Smolinka, Kai: Biomimetische Studien an Arzneistoffen mit Benzilsäure- oder Estrogenstruktur

113

Kapitel 4. Experimenteller Teil

4.1 Geräte

Die analytischen HPLC-Untersuchungen erfolgten an einem HP 1090 M (Hewlett Packard) mit einem Dioden-Array-Detektor (DAD) und der Software HP Chem A.04 (Hewlett
Packard).

Die Aufnahme der EI-MS erfolgte an einem MS 5995 A (Hewlett Packard) mit Direkteinlasssystem. Die FAB-MS wurden an einem Autospect (Micromass) mit „magic bullett“® als Matrix aufgenommen. Die Aufnahme der CI-MS erfolgte an einem MAT Finnigan 95 ST mit Isobutan als CI-Matrix. Für die ESI-MS wurde ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer TQS 700 mit Elektrospray(API)-Ionisationsquelle (MAT Finnigan) eingesetzt.

Für die GC-MS-Untersuchungen kamen ein GC 5890 Serie II (Hewlett Packard) mit einem Injektor KAS 3 (Gerstel) und ein MS 5989 B (Hewlett Packard) zum Einsatz.

Die NMR-Spektren wurden an einem DPX 300 NMR-Spektrometer (Bruker) erstellt.

Die Schmelzbereiche wurden mit einem Heiztischmikroskop Thermogalen GA-D-4/89 (Leica) bestimmt.

Die Einengung der Lösungsmittel erfolgte mit einem Vakuumrotationsverdampfer Rotavapor R 111 (Büchi).

Weiterhin wurden ein Ultraschallbad Sonorex RK 100 (Bandelin), Magnetrührer RCT basic (IKA Labortechnik), ein pH-Messgerät pH 522 (Wissenschaftlich-Technische Werkstätten) und eine UV-Lampe Nr. 022.9230 mit 8 W Leistung (Camag) verwendet.


114

4.2 Chemikalien und Vergleichssubstanzen

4.2.1 Chemikalien

Aceton (Merck), d6-Aceton ge 99,8 % (Aldrich), Acetonitril gradient grade (Merck), Ammo-niak-Lösung 33 % (Ferak), Ammoniumacetat (Laborchemie Apolda), Benzoylchlorid (Fluka), basisches Bismutoxidnitrat, tert-Butylhydroperoxid 70 % (Fluka), Chloroform (Baker), alpha-Cyclodextrin (Aldrich), beta-Cyclodextrin (Fluka), Cyclohexan (Ferak), Deuterochloroform ge 99,5 % (Merck), Dichlormethan (Merck), Diethylether (Baker), d6-Dimethylsulfoxid ge 99,8 % (Merck), Dinatriumhydrogenphosphat × 12 H2O (Laborchemie Apolda), 1,4-Dioxan (Laborchemie Apolda), Essigsäure 100 % (Merck), Ethanol (Baker), Ethylacetat (Aldrich),
n-Hexan (Merck), 3-Hydroxy-N-Methylpiperidin 98 % (Aldrich), 4-Hydroxy-N-Methylpiperidin 98 % (Aldrich), Imidazol (Serva), Iod (Fluka), Kaliumdihydrogenphosphat (Laborchemie Apolda), Kaliumhexacyanoferrat(III) (Laborchemie Apolda), Kaliumiodid (Merck), Methanol (Baker), Methanol gradient grade (Merck), d4-Methanol ge 99,8 % (Merck), 3-Methylbenzthiazolin-2-on-hydrazon × HCl × H2O (Aldrich), Natriumhydroxid (Chemapol), Natriumsulfat wasserfrei (Riedel-de-Haën), Perchlorsäure 70 % (Ferak), Phosphorpentoxid (Aldrich), 4-Piperidinol (Fluka), 2-Propanol (Merck), Pyridin (Ferak), Salzsäure 36 % (Riedel-de-Haën), Schwefelsäure 96 % (Laborchemie Apolda), Toluen (Merck), Veratrol (Fluka), Wasserstoffperoxidlösung 30 % (Riedel-de-Haën).

Die verwendeten Metallporphyrine und Iodosylbenzen wurden in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin synthetisiert [133] .


115

4.2.2 Vergleichssubstanzen

4.2.2.1 ,4-Dimethoxybenzilsäurederivate und verwandte Substanzen

3,4-Dimethoxybenzophenon (8)

Eine Mischung aus 13,8 g (0,10 mol) Veratrol, 15,5 g (0,11 mol) Benzoylchlorid und 2 g Iod wird 15 Stunden am Rückfluss erhitzt, nach Abdestillieren noch vorhandener Ausgangsstoffe im Vakuum wird 8 erhalten und aus n-Hexan umkristallisiert [134] .

C15H14O3

Mr = 242,3 g/mol

Fp:

98 - 101°C

HPLC:

RT: 16,2 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,80 (II); 0,88 (III); 0,57 (V); 0,83 (VI)

 

Detektion: A, B (gelb), D (gelb)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 242 (26, M+), 165 (100, a), 137 (12, b), 105 (29, c), 77 (52, d)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,78 (3H, OCH3); 3,82 (3H, OCH3); 6,90 (1H, 3J = 8,5 Hz, C5-H); 7,28 (1H, 3J = 8,3 Hz, 4J = 2 Hz, C6-H); 7,37 (1H, 4J = 1,9 Hz, C2-H); 7,42 (2H, C3’/C5’-H); 7,51 (1H, C4’-H); 7,63 (2H, C2’/C4’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 56,8 (OCH3); 56,9 (OCH3); 111,9 (C5); 113,8 (C2); 127,3 (C6); 129,8 (C3’/C5’); 131,1 (C2’/C6’); 131,6 (C1); 133,6 (C4’); 140,0 (C1’); 150,9 (C3); 155,5 (C4); 198,0 (CO)

2-Hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenon (9)

C15H14O4

Mr = 258,3 g/mol

HPLC:

RT: 14,8 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,67 (V)

 

Detektion: A, B (gelb), D (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 258 (23, M+), 181 (15, a), 165 (21, a’), 153 (3, b), 137 (23, b’), 105 (81, c), 77 (100, d)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,65 (3H, OCH3); 3,89 (3H, OCH3); 6,50 (1H, C3-H); 6,93 (1H, C6-H); 7,41 - 7,61 (5H, C2’- bis C6’-H); 12,53 (1H, OH)


116

13C-NMR:

delta (ppm) = 56,3 (OCH3); 56,5 (OCH3); 100,7 (C3); 114,4 (C6); 128,4 (C3’/C5’); 128,7 (C2’/C6’); 131,5 (C4’); 199,6 (CO)

3-Hydroxy-4-methoxybenzophenon (10)

C14H12O3

Mr = 228,2 g/mol

HPLC:

RT: 14,2 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,47 (II); 0,72 (III); 0,35 (V)

 

Detektion: A, B (gelb), D (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 228 (26, M+), 151 (100, a), 123 (15, b), 105 (26, c), 77 (31, d)

1H-NMR:

delta (ppm): 3,82 (3H, OCH3); 5,75 (1H, OH); 6,90 (1H, 3J = 8,2 Hz, C5-H); 7,17 (1H, 3J = 8,2 Hz, 4J = 2,2 Hz, C6-H); 7,19 (1H, 4J = 2,0 Hz, C2-H); 7,38 (2H, C3’/C5’-H); 7,48 (1H, C4’-H); 7,59 (2H, C2’/C6’-H)

13C-NMR:

delta (ppm): 56,5 (OCH3); 111,6 (C5); 117,6 (C2); 125,1 (C6); 129,3 (C3’/C5’); 130,6 (C2’/C6’); 131,4 (C1); 133,2 (C4’); 139,6 (C1’); 147,6 (C3); 153,6 (C4); 197,9 (CO)

4-Hydroxy-3-methoxybenzophenon (11)

C14H12O3

Mr = 228,2 g/mol

HPLC:

RT: 14,6 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,53 (II); 0,38 (III); 0,41 (V)

 

Detektion: A, B (gelb), D (blau)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 228 (26, M+), 151 (100, a), 123 (30, b), 105 (16, c), 77 (37, d)

1H-NMR:

delta (ppm): 3,90 (3H, OCH3); 6,94 (1H, 3J = 8 Hz, C5-H); 7,33 (1H, 3J = 8 Hz, 4J = 2 Hz, C6-H); 7,52 (1H, 4J = 2 Hz, C2-H); 7,44 (2H, C3’/C5’-H); 7,49 (1H, C4’-H); 7,58 (2H, C2’/C6’-H)

13C-NMR:

delta (ppm): 56,0 (OCH3); 111,8 (C2); 113,5 (C5); 126,3 (C6); 128,4 (C3’/C5’); 129,67 (C2’/C6’); 129,75 (C1); 133,7 (C4’); 138,2 (C1’); 146,6 (C4); 150,2 (C3); 195,7 (CO)


117

N-Methyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (1)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 16.

C22H27NO5

Mr = 385,4 g/mol

Fp:

108 - 110 °C (Diethylether)

HPLC:

RT: 10,6 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,50 (II); 0,80 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 385 (1, M+), 243 (31, a), 165 (3, b), 137 (1, c), 105 (100, d), 99 (38, f), 98 (15, g), 97 (4, h), 96 (10, i), 77 (15, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,66 und 1,81 (4H, CH2); 2,1 (3H, N-CH3); 2,15 und 2,25 (4H, N-CH2); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,3 (1H, OH); 4,9 (1H, CH); 6,75 (1H, C5-H); 6,89 (1H, C6-H); 6,93 (1H, C2-H); 7,19 - 7,37 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 30,3; 30,4; 46,1; 52,1; 55,83; 55,86; 72,0; 80,7; 110,2; 110,7; 119,9; 127,4; 127,96; 128,0; 134,4; 142,2; 148,5; 148,7; 174,0

3,4-Dimethoxybenzilsäure (12)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Benzilsäureumlagerung des 3,4-Dimethoxybenzils.

C16H16O5

Mr = 288,3 g/mol

Fp:

92 - 96 °C (Wasser)

HPLC:

RT: 9,8 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,22 (II; III); 0,50 (VI)

 

Detektion: A, B (türkis)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 288 (3, M+), 243 (17, a), 165 (7, b), 137 (1, c), 105 (100, d), 77 (26, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,7 - 6,3 (2H, breit, OH und COOH); 6,76 (1H, C5-H); 6,93 (1H, C2-H); 6,95 (1H, C2-H); 7,27 - 7,41 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 55,9; 80,8; 110,4; 110,6; 119,8; 127,3; 128,3; 128,4; 133,4; 141,3; 148,7; 149,0; 177,7


118

(cis, trans)-N-Methyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid (13)

3,85 g (0,01 mol) der freien Base 1 werden mit 15 ml 30%iger Wasserstoffperoxidlösung 4 Stunden gerührt, im Vakuum eingeengt und schichtchromatographisch (Methode II) von noch vorhandenen 1 und Abbauprodukten (12, 8) getrennt.

C22H27NO6

Mr = 401,4 g/mol

HPLC:

RT: 11,6 und 12,3 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,22 und 0,33 (II); 0,22 und 0,30 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 385 (<1, [M+ - O]), 243 (26, a), 165 (30, b), 137 (4, c), 105 (100, d), 99 (23, f), 98 (14, g), 97 (3, h), 96 (10, i), 77 (36, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,60/1,64 und 2,45/2,24 (4H, cis/trans CH2); 2,55/3,08 und 2,80/2,87 (4H, cis/trans N-CH2); 2,80/2,89 (3H, cis/trans N-CH3); 3,76/3,66 (3H, cis/trans OCH3); 3,84/3,74 (3H, cis/trans OCH3); 4,2 (1H, trans OH); 5,1/4,7 (1H, cis/trans CH); 6,77/6,69 (1H, cis/trans C5-H); 6,85/6,85 (1H, cis/trans C6-H); 6,98/6,91 (1H, cis/trans C2-H), 7,28 - 7,36/7,19 - 7,30 (5H, cis/trans Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 24,5/25,8; 55,7/55,8; 59,9/58,6; 60,4/64,1; 66,6/69,1; 80,9/80,9; 110,0/110,3; 110,9/110,7; 119,5/19,6; 127,2/127,1; 127,6/127,9; 127,7/128,0; 135,0/134,6; 142,9/142,6; 148,4/148,4; 148,5/148,6; 173,0/173,5

4-Piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (14)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 16.

C21H25NO5

Mr = 371,4 g/mol

Fp:

160 °C (Chloroform/Diethylether)

HPLC:

RT: 9,9 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,37 (II); 0,53 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 371 (3, M+), 243 (57, a); 165 (6, b), 137 (1, c), 105 (100, d), 85 (23, f), 84 (12, g), 83 (1, h), 82 (6, i), 77 (21, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,5 und 1,8 (4H, CH2); 2,6 und 2,8 (4H, N-CH2); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,2 (1H, OH); 4,97 (1H, CH); 6,75 (1H, C5-H); 6,92 (1H, C6-H); 6,94 (1H, C2-H), 7,19 - 7,37 (5H, Phenyl-H)


119

13C-NMR:

delta (ppm) = 32,2; 32,3; 44,0; 56,3; 74,0; 80,6; 110,7; 111,2; 119,6; 127,8; 128,4; 128,5; 134,8; 142,6; 148,9; 173,9

(E, Z)-N-Formyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (15)

C22H25NO6

Mr = 399,4 g/mol

HPLC:

RT: 13,1 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,53 (II); 0,83 (III); 0,60 (VI)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 399 (<1, M+), 243 (25, a), 165 (6, b), 137 (1, c), 113 (7, f), 105 (100, d), 77 (23, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,63 und 1,75 (4H, CH2); 3,16 und 3,45 (4H, N-CH2); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 5,15 (1H, CH); 6,75 (1H, C5-H); 6,87 (1H, C6-H); 6,93 (1H, C2-H); 7,19 - 7,36 (5H, Phenyl-H), 7,9 (1H, N-CHO)

13C-NMR:

delta (ppm) = 29,8/29,9; 31,1/31,2; 36,3/36,4; 42,4/42,5; 56,3; 72,1; 81,2; 110,70/110,73; 111,1; 120,1/120,3; 127,67/127,72; 128,51/128,57; 128,7; 134,43/134,49; 142,2; 149,05/149,11; 149,28/149,33; 161,0; 174,2

Methyl 3,4-dimethoxybenzilat (16)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB durch Veresterung von 12 mit Dimethylsulfat.

C17H18O5

Mr = 302,3 g/mol

Fp:

88 - 90 °C (Ethanol/Wasser)

HPLC:

RT: 14,4 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,67 (II); 0,87 (III); 0,40 (V); 0,75 (VI)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (grau)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 302 (1,5; M+), 243 (15, a), 165 (5, b), 137 (1, c), 105 (100, d), 77 (30, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,74 (3H, OCH3); 3,78 (3H, COOCH3); 3,80 (3H, OCH3); 4,1 (1H, OH); 6,74 (1H, C5-H); 6,86 (1H, C6-H); 6,93 (1H, C2-H); 7,18 - 7,34 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 53,19; 55,5; 80,5; 110,0; 110,4; 119,5; 127,0; 127,8; 133,4; 141,6; 148,3; 148,5; 174,7


120

N-Methyl-4-piperidinyl 3,4-dimethoxy-O-methylbenzilat (18)

C23H29NO5

Mr = 399,4 g/mol

HPLC:

RT: 14,2 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,55 (II)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 399 (<1, M+), 257 (77, a), 165 (34, b), 137 (6, c), 105 (99, d), 99 (19, f), 98 (69, g), 97 (16, h), 96 (69, i), 77 (63, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,62 und 1,70 (4H, CH2); 2,13 (3H, N-CH3); 2,1 - 2,3 (4H, N-CH2); 3,1 (3H, OCH3); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3), 4,8 (1H, CH), 6,74 (1H, C5-H); 6,90 (1H, C6-H); 6,92 (1H, C2-H); 7,19 - 7,36 (5H, Phenyl-H)

N-Methyl-3-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (2)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 16.

C22H27NO5

Mr = 385,4 g/mol

Fp:

82 - 85 °C (Diethylether)

HPLC:

RT: 12,8 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,67 (II); 0,88 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 385 (<1, M+), 243 (8, a), 165 (7, b), 137 (2, c), 105 (68, d), 99 (16, f), 98 (21, g), 97 (100, h), 96 (13, i), 84 (28), 77 (22, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,33 und 1,75 (2H, O-CH-CH2); 1,47 und 1,63 (2H, N-CH2-CH2); 2,11 und 2,59 bzw. 2,37 (4H, N-CH2); 2,13 (3H, N-CH3); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,6 (1H, OH); 4,9 (1H, O-CH); 6,7 (1H, C5-H); 6,94 (1H, C6-H); 6,98 (1H, C2-H); 7,19 - 7,32 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 22,3; 28,4; 46,1; 55,1; 55,79; 55,84; 58,6; 72,1; 80,7; 110,2; 110,7; 119,7; 127,3; 127,9; 134,5; 142,4; 148,5; 148,6; 173,7

3-Piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (21)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 16.

C21H25NO5

Mr = 371,4 g/mol

HPLC:

RT: 12,3 min (Methode IV)


121

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,43 (II); 0,80 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 371 (0, M+), 243 (7, a), 165 (5, b), 137 (1, c), 105 (100, d), 85 (22, f), 84 (13, g), 83 (18, h), 82 (7, i), 77 (37, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,35 und 1,44 (2H, O-CH-CH2); 1,65 und 1,73 (2H, N-CH2-CH2); 2,57 (2H, N-CH2); 2,72 und 2,82 (2H, N-CH2); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,8 (1H, CH); 6,73 (1H, C5-H); 6,88 (1H, C6-H); 6,95 (1H, C2-H); 7,20 - 7,33 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 22,8; 28,7/28,8; 45,4; 49,1/49,2; 55,8; 71,3; 80,9; 110,2; 110,7; 119,6/119,8; 127,1; 127,3; 128,0; 134,6; 142,39/142,42; 148,4; 148,6; 173,5

N-Methyl-3-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat N-oxid (22)

Die Substanz wird analog Verbindung 13 von 2 ausgehend synthetisiert.

C22H27NO6

Mr = 401,4 g/mol

HPLC:

RT: 12,9 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,35 (II); 0,46 (III)

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 243 (12, a), 165 (31, b), 137 (4, c), 105 (100, d), 99 (11, f), 98 (11, g), 97 (58, h), 96 (7, i), 77 (41, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,23 und 1,88 (2H, N-CH2-CH2); 1,52 und 2,11 (2H, O-CH-CH2); 2,88 und 3,06 (2H, N-CH2); 2,93/2,97 (1H, N-CH3); 3,60 (2H, N-CH2); 3,7 (3H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 5,44 (1H, CH); 6,72 (1H, C5-H); 6,85 (1H, C6-H); 6,94/6,99 (1H, C2-H); 7,22 - 7,39 (5H, Phenyl-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 18,52/18,55; 26,95/27,05; 55,66/55,73; 59,48/59,54; 66,1; 67,3; 68,32/68,36; 80,86/80,90; 109,98/110,03; 110,83/110,95; 119,81/119,85; 127,35/127,44; 127,60/127,77; 127,9; 134,76/135,19; 142,42/142,75; 148,21/148,25; 148,32/148,36; 173,4

N-Formyl-3-piperidinyl 3,4-dimethoxybenzilat (23)

C22H25NO6

Mr = 399,4 g/mol

HPLC:

RT: 12,9 min (Methode IV)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,70 (II); 0,88 (III); 0,61 (VI)


122

 

Detektion: A, B (hellblau), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 399 (1, M+), 243 (22, a), 165 (5, b), 137 (1, c), 113 (28, f), 105 (100, d), 77 (23, e)

4.2.2.2 ,3’-Dimethoxybenzilsäurederivate und verwandte Substanzen

N-Methyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxybenzilat (3)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 30.

C22H27NO5

Mr = 385,4 g/mol

Fp:

118 - 120 °C (Chloroform/Diethylether)

HPLC:

RT: 13,7 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,40 (II); 0,85 (III)

 

Detektion: A, B (grauviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 385 (1, M+), 243 (16, a), 135 (100, b), 107 (37, c), 99 (68, f), 98 (75, g), 97 (17, h), 96 (82, i), 92 (17, d), 77 (27, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,64 und 1,79 (4H, CH2); 2,1 (3H, N-CH3); 2,2 (4H, N-CH2); 3,68 (6H, OCH3); 4,5 (1H, OH); 4,9 (1H, CH); 6,76 (2H, C4/C4’-H), 6,94 (2H, C6/C6’-H); 6,95 (2H, C2/C2’-H); 7,16 (2H, C5/C5’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 30,3; 46,0; 52,0; 55,2; 72,2; 80,7; 113,4; 119,9; 128,9; 143,5; 159,3; 173,6

3,3’-Dimethoxybenzilsäure (25)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der HUB durch Benzilsäureumlagerung des 3,3’-Dimethoxybenzils.

C16H16O5

Mr = 288,3 g/mol

Fp:

105 - 106 °C (Ethanol)

HPLC:

RT: 3,8 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,20 (II); 0,35 (III); 0,55 (VI)

 

Detektion: A, B (grauviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 288 (2, M+), 243 (20, a), 135 (100, b), 107 (33, c), 92 (18, d), 77 (30, e)


123

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,7 (6H, OCH3); 6,80 (2H, C4/C4’-H); 6,98 (4H, C2/C6/C2’/C6’-H); 7,19 (2H, C5/C5’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 55,3; 81,0; 113,2; 113,8; 119,7; 129,3; 142,4; 159,4; 177,5

(cis,trans)-N-Methyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxybenzilat N-oxid (26)

Die Synthese erfolgt analog der von 13 von 3 ausgehend.

C22H27NO6

Mr = 401,4 g/mol

HPLC:

RT: 8,3 und 8,7 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,30 und 0,33 (II); 0,32 und 0,42 (III)

 

Detektion: A, B (grauviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 243 (14, a), 135 (100, b), 107 (36, c), 99 (16, f), 98 (21, g), 97 (5, h), 96 (23, i), 92 (25, d), 77 (40, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,58/1,79 und 2,42/2,42 (4H, cis/trans CH2); 2,61/3,22 und 2,81/3,35 (4H, trans/cis N-CH2); 2,81/3,05 (3H, cis/trans N-CH3); 3,72/3,71 (6H, cis/trans OCH3); 5,0/4,8 (1H, cis/trans CH); 6,80/6,79 (2H, cis/trans C4/C4’-H); 6,93/6,97 (2H, cis/trans C6/C6’-H); 6,97/6,99 (2H, cis/trans C2/C2’-H); 7,20/7,19 (2H, cis/trans C5/C5’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 24,4/25,8; 55,0/55,1; 59,8/58,7; 60,4/64,3; 66,5/69,3; 81,0/80,9; 112,6/113,2; 113,4/113,2; 119,6/119,6; 128,6/128,9; 144,3/143,7; 159,0/159,2; 172,6/173,4

4-Piperidinyl 3,3’-dimethoxybenzilat (27)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Umesterung von 30.

C21H25NO5

Mr = 371,4 g/mol

Fp:

152 - 154 °C

HPLC:

RT: 14,7 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,37 (II); 0,70 (III)

 

Detektion: A, B (grauviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 371 (0,5; M+), 243 (36, a), 135 (100, b), 107 (33, c), 92 (19, d), 85 (67, f), 84 (56, g), 83 (11, h), 82 (29, i), 77 (34, e)

 

 


124

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,5 und 1,8 (4H, CH2); 2,6 und 2,8 (4H, N-CH2); 3,7 (6H, OCH3); 4,9 (1H, CH); 6,76 (2H, C4/C4’-H); 6,94 (2H, C6/C6’-H); 6,95 (2H, C2/C2’-H); 7,16 (2H, C5/C5’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 31,7; 43,4; 55,2;73,5; 80,7; 113,2; 113,4; 119,8; 128,9; 143,4; 159,3; 173,6

(E,Z)-N-Formyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxybenzilat (28)

C22H25NO6

Mr = 399,4 g/mol

HPLC:

RT: 9,1 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,42 (II); 0,88 (III); 0,65 (VI)

 

Detektion: A, B (grauviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 243 (16, a), 135 (100, b), 113 (51, f), 107 (32, c), 92 (15, d), 77 (24, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 1,7 (4H, CH2); 3,14/3,14 und 3,48 (4H, N-CH2); 3,7 (6H, OCH3); 4,2 (1H, OH); 5,2 (1H, CH); 6,79 (2H, C4/C4’-H); 6,90 (2H, C6/C6’-H); 6,93 (2H, C2/C2’-H); 7,2 (2H, C5/C5’-H); 7,9 (1H, CHO)

13C-NMR:

delta (ppm) = 29,3/30,7; 35,8/42,0; 55,2; 71,8; 80,8; 113,35; 113,38; 119,67/119,75; 129,05/129,11; 143,1; 159,34; 159,39; 173,5

3,3’-Dimethoxybenzophenon (29)

C15H14O3

Mr = 242,3 g/mol

HPLC:

RT: 11,3 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,83 (II); 0,88 (III); 0,78 (V); 0,93 (VI)

 

Detektion: A, B (gelb), D (gelb)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 242 (12, M+), 135 (100, b), 107 (45, c), 92 (38, d), 77 (54, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,8 (6H, OCH3); 7,05 (2H, C4/C4’-H); 7,25 - 7,32 (6H, C2/C5/C6/C2’/C5’/C6’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 55,4; 114,4; 118,8; 122,8; 129,2; 138,9; 159,5; 196,2


125

Methyl 3,3’-dimethoxybenzilat (30)

Die Synthese erfolgte in der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Chemie (Prof. Dr. Göber) am Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Veresterung von 25 mit Dimethylsulfat.

C17H18O5

Mr = 302,3 g/mol

Fp:

69 - 70 °C (Methanol/Wasser)

HPLC:

RT: 10,2 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,67 (II); 0,78 (III); 0,58 (V); 0,85 (VI)

 

Detektion: A, B (grauviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 302 (1, M+), 243 (22, a) 135 (100, b), 107 (29, c), 92 (15, d), 77 (23, e)

1H-NMR:

delta (ppm) = 3,7 (6H, OCH3); 3,8 (3H, OCH3); 4,13 (1H, OH); 6,77 (2H, C4/C4’-H); 6,92 (4H, C2/C6/C2’/C6’-H); 7,17 (2H, C5/C5’-H)

13C-NMR:

delta (ppm) = 53,6; 55,2; 80,9; 113,3; 113,4; 119,8; 129,1; 143,2; 159,4; 174,7

N-Methyl-4-piperidinyl 3,3’-dimethoxy-O-methylbenzilat (31)

C23H29NO5

Mr = 399,5 g/mol

HPLC:

RT: 11,8 min (Methode III)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,90 (VI)

 

Detektion: A, B (grauviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 257 (24, a’), 243 (28, a), 135 (28, b), 107 (13, c), 105 (100, ?), 99 (36, f), 98 (26, g), 97 (15, h), 96 (25, i), 92 (6, d), 77 (34, e)

4.2.2.3 Denaverinhydrochlorid und Derivate

2-Dimethylaminoethyl O-(2-ethylbutyl)benzilat hydrochlorid (4-HCl); Denaverin-HCl

(Apogepha Arzneimittel GmbH)

HPLC:

RT: 20,1 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,88 (I); 0,78 (II); 0,95 (III); 0,14 (IV); 0,13 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 283 (4, d), 267 (4, a), 183 (30, b), 165 (7, e), 105 (22, c), 77 (7, f), 71 (44, g), 58 (100, h)


126

ESI-MS:

m/z: 384 [M + H]+

FAB-MS:

m/z: 384 [M + H]+

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,8 (6 H, CH3); 1,37 (5 H, CH-CH2); 2,6 ( 6 H, N-CH3); 3,2 (2 H, N-CH2); 3,4 (2 H, O-CH2); 4,5 (2 H, CO-O-CH2); 7,3 - 7,4 (10 H, aromatische Protonen)

13C-NMR:

delta (ppm) = 11,5; 23,8; 42,1; 43,2; 56,2; 59,7; 67,2; 87,1; 128,5; 128,7; 128,8; 140,7; 172,0

O-(2-Ethylbutyl)benzilsäure (36)

(Apogepha Arzneimittel GmbH)

HPLC:

RT: 3,6 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,92 (I); 0,55 (II); 0,55 (III); 0,70 (IV); 0,47 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 267 (17, a), 183 (100, b), 165 (24, e), 105 (87, c), 77 (31, f)

ESI-MS:

m/z: 311 [M - H]-

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,8 (6 H, CH3); 1,38 (5 H, CH-CH2); 3,2 (2 H, O-CH2); 7,3 - 7,4 (10 H, aromatische Protonen)

13C-NMR:

delta (ppm) = 11,4; 23,8; 41,8; 67,6; 86,8; 128,5; 129,0; 129,1; 138,5; 173,1

2-Methylaminoethyl O-(2-ethylbutyl)benzilat (37)

(Apogepha Arzneimittel GmbH)

Fp:

108 - 113°C

HPLC:

RT: 19,1 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,78 (I); 0,63 (II); 0,93 (III); 0,05 (IV); 0,07 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 268 (1, d), 267 (3, a), 183 (48, b), 165 (14, e), 105 (55, c), 77 (20, f), 57 (47, g), 44 (100, h)

ESI-MS:

m/z: 370 [M + H]+

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,8 (6 H, CH3); 1,35 (5 H, CH-CH2); 2,5 ( 3 H, N-CH3); 3,2 (2 H, N-CH2); 3,2 (2 H, O-CH2); 4,4 (2 H, CO-O-CH2); 7,3 - 7,4 (10 H, aromatische Protonen)

 

 


127

13C-NMR:

delta (ppm) = 10,1; 22,4; 32,0; 41,0; 46,5; 59,5; 66,0; 85,5; 127,0; 127,2; 127,4; 139,5; 171,0

2-Dimethylaminoethyl O-(2-ethylbutyl)benzilat N-oxid (38)

(Apogepha Arzneimittel GmbH)

HPLC:

RT: 14,9 (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,45 (I); 0,55 (II); 0,55 (III); 0,10 (IV); 0,03 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 283 (2, d), 267 (5, a), 183 (34, b), 165 (12, e), 105 (37, c), 77 (13, f), 71 (50, g), 58 (100, h)

ESI-MS:

m/z: 400 [M + H]+

FAB-MS:

m/z: 400 [M + H]+

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,7 (6 H, CH3); 1,26 (5 H, CH-CH2); 3,1 ( 8 H, N-CH3 und O-CH2); 3,9 (2 H, N-CH2); 4,6 (2 H, CO-O-CH2); 7,2 - 7,3 (10 H, aromatische Protonen)

13C-NMR:

delta (ppm) = 11,1; 23,4; 41,7; 56,5; 57,8; 66,8; 67,6; 86,1; 128,1; 128,3; 140,1; 171,1

(E,Z)-2-(N-Formyl-N-methylamino)ethyl O-(2-ethylbutyl)benzilat (39)

C24H31NO4

Mr = 397,5 g/mol

HPLC:

RT: 14,6 und 15,3 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,95 (I); 0,77 (II); 0,93 (III); 0,53 (IV)

 

Detektion: A, B (rotviolett), C (orange)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 297 (<1, d), 267 (17, a), 183 (100, b), 165 (17, e), 105 (77, c), 77 (22, f), 86 (23, g), 72 (8, h)

ESI-MS:

m/z: 398 [M + H]+, 420 [M + Na]+

FAB-MS:

m/z: 420 [M + Na]+

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,7 (6 H, CH3); 1,27 (5 H, CH-CH2); 2,5 bzw. 2,6 ( 3 H, (Z)- bzw. (E)-N-CH3); 3,0 (2 H, O-CH2); 3,3 bzw. 3,4 (2 H, (Z)- bzw. (E)-N-CH2); 4,19 bzw. 4,25 (2 H, (Z)- bzw. (E)-CO-O-CH2); 7,2 - 7,4 (10 H, aromatische Protonen); 7,6 bzw. 7,8 (1 H, (Z)- bzw. (E)-CHO)


128

13C-NMR:

delta (ppm) = 11,54 bzw. 11,56; 23,84 bzw. 23,86; 30,0 bzw. 35,6; 42,1; 43,6 bzw. 48,5; 62,0 bzw. 63,2; 86,5; 128,19; 128,29; 128,41; 128,80; 128,83; 141,2 bzw. 141,5; 163,0 bzw. 163,1; 172,1

2-[2-(2-Ethylbutoxy)-2,2-diphenylacetoxy]essigsäure (40)

C22H26O5

Mr = 370,4 g/mol

HPLC:

RT: 4,7 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,72 (I); 0,37 (III); 0,61 (IV)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 267 (24, a), 183 (100, b), 165 (23, e), 105 (75, c), 77 (25, f)

FAB-MS:

m/z: 393 [M + Na]+

CI-MS:

m/z: 353 [M + H - H2O]+

1H-NMR:

delta (ppm) = 0,8 (6 H, CH3); 1,2 (5 H, CH-CH2); 3,1 (2 H, O-CH2); 4,2 (2 H, CO-O-CH2); 7,1 - 7,4 (10 H, aromatische Protonen)

13C-NMR:

delta (ppm) = 11,0; 23,1; 41,2; 64,9; 65,2; 85,2; 127,42; 127,46; 128,4; 142,1; 168,9; 170,9

Benzophenon (41)

(Aldrich)

Fp:

49 - 51°C

HPLC:

RT: 6,4 (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,97 (I); 0,93 (II); 0,95 (III); 0,80 (IV); 0,85 (V)

 

Detektion: A, B (gelb), D (gelb)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 182 (20, M+), 105 (100, c), 77 (35, f)

Methyl benzilat (42)

0,02 mol Benzilsäure (44) werden in Methanol gelöst und mit etherischer Diazomethanlösung (Herstellung nach [135] ) bis zur bleibenden, schwachen Gelbfärbung versetzt; bis zur Trockne im Vakuum eingeengt; in wenig Diethylether aufgenommen, mit verdünnter Natronlauge und Wasser gewaschen; mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt.

C15H14O3

Mr = 242,3 g/mol


129

HPLC:

RT: 4,1 (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,95 (I); 0,88 (II); 0,95 (III); 0,73 (IV); 0,75 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 183 (47, b), 165 (2, e), 105 (100, c), 77 (72, f)

FAB-MS:

m/z (%, Fragment): 265 (68, [M + Na]+), 225 (60, i), 197 (14, k), 183 (84, b)

Methyl O-(2-ethylbutyl)benzilat (43)

Die Synthese erfolgte, analog der von 42, von 36 ausgehend.

C21H26O3

Mr = 326,4 g/mol

HPLC:

RT: 18,7 (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,97 (I); 0,92 (II); 0,97 (III); 0,88 (IV); 0,90 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 267 (11, a), 183 (79, b), 165 (17, e), 105 (100, c), 77 (55, f)

FAB-MS:

m/z (%, Fragment): 349 (33, [M + Na]+), 267 (18, a), 225 (92, i), 197 (21, k), 183 (100, b)

Benzilsäure (44)

(Apogepha Arzneimittel GmbH)

Fp:

146 - 148°C

HPLC:

RT: 1,0 (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,43 (I); 0,32 (II); 0,42 (III); 0,42 (IV); 0,08 (V)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

2-Hydroxybenzophenon (45)

(Aldrich)

Fp:

37 - 39°C

HPLC:

RT: 7,6 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,98 (I); 0,93 (II); 0,95 (III); 0,93 (IV); 0,87 (V)

 

Detektion: A, B (gelb), D (rot)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 198 (12, M+), 121 (11, c), 105 (100, c), 93 (7, f), 77 (60, f)


130

2-Dimethylaminoethyl O-(2-ethylbutyl)-2-hydroxybenzilat (46)

C24H33NO4

Mr = 399,5 g/mol

HPLC:

RT: 15,1 min (Methode I)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,58 (I)

 

Detektion: A, B (rotviolett), C (orange), D (rot)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): kein M+, 299 (1, d), 283 (<1, a), 199 (16, b), 181 (4, e), 121 (9, c), 105 (26, c), 93 (3, f), 77 (9, f), 71 (50, g), 58 (100, h)

FAB-MS:

m/z: 400 [M + H]+, 422 [M + Na]+

Weiterhin standen als Vergleichssubstanzen zur Verfügung: 2-Dimethylaminoethyl benzilat, 2-Dimethylaminoethyl benzilat N-oxid, 2-Methylaminoethyl benzilat, 2-Dimethylaminoethyl 2,2-diphenylacetat, 2,2-Diphenylessigsäure und 3,3-Diphenyl-4-methyl-morpholin-2-on (alle Apogepha Arzneimittel GmbH).

4.2.2.4 Estrogene

3-Methoxy-estra-1,3,5 (10)-trien-17-on (5), Estronmethylether

(Jenapharm GmbH)

HPLC:

RT: 22,4 min (Methode V)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,87 (VII); 0,90 (VIII); 0,65 (IX)

 

Detektion: A, B (gelb), D (gelb)

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 284 (100, M+), 240 (3, c’’), 228 (7, d), 227 (14, d’), 199 (99, l), 186 (51, t oder t’’), 174 (20, e), 173 (25, e’), 171 (20, m), 160 (76, u), 159 (33, u’), 147 (22, f)

3-Methoxy-estra-1,3,5 (10)-trien-6,17-dion (47), 6-Oxoestronmethylether

C19H22O3

Mr = 298,2 g/mol

HPLC:

RT: 19,1 min (Methode V)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,53 (VII)

 

Detektion: A, B (grau), D (gelb)

 

 


131

EI-MS:

m/z (%, Fragment): 298 (100, M+), 254 (18, c’’), 242 (18, d), 241 (28, d’), 213 (15, l), 200 (35, t oder t’’), 188 (20, e), 187 (39, e’), 185 (8, m), 174 (32, u), 161 (22, f), 135 (21)

19-Nor-17alpha-pregna-1,3,5(10)-trien-20-in-3,17-diol (6), Ethinylestradiol

(Jenapharm GmbH)

HPLC:

RT: 16,3 min (Methode V)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,35 (VII), 0,57 (VIII)

 

Detektion: A, B (rotviolett)

3-Methoxy-19-nor-17alpha-pregna-1,3,5(10)-trien-20-in-17-ol (7), Mestranol

(Jenapharm GmbH)

HPLC:

RT: 21,8 min (Methode V)

DC:

RF (Fließmittelgemisch): 0,68 (VII), 0,80 (VIII)

 

Detektion: A, B (grau)

4.3 Biomimetische Reaktionsansätze

Es wurden 2 mmol Substrat, 150 µmol Co-Katalysator und 15 µmol Katalysator in 10 ml des entsprechenden Lösungsmittels gelöst. Als Lösungsmittel wurden, soweit nicht anders angegeben, für die nichtwässrigen Ansätze ein Gemisch aus Dichlormethan und Acetonitril im Verhältnis 1 : 1 und für die wässrigen Ansätze bidestilliertes Wasser, teilweise unter Zusatz von 1 molarer Salzsäure zur pH-Wert-Einstellung, verwendet. Nach Zugabe von 2 mmol des Sauerstoffdonators wurde der Ansatz 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die wässrigen Ansätze wurden gefriergetrocknet und in 10 ml Methanol aufgenommen. Die Isolierung der Reaktionsprodukte erfolgte über präparative Schichtchromatographie.

4.4 Biologische Reaktionsansätze

Es wurden männliche Wistar-Ratten (150 - 200 g) verwendet, denen 12 Stunden vor Versuchsbeginn die Nahrung entzogen wurde.


132

Präparation des 10 000 g-Überstandes:

Die Rattenleber wurde nach Präparation unter eiskalten Bedingungen gewogen und anschließend in eiskaltem Puffer (0,01 mol/l Phosphatpuffer, pH-Wert = 7,6, mit Zusatz von 1,15 % Kaliumchlorid) mit einem Potter-Elvehjem-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 10 000 g, 4 °C, 20 min zentrifugiert. Der 10 000 g-Überstand wurde sofort verwendet. 2 ml des Überstandes entsprachen 0,5 g Leber.

Inkubationsansätze:

1 ml der 4-HCl-Lösung (2,6 mmol/l), 3 ml der Cofaktorlösung und 2 ml des 10 000 g-Überstandes wurden 1 h bei 37 °C inkubiert. 3 ml Cofaktorlösung enthielten in Phosphatpuffer (0,5 mol/l, pH-Wert = 7,6) 0,65 µmol NADP, 10 µmol Glucose-6-phosphat, 50 µmol Nicotinamid und 25 µmol Magnesiumchlorid gelöst. Als Blindproben wurden Ansätze mit 1 ml Wasser statt der 4-HCl-Lösung und als Vergleichsprobe Ansätze mit 2 ml Phosphatpuffer (0,01 mol/l, pH-Wert = 7,6, mit Zusatz von 1,15 % Kaliumchlorid) statt des 10 000 g-Überstandes mitgeführt.

Isolierung der Reaktionsprodukte:

Die inkubierten Ansätze wurden gefriergetrocknet, dreimal mit einem Dichlormethan-
2-Propanol-Gemisch (3 : 1) extrahiert, vorsichtig eingeengt und in Methanol aufgenommen. Die weitere Isolierung und Identifizierung erfolgte analog der Aufarbeitung der biomimetischen Reaktionsansätze.

4.5 Chromatographische Methoden

4.5.1 Analytische Dünnschichtchromatographie

Für die analytische DC wurden HPTLC-Platten, Kieselgel 60F254, 5 × 7,5 cm (Merck) verwendet. Die Entwicklung der Platten erfolgte in Doppeltrogkammern (Camag), nach 15minütiger Kammersättigung, über eine Laufhöhe von 60 mm. Die Platten wurden nach der Entwicklung luftgetrocknet.


133

Fließmittelgemische:

I

: Dichlormethan/Methanol (90 + 10)

II

: Dichlormethan/Cyclohexan/Methanol/Ammoniak (50 + 35 + 15 + 1)

III

: Dioxan/Cyclohexan/Ethylacetat/Ethanol/Ammoniak (15 + 15 + 40 + 20 + 10)

IV

: Toluen/Dioxan/Essigsäure 100 % (76 + 21 + 3)

V

: Toluen/Ethylacetat (80 + 20)

VI

: Toluen/Dioxan/Methanol/Essigsäure 100 % (66 + 21 + 10 + 3)

VII

: Chloroform/Ethylacetat (90 + 10)

VIII

: Chloroform/Aceton/n-Hexan (80 + 10 + 10)

IX

: Aceton/n-Hexan (70 + 30)

Detektionsmittel (Dm):

A:

Fluoreszenslöschung bei 254 nm

B:

konzentrierte Schwefelsäure (96 %), anschließend wird die Platte 10 min bei 120 °C erhitzt

C:

Dragendorffs Reagenz [136] : 0,85 g basisches Bismutoxidnitrat werden in 50 ml Essigsäure (20 %) gelöst, 8 g Kaliumiodid werden in 20 ml Wasser gelöst; zur Herstellung der Sprühlösung werden je 5 ml beider Lösungen gemischt und mit 90 ml Essigsäure (20 %) verdünnt.

D:

MBTH-Reagenz [56] : die Platte wird in einer mit Ammoniak gesättigten Kammer 15 min gesättigt und anschließend nacheinander mit einer 2%igen, methanolischen MBTH-Lösung und einer 8%igen, wässrigen Kaliumhexacyanoferrat(III)-Lösung besprüht.

4.5.2 Präparative Schichtchromatographie

Für die präparative Schichtchromatographie wurden PSC-Fertigplatten, Kieselgel 60F254, 20 × 20 cm, 2 mm Schichtdicke (Merck) und DC-Alufolien, Kieselgel 60F254, 20 × 20 cm (Merck) verwendet. Die Entwicklung erfolgte in Normalkammern, nach 30minütiger Kammersättigung, über eine Laufhöhe von 16 cm. Die verwendeten Fließmittelgemische entsprachen denen der analytischen DC. Die Substanzbanden wurden detektiert, ausgekratzt oder ausgeschnitten, mit Methanol extrahiert und anschließend eingeengt.


134

4.5.3 HPLC

Als stationäre Phase wurden eine LiChroCart-Vorsäule (4 × 4 mm) und eine LiChroCart-Fertigsäule (125 × 4 mm), (Merck), verwendet, jeweils mit dem angegebenen LiChroSpher-Material (5 µm) gefüllt. Die Detektion erfolgte mit einem Dioden-Array-Detektor bei den angeführten Wellenlängen.

Methoden:

I

:Dinatriumhydrogenphosphatlösung 0,0002 mol/l / Methanol; Gradientenverlauf: linear von 60 % auf 98 % Methanol in 20 min; Fluss: 1 ml/min; Detektion: 230 nm; LiChroSpher RP-8

II

:Wasser / Acetonitril; Gradientenverlauf: lineare Erhöhung des Acetonitrilanteils von 20 % auf 100 % in 25 min; Fluss: 1 ml/min; Detektion: 254 nm; LiChroSpher RP-18

III

:Kaliumdihydrogenphosphatpuffer pH-Wert = 7,5 / Acetonitril; Gradientenverlauf: konstant 10 % Acetonitril, nach der ersten Minute lineare Erhöhung des Acetonitrilanteils auf 90 % nach 17 min, konstant bis 20 min; Fluss: 1,5 ml/min; Detektion: 280 nm; LiChroSpher RP-select B

IV

:wässrige Ammoniumacetatlösung (0,05 mol/l), mit 70%iger Perchlorsäure auf pH-Wert = 2,3 eingestellt / Acetonitril; Gradientenverlauf: lineare Erhöhung des Acetonitrilanteils von 20 % auf 27 % innerhalb 10 min, auf 50 % nach 15 min, konstant bis 20 min; Fluss: 1,2 ml/min; Detektion: 280 nm; LiChroSpher RP-select B

V

:Wasser / Methanol mit 12 Vol% Dichlormethan und 4 Vol% 2-Propanol; Gradientenverlauf: lineare Erhöhung des Methanolanteils von 38 % auf 43 % innerhalb 10 min, auf 63 % nach 13 min, auf 71 % nach 18 min, konstant bis 20 min, dann wieder Erhöhung auf 100 % nach 22 min, konstant bis 25 min; Fluss: 1,2 ml/min; Detektion: 280 nm; LiChroSpher RP-18

4.5.4 Quantitative Bestimmungen

Die Bezugskurven für die quantitative Bestimmung von 1 wurden mit der HPLC-Methode IV erstellt. Als Standardlösungen wurden drei unabhängige Verdünnungsreihen mit drei Konzentrationen von 5,0 mg/ml, 2,5 mg/ml und 1,25 mg/ml in Acetonitril mit Zusätzen von MnTPFPPCl und Imidazol hergestellt und vermessen (Abbildung 26). Die lineare Regression ergibt eine Abhängigkeit der Peakfläche (y) von der Konzentration (x) nach der Gleichung: y = 1032,36x + 16,261. Der Korrelationskoeffizient beträgt 0,9984.


135

Abbildung 26: Bezugskurve für die Bestimmung von 1

Aus den Bestimmungen von zehn Lösungen mit je 3,72 mg/ml 1 wurden der Mittelwert (x), die Standardabweichung (s) und die prozentuale Standardabweichung (srel) bestimmt (Tabelle 13).

Tabelle 13: Statistische Auswertung für die Bestimmung von 1

integrierte Peakfläche

berechneter Gehalt mg/ml

 

3623,92

3,495

 

3671,89

3,541

 

3875,59

3,738

Mittelwert

3932,35

3,793

x = 3,65 mg/ml

3751,11

3,618

Standardabweichung

3692,36

3,561

s = ± 0,10047 mg/ml

3816,94

3,682

Prozentuale

3840,63

3,704

Standardabweichung

3740,81

3,608

srel = ± 2,75 %

3897,84

3,760

 


136

Der Test auf Richtigkeit nach Student [137] ergab keine signifikante Abweichung vom Sollwert im Vertrauensintervall von 95 % (alpha = 0,05).

4.6 NMR-Untersuchungen

Ca. 5 - 10 mg Substanz wurden in 0,6 ml Deuterochloroform gelöst und in 5 mm Probenröhrchen gegen Tetramethylsilan als internen Standard vermessen.

1H-NMR:

eindimensionale 1H-Spektren: Frequenz: 300,13 MHz, 0 bis 14 ppm Messbreite, 16 bis 32 Akkumulationen

13C-NMR:

eindimensionale 13C-Spektren: Frequenz: 75,47 MHz, 0 bis 240 ppm Messbreite, normalerweise 120 bis 960 Akkumulationen, z. T. bis 2048 Akkumulationen

zweidimensionale 1H-13C-korrelierte Spektren: bis zu 8 Akkumulationen

4.7 Massenspektrometrische Untersuchungen

EI- Bedingungen: Ionenquelltemperatur: 140 - 175 °C; Ionisationsenergie: 70 eV

Die m/z-Werte sind den Massenspektren entnommen und mit den relativen Intensitäten [%] aufgeführt.

4.8 GC-MS-Untersuchungen

1 ml einer Acetonitrillösung von je ca. 0,5 µmol/ml der Piperidinderivate wurde in einem 4 ml-Glas bei 50 °C temperiert. Die Extraktion der Verbindungen erfolgte über 5 min in der Gasphase über der Lösung (Headspace-Technik) mit einer Polyacrylatfaser, 85 µm Schichtdicke (Supelco). Anschließend wurde die Faser direkt in den Injektorblock des Gaschromatographen gebracht und über einen Temperaturgradienten desorbiert. Die Probe wurde splitless auf die GC-Säule aufgegeben. Als GC-Säule wurde eine HP 5 MS-Säule mit 30 m Länge,


137

einem Innendurchmesser von 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,25 µm von Hewlett
Packard verwendet. Die Detektion erfolgte massenspektrometrisch.

Bedingungen:

Injektor: Temperaturgradient: von 40 °C bis 300 °C mit einem Anstieg von 12 °C/min

GC: Trägergas: Helium, Temperaturverlauf: 70 °C, nach 2 min mit 10 °C/min ansteigend bis 150 °C, danach mit 20 °C/min bis auf 270 °C ansteigend

Massenselektiver Detektor: Elektronenstoßionisation mit einer Ionisationsenergie von 70 eV, Massenscan [m/z]: 60 - 120


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Sep 14 18:26:50 2001