4. Methoden

4.1  Tierexperimentelle Methoden

4.1.1  Tierhaltung

↓42

Die Tierhaltung sowie alle durchgeführten Tierexperimente entsprachen den Institutsrichtlinien gemäß den Anforderungen der leitenden staatlichen Behörde in Berlin, dem Landesamt für Arbeitsschutz, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit (LaGetSi). Die durch das Landesamt vergebenen Genehmigungen der durchgeführten Tierversuche waren 0070/03 und 0039/03. Alle tierexperimentellen Versuche wurden nur von entsprechend autorisierten Personen durchgeführt. Folgende Mäusestämme wurden verwendet: männliche DBA/2J-Mäuse (Charles River, Wilmington/MA, USA), weibliche CBA/J-Mäuse (Charles River, Les Oncins, Frankreich), männliche und weibliche BALB/c-Mäuse (Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland und BgVV, Berlin, Germany) und männliche C57/BL6-Mäuse (BgVV, Berlin, Germany).

Die Haltung der Tiere erfolgte artgerecht mit einem 12-stündigen Licht-/Dunkelrhythmus, im Forschungshaus der Charité, Campus Virchow, Berlin. Die Käfige, bestehend aus eingeschobenen Draht-Spanndeckeln, wurden regelmäßig vom Pflegepersonal gereinigt. Die Mäuse erhielten täglich über eine Trinkflasche frisches Wasser und über Futterraufen pelletierte Standarddiät (Ssniff).

4.1.2 Verpaarung der Mäuse

Zwei Monate alte weibliche CBA/J- bzw. BALB/c-Mäuse wurden mit zwei bis vier Monate alten männlichen DBA/2J-, BALB/c- bzw. C57BL6-Mäusen verpaart. Zweimal täglich wurden die weiblichen Mäuse auf einen vaginalen Pfropfen (Inseminationsfleck) hin untersucht. Das Auftreten dieses Merkmals wurde als Tag 0 der Schwangerschaft angesehen. Die Weibchen wurden daraufhin von den Männchen getrennt.

4.1.3 Tiermodell für den spontanen Abort

↓43

Um die Rolle von HO-1 bei einem spontanen Abort untersuchen zu können, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit drei Tierversuche durchgeführt, wobei bei den ersten beiden Versuchen auf das Tiermodell für den immunologischen Abort (Clark et al. 1980) zurückgegriffen wurde. Bei der Abortgruppe wurden weibliche CBA/J Mäuse mit männlichen DBA/2J Mäusen verpaart. Als Kontrollgruppe für eine normale Schwangerschaft wurden weibliche CBA/J Mäuse mit männlichen DBA/2J Mäusen verpaart.

Ziel des ersten Versuches war es, die Expression von HO-1 in Abortmäusen mit normal-schwangeren Mäusen zu analysieren und mögliche Interaktionspartner der HO-1 bei der spontanen Fehlgeburt zu identifizieren. Die Tiere wurden verpaart und am Tag 14 der Schwangerschaft wurden die schwangeren CBA/J Weibchen getötet.

CBA/J ♀

X

BALB/c ♂

n=11

normale Schwangerschaft

↓44

CBA/J ♀

X

DBA/2J ♂

n=11

spontaner Abort

Zeitlicher Versuchsverlauf:

Plug

Sektion

Tag 0

Tag 14

↓45

Bei dem zweiten Versuch sollte die Expression von HO-1 durch eine therapeutische Behandlung in den Abortmäusen verändert werden. Die trächtigen CBA/J Weibchen, aus der Verpaarungskombination CBA/J x DBA/2J, wurden hierzu am Tag 4 der Schwangerschaft i.p. mit PBS, 5 mg/kg CO-PP, um HO-1 hochzuregulieren, oder 40 mg/mk Zn-PP, um HO-1 und HO-2 herunterzuregulieren, behandelt. Die trächtigen CBA/J Weibchen, aus der normalen Schwangerschaftskombination CBA/J x BALB/c, wurden als Kontrolle i.p. mit PBS behandelt. Die Mäuse wurden entweder am Tag 8 oder am Tag 14 der Schwangerschaft getötet. Am Tag 8, um die Expression von HO-1 zu einem früheren Zeitpunkt der Schwangerschaft analysieren zu können. Am Tag 14, um bei den Mäusen die HO-1 Expression am Ende der Schwangerschaft zu untersuchen.

200µl PBS

CBA/J ♀

X

BALB/c ♂

n=17

normale Schwangerschaft

200µl PBS

CBA/J ♀

X

DBA/2J ♂

Tag 8: n=6
Tag 14 n=10

spontaner Abort

↓46

5 mg/kg Co-PP

CBA/J ♀

X

DBA/2J ♂

Tag 8: n=6
Tag 14 n=6

spontaner Abort mit Co-PP Behandlung

40 mg/kg Zn-PP

CBA/J ♀

X

DBA/2J ♂

Tag 8: n=6
Tag 14 n=5

spontaner Abort mit Zn-PP Behandlung

Zeitlicher Versuchsverlauf:

↓47

Plug

Behandlung

Sektion

oder

Sektion

Tag 0

Tag 4

Tag 8

Tag 14

4.1.4 Tiermodell für die Präeklampsie

Eine weitere Schwangerschaftskomplikation, bei der die Rolle von HO-1 untersucht wurde, war die Präeklampsie. Anders als bei dem Mausmodell für den spontanen Abort, kann man bei dem Mausmodell für Präeklampsie nicht auf unterschiedliche Verpaarungskombinationen zurückgreifen, sondern muss den Zustand der Präeklampsie künstlich durch eine Injektion von Th1-Zellen herbeiführen. Um die Expression von HO-1 in dem Mausmodell für Präeklampsie analysieren zu können, wurden weibliche BALB/c Mäuse mit männlichen C57BL6 Mäusen verpaart. Um Präeklampsie ähnliche Symptome hervorzurufen, wurde den schwangeren BALB/c-Mäusen am Tag 10 und Tag 12 der Schwangerschaft Th1-Zellen i.v. injiziert. Der Kontrollgruppe wurden anstatt Th1-Zellen 100µl PBS i.v. injiziert. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob es nach einer veränderten Expression von HO-1, induziert durch eine therapeutische Behandlung mit Co-PP, um HO-1 hochzuregulieren bzw. mit Zn-PP, um HO-1 herunterzuregulieren, bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen zu physiologischen Veränderungen kommt. Hierzu erhielt die Verpaarungskombination BALB/c x C57BL6 zusätzlich zu der i.v. Injektion von Th1-Zellen am Tag 10 und Tag 12, am Tag 10 der Schwangerschaft eine i.p. Injektion von 5 mg/kg Co-PP oder 40 mg/kg Zn-PP. Die Mäuse wurden am Tag 14 der Schwangerschaft getötet. Zur Kontrolle der physiologischen Symptome wurde bei den Mäusen alle zwei Tage der Blutdruck gemessen, wobei die Adaptation an das Blutdruckmessen 21 Tage vor der eigentlichen Schwangerschaft begann.

100µl PBS i.v.

BALB/c ♀

X

C57BL/6 ♂

n=10

normale Schwangerschaft

↓48

3 x 107 Th1-Zellen i.v.

BALB/c ♀

X

C57BL/6 ♂

n=9

Präeklampsie ähnliche Symptome

3 x 107 Th1-Zellen i.v. +
5 mg/kg Co-PP

BALB/c ♀

X

C57BL/6 ♂

n=5

Präeklampsie ähnliche Symptome mit Co-PP Behandlung

3 x 107 Th1-Zellen i.v. +
40 mg/kg Zn-PP

BALB/c ♀

X

C57BL/6 ♂

n=6

Präeklampsie ähnliche Symptome mit Zn-PP Behandlung

↓49

Zeitlicher Versuchsverlauf:

Adaptation an das Blutdruckmessen

Plug

Zellbehandlung/CoPP/ZnPP Injektion

Zellbehandlung

Sektion

-21 Tage

Tag 0

Tag 10

Tag 12

Tag 14

Blutdruckmessung am Tag

-21---19---17….………….

-1----1---3---5---7---9

-----11

-------------13

-----14

4.1.5 Präparation der Mäuse und Probengewinnung

Am 8ten oder 14ten Tag der Schwangerschaft wurden die weiblichen Mäuse durch Genickbruch getötet. Das Fell wurde sorgfältig desinfiziert und das Tier auf einer sterilen Arbeitsfläche fixiert, anschließend wurden Abdomen und Becken geöffnet. Den trächtigen Tieren entnahm man den bicorneale Uterus, welcher anschließend beiderseits der Länge nach aufgeschnitten wurde. Die Lage der gesunden Embryonen sowie die Lage der von der Mutter resorbierten Embryonen wurde dokumentiert. Die Resorptionen unterschieden sich im Vergleich zu den normalen Embryonen und Plazenten durch die wesentlich geringere Größe und das nekrotische, hämorrhagische Erscheinungsbild. Die Abortrate in der Mausschwangerschaft wird folgendermaßen berechnet:

↓50

Abortrate =

Anzahl Implantationen x 100

Anzahl Resorptionen

Der Uterus wurde geöffnet, die Plazenten und Embryonen sorgfältig voneinander getrennt und anschließend die Dezidua frei präpariert. Weiterhin entnahm man der Maus die Milz und die Nieren. Für die Protein- und RNA-Isolation und die Messung der Caspase-3 Aktivität wurden die Gewebe mit kaltem, sterilem PBS (pH 7,4) gewaschen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C aufbewahrt. Für die immunhistologischen Analysen wurden die Plazenten und Nieren in 96% Alkohol aufgenommen. Die für die Lymphozytenisolierung bestimmte Dezidua wurde in kleine Stücke geschnitten und in 50 ml Falconröhrchen unter Zugabe von 5 ml HBSS („Hank´s balanced salt solution“, ohne Ca2+- bzw. ohne Mg2+-Salze) gesammelt und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert. Die für die Lymphozytenisolierung bestimmte Milz wurde in sterilem FCS-RPMI-Medium aufgenommen und bis zur Weiterverarbeitung ebenfalls auf Eis gelagert.

4.1.6 Blutdruckmessung 

↓51

Der Blutdruck bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen wurde als physiologischer Kontrolle herangezogen.

Vor dem eigentlichen Beginn des Tierversuchs wurden die Mäuse 21 Tage lang auf den Ablauf der Blutdruckmessung hin konditioniert, wobei die Blutdruckmessung bei den weiblichen BALB/c Mäusen alle zwei Tage erfolgte.

Zur Blutdruckmessung wurden die Tiere auf einer warmen Platte (37°C) mit Hilfe eines Käfigs fixiert. Eine Blutdruckmanschette (17mm ∅) wurde an der Schwanzbasis angelegt, um den Blutdruck zu messen. Ein Pulssensor am Schwanz ermittelte die Herzfrequenz. Das Blutdruckmessgerät wurde so eingestellt, dass ein Blutdruck zwischen 60 mmHg bis 240 mmHg ermittelt werden konnte. Der Bereich der Herzfrequenzmessung lag zwischen 350 Bpm und 800 Bpm. Zwischen den einzelnen Messungen lag eine Ruhepause von 1 sec. Um die Messfehler durch Bewegungen der Maus zu minimieren, wurden je 10 Messungen durchgeführt, wobei der Durchschnitt dem systolischen Blutdruck der Maus entsprach.

4.1.7 Lymphozytenisolierung aus der Dezidua

↓52

Die bei der Sektion gewonnene Dezidua, welche in 5 ml HBSS aufgenommen und auf Eis gelagert wurde, wurde anschließend mit 1 mM DDT-HBSS-Lösung auf 50 ml aufgefüllt und für 20 Minuten bei 37°C in einem Wannenbad inkubiert. Die Proben wurden während dieser Inkubation alle 5 Minuten geschüttelt. Der Überstand mit den aus der Dezidua gelösten Zellen wurde durch ein 100 µm Nylonnetz in ein neues Falconröhrchen pipettiert, welches daraufhin 10 Minuten bei 4°C und 1200 rpm zentrifugiert wurde. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt und das leukozytäre Pellet in 1 ml FCS-RPMI-Lösung resuspendiert. Die Gewebsstücke wurden in der Zwischenzeit wieder in 40 ml HBSS aufgenommen und abermals für 20 Minuten bei 37°C im Wannenbad inkubiert. Der Überstand wurde dann wieder durch ein 100 µm Nylonnetz auf das bereits vorhandene leukozytäre Pellet pipettiert, 10 Minuten bei 4°C und 1200 rpm zentrifugiert und abermals in 1 ml FCS-RPMI Lösung aufgenommen. Dieser Arbeitsschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt.

Am Ende wurde das Zellpellet in 3 ml RPMI-Medium aufgenommen und nach Resuspendierung vorsichtig auf 5 ml FicoLite-M® geschichtet, welches sich in einem 15 ml Falconröhrchen befand. Anschließend erfolgte eine Dichtegradienten-Zentrifugation für 20 Minuten bei 2400 rpm, ohne Bremse und langsames Starten der Zentrifugation. Nach der Zentrifugation wurden die mononukleären Zellen (v.a. Lymphozyten) vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus der Interphase entfernt, mit RPMI gewaschen und für 10 Minuten bei 4°C und 1200 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 1 ml FCS-RPMI-Medium resuspendiert und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert.

4.1.8 Lymphozytenisolierung aus der Milz

Die bei der Sektion gewonnene Milz wurde unter Zugabe von 5 ml RPMI-Medium und mit Hilfe eines Spitzenstempels durch ein 100 µm Nylonnetz gepresst und homogenisiert. Die Zellsuspension wurde in den Vertiefungen einer 6-Well-Platte aufgenommen. Die Zellen wurden anschließend in ein 50 ml Falconröhrchen überführt und auf Eis gelagert. Die Suspension wurde dann mit Lysis-Puffer auf 50 ml aufgefüllt und für 20 Minuten zur Lyse der Erythrozyten bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation von 10 Minuten bei 4°C und 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 10 ml RPMI-Medium aufgenommen, es folgte eine erneute Zentrifugation. Am Ende wurde das Pellet in 1 ml FCS-RPMI-Medium resuspendiert und bis zur Weiterverarbeitung auf Eis gelagert.

4.1.9 Generierung von Th1-Zellen

↓53

Nicht schwangeren BALB/c Mäusen wurden unter sterilen Bedingungen die Milz entnommen. Die gewonnene Milz wurde, unter Zugabe von 5 ml FCS-RPMI-Medium mit Hilfe eines Spitzenstempels durch ein 100 µm Nylonnetz gepresst und homogenisiert. Nach 10 Minuten zentrifugation bei 1500 rpm wurde das Pellet in 3ml FCS-RPMI-Medium aufgenommen und langsam auf 5 ml FicoLite-M® geschichtet, wobei darauf geachtet wurde, dass sich die beiden Phasen nicht vermischten, um einen Dichtegradienten zu erhalten. Die mononuklearen Zellen wurden nach einer Zentrifugation von 20 Minuten bei 4°C und 1500 rpm aus der Interphase entnommen, mit FCS-RPMI-Medium gewaschen und nochmals zentrifugiert (10 Minuten, bei 4°C und 1500 rpm). Anschließend wurde das Zellpellet in 1 ml RPMI aufgenommen. Die polyclonale Aktivierung der Zellen erfolgte durch die Gabe von anti-CD3 (3µg/ml), wobei das Zellpellet für 20 Minuten mit dem Antikörper inkubiert wurde. Die Zellen wurden nach der Aktivierung mit einer Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/ml bei 5% CO2 und 37°C in Kultur genommen. Das Kulturmedium enthielt HEPES (25 mmol/L), Glutamine (2 mmol/L), 10% Fötales Kälber Serum, Penicillin/Streptavidin, 1.022 ng rmIL-2 und 4 ng rmIL-12/mL. Die Zellen wurden 48 Stunden lang in Kultur gehalten und anschließend wurde die Zellzahl bestimmt. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie wurden die Zellen auf ihre Th1-Zytokinproduktion hin untersucht. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS wurden 3 x 107 Zellen in 100 μl aufgenommen und den Mäusen i.v. inijziert.

4.2 Durchflusszytometrie

Bei der Durchflusszytometrie erfolgt die Detektion, Messung und Analyse von Signalen, die von einzelnen Zellen erhalten werden, wenn sie in einem Flüssigkeitsstrom durch einen Lichtstrahl treten. Die Durchflusszytometrie erlaubt es gleichzeitig mehrere physikalische und Fluoreszenz-Parameter einer einzelnen Zelle in einer größeren Zellpopulation quantitativ zu bestimmen, wobei im Rahmen dieser Arbeit drei verschiedene Farben verwendet wurden, um so die gleichzeitige Bestimmung von Zelloberflächenmarkern und intrazellulären Zytokinen zu ermöglichen. Der Durchflusszytometer misst, wie die Zellen das Licht absorbieren bzw. reflektieren und wie intensiv die Fluoreszenz der Zellen ist. Diese Daten werden in ein computergerechtes Signal umgewandelt und anschließend ausgewertet.

Nach der Isolierung der Lymphozyten aus der Dezidua und der Milz wurden diese auf Eis gelagerten Zellen in eine 12 Wellplatte überführt und 4 Stunden stimuliert. Zur Stimulierung wurden die Zellen in RPMI 1640 mit 10% FCS und Pen/Strep aufgenommen, welches zusätzlich mit 50 ng/ml PMA und 1 µg/ml Ionomycin versetzt wurde. PMA stimuliert dabei durch eine Aktivierung der Proteinkinase C ein Triggern des T-Zell Rezeptors, während Ionomycin gleichzeitig für einen Calziumeinstrom in die T-Zelle sorgt. Dadurch wird eine maximale Aktivierung jeder T-Zelle bewirkt und deren Zytokinprogramm abgerufen. Die Akkumulation der Zytokine im Golgi Vesikel ermöglicht eine spätere Färbung mittels Antikörpern. Nach einer Stunde Inkubation wurde den Zellen zusätzlich noch 0,2 µM Monensin zugefügt. Monensin fungiert als Protein-Transport-Inhibitor, um die Zytokinsekretion der Zelle zu verringern und damit die intrazelluläre Zytokinkonzentration zu erhöhen. Nach der Inkubation erfolgte eine gleichmäßige Aufteilung der Zellen auf FACS-Röhrchen. Die Zellen wurden mit 2 ml FACS–Puffer gewaschen und für 10 Minuten bei 4°C und 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die extrazellulär bindenden Antikörper CD4 (FITC-conjugiert), CD8 (Cy5-conjugiert) oder CD25 (PE-conjugiert) bzw. die Isotypkontrolle (PE-conjugiert) auf das Pellet pipettiert Alle Antikörper wurden vorher mit FACS-Puffer auf 1:100 verdünnt. Nach der Resuspendierung des Zell-Pellets erfolgte eine Inkubation der Proben für 10 Minuten bei 4° C. Anschließend wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen und für 10 Minuten bei 4° C und 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 100µl 1% Paraformaldehyd aufgenommen und über Nacht (ÜN) bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen, zentrifugiert (10 Minuten, 1500 rpm bei 4° C) und für 20 Minuten mit den intrazellulären Antikörpern IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α oder INF-γ (alle PE-conjugiert) inkubiert. Die Antikörper wurden zuvor mit 0,1% Saponin auf 1:200 verdünnt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Saponin gewaschen und nochmals für 10 Minuten bei 4°C und 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Zellen in 100 ml FACS-Puffer aufgenommen. Es folgte die Analyse der Zellen mit Hilfe des FACS-Caliburs.

4.3 Histochemie

4.3.1  Paraffineinbettung von Gewebe

↓54

Zur Fixierung der Plazenten und Nieren, die während der Sektion der Tiere gewonnen und in 96% Ethanol aufgenommen wurden, wurden diese in Plastikbehältnisse überführt, gekennzeichnet und anschließend für 1 ½ Stunden in 100% Ethanol bei 4°C dehydriert. Die Proben wurden dann in Xylol überführt und abermals bei 4°C für 1 ½ Stunden dehydriert. Anschließend erfolgte eine 1 ½-stündige Lagerung der Gewebe in Xylol bei Raumtemperatur (RT). Xylol diente hierbei als Intermedium, das den Alkohol verdrängt und sich anschließend mit dem Paraffin vermischt. Die Gewebeproben wurden dann für 1 ½ Stunden in flüssiges Paraffin eingelegt, gefolgt von der Einbettung der Gewebe. Die Gewebeproben wurden dazu in eine warme Metallschale gelegt und flüssiges Paraffin zugefügt. Die Metallschale wurde durch eine Plastikschale verschlossen und auf eine Metallplatte mit einer Temperatur von -30°C gestellt. Nach Abkühlung und Aushärtung des Paraffins entfernte man die Metallschale und säuberte die Proben von überschüssigen Paraffinresten. Diese Methode der Gewebefixierung wurde erstmals 1962 von Saint-Marie beschrieben.

4.3.2 Immunhistochemie (IHC)

In der Immunhistochemie nutzt man die Spezifität von Antikörpern, um die Verteilung von bestimmten Antigenen am histologischen Schnitt sichtbar zu machen. Der primäre Antikörper bindet an das dazustellende Antigen. Um diese Bindung nachzuweisen, markiert man den ersten Antikörper mit einem biotinylierten sekundären Antikörper. Der Sekundärantikörper richtet sich gegen das Fc-Fragment von Immunglobulinen der Tierspezies, in welcher der Primärantikörper hergestellt wurde. An den Sekundärantikörper wird durch eine Verbindung zwischen Biotin und Avidin ein Meerettich-Peroxidase-Komplex (HRP, engl.: horseradish-peroxidase) angelagert. Zur Visualisierung des gesamten Antikörper-Komplexes werden verschiedene Chromogene verwendet (z.b. DAB oder AEC), die an die Peroxidase des HRP binden.

↓55

Die in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden auf eine Dicke von 5-7 µm zugeschnitten und auf einen Objektträger fixiert. Die Schnitte wurden bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt. Vor der eigentlichen Färbung mussten die Schnitte deparaffinisiert werden. Dazu wurden die Schnitte zweimal 20 Minuten bei RT in Xylol gewaschen. Anschließend erfolgten weitere Waschschritte von je 10 Minuten in 100%, 96% und 75% Ethanol. Die Schnitte wurden abschließend 10 Minuten lang in Aqua dest. gewaschen. Nach einem weiteren Waschschritt in TBS (10 Minuten) wurden die Gewebe für 20 Minuten mit 3% H2O2 inkubiert, um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu unterdrücken. Nach erneutem Waschen der Schnitte in TBS wurden diese dann für 20 Minuten mit BSA blockiert (10% BSA in PBS), um unspezifische Bindungen zu verhindern und somit eine Hintergrundfärbung zu vermeiden. Nach 10 Minuten Waschen in TBS wurden die Schnitte für 20 Minuten mit dem Avidin-Biotin-Blocking Kit inkubiert, um weitere unspezifische Anlagerungen des Antikörpers an Biotin zu verhindern. Es folgte ein weiterer Waschschritt der Proben in TBS (10 min). Die Inkubation der Gewebeschnitte mit dem ersten Antikörper erfolgte in einer feuchten Kammer bei 4°C ÜN. Der erste Antikörper wurde hierzu in 10% BSA verdünnt. Als erste Antikörper wurden HO-1 (1:100), HO-2 (1:500), iNOS (1:50) oder eNOS (1:25) verwendet. Am nächsten Tag wurden die Schnitte wieder 10 Minuten lang in TBS gewaschen. Anschließend erfolgte eine Inkubation für eine Stunde mit dem 2. Antikörper, ein biotinilierter Ziege-Anti-Hase Antikörper, welcher in 10% BSA 1:200 für HO-1 und HO-2 und 1:100 für iNOS und eNOS verdünnt wurde. Nach 10 Minuten waschen in TBS wurden die Proben 30 Minuten lang mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (HRP) inkubiert und anschließend abermals in TBS gewaschen (10 Minuten). Um die gebundenen Antikörper sichtbar zu machen, wurde für HO-1 und iNOS 3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC) verwendet und für HO-2 und eNOS Diaminobenzidin (DAB). Die Schnitte wurden jeweils 5 Minuten mit AEC oder DAB inkubiert und anschließend wieder in TBS gewaschen (10 Minuten). Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte für 2 Minuten mit Hämalaun inkubiert. Nach kurzem Waschen in Aqua dest. wurden die Schnitte, welche mit DAB gefärbt wurden, jeweils 10 Sekunden in 75%, 96% und 100% Ethanol und dann 5 Minuten in Xylol gewaschen, anschließend erfolgte die Versiegelung der Gewebsschnitte mit einem Kit von Roth (Roti®-HistoKit). Die Gewebeschnitte mit der AEC-Färbung wurden nach kurzem Waschen in Aqua dest. mit Ultramount Medium versiegelt. Als negative Kontrolle für die Färbung erfolgte eine Inkubation mit 10% BSA anstatt mit dem 1. Antikörper. Nach Aushärtung der Versiegelung erfolgte eine Analyse der Schnitte unter dem Lichtmikroskop, welche von 2 Begutachtern unabhängig voneinander erfolgte. Bei der Analyse der Schnitte wurden die verschiedenen Zelltypen der Plazenta und die Dezidua einzeln voneinander betrachtet und die Farbintensität dieser Zellen bestimmt. Zur Bestimmung der Farbintensität wurde eine Skala von 0-6 von dem Begutachter festgelegt, wobei 0 keine Färbung der Zellen bedeutet und 6 die stärkste vom Begutachter festgelegte Färbung. Die Beschriftung der Schnitte wurde während der Bestimmung der Farbintensität verdeckt, sodass die Schnitte erst nach der Auswertung einer Gruppe zugeordnet werden konnten.

 

4.3.3 TUNEL (Terminale Desoxyribosyl-Transferase mediated dUTP Nick End Labeling)

Zur Bestimmung der Anzahl von apoptotischen Zellen in plazentalem Gewebe wurden die in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (4.3.1) auf eine Dicke von 5-7µm zugeschnitten. Die Entparaffinisierung erfolgte wie in 4.3.2 beschrieben. Zur Färbung der apoptotischen Zellen wurde das in situ Cell Death Detection Kit, POD (Roche) verwendet. Damit der Farbstoff des POD-Kits in der Lage sein konnte in den Zellkern vorzudringen, wurden die Schnitte zur Permeabilisierung der Zellwände mit Zitratpuffer 2-mal 5 Minuten bei 360W in der Mikrowelle behandelt. Um den Puffer abzukühlen wurde langsam Aqua dest. hinzugefügt. Nach 10 Minuten Waschen in PBS wurden die Schnitte für 20 Minuten mit 3%H2O2 bei RT inkubiert. Es folgte ein zweimaliges Waschen in PBS für je 5 Minuten. Die Schnitte wurden anschließend für 30 Minuten bei RT mit 0,1M Tris-HCL (mit 3% BSA und 20% FCS) inkubiert. Nach weiterem Waschen für 2-mal 5 Minuten in PBS erfolgte die Inkubation der Schnitte mit dem TUNEL-Reagenz für eine Stunde bei RT. Die TUNEL-Reagenz wurde aus der Label-Solution und der Enzym-Solution hergestellt. Es folgte ein weiterer Waschschritt in PBS, um anschließend die Proben für 20 Minuten mit dem Converter-POD bei RT zu inkubieren. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte 5 Minuten langen mit DAB inkubiert um die markierten 3’ Enden zu färben. Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämalaun für 5 min. Anschließend wurden die Schnitte für 5 min in Aqua dest. gewaschen, um dann mit einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert zu werden (siehe 4.3.2). Die Gewebe wurden dann mit dem Roti-HistoKit versiegelt. Bei der Negativ-Kontrolle wurde bei der Herstellung des TUNEL-Reagenz nur die Label-Solution verwendet. Die Schnitte wurden nach Aushärtung der Versiegelung unter dem Lichtmikroskop von 2 unabhängigen Begutachtern untersucht. Mit Hilfe eines Augenstückes, in welches ein Mikrometer eingraviert war, wurde die Anzahl der positiven Zellen in dem Gewebe in 20 aneinander liegende 1mm x 1mm großen Quadraten bestimmt, wobei der Startpunkt der Bestimmung in dem Gewebe zufällig gewählt wurde und die Größe der Quadrate durch das Mikrometer festgelegt war. Am Ende wurde dann die Anzahl der positiven Zellen pro mm2 plazentalen Gewebes berechnet, wobei auch Quadrate mit einbezogen wurden, die keine apoptotischen Zellen aufwiesen. 

4.4 Real-Time RT-PCR

↓56

Bei der reversen Transkription (RT) wird zunächst mRNA in eine komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. In der nachfolgenden Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hybridisieren kurze Oligonukleotide (Primer), die den interessierenden DNA- Abschnitt von beiden Seiten her begrenzen, mit den jeweils komplementären Basensträngen der cDNA. Eine hitzebeständige DNA- Polymerase ergänzt die fehlenden Stücke komplementär zur Vorlage. Am Ende der Reaktion liegen 2 identische DNA- Doppelstränge, die durch Hitze in ihre beiden Einzelstränge getrennt werden. Durch Wiederholungen des Zyklus wird somit das DNA- Molekül exponentiell amplifiziert. Bei der Real-time-PCR ist man in der Lage, mit Hilfe von Fluoreszenz den Verlauf der PCR zu verfolgen. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Methoden verwendet, um die Real-time PCR verfolgen zu können. Zum einen wurde die TaqMan™-PCR durchgeführt und zum anderen erfolgte die PCR mittels SYBR-Green. Bei der TaqMan™-PCR wurde zusätzlich zu den zwei cDNA-Primern eine cDNA-Sonde eingesetzt, die an einem Ende mit dem Quencher, am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (FAM) markiert sind. Die Sonden binden spezifisch an einen Teil des zu detektierenden DNA-Abschnittes zwischen den beiden Primern. Die Taq-Polymerase baut während der Synthese des Gegenstranges die Sonde ab, wodurch der Quencher und das Fluorophor voneinander getrennt werden und eine steigende Reporter-Fluoreszenz gemessen werden kann. Mit Hilfe des ABI PRISM 7700 Sequence Detection Systems werden die Fluoreszenzänderungen von Zyklus zu Zyklus in Echtzeit erfasst. Je höher die Anfangskopienzahl der cDNA einer Probe ist, umso schneller steigt die Fluoreszenzintensität an. Beim SYBER-Green lagert sich der Fluoreszenzfarbstoffe direkt in die DNA ein bzw. bindet sich an die doppelsträngige DNA, wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus.

4.4.1  RNA-Isolierung aus Plazenta-, Dezidua- und Nierengewebe

Die bei der Sektion gewonnenen Gewebe (Plazenta, Dezidua und Niere) wurden jeweils mit 1 ml TRIZOL-Reagenz versetzt, mit Hilfe eines Homogenisators zerkleinert und auf Eis gelagert. Dem homogenisierten Gewebe wurde anschließend 200 µl Chloroform zugegeben und danach für 2 Minuten bei RT gevortext. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 4°C und 10000 rpm kam es zur Bildung von drei Phasen: Einer Phenol-Chloroform-Phase, einer DNA- und Protein-Interphase sowie einer RNA-enthaltenden Phase. Die obere Phase, welche die RNA enthielt, wurde in neues Eppendorfgefäß überführt, mit 0,5 ml Isopropylalkohol versetzt und für 10 Minuten bei RT inkubiert. Es folgte eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 4°C und 10000 rpm. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 1 ml 75% Ethanol gewaschen und 5 Minuten bei 4°C und 6000 rpm zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Am Ende wurde das Pellet luftgetrocknet, in RNAse-freiem Wasser gelöst und mit einer Konzentration von 1µg/µl bei –80°C gelagert. Die RNA-Isolation aus den Geweben wurde auf Eis durchgeführt und unter Beachtung von RNAse-Freiheit gearbeitet.

4.4.2 Konzentrationsbestimmung der RNA

Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wurde die RNA in RNAse-freiem Wasser 1:1000 verdünnt und in einer 1 ml-Quarzküvette ein Absorptionsbereich von λ = 200-300 nm gemessen. Alle Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt. Der Quotient aus OD260/OD280 gibt Auskunft über eventuelle Verunreinigungen der Nukleinsäuren und sollte zwischen 1,7-2,1 liegen. Die Konzentration der Ausgangslösung in µg/ml wurde nach folgender Formel errechnet:

↓57

Konzentration = 40x OD260 x Verdünnungsfaktor in der Küvette x spezifische Konzentration

in µg/ml Lösungsmittel

Zur Qualitätskontrolle der RNA wurde eine Agarose-Gelchromatographie durchgeführt. Auf ein 1,5% Agarosegel wurde 1µg RNA aufgetragen, und die Elektrophorese für 1 Stunde bei 180V durchgeführt. Den einzelnen Proben wurde Ethidiumbromid hinzugefügt, um die Nukleinsäuren unter UV-Licht sichtbar zu machen (Abb.7). Bei einer hochwertigen Qualität der RNA sollten ausschließlich die 28S- und 18S-Banden der ribosomalen RNA erkennbar sein. Bei einer schlechten Isolation kann man die hochmolekulare DNA obere Bande beobachten.

↓58

Abbildung 7: Agarosegel zur Kontrolle der RNA-Qualität. Die obere entspricht der 28S- und und die untere Bande der 18S- ribosomalen RNA

4.4.3 Reverse Transkription

Die RNA-Proben werden mittels der reversen Transkriptase (Moloney-Maus-Leukämie-Virus Reverse Transkriptase, MMLV-RT) in cDNA umgeschrieben.

2 µl RNA-Lösung (1 µg/µl) wurden hierzu auf 18 µl Gesamtvolumen mit RNAse-freiem Wasser aufgefüllt und 2 µl oligo-dThymidin-Ribonukleotide (odT) zugefügt. Die Probe wurde gevortext, kurz abzentrifugiert, für 10 Minuten bei 75°C erhitzt und anschließend für 2 Minuten auf Eis abgekühlt. Anschließend wurden der Probe 8 µl MMLV-RT-Puffer, 4 µl Aqua ad inject., 4 µl dNTPs [2,5 mM], 2 µl DNAse [2u/µl] und 0,5 µl RNAse-Inhibitor [40 u/µl]) zugegeben und die Probe für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die DNAse verdaut eventuell vorhandene gen. DNA. Zur Inaktivierung der DNAse wurde anschließend die Probe für 5 Minuten auf 75°C erhitzt und danach für 2 Minuten auf Eis abgekühlt.

↓59

Die eigentliche cDNA-Synthese erfolgte durch die Gabe von 1 µl MMLV-Reverse-Transkriptase [200u/µl] und 1 µl RNAse-Inhibitor [40 u/µl]) und der Inkubation bei 42°C für 60 Minuten. Zur Inaktivierung der reversen Transkriptase wurde die Probe für 5 Minuten auf 94°C erhitzt. Die cDNA-Proben wurden anschließend bei –35°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.

4.4.4 Real-Time RT-PCR mit Sonde

cDNA-Proben von Plazenta, Dezidua und Niere wurden mittels Real-Time RT-PCR auf folgende Gene hin untersucht: HO-1, TNF-α und TGF-β, als house keeping genes wurde β-Actin verwendet.

Für die Real-Time RT-PCR wurden 2µl (für HO-1, TNF-α und TGF-β) cDNA zur Amplifikation verwendet. Zu der cDNA wurde ein Mastermix aus 6,5 µl PCR-Mastermix, 3 µl Primermix (Vorwärts- und Rückwärtsprimer Tab.1), 0,5 µl Sonde (Tab.1) und 2 µl sterilem Wasser gegeben. Für die no template control (NTC) wurde anstatt cDNA Wasser verwendet. Die Amplifikationsreaktion an dem ABI Prism 7700 Sequence Detection System lief wie folgt ab:

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2 Minuten Inkubation bei 50°C, gefolgt von einem erstmaligen Denaturierungschritt der DNA bei 90°C für 10 min, anschließend folgten 40 Amplifikationszyklen (je 15 Sekunden bei 95°C und 60 Sekunden bei 60°C). 

Bei allen Amplifikationsreaktionen wurden von allen Proben Doppelbestimmungen durchgeführt.

Tabelle 2: Sequenzen der Primer und Sonden, die bei der Real-Time RT-PCR verwendet wurden. Alle verwendeten Sonden waren mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff FAM gelabeld.

HO-1

Vorwärtsprimer

5´- CAG AAG AGG CTA AGA CCG CCT T -3´

Rückwärtsprimer

5´- TCT GGT CTT TGT GTT CCT CTG TCA -3´

Sonde

5´- TGC TCA ACA TTG AGC TGT TTG AGG AGC TG -3´

iNOS

Vorwärtsprimer

5´- CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3´

Rückwärtsprimer

5´- TGA ATG TGA TGT TTG CTT CGG-3´

eNOS

Vorwärtsprimer

5´- GCT GGA TGA AGC CGG TGA -3´

Rückwärtsprimer

5´- CGA AAA TGT CCT CGT GGT AGC -3´

TGF-β

Vorwärtsprimer

5’-GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGT CT-3’

Rückwärtsprimer

5’-CCG GGT TGT GTT GGT TGT AGA-3’

Sonde

5’-CAC ACA GTA CAG CAA GGT CCT TGC CCT-3’

TNF-α

Vorwärtsprimer

5’-TCG AGT GAC AAG CCC GTA GC-3’

Rückwärtsprimer

5’-CTC AGC CAC TCC AGC TGC TC-3’

Sonde

5’-CGT CGT AGC AAA CCA CCA AGC GGA-3’

β-Actin

Vorwärtsprimer

5’-GCT TCT TTG CAG CTC CTT CGT T-3’

Rückwärtsprimer

5‘-GTT GTC GAC GAC CAG CGC-3’

Sonde

5’-CAF CCT TCC TTC TTG GGT ATG GAA TCC T-3’

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Für die Auswertung der Real-Time RT-PCR wurde zuerst das zu untersuchende Gen in Relation auf das house keeping gene bezogen. Bei house keeping genes handelt es sich um Gene, die in jedem Gewebe in gleichem Maße exprimiert werden. Als house keeping gene wurde im Rahmen der Arbeit das ß-Actin-Gen verwendet, was, außer während der Zellproliferation, in seiner Expression weitgehend konstant ist.

Die relative Quantifizierung erfolgt durch die Berechnung des ΔCTBildung des ΔCT-Wertes:

ΔCT = Mittelwert CT (Zielsequenz) – Mittelwert CT (house keeping gene)

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Um den ΔCT in Relation mit der Effizienz der PCR zu setzen, wurde zur Kontrolle eine Standardkurve der PCR ermittelt. Die Steigung der Standardkurve zeigte, dass die Effizienz der PCR bei 100 Prozent liegt und somit von einer Verdopplung der Kopienzahl von Zyklus zu Zyklus ausgegangen werden kann.

Damit kann das Ergebnis der RT-PCR als 2-ΔCT dargestellt werden.

4.4.5 Real-Time RT-PCR mit SYBR Green

cDNA-Proben von Plazenta, Dezidua und Niere wurden mittels Real-Time RT-PCR mit SYBR Green auf folgende Gene hin untersucht: eNOS, iNOS als house keeping genes wurde β-Actin verwendet.

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Ein Mastermix aus 6,5 µl SYBR-Green-Mastermix, 3 µl Primermix (Vorwärts- und Rückwärtsprimer Tab.1), 5 µl 25 nM Fluorescein und 2 µl sterilem Wasser wurde zu 1 µl cDNA gegeben. Die Amplifikationsreaktion wurde am i-Cycler durchgeführt und sah wie folgt aus:

3 Minuten Inkubation bei 95°C, gefolgt von 40 Amplifikationszyklen (30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C) und anschließend 1 Minute bei 95°C. In der Regel wurde danach eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt; sie hatte folgendes Thermoprofil: 1 Minute bei 50°C und anschließend 80 Zyklen á 10 Sekunden mit einer stufenweisen Temperatursteigerung von 0,5°C pro Zyklus. Mit Hilfe der Schmelzkurvenanalyse kann nach erfolgter PCR zwischen dem Zielprodukt und unspezifischer DNA differenziert werden. Bei allen Amplifikationsreaktionen wurden von allen Proben Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Auswertung erfolgte wie unter 4.4.4 beschrieben.

4.4.6 Primeretablierung für eNOS und iNOS

Zur Optimierung der Transkription muss daher das beste Verhältnis des forward und reverse Primers durch Titration bestimmt werden.

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Die Titration der Primer erfolgte mittels einer Real-Time PCR. Den Proben wurde 6,5 µl SYBR-Green-Mastermix, 0,5 µl 25 nM Fluorescein, 2 µl steriles Wasser und 1 µl cDNA (bzw. 1µl steriles Wasser bei der negativ Kontrolle) hinzugefügt. Anschließend wurde 3 µl Primermix in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen dazugegeben. Folgende Konzentrationsverhältnisse in nmol/l wurden verwendet: 50/50, 50/300, 50/900, 300/50, 300/300, 300/900, 900/50, 900/300, 900/900 (Vorwärts-/Rückwärtsprimer). Alle anderen Primer waren bereits am Institut etabliert bzw. wurden von meinen Arbeitskollegen etabliert.

Die Auswahl der bestmöglichen Primerkombination erfolgte dann durch Auswertung der CT-Werte und die Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse. 

Zusätzlich wurde eine Titration mit cDNA und eine Titration zur Beurteilung der Primerdimer-Bildung nur für die NTCs (no template control) durchführt, um eine Bildung von Primerdimeren zu minimieren. Primerdimere bilden sich entweder, wenn die zu untersuchende cDNA nur sehr geringe Mengen des Zielgens enthält oder wenn Vorwärts- und Rückwärtsprimer eine zu große Komplementarität aufweisen.

4.5 Proteinanalysen

4.5.1  Herstellung eines Proteinextraktes 

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Zur Herstellung eines Proteinextraktes wurden die bei der Sektion gewonnen Gewebe von Plazenta und Dezidua in 100 µl Lysis-Puffer (PBS, pH 7,4 + 0,1% Triton X 100, 100mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 100 mM Benzamidin, 100 mM E-Aminocapronsäure und 100mM EDTA) aufgenommen. Um ein feines Homogenisat zu erhalten, wurde die Suspension anschließend in weiteren 200-400 µl Lysis-Puffer aufgenommen und auf Eis mit einem Hand-Homogenisator weiter aufgeschlossen. Nach 10 Minuten Zentrifugation bei 10000 rpm und 4°C wurde der Überstand abgenommen und bei –80°C bis zur Weiterverarbeitung gelagert.

4.5.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 

Der BCA-Test wurde zur Bestimmung der Proteinkonzentration herangezogen. Der Test verwendet folgende Konzentrationen von BSA (1, 0,5, 0,25, 0,01, 0,005, 0,0025, 0,001 mg/ml) als Standard, um die gesuchte Proteinkonzentration zu ermitteln. In eine 96er Mikrotiterplatte wurden je Well 10µl der zu bestimmenden Probe oder BSA-Standard pipettiert, wobei immer Doppelbestimmungen durchgeführt wurden. Anschließend wurden 200 µl Bio-Rad Protein Assay, welche vorher im Verhältnis 5:1 mit Aqua dest. verdünnt wurde, hinzugefügt. Die folgende Farbreaktion wurde über eine OD von 570nm in einem Spektralphotometer bestimmt.

Zur Ermittlung der Proteinkonzentrationen der zu untersuchenden Proben wurde anhand der Messwerte des BSA-Standards eine Eichkurve erstellt, mittels derer die unbekannten Konzentrationen der Proteine bestimmt werden konnten.

4.5.3 Auftrennung von Proteinen durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

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Die Trennung einzelner Proteine erfolgte nach ihrem Molekulargewicht in einem Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Gel). Jede Probe wurde mit zweifach konzentriertem SDS-Probenpuffer gemischt, wobei das Verhältnis von Probe zu Probenpuffer 2:1 betrug, für 5 Minuten bei 95°C gekocht und dann kurz bei 10000 rpm zentrifugiert. Die Proben wurden dann auf das Gel aufgetragen. Zur Bestimmung des Molekulargewichtes wurde ein Rainbow-Marker als Molekulargewichtsstandard verwendet.

Das Gel setzte sich aus einem 4%igem Sammelgel und einem sich anschließenden 12%igem Trenngel bei HO-1, HO-2 und einem 6%igem Trenngel bei iNOS und eNOS zusammen. Für die Auftrennung der Proteine wurde eine Spannung von 100V angelegt. Anschließend an die Elekrophorese erfolgte die Weiterverarbeitung des Gels für den Western-Blot an (siehe 4.5.4).

4.5.4 Western-Blot

Der Western-Blot dient der Identifikation und Quantifizierung spezifischer Proteine in Proteingemischen. Dabei werden einzelne Proteine aus Gewebe-Lysaten der Plazenta und der Dezidua nachgewiesen. Nach Auftrennung der Proteine, abhängig von ihrer Größe, im elektrischen Feld werden sie auf eine Membran transferiert und dadurch immobilisiert. Auf der Membran erfolgt der Nachweis des Proteins mittels eines spezifischen Antikörpers. An den gebundenen ersten Antikörper wird ein zweiter Antikörper angelagert, welcher biotinylierten ist. Durch eine enzymatische Reaktion zwischen Biotin und Avidin wird an den zweiten Antikörper ein HRP-Komplex gebunden, welcher mit einer Peroxidase gekoppelt ist. Zur Visualisierung des gesamten Antikörper-HRP-Komplexes wird das ECLTM Western Blotting Analysis System (Kit) verwendet. Durch eine Reaktion des ECLs mit der Peroxidase wird Fluoreszenz freigesetzt, welche mit einem Röntgenfilm sichtbar gemacht wird.

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Der spezifische Proteinnachweis der im Proteinextrakt enthaltenen Proteine HO-1, HO-2, iNOS, eNOS erfolgte durch Western-Blot mittels Protein-spezifischer Antikörper. Die Proteine wurden dazu im Western-Blot-Verfahren auf eine Nitrozellulosenmembran (Porengröße 0,45µm) übertragen. Hierzu wurde das Gel der SDS-PAGE auf die Membran gelegt, wobei die Membran durch den Transferpuffer angefeuchtet war. Ober- und unterhalb des Gels und der Membran wurden zwei Lagen Whattmanpapier und je ein Schwammgewebe gelegt, welche ebenfalls bereits mit dem Transferpuffer befeuchtet waren und mittels einer Klammer zusammengedrückt. Es wurde besonders darauf geachtet, dass keine Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran eingeschlossen wurden. Anschließend wurde die Klammer in der Transferkammer befestigt. Das Gel zeigte zum negativen Pol, die Nitrozellulosemembran zum positiven Pol. Der Transfer von Proteinen erfolgte aus dem SDS-Gel auf die Nitrozellulosemembran bei einer Stromstärke von 10V ÜN.

Nach dem Transfer der Proteine wurde die Membran für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit TBS-Puffer (5% Milchpulver) inkubiert, um freie Proteinbindestellen abzublocken. Es folgte die Inkubation mit dem ersten Antikörper HO-2, eNOS, iNOS (1:5000), HO-1 (1:1000) für zwei Stunden bei RT auf einem Schwenktisch. Die Antikörper wurden in TBS mit 5% Milchpulver verdünnt. Der spezifische Antikörper bindet das zu detektierende Protein. Der restliche freie Antikörper wurde anschließend durch dreimaliges Waschen mit TBS (5% Milchpulver) entfernt. Der zweite biotinilierte Antikörper Ziege-Anti-Hase wurde mit TBS (5% Milchpulver) auf 1:5000 verdünnt und anschließend für 2 Stunden unter ständiger Bewegung inkubiert. Dieser Antikörper bindet spezifisch an den primären Antikörper. Nach 2-maligem Waschen in PBS (0,1% Tween 20) wurde die Membran mit dem HRP für 30 Minuten bei RT inkubiert. Zur Visualisierung der positiven Banden wurde das ECLTM Western Blotting Analysis System (Kit) verwendet. Nach Mischen der beiden Komponenten des Kits im Verhältnis 1:1 wurde die Membran 1 Minute im Dunkeln inkubiert. Es folgte die Belichtung eines Röntgenfilms in einer Dunkelkammer durch Inkubation mit der Membran für 30 Sekunden-2 Minuten. Der Röntgenfilm wurde dann automatisch durch die Compact2 Röntgenfilmentwicklungsmaschine entwickelt. Die Dichte der Banden wurde mit Hilfe des Imagequant TL Programms (Amersham) ausgewertet. Hierzu wurden die Membranen eingescannt (Abb.8), anschließend legte man mit Hilfe des Computerprogramms die einzelnen positiven Banden fest, die das Programm analysieren sollte. Das Programm ermittelte dann die Dichte der einzelnen Banden. Anschließend wurde die Ratio aus der Dichte der Banden von HO-1, HO-2, iNOS und eNOS gegen die Dichte von beta-actin berechnet.

Abbildung 8: Beispielröntgenbild eines Western-Blots. Die oberen Banden zeigen den positiven Nachweis an eNOS in je 3 Proteinproben der normalen Schwangerschaftsgruppe (NS), der Kontrollabortgruppe (Abort), der Abortgruppe die mit Co-PP behandelt wurde und der Abortgruppe die mit Zn-PP die unteren Banden zeigen den positiven Nachweis an beta-actin in diesen Proteinproben

4.6 Statistik

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Alle statistischen Berechnungen und Darstellungen wurden mit Hilfe des Computerprogramms SPSS („Statistical Package for the Social Sciences“, Version 11.5) oder mit Microsoft Excel 2003 durchgeführt.

Die graphische Darstellung der Ergebnisse erfolgte entweder mittels Box-Plots (Abb. 9), bei dem der Median sowie das obere und untere Quartil und Extremwerte dargestellt werden oder mittels einer Liniengraphik, bei dem der Median dargestellt ist.

Zur statistischen Erhebung der Daten wurde der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test , bei dem die Signifikanz zwischen allen Gruppen berechnet wurde, und der Mann-Whitney-U-Test, bei dem die Gruppen paarweise mit einander verglichen wurden, angewandt. Als Signifikant wurde p ≤ 0,05 angesehen, wobei * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Bei gepoolten Proben wurde der Chi –Quadrat Test angewandt.

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Abbildung 9: Schematische Box –Plot -Darstellung


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06.02.2008