenzahlen auf (vergleiche Schema 37).

Abbildung 21: Strukturvorschlag für 46

Die Bruchstücke c und f treten jeweils doppelt für den phenolischen und phenylischen Ring mit den Massenzahlen m/z 121 und 105 und m/z 93 und 77 auf und sind strukturbeweisend.


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Basispeak ist Fragment h mit m/z 58. Im FAB-MS lässt sich der Molekülionenpeak als [M + H]+-Peak bei m/z 400 und als [M + Na]+-Peak bei m/z 422 nachweisen. Dc wurde 46 im Fließmittel I durch Rotfärbung mit Dm D als Phenol detektiert. Im UV-Spektrum ist die
Phenylabsorption bathochrom auf ca. 230 nm verschoben, zusätzlich tritt ein intensives
Maximum bei 278 nm auf. Für 46 kann demnach die in Abbildung 21 angegebene Struktur postuliert werden. Die Stellung der OH-Gruppe wurde aus dem Auftreten von 45 abgeleitet.

3.3.2 Orientierende Untersuchungen mit einem biologischen Modell

Im Fremdstoffmetabolismus nimmt die Leber einen herausragenden Platz ein. Sie verfügt über ein fast komplettes metabolisches Enzymmuster und eine hohe biotransformatorische Aktivität. Viele biologische Modelle basieren daher auf Leberpräparationen im weiteren
Sinne. Die verwendeten Testsysteme reichen von der isolierten, perfundierten Leber über isolierte kultivierte Hepatozyten und subzelluläre Fraktionen bis zu den isolierten, gereinigten Enzymen. Diese verschiedenen Modelle unterscheiden sich in ihren biologischen Organisa-tionsstufen, was sich auch auf die ablaufenden Biotransformationswege auswirkt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum Vergleich mit dem chemischen Modellsystem als einfaches biologisches Modell die Rattenlebermikrosomenfraktion gewählt. Mikrosomen sind subzelluläre Fraktionen, die bei der Isolierung von endoplasmatischem Retikulum als Membranvesikel entstehen. Neben den Cytochrom P450 Isoenzymen sind auch andere Enzyme, wie die Epoxidhydrolase, die Glucuronyl-, die Sulfo- und die Methyltransferase in der Lebermikrosomenfraktion nachgewiesen worden. Zusätzliche Enzymaktivitäten sind aufgrund des ebenfalls im 10 000 g-Überstand vorhandenen Zytosols zu erwarten. Die gewählte Fraktion ist relativ einfach zu präparieren und zu handhaben (siehe Schema 39). Nach Zellaufschluss durch schonende Homogenisierung werden die Zellkerne und Gewebebruchstücke durch Zentrifugieren bei 1000 g gefällt. Der Überstand wird erneut, üblicherweise bei 9000 g, zentrifugiert, wobei Mitochondrien und weitere Zellorganellen sedimentieren. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde bei 10 000 g zentrifugiert, wodurch die Zentrifugierungsdauer verkürzt werden konnte. Im Überstand verbleiben die mikrosomale und die zytosolische Fraktion.

Die für 1 h bei 37 °C inkubierten Ansätze werden gefriergetrocknet, dreimal mit einem Dichlormethan/2-Propanol-Gemisch (3 : 1) extrahiert und die Extrakte im Vakuum eingeengt. Der


88

Rückstand wird in Methanol aufgenommen. Die Isolierung und Identifizierung der Metaboliten erfolgte analog zu den biomimetisch gewonnenen Umsetzungsprodukten dc und hplc.

Schema 39: Gewinnung der Rattenlebermikrosomenfraktion

In den inkubierten Ansätzen konnten die Verbindungen 36 - 38 durch dc und hplc Vergleich mit Vergleichssubstanzen nachgewiesen werden. Weitere Metaboliten wurden dc durch Rotfärbung mit Dm B in geringen Mengen nachgewiesen, ließen sich jedoch nicht isolieren. Sie unterscheiden sich in ihrem chromatographischen Verhalten von allen aus den chemischen Umsetzungen und der Rattenbiotransformation bekannten und als Vergleichssubstanzen vorliegenden Derivaten (siehe 3.4.2 und 4.2.2.3).

Die freie Säure 36 wurde in Vergleichsansätzen ohne Zusatz des 10 000 g-Überstandes in vergleichbaren Mengen isoliert. Damit ist 36 kein Produkt enzymatischer Aktivität, sondern als Artefakt zu bewerten.

Bezogen auf die eingesetzte Menge an 4 wurde im Vergleich zum chemischen Modell wesentlich mehr Substrat umgesetzt.


89

3.4 Diskussion der Umsetzungen von Arzneistoffen mit Benzilsäurestruktur

3.4.1 Diskussion unter Berücksichtigung der Reaktionsmechanismen

Für die meisten der hier gezeigten biomimetisch vermittelten Reaktionen gibt es Hinweise auf eine Beteiligung von Cytochrom P450 Isoenzymen in vivo oder in vitro. Im Folgenden sollen für die verschiedenen Reaktionsprodukte mögliche Reaktionswege und -mechanismen aufgezeigt und mit der metabolischen Bildung in vivo verglichen werden.

Um die Bildung von N-Oxiden durch Oxidation tertiärer Amine konkurrieren in vivo die Cytochrom P450 Isoenzyme mit flavinhaltigen Monooxygenasen. Die resultierenden N-Oxide sind stark polar und werden im Allgemeinen schnell eliminiert. Sie können jedoch im Organismus auch wieder zur Ausgangsverbindung reduziert und damit als Metabolit nicht erkannt werden. Im chemischen Modellsystem werden die N-Oxide 38, 13, 22 und 26 zwar auch ohne Katalysator gebildet, die Ausbeute wird jedoch durch den Metallporphyrinkatalysator wesentlich erhöht. Teilweise werden in biomimetischen Systemen N-Oxide als Sauerstoffdonatoren verwendet [108] . Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass in den hier verwendeten Systemen primär die N-Oxide entstehen, welche dann als Sauerstoffquelle für die weiteren Reaktionen dienen. Diese Möglichkeit wurde jedoch nicht weiter untersucht.

Schema 40: Postulierter Bildungsweg der N-Formylgruppe

Oxidative N-Demethylierungen tertiärer Amine sind enzymatisch und metallporphyrinkatalysiert vielmals nachgewiesen worden. Der Reaktionsmechanismus verläuft, wahrscheinlich übereinstimmend, über einen Elektronentransferprozess (siehe 2). Das hypothetisch auftretende Carbinolamin wird in den vorliegenden Untersuchungen ebenfalls als Zwischenprodukt für die Bildung der N-Formylderivate 39, 15, 23 und 28 postuliert, aus welchem durch Oxidation die N-Formylgruppe entsteht (siehe Schema 40). N-Formylderivate wurden auch in biomimetischen Umsetzungen anderer Arzneistoffe beobachtet, so z. B. von Aminophenazon [94] . Der gleiche Mechanismus der Bildung über eine alpha-Hydroxyverbindung wird für die biomimetische Bildung des N-Acetylderivates von Lidocain postuliert [109] . Metabolite mit N-


90

Formylstruktur wurden bisher nur selten isoliert, so z. B. bei Biotransformationsstudien mit 5-Aminosalicylsäure. Aber auch die als Zwischenprodukte auftretenden Carbinolamine sind teilweise so stabil, dass sie unverändert ausgeschieden werden. Ein Beispiel ist der Benzodiazepinprecursor 450191-S, hier wurden die N-Hydroxymethylderivate des sekundären und tertiären Amins isoliert. Bei Benzazepin erfolgt die Oxidation der N-Methylgruppe in vivo bis zur Säure [110] .

Schema 41: Postulierter Bildungsweg von 40

Ebenfalls als N-Dealkylierung kann die Bildung von 40 aufgefasst werden. Das Carbinolamin wird an der N-Ethylstruktur gebildet. Nach der Spaltung zum entsprechenden Aldehyd erfolgt anschließend die Oxidation zur Säure (siehe Schema 41). Dies entspricht metabolisch einer oxidativen Deaminierung mit anschließender Dehydrierung zur Carbonsäure. In vivo unterliegt beispielsweise Chlorphenoxamin, ein 2-(N-Dimethylamino)ethylether des 4-Chlorbenz-hydrols, der oxidativen Deaminierung, wobei sich das entsprechende 2-Benzhydryloxy-essigsäure und -ethanolderivat nachweisen lassen. Der intermediäre Aldehyd wird hier entweder zur Säure oxidiert oder zum Alkohol reduziert. Im Falle des Chloroquin wurden nach


91

Abspaltung der Dialkylaminogruppe der entsprechende Aldehyd und die Säure identifiziert [110] . Am Beispiel des Losartans gelang mittels Humanlebermikrosomen in vitro der
Nachweis, dass die Oxidation des Aldehyds zur Säure durch Cytochrom P450 Isoenzyme
katalysiert wird [111] .

Ester werden in vivo im Allgemeinen durch unspezifische Esterasen schnell hydrolysiert. Es ist für wenige Arzneistoffgruppen, wie beispielsweise für die Nifedipinabkömmlinge, auch eine oxidative Esterspaltung nachgewiesen worden [31] . Auch für andere Arzneistoffe wie Cypermethrin werden nichthydrolytische Esterspaltungen diskutiert [110] . Für die Esterspaltung von 1 gelang der eindeutige Nachweis eines oxidativen Reaktionsmechanismus mit dem Nachweis des N-Methyl-4-piperidons. Für die anderen untersuchten Arzneistoffe wird analog teilweise eine oxidative Esterspaltung angenommen. So ist die Ausbeute an Benzophenon (41) und damit an freier Säure 44 in den Umsetzungen von Denaverin mit Metallporphyrinkatalysator und Sauerstoffquelle gegenüber den Vergleichsansätzen nur mit dem Katalysator oder nur mit dem Sauerstoffdonator wesentlich erhöht. Eine metallkatalysierte Hydrolyse kann damit ausgeschlossen werden. Nur im wässrigen, neutralen Milieu ohne Katalysator, aber mit Zusatz der als Co-Katalysator verwendeten Stickstoffbase Imidazol, tritt Benzophenon als Folgeprodukt der basenkatalysierten Hydrolyse von 4 zur Benzilsäure auf.

Schema 42: Möglicher Mechanismus der metallporphyrinkatalysierten, oxidativen Decarboxylierung (nach Hirobe [90] )

Die Benzophenonderivate 8, 29, 41 und 45 entstehen durch Decarboxylierung der entsprechenden Benzilsäuren. In biomimetischen Umsetzungen wurden oxidative Decarboxylierungen erstmals von Hirobe an alpha-Arylcarbonsäuren beobachtet [90] . Von ihm wurde ein möglicher Reaktionsmechanismus postuliert, auf welchem der vorgeschlagene Mechanismus der metallporphyrinkatalysierten Bildung von Benzophenonen aus Benzilsäuren in Schema 42 basiert. Er bedarf jedoch noch einer endgültigen Klärung.

Decarboxylierungen spielen im physiologischen Stoffwechsel eine wichtige Rolle. Der Abbau von Aminosäuren durch nichtoxidative Abspaltung von Kohlendioxid führt zu biogenen


92

Aminen, die im Organismus essentiell sind. Oxidative Decarboxylierungen werden z. B. von der Pyruvat-Dehydrogenase, einem Enzym des Kohlenhydratstoffwechsels, katalysiert. Dabei werden 2-Oxosäuren in die jeweils nächst niedere Carbonsäure und Kohlendioxid umgewandelt. Die Fähigkeit von Cytochrom P450 zur Katalyse der oxidativen Decarboxylierung wurde am Beispiel des Indometacins in vitro durch die Hemmung der Reaktion mit einem spezifischen Inhibitor eindeutig nachgewiesen [35] . Der Umfang der Beteiligung von Cytochrom P450 Isoenzymen an der Decarboxylierung von Xenobiotica bedarf jedoch noch weiterer Studien.

Als weitere Reaktion tritt in den biomimetischen Umsetzungen mit 1 und 3 die Methylierung der freien OH-Gruppe auf. Im Organismus wird diese Reaktion als Konjugationsreaktion von Methyltransferasen katalysiert. Erstmals wurden mit den Verbindungen 18 und 31 in biomimetischen Systemen Derivate von Umwandlungen beobachtet, die im Ergebnis Phase II-Reaktionen entsprechen. Der zugrundeliegende Reaktionsmechanismus ist nicht bekannt. Rein hypothetisch wäre die Methylierung durch ein Formaldehyd-Ameisensäure-Gemisch, welches durch teilweise Oxidation des durch N-Demethylierung entstehenden Aldehyds zur Säure entsteht, möglich. Dieses Reagenz dient in der Synthesechemie als Methylierungs-gemisch.

Die Übertragung von Chlor auf Substrate wird in der Natur von Chlorperoxidasen katalysiert. Die Chlorperoxidase gehört wie das Cytochrom P450 zu den Häm-Thiolat-Proteinen. Sie kann neben der Halogenierung auch Reaktionen, die von Peroxidasen, Katalasen und
Cytochrom P450 bekannt sind, katalysieren. Es wird angenommen, dass der Reaktionsmechanismus über eine aktive Oxoferrylspezies verläuft, welche dann in der Lage ist, Chlorid zur Substrathalogenierung zu verwenden. Diese oxidative Halogenierung wurde mit Metallporphyrinsystemen bereits nachgeahmt [82] . In den in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen werden verschiedene halogenierte Produkte nachgewiesen. Es ist auch möglich, dass
diese Produkte durch radikalische Reaktionen mit Cl2, welches aus Chlorid und Wasserstoffperoxid generiert wird, gebildet werden.

Die unterschiedlichen katalytischen Aktivitäten der verwendeten biomimetischen Systeme stehen in Übereinstimmung mit den unter 2.1 aufgeführten systematischen Untersuchungen der Einflussfaktoren bei der Zusammensetzung solcher Modellsysteme. Generell zeigen Sys-teme mit einem Manganporphyrin der zweiten oder dritten Generation eine höhere Aktivität als die entsprechenden Eisenporphyrine. Die Ausbeuten im wässrigen Milieu sind dabei
geringer als in nichtwässrigen Lösungen. Für Eisenporphyrinkatalysatoren lässt sich die Aktivität durch Zusatz von Stickstoffbasen als Co-Katalysatoren im wässrigen Milieu nur in ge


93

ringem Maße steigern, da Eisenporphyrine bevorzugt zwei Stickstoffbasenmoleküle komplexieren. Hydroperoxide sind jedoch nicht in der Lage solche Liganden zu verdrängen. Die Bildung der aktiven Spezies ist daher nicht möglich. Im sauren pH-Bereich liegen die Ausbeuten niedriger als im neutralen, da die Bildung der aktiven Spezies im sauren Milieu langsamer ist als der Zerfall oder Abbau des Sauerstoffdonators. In Übereinstimmung mit den systematischen Untersuchungen von Fröhlich [95] zu biomimetischen Umsetzungen an Diphenylmethanderivaten führt Pyridin als Co-Katalysator zu etwas höheren Ausbeuten als Imidazol.

3.4.2 Diskussion unter Berücksichtigung der Biotransformation von Benzilsäurederivaten

In Untersuchungen zur Biotransformation von Denaverin in der Ratte konnten aus dem Harn neben unverändertem 4 elf Metaboliten isoliert werden, von denen neun in ihren Strukturen aufgeklärt wurden [112] . Die Hauptbiotransformationsprodukte waren Benzilsäure (44) und 3,3-Diphenylmorpholin-2-on, für welches als Vorstufe der nach Etherspaltung entstehende Benzilsäureester diskutiert wurde. Weiterhin wurden die N-Demethylverbindung (37) und unsubstituierte bzw. veresterte 2,2-Diphenylessigsäure isoliert. Letztere müssten durch reduktive Etherspaltung entstehen. Die gefundenen Methyl- und Ethylester von 36 und 44 wurden als Artefakte, bedingt durch das Arbeiten mit den entsprechenden Alkoholen, angesehen.
Betrachtet man die Gesamtheit der Metaboliten, so lässt sich ihre Bildung mit den Funktionalisierungsreaktionen O- und N-Dealkylierung und Esterspaltung zusammenfassen. Phase II-Metaboliten wurden nicht gefunden.

Zum Metabolismus von 4 im Menschen liegen wenige Daten vor. Bei pharmakokinetischen Untersuchungen zur renalen Ausscheidung von 4 wurde die N-Demethylverbindung 37 mittels GC-MS identifiziert [113] . In einer anderen Studie wurden 37 und 44 in Harnproben quantifiziert. Insgesamt konnten jedoch nur unter 1 % der verabreichten Dosis an unverändertem Arzneistoff und Metaboliten im Urin wiedergefunden werden [106] . In neuesten
Untersuchungen wurden weitere Metaboliten aus dem Urin von Probanden isoliert und mittels GC-MS Strukturvorschläge erarbeitet [114] . Sie wurden nicht quantifiziert. Die Mehrzahl der Verbindungen zeigen eine 2-Hydroxyethylesterstruktur und wurden zusätzlich an der Etherseitenkette an verschiedenen Positionen hydroxyliert. Die zugrundeliegenden Biotransformationsreaktionen sind oxidative Deaminierung mit anschließender Reduktion zum 2-Hydroxy-ethylderivat und C-Oxidation. Weiterhin wurden als Phase-I-Reaktionen die N-Demethy-


94

lierung bis zur primären Aminofunktion, die Oxidation der durch C-Oxidation gebildeten
Alkohole zum Aldehyd und zur Carbonsäure, Esterspaltung sowie Etherspaltung mit
anschließender Reduktion zum Diphenylessigsäurederivat beobachtet. Die Metabolite wurden im Urin überwiegend als Glucuronsäurekonjugate ausgeschieden. In Humanfäzesproben wurden 4 und 37 in kumulativen Ausscheidungsmengen von 11 % bzw. 3 % der verabreichten Dosis detektiert. Es wird vermutet, dass die Ausscheidung im Fäzes aus unvollständiger
Resorption, biliärer Sekrektion oder gastrointestinalem Metabolismus resultiert. Weitere aus Stabilitätsuntersuchungen oder Biotransformationsstudien bekannte Derivate oder an den aromatischen Ringen veränderte Derivate wurden als Metabolite im Urin oder Fäzes aus-geschlossen.

Benactyzin, 2-Diethylaminoethyl benzilat, unterscheidet sich in seiner Struktur vom Denaverin durch die fehlende Etherseitenkette und durch die Diethylaminostruktur. Die Biotransformation in der Ratte führt zur Benzilsäure als Hauptmetabolit, weiterhin wurden die deethylierte und die unveränderte Ausgangsverbindung detektiert. Die Funktionalisierungsreaktionen sind in Analogie zum Verhalten von 4 N-Dealkylierung und Esterspaltung. Die
Hydrolyse zur Benzilsäure kann in vivo enzymatisch und nichtenzymatisch ablaufen [115] .

Die Biotransformation des N-Ethyl-3-piperidinyl benzilates wurde in vivo an Ratten und in vitro mit Rattenleberpräparationen untersucht [116] . In vitro wurden im Rattenleberhomogenat die Ausgangssubstanz, die deethylierte Ausgangsverbindung und N-Ethyl-3-piperidinol nachgewiesen. In vivo wurden die unveränderte Ausgangssubstanz und die nach Esterspaltung auftretenden Benzilsäure und N-Ethyl-3-piperidinol im Urin nachgewiesen. Die renale Ausscheidung der deethylierten Ausgangsverbindung und des 3-Piperidinols wurde ausgeschlossen. Insgesamt wurden im Urin weniger als 15 % der verabreichten Dosis wiedergefunden.

Zur Biotransformation von Propiverin (N-Methyl-4-piperidinyl O-propylbenzilat) in Mensch und Tier liegen inzwischen zahlreiche Berichte vor [56] . Es wurden vielfältige Produkte der O- und N-Dealkylierung, der N- und C-Oxidation, der Esterspaltung sowie von Kombinationen aus diesen isoliert. Diphenylessigsäurederivate als Produkte reduktiver Prozesse und kernhydroxylierte Derivate wurden nicht gefunden. Unterschiede bestehen im Metabolismus von Ratte und Mensch. In der Ratte entstehen keine N-dealkylierten Verbindungen, und die N-Oxidation findet in geringerem Maße, die Bildung von 44 in höherem Maße im Vergleich zum menschlichen Metabolismus statt. Der menschliche Organismus dagegen produziert viele verschiedene Produkte durch vielfältige Kombinationen der Grundreaktionen. Hauptmetaboliten sind das Propiverin-N-oxid, die N-Oxide weiterer Metabolite und seitenkettenhydroxylier


95

te Derivate. Nachgeordnet finden auch Esterspaltung und N-Demethylierung statt. Als Ergebnis von Konjugationsreaktionen wurden Glucuronide isoliert.

Für N-Methyl-4-piperidinyl 4-methoxybenzilat liegen einige Ergebnisse zum Metabolismus in der Ratte vor [117] . Es wurden fünf Metaboliten isoliert und identifiziert. Es handelt sich dabei um die O-dealkylierte Ausgangsverbindung, 4-Methoxybenzilsäure, 4-Methoxybenzo-phenon und die entsprechenden phenolischen Analoga. Hauptbiotransformationswege sind damit die O-Dealkylierung, Esterspaltung und Decarboxylierung. Mittels fraktionierter Verdampfung mit anschließender Massenspektroskopie wurden weitere Metaboliten von
N-Oxidations-, N-Demethylierungs- und eventuell von aromatischen Hydroxylierungs-reaktionen charakterisiert. Letztere konnten jedoch nicht eindeutig bewiesen werden. Es
wurden ebenfalls Hinweise auf die Bildung von 2-(4-Methoxyphenyl)-2-phenylessigsäure gefunden. Solche Metaboliten reduktiver O-Dealkylierungen wurden auch bei der Biotransformation von Denaverin in der Ratte beobachtet.

Epicainid (N-[(1-Ethyl-2-pyrrolidinyl)methyl]benzilamid), ein Benzilamid mit antiarrhythmischer Wirkung, wird im menschlichen und Rattenorganismus unterschiedlich metabolisiert [118] . Hauptbiotransformationsweg der Ratte ist die aromatische Oxygenierung, Hauptmetabolit 3-Hydroxy-4-methoxy-epicainid, weiterhin wurden die 4-Hydroxy-, 3,4-Dihydroxy- und die 3,4’-Dihydroxy-4-methoxyverbindungen identifiziert. Es konnten keine Metaboliten nachgewiesen werden, die durch Amidspaltung oder Reaktionen am N-Ethylpyrrolidinring gebildet wurden. Grundsätzlich verschieden verläuft die Biotransformation im Menschen. Die Aromaten werden nicht verändert. Die Hauptmetaboliten werden durch N-Deethylierung und Oxidation in alpha-Stellung zum Stickstoffatom im Pyrrolidinring gebildet. Amidspaltung und
N-Dealkylierung am Amidstickstoff sind weitere Metabolisierungsreaktionen. Ein Teil der Metabolite wird als Konjugat ausgeschieden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass basische Benzilsäurederivate im menschlichen Organismus vor allem an der basischen Seitenkette metabolisiert werden. Für den Rattenstoffwechsel lässt sich kein bevorzugter Biotransformationsweg finden.

Aus den biomimetischen Ansätzen mit Denaverin konnten insgesamt elf Derivate isoliert werden. Sie sind Produkte der O- und N-Dealkylierung, der N- und C-Oxidation, der Esterspaltung, der oxidativen Decarboxylierung und der aromatischen Oxygenierung. Im biologischen Modell wurden die isolierten Metaboliten durch N-Dealkylierung und N-Oxidation gebildet. In der Tabelle 10 werden die oxidativen und hydrolytischen Reaktionen des biomimetischen Modells den Funktionalisierungsreaktionen in vitro und in vivo gegenübergestellt.


96

Dabei ist zu beachten, dass in vivo die Metaboliten oft durch mehrere Biotransformationsreaktionen gebildet werden, hier jedoch die zugrundeliegenden Reaktionen verglichen werden.

Tabelle 10: Übersicht der Derivatisierungen von 4 (a indirekt bewiesen, b weitere Produkte wurden detektiert, aber nicht identifiziert, ( ) in geringem Umfang stattfindend)

Funktionalisierungsreaktion

Biomimetisches Modell

Metabolismus im Mensch

Metabolismus der Ratte

Biologisches Modell

Esterspaltung

×

(×)

×

-

Etherspaltung


[(×)]

(×)

×


[-]

Ester- und

Etherspaltung

(×)a

(×)

×

-

N-Demethylierung

×

×

×

×

N-Oxidation

×

-

-

×

Deaminierung

×

×

-

-

C-Oxidation der

Etherseitenkette

-

×

-

-

C-Oxidation der

basischen Seitenkette

×

-

-

-

Decarboxylierung

×

-

-

-

Aromatische

Oxygenierung

(×)

-

-

-

Weitere

-

Reduktion

Reduktion, ?b

?b

Mit der biomimetischen Methode wurden zahlreiche Derivate von Denaverin gewonnen. Mit Ausnahme des Morpholinderivates wurde die Bildung aller Produkte oxidativer Biotransformationswege der Ratte im chemischen Modell nachempfunden. Unterschiede bestehen in den Mengen und Verhältnissen der einzelnen Derivate. Das Fehlen der Diphenylessigsäurederivate im biomimetischen Produktspektrum überrascht nicht, da das System als Modell für Oxygenierungsreaktionen entwickelt wurde. Bis jetzt wurden keine Reduktionen in metallporphyrinkatalysierten, biomimetischen Metabolismusstudien beobachtet. Ein weiterer Unterschied zur Biotransformation der Ratte ist das Fehlen des eindeutigen Nachweises der durch Ester- und Etherspaltung gebildeten Benzilsäure 44, lediglich der Methylester (42) wurde nachgewiesen. Dessen Bildung ist durch eine Veresterung von 44 oder durch Umesterung des nach Etherspaltung entstehenden Benzilsäureesters möglich. Nach Untersuchungen von Lisowski zeigt 44 nur eine geringe Tendenz zur Veresterung. Der basische Ester zeigt jedoch eine


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schnelle Umesterung zu 42 [119] . Somit kann 42 nur als Beweis der O-Dealkylierung betrachtet werden. Das Auftreten von 41 beweist indirekt 44, da dessen Bildung nur aus der unsubstituierten Säure möglich ist. Die freie Säure 44 wird in Lösung auch in Abwesenheit des Katalysators teilweise zu 41 abgebaut. Aufgrund des vollständigen Umsatzes wird jedoch eine Beteiligung der reaktiven Metallporphyrin-Oxo-Spezies und damit ein oxidativer Mechanismus als wahrscheinlich angenommen. Die untergeordnet stattfindende Etherspaltung steht in Übereinstimmung mit den bisherigen Ergebnissen zum Metabolismus im Menschen. Obwohl 44 renal ausgeschieden wird, wurde es in den untersuchten Harnproben nur in geringen Mengen quantifiziert. Dies wird in den neuesten Untersuchungen bestätigt. Bis auf zwei Metabolite zeigen auch alle anderen identifizierten Biotransformationsprodukte des Menschen eine intakte Etherstruktur. In der Ratte stellt die Etherspaltung zusammen mit der Esterspaltung einen Hauptbiotransformationsweg dar. Ähnlich ist im Falle des Propiverins 44 einer der Hauptmetaboliten in der Ratte, während es vom Menschen nur in geringem Maße gebildet wird. Mit dem in vitro-Modell konnte die Etherspaltung nicht gezeigt werden. Die zur Bildung von 44 und 36 nötige Esterspaltung wurde mit dem chemischen Modell in Übereinstimmung mit der Biotranformation der Ratte und des Menschen nachgewiesen, während die im biologischen Modell mit der Rattenlebermikrosomenfraktion auftretende Verbindung 36 nichtenzymatisch gebildet wird. Übereinstimmung mit dem Metabolismus des Menschen und der Ratte zeigen alle Produktspektren von Denaverin im Auftreten von 37. Nicht in Übereinstimmung mit den verfügbaren in vivo-Daten steht das Auftreten des N-Oxids in den chemischen und biologischen Ansätzen. Ursache könnten eine geringe renale Ausscheidung oder eine im menschlichen oder tierischen Organismus nachfolgende Reduktion zum tertiären Amin sein. Für Propiverin stellt die N-Oxidation sowohl in vivo als auch biomimetisch einen wichtigen Biotransformationsweg dar. In den biomimetischen Systemen wurde weiterhin eine oxidative Deaminierung beobachtet, die durch nachfolgende Oxidation zum Carbonsäurederivat 40 führt. Dieser Biotransformationsweg wurde durch die neuesten Untersuchungen zum Metabolismus des Menschen bestätigt. Der Deaminierung folgt jedoch die Reduktion zum Alkohol, die mit dem biomimetischen Modell für Oxygenierungen nicht nachgeahmt werden kann. Es ist jedoch möglich, dass auch in vivo nach Deaminierung eine Oxidation zur Säure stattfindet. Da Verbindung 40 nicht als Vergleichssubstanz vorlag, kann ihre Bildung nicht ausgeschlossen werden. Dies gilt ebenfalls für das biomimetisch synthetisierte N-Formyl-derivat 39, welches in vivo bisher nicht beobachtet wurde. Möglicherweise stehen 39 und 40 in Übereinstimmung mit beobachteten, aber nicht identifizierten Metaboliten der Ratte. In den biomimetischen Produktspektren und im Metabolitenspektrum der Ratte fehlen im Vergleich

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zum Metabolitenspektrum des Menschen Produkte von C-Oxidationen an der Etherseitenkette. Ringhydroxylierte Derivate traten nur in den biomimetischen Ansätzen von 4 auf. Sie lagen in sehr geringen Konzentrationen vor und wurden nur von einem definierten biomimetischen System (FeTPFPS4PCl/Imidazol/Wasserstoffperoxid in Wasser im pH-Bereich = 6 - 8) gebildet. 2-Hydroxybenzophenon (45) entsteht aus der ringhydroxylierten Verbindung 46 nach Ester- und Etherspaltung durch oxidative Decarboxylierung. Da es für ein Abbauprodukt in relativ hohen Mengen im Verhältnis zu 46 auftritt, wird analog zur Bildung des Benzophenons 41 aus 44 eine Katalyse der Decarboxylierung angenommen. Die Bildung durch direkte Hydroxylierung von 41 ist nicht möglich, da biomimetische Umsetzungen von 41 zu den entsprechenden 3- und 4-Hydroxyverbindungen führen. Die als Zwischenprodukt notwendig auftretende 2-Hydroxybenzilsäure konnte nicht nachgewiesen werden.

Ähnliche Reaktivitäten in biomimetischen Systemen zeigen die untersuchten, neuen Benzilsäurederivate 1, 2 und 3. Hauptumsetzungsprodukte sind die N-Formylderivate, weiterhin wurden in beachtlichen Ausbeuten die N-Oxide, die N-Demethylderivate, die freien Benzilsäuren und die entsprechenden Benzophenone erhalten. Zwischen den wässrigen und nichtwässrigen Systemen bestehen keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der erhaltenen Produktspektren. Die Reaktivität ist in den wässrigen Modellsystemen geringer. In Übereinstimmung zu den biomimetischen Untersuchungen mit Denaverin und Propiverin sowie mit den bekannten Biotransformationswegen von basischen Benzilsäureestern finden Umwandlungen vor allem an der basischen Seitenkette statt. Hinweise auf die Bildung von Diphenyl-acetoxypropansäurederivaten durch Aufspaltung des Piperidinringes als Folge einer Deaminierung, in Analogie zur Bildung von 40 durch Deaminierung von 4, gibt es nicht.

Unterschiede bestehen zwischen den 4- und 3-Piperidinylderivaten. 2 ist gegenüber oxidativen Angriffen stabiler, was sich in geringeren Ausbeuten und einem eingeschränkten
Produktspektrum ausdrückt.

In allen im Rahmen dieser Arbeit untersuchten biomimetischen Umsetzungen von basischen Benzilsäureestern finden keine O-Dealkylierungen bzw. für 1 nur in sehr geringem Ausmaß statt, obwohl die Fähigkeit des Metallporphyrinkatalysators zur Katalyse der Spaltung von aromatischen und aliphatischen Ethern in Benzilsäurederivaten oftmals nachgewiesen wurde. In vivo unterliegen Verbindungen mit 3,4-Dimethoxyphenylstrukturen, beispielsweise Verapamil oder Papaverin, der Methoxygruppenspaltung, wobei in der Regel nur eine Etherbindung gespalten wird. Beispiele für Arzneistoffe, bei denen die Methoxygruppen nicht biotransformiert werden, wurden in der Literatur nicht gefunden. Somit ist nach den bisherigen Erkenntnissen von der Spaltung einer Methoxygruppe in vivo auszugehen. Systematische Un


99

tersuchungen zur Eignung der verwendeten biomimetischen Systeme, den unterschiedlichen Metabolismus von aromatischen Methoxygruppen nachzuahmen, wurden bisher nicht durchgeführt. Die systematischen Studien zum biomimetischen Verhalten von an den aromatischen Ringen substituierten Benzophenonen und Benzilsäuren beschränkten sich auf Verbindungen mit maximal einer Methoxygruppe in para-Stellung eines oder beider Phenylringe. Verbindungen mit 3,4-Dimethoxystruktur oder mit Methoxygruppen in meta-Stellung wurden nicht einbezogen. Die biomimetischen Umsetzungen des 3,4-Dimethoxybenzophenons im Rahmen dieser Arbeit führten zur Etherspaltung vorrangig der 3-, aber auch der 4-Methoxy-gruppe. Die entsprechende Dihydroxyverbindung wurde nicht gebildet. Hauptreaktion war die aromatische Hydroxylierung in 2-Stellung. In den biomimetischen Untersuchungen der entsprechenden 3,4-Dimethoxybenzilsäureester 1 und 2 wurde keine der Reaktionen beobachtet. Auch 4 unterscheidet sich in seinem biomimetischen Verhalten vom entsprechend unsubstituierten Benzophenon. 41 wird biomimetisch zur 4-Hydroxy- und zur 3-Hydroxyverbindung umgesetzt. 4 unterliegt keiner aromatischen Oxygenierung. Die entsprechende freie Benzilsäure 44 wird in biomimetischen Systemen zur 4-Hydroxy- und zur 2-Hydroxybenzilsäure oxygeniert. Betrachtet man zusätzlich die Produktspektren der aromatischen Oxygenierung von N-Methyl-4-piperidinyl benzilat und dem zusätzlich veretherten Propiverin in biomimetischen Modellsystemen, zeigt sich, dass die veresterte Benzilsäure in Übereinstimmung mit 44 in 4- und 2-Stellung des Aromaten oxygeniert, Propiverin an den Phenylringen jedoch nicht verändert wird. Für die entsprechenden 4-Methoxyderivate, 4-Methoxybenzophenon,
4-Methoxybenzilsäure und N-Methyl-4-piperidinyl 4-methoxybenzilat, stimmen die biomimetisch gebildeten Produkte aromatischer Oxygenierungen überein. Es werden die
4-Hydroxy- und die 3-Hydroxy-4-methoxyderivate generiert. Da bisher keine 3-Methoxy-benzilsäurederivate biomimetisch untersucht wurden, lassen sich zum Vergleich mit den Umsetzungen von 3 nur die Reaktionen von den ebenfalls an beiden Phenylringen substituierten Derivaten 4,4’-Dimethoxybenzophenon und 4,4’-Dimethoxybenzilsäure heranziehen. Die Produktspektren des Benzophenonderivates unterscheiden sich von denen der Benzilsäure insoweit, als beide zu den 4-Hydroxy-4’-methoxy- und 3-Hydroxy-4,4’-dimethoxy-verbindungen reagieren, 4,4’-Dimethoxybenzophenon aber auch an beiden Methoxygruppen zum 4,4’-Dihydroxyderivat demethyliert wird. Mit 3 werden im biomimetischen System
keine O-Demethylierungen oder aromatischen Oxygenierungen beobachtet. Das 3,3’-Di-methoxybenzophenon stand für entsprechende biomimetische Studien leider nicht zur Verfügung. Insgesamt lässt sich ableiten, dass sich das biomimetische Verhalten nicht nur von
Benzophenonen und Benzilsäuren unterscheiden kann, sondern auch unterschiedliche Benzil

100

säurederivate, freie Säure, veresterte Säure oder veresterte und veretherte Benzilsäure, ein unterschiedliches biomimetisches Verhalten zeigen.

Für den Metabolismus der neuen Benzilsäurederivate werden vor allem Reaktionen an der basischen Seitenkette, neben Esterspaltung und N-Demethylierung auch C-Oxygenierung und Oxidation, erwartet. Aromatische Oxygenierungen treten in den biomimetischen Umsetzungen nur untergeordnet auf und werden daher sicherlich nicht den Hauptbiotransformationsweg darstellen. Offen bleibt die Bedeutung der nur untergeordnet stattfindenden O-Dealkylie-rungen der aromatischen Methoxygruppen der Verbindungen 1, 2 und 3.

Für Denaverin wurden die vermuteten Biotransformationsreaktionen Deaminierung, N-De-alkylierung und Esterspaltung sowie die nur untergeordnet stattfindende Etherspaltung durch neueste Untersuchungen bereits bestätigt.


101

3.5 Umsetzungen von Estrogenen

Zur Überprüfung der Anwendbarkeit des biomimetischen Modells auf Stoffe ohne Diphenylmethanstruktur wurden aufgrund der breiten Anwendung als Arzneimittel Estrogene als Substrate ausgewählt. Von den zur Verfügung stehenden Steroiden wurde zunächst der Estron-3-methylether (5) als Modellsubstanz ausgewählt. Anschließend wurden das therapeutisch verwendete Ethinylestradiol (6) und der entsprechende 3-Methylether (7) untersucht, für die eine Reihe von Metaboliten bekannt ist. Zielstellung war die Nachahmung der metabolischen
Reaktionen am Aromaten, Methyletherspaltung und aromatische Oxygenierung.

3.5.1 Biomimetische Untersuchungen

Die Umsetzungen von 5 erfolgten in wässrigen und nichtwässrigen Systemen mit verschiedenen Katalysatoren, Sauerstoffdonatoren, mit Imidazol als Co-Katalysator und zum Teil unter Zusatz von beta-Cyclodextrin. Die Reaktionsansätze und -bedingungen sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Zur Isolierung der Reaktionsprodukte siehe 4.3.

Zur chromatographischen Charakterisierung wurde eine HPLC-Methode entwickelt, die eine weitgehende Trennung aller zur Verfügung stehenden Vergleichssubstanzen ermöglicht (zur Struktur der verwendeten Substrate und Vergleichssubstanzen siehe Abbildung 22). Als
stationäre Phase wurde eine RP-18-Säule (5 µm) 125 × 4 mm verwendet. Als mobile Phase erwiesen sich Mischungen aus Wasser und Methanol, das 16 Vol% einer Dichlormethan-
2-Propanol-Mischung enthielt, im Gradientenverlauf am günstigsten (Methode V). Die Detektion erfolgte aufgrund der Absorptionsmaxima der Vergleichssubstanzen mittels DAD bei 280 nm. Dc wurden die Reaktionsansätze in Fließmittel VII, VIII und IX aufgetrennt. Die Umsetzungsprodukte ließen sich mit Dm A und B detektieren. Zusätzlich wurde Dm D zur Detektion phenolischer Produkte eingesetzt.

Die Umsetzungen von 5 mit MnTPFPPCl/Imidazol/Wasserstoffperoxid in Aceton führten zu einer Vielzahl von Reaktionsprodukten, die sich nur unvollständig trennen ließen. Hplc lagen die RT-Werte der Umsetzungsprodukte in der Mehrzahl zwischen 15,0 und 20,0 min.


102

Tabelle 11: Biomimetische Reaktionsansätze der Steroide

Substrat

Katalysator

O-Donator

Lösungsmittel

Weitere

Bedingungen

5

MnTPFPPCl

Wasserstoffperoxid

Aceton, 25 ml

-

5

MnTPFPPCl

Iodosylbenzen

Aceton, 25 ml

-

5

MnTPFPPCl

tert-Butylhydroperoxid

Aceton, 25 ml

-

5

FeTPFPPCl

Wasserstoff-peroxid

Aceton, 25 ml

-

5

FeTPFPPCl

Iodosylbenzen

Aceton, 25 ml

-

5

MnTPPCl

Wasserstoffperoxid

Aceton, 25 ml

-

5

MnTPPCl

Iodosylbenzen

Aceton, 25 ml

-

5

FeTPPCl

Wasserstoffperoxid

Aceton, 25 ml

-

5

FeTPPCl

Iodosylbenzen

Aceton, 25 ml

-

5

-

Wasserstoffperoxid

Aceton, 25 ml

-

5

-

Iodosylbenzen

Aceton, 25 ml

-

5

MnTPFPS4PCl

Wasserstoffperoxid

Wasser, 100 ml

beta-Cyclodextrin, 37°C

6

MnTPFPS4PCl

Wasserstoffperoxid

Wasser, 200 ml

beta-Cyclodextrin

7

MnTPFPS4PCl

Wasserstoffperoxid

Wasser, 200 ml

beta-Cyclodextrin

Dc waren Produkte über die gesamte Laufstrecke verteilt. Aus den Färbungen mit Dm B lassen sich keine Rückschlüsse auf Strukturelemente ziehen, zumal die resultierenden Farben sehr stark von der aufgesprühten Menge Schwefelsäure, der Dauer der Erwärmung auf 120 °C und dem Zeitpunkt der Betrachtung abhängig sind. Mit Dm D konnten ebenfalls einige Produkte angefärbt werden. Die resultierenden Farben reichten von orange über rot, rotviolett bis grau und bläulich. Zumindest für die roten und rotvioletten Färbungen werden phenolische Strukturen angenommen, obwohl Dm D auch mit Carbonylen kuppeln kann. Für in ihren Strukturen bekannte Carbonyle, wie z. B. 5, wurden jedoch nur gelbe Färbungen beobachtet. Der Reaktionsansatz wurde dc getrennt und massenspektrometrisch untersucht. Dabei zeigte sich, dass die einzelnen Fraktionen noch Stoffgemische darstellten. Ihre weitere Trennung war aufgrund der geringen Mengen nicht möglich.


103

Abbildung 22: Strukturen der zur Verfügung stehenden Estrogene

Als einziges Reaktionsprodukt konnte 6-Oxoestronmethylether (47) (siehe Abbildung 23) isoliert und in seiner Struktur aufgeklärt werden. Das nach Methyletherspaltung entstehende Estron konnte dc und hplc nicht sicher nachgewiesen werden.

Abbildung 23: Struktur von 6-Oxoestronmethylether

Die weiteren Variationen des nichtwässrigen Systems hinsichtlich der Katalysatoren oder Sauerstoffdonatoren (siehe Tabelle 11) führten ebenfalls zu einer Vielzahl von Reaktionsprodukten. Die Produktspektren variieren in ihrer Zusammensetzung und auch in den Mengen


104

einzelner Derivate beträchtlich. Lediglich 47 konnte in allen Ansätzen dc nachgewiesen werden. Die größte Ausbeute wurde nach dc Abschätzung mit den Systemen FeTPFPPCl/Imidazol/Iodosylbenzen und MnTPFPPCl/Imidazol/tert-Butylhydroperoxid
erzielt. Eine Abschätzung des Gesamtumsatzes ist nicht möglich, da die spektroskopischen Eigenschaften der Reaktionsprodukte sehr uneinheitlich sind. So wurden hplc einige Derivate detektiert, die im UV-Spektrum bei 280 nm ein Minimum zeigten, so dass ein Mengenvergleich aufgrund der Peakhöhen oder -flächen nicht möglich ist. Analog dürften auch dc die Nachweisgrenzen mit den verschiedenen Dm sehr unterschiedlich ausfallen.

Für die wässrigen Ansätze wurde zunächst Cyclodextrin als Lösungsvermittler und zur Erhöhung der Regioselektivität ausgesucht. In Vorversuchen wurden alpha- und beta-Cyclodextrin in Wasser und Wasser-Methanol-Gemischen auf ihre Effektivität hinsichtlich der Löslichkeitsverbesserung von 5 untersucht. Die höchste Löslichkeit erreichte 5 unter Zusatz von 0,01 mol/l beta-Cyclodextrin. Die Komplexierung von Estrogenen durch beta-Cyclodextrin wurde bereits systematisch untersucht [120] . Dabei bilden sich mit steigender Cyclodextrinkonzentration zunächst leichter wasserlösliche Einschlussverbindungen mit einem Verhältnis Cyclodextrin : Steroid von 1 : 1, welche bei weiterer Konzentrationserhöhung in schwerer lösliche Komplexe mit einem gegenüber dem Steroid erhöhten Anteil an Cyclodextrin übergehen. Die Gesamtmenge an solubilisierten Steroid nimmt daher mit steigenden beta-Cyclodextrin-konzentrationen zunächst zu und fällt dann wieder ab. Welcher Molekülteil des Steroids für die Einschlussverbindung verantwortlich ist, ist nicht bekannt. Für die Reaktionsansätze wurden 5 und die entsprechende Menge beta-Cyclodextrin zunächst in Wasser bei 37 °C 3 Stunden zur Gleichgewichtseinstellung gerührt, filtriert und der Katalysator, Imidazol und Wasserstoffperoxid zugegeben. Nach 24 Stunden wurde der Ansatz bis zur Trockne im Vakuum eingeengt und in 10 ml Aceton aufgenommen. Das Produktspektrum wurde analog zu den nichtwässrigen Ansätzen analysiert. Es waren jedoch nur wenige Produkte an der Nachweisgrenze detektierbar, wobei ein Produkt einen mit 47 übereinstimmenden RF-Wert hatte. Die eindeutige Zuordnung gelang aufgrund der geringen Menge nicht. Die als Vergleichssubstanzen zur Verfügung stehenden Derivate wurden im Reaktionsansatz nicht gefunden. Eine
Methyletherspaltung zum Estron fand nicht statt. Kein Reaktionsprodukt ließ sich mit Dm D detektieren.

Die Umsetzungen im wässrigen Milieu wurden unter wenig geänderten Bedingungen (siehe Tabelle 11) ebenfalls mit 6 und 7 durchgeführt. Für 7 waren analog zu 5 nur wenige Reak-tionsprodukte nahe der Nachweisgrenze detektierbar. Das nach Methyletherspaltung entste


105

hende 6 wurde nicht nachgewiesen. Nach den Umsetzungen von 6 lagen wenige Produkte in etwas größeren Mengen vor, jedoch war eine Strukturaufklärung nicht möglich.

Im Folgenden werden die gemessenen MS und NMR-Daten von Verbindung 5 beispielhaft vorgestellt.

Estrone und andere Estrogene zeigen in der Massenspektrometrie ein recht einheitliches Fragmentierungsverhalten. Neben dem mit hoher Intensität auftretenden Molekülionenpeak, der in der Regel den Basispeak bildet, lassen sich weitere Fragmente in Bruchstücken klassifizieren durch Spaltung des Ringes D (A/B/C-Fragmente), A/B-Fragmente und A/C/D-Fragmente durch Öffnung des B-Ringes [121] . Letztere zeigen nur geringe Intensitäten, so dass sie zur Strukturklärung nur bedingt beitragen. Zudem ist die Zuordnung der Massenzahlen zu bestimmten Fragmentstrukturen nicht immer eindeutig und erfordert intensive ms Untersuchungen. Im MS von 5 treten neben dem Molekülionenpeak als Basispeak vor allem A/B-Fragmente in moderaten Intensitäten auf (siehe Abbildung 24).

Die höchste Intensität mit 99 % zeigt Fragment l, welches nach C16-C17-Bindungsspaltung durch e--Wanderung vom C15 zum C13 entsteht. Spaltung der C11-C12-Bindung führt zu den Fragmenten e und e’, durch Bindungsspaltung und e--Verschiebung oder Umlagerungen bilden sich u und u’. Die Vinylgruppe der Fragmente t/t’’ besteht aus C14/C15 (t) oder C11/C12 (t’’). Weitere A/B-Fragmente sind f und m. Relativ intensive A/B/C-Fragmente sind das nach C15/C16-Bindungsspaltung entstandene c’’ und analog das durch C14/C15-Spaltung gebildete d und d’. Darüber hinaus treten noch weitere Fragmente mit Intensitäten unter 10 %, jedoch ohne bekannte Strukturen im MS auf.

Das 13C-NMR von 5 wurde bereits mehrfach vermessen und zugeordnet [122] . Die Zuordnung der 1H-Signale wurde aus dem aufgenommenen 1H-13C-korrelierten, zweidimensionalen Spektrum abgeleitet. Die Verschiebungen der einzelnen Atome von 5 und 47 sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Charakteristisch für 5 sind die Protonensignale des aromatischen Ringes bei 6,57 ppm; 6,65 ppm und 7,15 ppm; die Protonensignale der CH3- und der CH3O-Gruppe bei 0,83 ppm bzw. 3,71 ppm und das isolierte Protonensignal der CH2-Gruppe in Position 6 bei 2,82 ppm. Die restlichen Protonen zeigen Resonanzen im Bereich von 1,3 bis 2,5 ppm mit zahlreichen Überlappungen der Multipletts.

Das UV-Spektrum von 5 ist durch zwei Maxima bei 281 nm und 287 nm gekennzeichnet.

Substanz 5 zeigt in Fließmittel VII bei einem RF-Wert von 0,88 mit Dm B eine orange Färbung, in höheren Konzentrationen mit Dm D eine gelbe Färbung.


106

Abbildung 24: Charakteristische Fragmente im MS von Estronmethylether


107

Tabelle 12: 1H- und 13C-Daten von 5 und 47

C-Atom

5

47

 

13C [ppm]

1H [ppm]

13C [ppm]

1H [ppm]

1

126,31

7,15

126,58

7,34

2

111,54

6,65

121,70

7,12

3

157,55

-

158,34

-

4

113,85

6,57

109,75

7,58

5

137,72

-

130,87

-

6

29,64

2,82

197,28

-

7

26,52

1,93

43,25

(1,25-2,65)

8

38,34

1,46

39,56

(1,25-2,65)

9

43,94

2,20

42,97

2,89

10

132,00

-

138,92

-

11

25,90

1,40/2,30

25,20

(1,25-2,65)

12

31,55

1,40/1,85

31,23

(1,25-2,65)

13

48,00

-

47,68

-

14

50,37

1,46

50,23

(1,25-2,65)

15

21,56

1,50/2,00

21,36

(1,25-2,65)

16

35,85

2,05/2,44

35,68

(1,25-2,65)

17

220,85

-

219,67

-

18

13,82

0,84

13,68

0,92

OCH3

55,18

3,71

55,54

3,85

Die Struktur von 47 wird durch seine MS und NMR-Spektren belegt. Das EI-MS zeigt als Basispeak den Molekülionenpeak bei m/z 298. Die Summenformel C19 H22 O3 wird durch das beobachtete Isotopenmuster des Molekülions bestätigt. Im MS treten neben dem Molekül-ionenpeak (A) der (A + 1)-Peak und der (A + 2)-Peak mit relativen Häufigkeiten von 21,6 % und 2,9 % (theoretisch 21,3 % und 2,7 %) auf.


108

Strukturbeweisend treten die aus dem MS von 5 bekannten und um jeweils 14 Masseeinheiten erhöhten Fragmente auf (siehe Abbildung 23), wobei die A/B/C-Fragmente (c’’, d ,d’) im Vergleich höhere Intensitäten zeigen, während die A/B-Fragmente (l, m, t, u, u’) in geringerer Intensität auftreten, mit Ausnahme von e’ mit erhöhtem Signal und e und f, welche gleichbleibend registriert werden. Die 6-Stellung der zusätzlichen Ketogruppe ist mit dem Auftreten des Fragmentes der Massenzahl m/z 135 bewiesen, dessen Struktur in Abbildung 25 wiedergegeben ist.

Abbildung 25: Struktur des Fragmentes mit m/z 135

In Übereinstimmung mit der 6-Oxostruktur stehen die NMR-Spektren, die sich deutlich von den Spektren von 5 unterscheiden. Im 13C-NMR zeigt C6 stark tieffeldverschoben bei 197,3 ppm (+ 167,7 ppm) Resonanz, sowie C7 bei 43,2 ppm (+ 16,7 ppm) , C2 bei 121,7 ppm (+ 10,2 ppm) und C10 bei 138,9 ppm (+ 6,9 ppm). Dagegen sind die Signale von C5 bei 130,9 ppm (- 6,8 ppm) und C4 bei 109,8 ppm (- 4 ppm) hochfeldverschoben. Die Resonanzen der anderen C-Atome sind durch die Substitution nur wenig beeinflusst. Im 1H-NMR sind im Vergleich zu 5 alle Signale der aromatischen Protonen tieffeldverschoben, das Signal des Protons am C4 mit + 1,01 ppm am stärksten. Das C2-Proton ist um + 0,47 ppm und das
C1-Proton um + 0,19 ppm ins tiefe Feld verschoben. Dies weist auf eine Substitution in der Nähe des aromatischen Ringes hin. Das Signal der C6-Methylengruppe ist nicht mehr vorhanden. Das bei 2,89 als Dublett vom Dublett auftretende Signal eines Protons stammt vom H-Atom am C9. Weiterhin ist bei 3,85 ppm das Protonensignal der Methoxygruppe am C3 erkennbar, während die restlichen Protonensignale Multipletts zwischen 1,25 und 2,65 ppm zeigen. Die Daten des Protonenresonanzspektrums stimmen mit den bisher in der Literatur für 6-Oxoestronmethylether veröffentlichten überein [123] .

Trotz der Ketogruppe als zusätzlichem Chromophor sind die Maxima im UV-Spektrum von 5 nicht bathochrom, sondern hypsochrom verschoben. Die Maxima bei 256 nm und 323 nm (in Chloroform) stimmen mit den Literaturdaten (255 nm, 324 nm) überein [124] .


109

3.5.2 Diskussion

Für 5 liegen keine Daten zum in vivo Metabolismus im Menschen vor. Estron und 16alpha-Azidoestronmethylether wurden hinsichtlich ihres Verhaltens in isolierter, perfundierter Leber von Ratten bzw. Meerschweinchen untersucht [110] . Estron wird am D-Ring hydroxyliert. Beim 16alpha-Azidoderivat epimerisiert die Azidogruppe, der Methylether wird gespalten und die Ketogruppe am C17 wird zur Hydroxygruppe reduziert. Die Inkubation von Gewebeschnitten humaner Leber mit Estron führte zu einer Reihe von Metaboliten [125] . Hauptwege der Biotransformation waren die Reduktion zum Estradiol und anschließende Hydroxylierungen. In geringen Mengen wurden auch 16alpha-Hydroxyestron und 2-Methoxyestron isoliert. Weder die Methoxygruppenspaltung noch die Hydroxylierung im D-Ring oder des aromatischen Ringes konnten mit den biomimetischen Systemen nachgeahmt werden.

Das Verhalten von Steroiden wurde bereits in Systemen mit Metallporphyrinen untersucht. Hirobe setzte Estron mit Rutheniumporphyrinen und 2,6-Dichlorpyridin-N-oxid als Sauerstoffdonator um [108] . Es wurden eine Vielzahl von nicht trennbaren Reaktionsprodukten detektiert, wobei 6-Oxoestron als einziges Produkt in 21%iger Ausbeute in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Umsetzungen weiterer Steroide ohne Estrogenstruktur, 5alpha-Cholestan-3-on und andere 5alpha- und 5beta-Steroide, ergaben Hydroxy- und Ketogruppen in 5-, 14- und 15-Stellung und an der C17-Seitenkette. Breslow verwendete für die Umsetzung eines Diesters von Androstan-3,17-diol (siehe Schema 43) ein Mangantetraphenylporphyrin mit vier, an die Phenylringe gebundenen beta-Cyclodextrineinheiten, Pyridin und Iodosylbenzen [126] . Nach Hydrolyse der Ester erhielt er als einziges detektierbares Produkt das Androstan-3,6alpha,17-triol in 40%iger Ausbeute. Mit dem entsprechenden Mangantetrakispentafluorphenylporphyrinderivat konnte die Ausbeute auf 95 % gesteigert werden [127] . Die Sulfonsäuregruppe der Diesterstruktur diente der Löslichkeitserhöhung, während die tert-Butylphenylgruppen für die
Bindung an die Cyclodextrineinheiten und damit für die räumlichen Anordnung des Substrates zum aktiven Zentrum des Katalysators verantwortlich gemacht wurden. Ohne tert-Butylphenylgruppen am Substrat fand keine Umsetzung statt.

Chauhan setzte Cholesterol mit einem Manganporphyrinderivat und Iodosylbenzen um und erhielt die 5alpha,6alpha- und 5beta,6beta-Epoxide in 10%iger bzw. 45%iger Ausbeute [128] . Die Inkorporation des Katalysators in Phospholipidvesikel, als Modell für biologische Membranen, führte zu einer erhöhten Stereoselektivität. Das 5beta,6beta-Epoxid wurde mit 60%iger und das


110

5alpha,6alpha-Epoxid mit 2%iger Ausbeute gebildet. Umsetzungen mit Stigmasterol zeigten vergleichbare Ergebnisse. Es wurde nur die 5,6-Doppelbindung epoxidiert, während die
22,23-Doppelbindung erhalten blieb.

Schema 43: Diester von Androstan-3,17-diol und die Produkte nach biomimetischer Umsetzung und Hydrolyse (nach Breslow)

Die Aromataseaktivität von biomimetischen Porphyrinsystemen wurde von Valentine untersucht [129] . Mit einer bizyklischen Modellsubstanz, die den bei der metabolischen Aromatisierung als Zwischenpodukt postulierten enolischen Ring A als Triflat (I) stabilisiert enthält, gelang die Aromatisierung unter Deformylierung. Mit dem natürlichen Aromatasesubstrat Androsten-19-al-3,17-dion fand unter biomimetischen Bedingungen jedoch die Epoxidierung der Doppelbindung statt (siehe Schema 44). In geringen Mengen wurden noch andere
Produkte detektiert. Aromatisierung konnte nicht nachgewiesen werden.


111

Schema 44: Substrate und Produkte in biomimetischen Aromatasemodellen (nach [129] )

Aufgrund ihrer Strukturverwandschaft zu den Steroiden und zu den polyzyklischen Kohlenwasserstoffen, potentiell carcinogene Verbindungen, untersuchte Harden das Verhalten von Cyclopenta[a]phenanthrenonen in biomimetischen Systemen auf Metallporphyrinbasis [130] . Mit an den Phenylringen verschieden substituierten Eisentetraphenylporphyrinen und Penta-fluoriodosylbenzen erhielt er die 6,7-Epoxide in 21 - 74%iger Ausbeute und die 6,7-Diole in maximal 11%iger Ausbeute. Im Gegensatz dazu werden auf biologischem Weg Ring-A-hydroxylierte Produkte gebildet. Auf klassisch chemischen Wegen werden der C17-Dipol und die elektronenreiche C6/C7-Doppelbindung angegriffen.

Die Oxidationsprodukte von Estron wurden auch in Systemen ohne Metallporphyrine, aber mit anderen modulierenden Zusätzen untersucht, unter anderem mit Co(II)salen [Bis(salicylaldehyd)ethylendiiminocobalt(II)], unter Basenzusatz und mit molekularem Sauerstoff unter Druck [38] ; oder als Photooxygenierung mit Bengalrosa [131] oder Tetraphenylporphyrinbase [132] als Sensitizer und molekularem Sauerstoff. Die Reaktionen führten vor allem zu Ring-A-oxidierten Produkten mit chinoider Struktur und zu am C10 hydroxylierten bzw. perhydroxylierten Derivaten. Obwohl diese Systeme über einen anderen Reaktionsmechanismus wirksam werden, kann die Bildung dieser Derivate im metallporphyrinkatalysierten Reaktionen nicht ausgeschlossen werden. In den ms untersuchten Fraktionen war in einer Fraktion ein Fragment mit der Massenzahl m/z 286 nachweisbar, Fragmente der anderen Hauptprodukte mit der Massenzahl m/z 302 (siehe Abbildung 26) jedoch nicht vorhanden.


112

Abbildung 26: Reaktionsprodukte nicht metallporphyrinkatalysierter Reaktionen (nach [131] [132] )

Insgesamt lässt sich sagen, dass die biomimetischen Untersuchungen im Hinblick auf die Nachahmung metabolischer Reaktionen von Steroiden und verwandten Substanzen bisher nicht erfolgreich waren. Es konnten jedoch einige auf klassisch chemischen Wegen nur schwer zugängliche Derivate mit hoher Regio- und Stereoselektivität synthetisiert werden. In zukünftigen Studien sollte mit komplexen, geometrisch anspruchsvollen Metallporphyrinen die Nachahmung biologischer Reaktionen gelingen.


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