5. Ergebnisse

5.1  Untersuchungen von HO-1 in einem Mausmodell für spontanen Abort

↓69

Das erste Ziel der Arbeit war es, die plazentale und deziduale Expression von HO-1 und HO-2 in Abortmäusen im Vergleich mit normal-schwangeren Mäusen zu bestimmen und eine mögliche Interaktionen zwischen HO, NOS und Zytokinen zu untersuchen. Um die Expression der HO untersuchen zu können, wurde auf das Mausmodell für spontanen Abort, welches von Clark (1980) erstmals beschrieben wurde, zurückgegriffen.

5.1.1  Abortraten von normal-schwangeren Mäusen im Vergleich zum Mausmodell für Fehlgeburt 

Bei der Präparation der Mäuse am Tag 14 der Schwangerschaft, wurde die genaue Anzahl der Implantationen festgehalten. Zu den Implantationen gehören sowohl die gesunden Embryonen als auch die Resorptionen.

↓70

Bei der Verpaarung von weiblichen CBA/J Mäusen mit männlichen DBA/2J konnte am Tag 14 der Schwangerschaft im Vergleich zu der Kontrollgruppe eine signifikante Erhöhung der Abortrate beobachtet werden (Abb.10A). Bei der Kontrollgruppe wurden weibliche CBA/J Mäuse mit männlichen BALB/c verpaart. Bei der normalen Schwangerschaft (NS) lag der Median der Abortrate um 0%. Bei der Verpaarungskombination für einen spontanen Abort (Abb. 10A) lag die Abortrate um 20%. Die beobachteten Abortraten werden durch die Literatur bestätigt (Clark 1980, Chaouat 1988). Die Anzahl der Implantationen beider Gruppen waren vergleichbar (Abb. 10B).

Abbildung 10: Die Daten werden als Box plots (Mediane) dargestellt. A) Gezeigt wird die Abortrate in %, wobei die Abortmäuse eine signifikante Erhöhung der Abortrate im Vergleich zu der Kontrollgruppe aufweisen *** = p<0,001, welches durch den Mann-Whitney-U Test ermittelt wurde. B) Zu sehen ist die Anzahl aller Implantationen der Abortgruppe im Vergleich zu der normalen Schwangerschaftsgruppe.

5.1.2 HO-1 und HO-2 Expression im Mausmodell für spontanen Abort

5.1.2.1  Immunhistochemische Analyse der Plazenta

Zur Untersuchung der HO-1 und HO-2 Expression in den unterschiedlichen Plazenta-Zelltypen wurden 5-7 µm dicke Paraffinschnitte der Plazenta angefertigt. Nach der Blockierung der endogenen Peroxidase und möglicher unspezifischer Bindungen, die die HO-1 und HO-2 Antikörper eingehen könnten, wurde die Plazenta mit dem jeweiligen Antikörper für HO-1 oder HO-2, gefolgt von einem 2.Ak, inkubiert und die gebundenen Antikörper mittels Chromogenen sichtbar gemacht.

↓71

Die Auswertung der Expression von HO-1 und HO-2 erfolgte semi-quantitativ durch Bestimmung der Farbintensität der einzelnen Zelltypen. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigten, dass in allen Zelltypen der Plazenta HO-1 und HO-2 exprimiert werden (Tab.III, repräsentative Bilder in Abb.11). Bei dem Vergleich der Expression zwischen den Abortmäusen und den Mäusen der Kontrollgruppe konnte gezeigt werden, dass bei den Tieren der Abortgruppe in allen Zelltypen der Plazenta, die Expression von HO-1 und HO-2 signifikant herabreguliert war (Tab.III, Abb.11). In der Dezidua konnte keine veränderte Expression zwischen den beiden Gruppen beobachtet werden.

Tabelle 3: HO-1 and HO-2 Expression in verschiedenen Zelltypen der Plazenta und der Dezidua in Abortmäusen (A) im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe (NS), dargestellt als Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten werden als Mediane gezeigt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05 and **:p <0,01).

HO-1

NS (n=6)

Abort (n=6)

Dezidua

0,50

1,25

Riesenzellen

4,00

1,75**

Spongiotrophoblasten

3,50

2,00**

Labyrinthzellen

3,25

2,50*

HO-2

Dezidua

1,25

1,00

Riesenzellen

3,00

3,25*

Spongiotrophoblasten

3,00

1,50*

Labyrinthzellen

1,25

1,50*

Abbildung 11: Repräsentative IHC-Bilder der Plazenta. Um HO-1 und HO-2 optisch auch von einander zu unterscheiden, wurden verschiedene Chromogene zur Visualisierung verwendet A) HO-1 positive Zellen an der Feto-maternalen Grenze. Der Pfeil markiert eine Riesenzelle (Rz), welche sich durch ihre starke Expression von HO-1 auszeichnet, weiterhin können HO-1+ Deziduazellen (Dez) beobachtet werden. (AEC-Färbung, rötliche Färbung) B) HO-2 positive Spongiotrophoblasten (Sp) zwischen negativen Glykogenzellen (DAB-Bärbung, bräunliche Färbung) C) Negativ Kontrolle bei der kein erster Antikörper verwendet wurde.

5.1.2.2 Untersuchung der HO-1 und HO-2 Expression mittels Western-Blot

↓72

Zur semi-quantitativen Analyse der HO-1 und HO-2 Expression in der Plazenta wurde aus dieser ein Proteinextrakt gewonnen. 10 µg des Proteinextraktes wurde dann mittels einer SDS Page der Molekulargröße nach aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Mit Hilfe von spezifischen HO-1 und HO-2 Antikörpern konnte nun die Intensität der Banden von HO-1 und HO-2 bestimmt werden. Hierzu wurden die spezifischen Banden der Antikörper mit Hilfe von Chemilumineszens auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht. Positive Banden für HO-1 (33kDa) und HO-2 (36 kDa) konnten sowohl in den normal-schwangeren Mäusen wie auch in Mäusen der Abortgruppe beobachtet werden. Bei der Analyse der Intensität der Banden konnte gezeigt werden, dass in den Abortmäusen die Intensität der Banden signifikant reduziert ist, im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppe (Abb. 12A und B)

Abbildung 12: zeigt die positiven Western-Blot Banden als Box plots (Mediane) A) HO-1 und B) HO-2, wobei jeweils links die positiven Banden aus der Analyse des Homogenisat normal-schwangerer Mäuse zu sehen sind und jeweils rechts die positiven Banden aus dem Homogenisat der Abortmäuse. Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Computerprogramms (Imagequant TL Programm) bestimmt und anschließend mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests (*:p<0,05) miteinander verglichen.

5.1.3 Die Th1 und Th2 Zytokin-Produktion beim murinen spontanen Abort 

Die aus der Milz und der Dezidua isolierten Lymphozyten wurden nach der Stimulation mit Ionomycin und PMA mit spezifischen Zytokin-Antikörpern markiert und anschließend im Durchflusszytometer auf die Menge der verschiedenen Zytokine und nach ihren Cluster of Differentiation (CD) hin untersucht. Bei der Analyse der Zytokine konnten sowohl in der Dezidua als auch in der Milz keine signifikanten Unterschiede in der Zytokinproduktion zwischen der Abortgruppe und der normalen Schwangerschaftsgruppe beobachtet werden (Tabelle IV). Die Daten zeigen jedoch, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ Zellen für die Produktion der Zytokine verantwortlich sind, da bei beiden Gruppen eine ähnliche Anzahl gemessen wurde. In der Milz konnten keine Unterschiede in der Th1/Th2 Ratio zwischen der Abortgruppe und der Kontrollgruppe festgestellt werden. In den Deziduazellen von Abortmäusen hingegen konnte eine statistisch signifikante Erhöhung der TNF-α/ΙL−10 Ratio im Vergleich zu der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei den Tieren der Abortgruppe konnte auch eine Erhöhung der IFN-γ/IL-4 Ratio festgestellt werden, welche jedoch nicht signifikant war.

↓73

Tabelle 4: Th1/Th2 Zytokine Produktion in Abortmäusen (A) im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe (NS). Dargestellt ist der prozentuale Anteil der positiven Zellen als Mediane. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des MannWhitney-U Tests (*: p<0,05) ermittelt

Milz 

Normale Schwangerschaft (n=10)

Abort (n=11)

Zytokine

TNF-α

1,36

1,08

IFN-γ

0,53

0,67

IL-10

0,95

0,87

IL-4

1,13

0,77

TNF-α/ IL-10

1,43

1,61

IFN-γ/IL-4

0,46

0,87

CD-Marker

CD4

10,12

8,36

CD8

9,97

7,57

CD25

1,99

1,54

CD4/CD25

1,09

0,87

Dezidua

Zytokine

TNF-α

2,12

4,24

IFN-γ

2,92

3,28

IL-10

2,28

2,52

IL-4

1,05

1,61

TNF-α/ IL-10

1,20

3,13*

IFN-γ/IL-4

2,00

2,60

CD-Marker

CD4

2,63

2,74

CD8

4,81

4,67

CD25

2,62

4,44

CD4/CD25

2,95

5, 53

5.1.4 iNOS und eNOS Expression im Mausmodell für spontanen Abort

5.1.4.1  Immunhistochemische Analyse der Plazenta 

Um die Expression von iNOS und eNOS in den verschiedenen Zellen der Plazenta und der Dezidua zu untersuchen, wurde iNOS und eNOS in Gewebeschnitte der Plazenta mittels spezifischer Antikörper markiert und sichtbar gemacht (Abb.13). Die Analyse der Schnitte zeigte bei beiden Isoformen von NOS nur eine sehr geringe Färbung der Zellen (Tab. V), was auf sehr geringe Mengen von NOS in der Plazenta hindeutet. Bei dem Vergleich der beiden Gruppen konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet werden (Tab. V).

Tabelle 5: iNOS und eNOS Expression in verschiedenen Zelltypen der Plazenta und der Dezidua in Abortmäusen (A) im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe (NS), dargestellt als Median der Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten selbst werden als Median gezeigt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

iNOS

NS (n=6)

Abort (n=6)

Dezidua

0,25

0,00

Riesenzellen

1,75

2,00

Spongiotrophoblasten

1,25

1,00

Labyrinthzellen

1,00

0,50

eNOS

Dezidua

0,50

0,50

Riesenzellen

3,50

1,50

Spongiotrophoblasten

1,00

1,00

Labyrinthzellen

1,00

1,50

↓74

Abbildung 13: Repräsentative IHC-Bilder der Zelltypen der Plazenta. A) Labyrinthgewebe (Lab) und Spongiotrophoblasten (Sp) welche eine typische iNOS positive Färbung zeigt (AEC Färbung) B) einige eNOS+ gefärbte Spongiotrophoblasten (DAB Färbung). Die Pfeile markieren die positiv gefärbten Zellen.

5.1.4.2 Western-Blot Analyse von iNOS und eNOS

Zur Analyse der iNOS und eNOS Expression in der Plazenta wurde aus der Plazenta ein Gesamtproteinextrat gewonnen, welches auf eine SDS Page aufgetragen wurde. Nach Trennung der Moleküle wurden die Proteinbanden auf eine Nitrozellulosemembran überführt. Mit Hilfe von spezifischen Antikörpern für iNOS und eNOS, gefolgt von einer Inkubation mit dem zweiten Antikörper und einer anschließenden Inkubation mit einem ECL-Kit, welches die Banden von iNOS und eNOS mittels Chemilumineszense auf einem Röntgenfilm sichtbar macht, konnte die Stärke der Banden und somit die Menge von iNOS oder eNOS in der Plazenta bestimmt werden.

In der Plazenta von normal-schwangeren Mäusen, wie auch in der Plazenta von Abortmäusen konnte iNOS (130kD) und eNOS (140kD) nachgewiesen werden (Abb.14). Die Intensität der Banden waren insgesamt sehr schwach, was bedeuten würde, dass nur sehr geringe Mengen von iNOS und eNOS in der Plazenta vorhanden sind. Die Analyse der Banden zeigte, dass die Expression von iNOS und eNOS in der Plazenta von Abortmäusen signifikant reduziert war, im Vergleich zu normal-schwangeren Mäusen (Abb.14).

↓75

Abbildung 14: zeigt die positiven Western-Blot Banden als Box plots (Mediane) für A) iNOS und B) eNOS wobei jeweils links die positiven Banden aus der Analyse des Homogenisat normal-schwangerer Mäuse zu sehen sind und jeweils rechts die positiven Banden aus dem Homogenisat der Abortmäuse. Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Computerprogramms (Imagequant TL Programm) bestimmt und anschließend mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests (*:p<0,05) miteinander verglichen.

5.2 Induktion von HO-1 bzw. Hemmung von HO-1 und HO-2 in dem Mausmodell für einen spontanen Abort

Die bisherigen Ergebnisse deuten daraufhin, dass HO-1 und HO-2 im Laufe der Schwangerschaft eine Rolle spielen. Um die genaue Rolle von HO bei einer erfolgreichen Schwangerschaft zu untersuchen, wurde ein weiterer Tierversuch durchgeführt. Ziel dieses Versuches war es, HO-1 und HO-2 systemisch in den Mäusen hoch- bzw. runterzuregulieren, um untersuchen zu können, welchen Einfluss HO auf den Schwangerschaftsverlauf hat. In der Transplantationsimmunologie konnte mit Hilfe von Co-PP, einem bekanntem HO-1 Induzierer, eine verbesserte Akzeptanz des Transplantats über einen längeren Zeitraum erreicht werden (Tullius et al. 2002), weshalb wir vermuten, dass eine erhöhte HO Expression zu einem Schutz des Feten führt.

5.2.1  Verminderte Abortraten in Co-PP behandelten Tieren 

DBA/2j verpaarte CBA/J Weibchen wurden am 4. Tag der Schwangerschaft mit Co-PP (5mg/kg) i.p. bzw. Zn-PP (40mg/kg) i.p. behandelt, um HO-1 hoch- bzw. HO-1 und HO-2 runterzuregulieren. Die normale Schwangerschaftskontrolle und die Kontrolle für den spontanen Abort erhielten beide eine neutrale Pufferlösung am Tag 4 der Schwangerschaft. Die Mäuse wurden entweder am Tag 8 oder am Tag 14 der Schwangerschaft getötet. An beiden Tagen wurden die Abortrate und die Implantationsrate der Tiere bestimmt. Die Analyse der am Tag 14 getöteten CBA/J Weibchen (Abb. 15A) zeigte, dass die Abortrate der spontanen Abortgruppe im Vergleich zu der normalen Schwangerschaftskontrolle signifikant erhöht war, welches die Daten des ersten Tierversuches bestätigte. Die Injektion von Co-PP führte zu einer signifikanten Reduktion der Abortrate im Vergleich zu der Abortgruppe, die eine neutrale Pufferlösung erhalten hatte. Die Abortrate der Tiere, die mit Zn-PP behandelt wurden, stieg hingegen im Vergleich zu allen anderen Gruppen des Versuches signifikant an. Das bedeutet, dass die Behandlung mit Co-PP vor einem spontanen Abort schützt, die Behandlung mit Zn-PP hingegen einen spontanen Abort induziert. Die Anzahl aller Implantationen war bei allen Gruppen vergleichbar und zeigte keine signifikanten Unterschiede, was einen Einfluss der Behandlung auf die Anzahl der Embryonen ausschließt (Abb. 15B). Die Abortrate am Tag 8 der Schwangerschaft konnte nicht ermittelt werden, da Aborte erst am Tag 8 der Schwangerschaft auftreten und somit keine Unterschiede zwischen den einzelnen Implantationen erkannt werden konnte. Die Anzahl der Implantation zeigte keine signifikanten Unterschiede (Tab. VI).

↓76

Abbildung 15: Die Daten werden als Blox plots (Mediane) dargestellt. A) gezeigt wird die Abortrate in %. Die erste Gruppe von links stellt die normale Schwangerschaftsgruppe (NS) dar. Die zweite Gruppe steht für den spontanen Abort (A), welche mit PBS behandelt wurde. Die Kontrollgruppe für den spontanen Abort zeigt eine signifikante Erhöhung der Abortrate im Vergleich zu der Kontrollgruppe, was durch den Mann-Whitney-U Tests ermittelt wurde *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001). Die dritte Gruppe von links stellt die Abortgruppe dar, welche mit Co-PP behandelt wurde (Co-PP). Im Vergleich zu der Abortkontrollgruppe ist die Anzahl der Aborte signifikant reduziert. Bei der letzten Gruppe handelt es sich um die Abortgruppe, welche mit Zn-PP behandelt wurde (Zn-PP). Diese Gruppe zeigt im Vergleich zu allen anderen Gruppen eine signifikante Erhöhung der Abortrate. B) Zu sehen ist die Anzahl der Implantationen aller Gruppen

Tabelle 6: zeigt die Anzahl der Implantationen der behandelten Gruppen b) und c) im Vergleich zu der spontanen Abortgruppe a).Die Daten werden als Mediane dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

Implantationsrate

a) Abort (n=5)

b) Co-PP (n=4)

c) Zn-PP (n=3)

9,5

9

8

5.2.2 HO-1 und HO-2 Expression nach Behandlung mit Co-PP oder Zn-PP

Die Expression von HO-1 und HO-2 4 bzw. 10 Tage nach der therapeutischen Behandlung mit Co-PP oder Zn-PP sollte mit Hilfe verschiedener Methoden analysiert werden und anschließend mit den beiden Kontrollgruppen, welche mit einer neutralen Pufferlösung behandelt wurden, verglichen werden.

5.2.2.1  Untersuchungen von HO-1 und HO-2 mittels IHC bei Mäusen die mit CO-PP bzw. Zn-PP behandelt wurden

↓77

Nach der spezifischen Färbung der histologischen Plazentaschnitten mittels IHC zeigte sich, dass die Expression von HO-1 und HO-2 zwischen den einzelnen Gruppen vergleichbar war.

Die Analyse der Plazenta zeigte, dass die Proteinexpression von HO-1 und HO-2 in der spontanen Abortgruppe, welche mit PBS behandelt wurde, in allen Zelltypen der Plazenta im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe signifikant reduziert war (Abb. 16 und 18). Damit wurde das Ergebnis des ersten Tierversuchs bestätigt.

Die Expression von HO-1 war in den Spongiotrophoblasten und den Labyrinthzellen signifikant erhöht. Bei der Behandlung mit Zn-PP konnte man bei HO-1 in allen Zelltypen keine Veränderung in der Proteinexpression im Vergleich zu den anderen Gruppen beobachten (Abb.16 und 17). Eine Behandlung mit Co-PP führte im Vergleich mit der Abortkontrollgruppe, zu einer signifikant erhöhten Expression von HO-2 in allen Zelltypen der Plazenta (Abb.18 und 19). Die Expression von HO-2 hingegen war in den Riesenzellen und in den Labyrinthzellen nach einer Behandlung mit Zn-PP signifikant erhöht (Abb. 18B).

↓78

Abbildung 16: HO-1 Expression in A) der Dezidua, B) den Riesenzellen, C) den Spongiotrophoblasten und D) den Labyrinthzellen, dargestellt als Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten selbst werden als Box Plots (Mediane) dargestellt. Die Signifikanz wurd mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05).

Abbildung 17: Repräsentative IHC-Bilder HO-1 positiver Deziduazellen (Dez), Labyrinthzellen (Lab), Spongiotrphoblasten (Sp) und Riesenzellen (RZ) der Plazenta A) Normale Schwangerschaft B) Abortkontrolle C) Co-PP behandelte Tiere D) Zn-PP behandelte Tiere

 

Abbildung 18: HO-2 Expression in A) der Dezidua, B) den Riesenzellen, C) den Spongiotrophoblasten und D) den Labyrinthzellen, dargestellt als Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten selbst werden als Box plots (Mediane) dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05)

↓79

Abbildung 19: Repräsentative IHC-Bilder HO-2 positiver Labyrinthzellen (Lab) und Spongiotrphoblasten (Sp) der Plazenta A) Normale Schwangerschaft B) Abortkontrolle C) Co-PP behandelte Tiere D) Zn-PP behandelte Tiere

5.2.2.2 HO-1 und HO-2 Western-Blot Analyse

Am Tag 14 der Schwangerschaft konnte bei Mäusen der Abortgruppe, welche mit PBS behandelt wurden, eine signifikante Reduktion der Proteinexpression von HO-1 und von HO-2 im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe festgestellt werden (Abb. 20), welches die Ergebnisse des ersten Tierversuches bestätigt. Eine Behandlung mit Co-PP führte bei beiden Formen von HO zu einem signifikanten Anstieg in der Proteinexpression (Abb. 20 A und B). Eine Behandlung mit Zn-PP führte jedoch nicht, wie erwartet, zu einer Reduktion der Proteinexpression, was vermutlich am späten Zeitpunkt der Schwangerschaft liegt und die Mäuse bereits begonnen haben, den schädlichen Auswirkungen der Zn-PP mit einer erhöhten Expression von HO-1 entgegen zu wirken. Bei HO-2 konnte man keine Unterschiede zwischen der Abortkontrollgruppe und der mit Zn-PP behandelten Gruppe beobachten, bei HO-1 kommt es am Tag 14 der Schwangerschaft sogar zu einem signifikanten Anstieg in der Proteinexpression nach einer Behandlung mit Zn-PP.

Abbildung 20: zeigt die Ratio von A) HO-1/ Beta-actin und B) HO-2/ Beta-actin als Box plot (Mediane). Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Computerprogramms (Imagequant TL Programm) bestimmt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests. (*:p<0,05, **: p<0,01) errechnet. Die erste Gruppe von links stellt die normale Schwangerschaftsgruppe (NS) dar. Die zweite Gruppe steht für den spontanen Abort (Abort), welche mit PBS behandelt wurde. Die dritte Gruppe von links stellt die Abortgruppe dar, welche mit Co-PP behandelt wurde (Co-PP). Bei der letzten Gruppe handelt es sich um die Abortgruppe, welche mit Zn-PP behandelt wurde (Zn-PP).

 

5.2.2.3 RT-PCR Analyse von HO-1 

↓80

Um die HO-1 mRNA nachzuweisen, wurde zuerst aus der Plazenta mit Hilfe von Trizol die RNA isoliert. Die RNA wurde anschließend in cDNA umgeschrieben, damit eine Analyse mittels Real-Time RT-PCR möglich wurde. Die cDNA wurde dann zusammen mit einem spezifischen Primermix für HO-1, welcher aus Vorwärts- und Rückwärtsprimer bestand und einer spezifischen HO-1 Sonde einem Standardinkubationsprogramm unterzogen, um die für HO-1 spezifische cDNA zu amplifizieren. Mit Hilfe der Fluoreszenz der Sonde konnte man dann die Menge an amplifizierter cDNA messen. Als house keeping gene wurde β-Actin verwendet. Bei der Analyse der Genexpression von HO-1 konnte man am Tag 14 der Schwangerschaft keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen beobachten (Tab. VII). Am Tag 8 der Schwangerschaft konnte man in den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden, im Vergleich zu den Abortkontrollmäusen einen leichten Anstieg an HO-1 mRNA beobachten (Tab. VIII). Die Tiere die mit Zn-PP behandelt wurden, zeigten, wenn man sie mit den Kontrollabortmäusen verglich, einen Rückgang in der HO-1 mRNA, welcher jedoch nicht signifikant war.

Tabelle 7: mRNA 2 - cT von HO-1 im Gewebe der Plazenta. Die mRNA 2 - cT wird als Median dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

HO-1

a) NS (n=5)

b) Abort (n=6)

c) Co-PP (n=5)

d) Zn-PP (n=5)

0,05513

0,05997

0,04465

0,04423

Tabelle 8: mRNA 2 - cT von HO-1 im Gewebe der Plazenta. Die mRNA 2 - cT wird als Median dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

HO-1

b) Abort (n=6)

c) Co-PP (n=5)

d) Zn-PP (n=5)

0,00081

0,00215

0,00012

5.2.3 Th1 und Th2 Zytokinproduktion nach Behandlung mit Co-PP oder Zn-PP 

5.2.3.1  Durchflusszytometrie-Analyse der Milz aus Tieren des murinen Abortmodells am Tag 8 der Schwangerschaft 

↓81

Bei der Präparation der Mäuse am Tag 8 der Schwangerschaft wurde die Milz gewonnen und aus dieser Lymphozyten isoliert. Die Lymphozyten der einzelnen Gruppen wurden gepoolt, mit Ionomycin und PMA stimuliert und mit spezifischen Zytokin-Antikörpern inkubiert, um später im Durchflusszytometer die Zytokinproduktion in diesen Lymphozyten bestimmen zu können.

Der Prozentuale Anteil der CD4+ als auch CD8+ Zellen ist in allen drei Gruppen vergleichbar. Man kann daher davon ausgehen, dass beide Zelltypen für die Produktion der Zytokine verantwortlich waren. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied in der Zytokinproduktion zwischen der Abortgruppe und den behandelten Gruppen beobachtet werden. Auch die Th1/Th2 Ratio weist keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen auf (Tab.IX). Dennoch kann man eine leichte Senkung der Th1/Th2 Ratio bei beiden behandelten Gruppen im Vergleich mit der Kontrollgruppe beobachten (Abb. 21)

Tabelle 9: Th1/Th2 Zytokineproduktion in Abortmäusen (Ab) im Vergleich mit Co-PP oder Zn-.PP behandelten Abortmäusen am 8. Tag der Schwangerschaft. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der positiven Zellen als Median. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

Zytokine

b) Abort (n=3)

c) Co-PP (n=5)

d) Zn-PP (n=3)

Milz

TNF-α

1,88

0,75

1,9

IFN-γ

3,31

1,82

1,43

IL-10

0,69

0,6

0,78

IL-4

0,82

0,73

1,11

CD-Marker

CD4

29,92

27,53

25,18

CD8

0,4

0,39

0,72

CD25

20,63

19,66

17,12

CD4/CD25

0,18

0,11

0,5

↓82

Abbildung 21: Th1/Th2 Ratio als Box plots (Mediane) in Abortmäusen (A) im Vergleich mit Co-PP oder Zn-.PP behandelten Abortmäusen am 8. Tag der Schwangerschaft. Dargestellt ist die Ratio von A) TNF-α/IL-10 und B) IFN-γ/IL-4. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

5.2.3.2 Durchflusszytometrie-Analyse der Dezidua und Milz aus Mäusen des spontanen Abortmodells am Tag 14 der Schwangerschaft 

Am Tag 14 der Schwangerschaft wurden aus der Dezidua und der Milz die Lymphozyten isoliert. Nach einer vierstündigen Stimulation der Zellen mit Ionomycin und PMA erfolgte die markierung der Zellen mit spezifischen Antikörpern. Mittels der Durchflusszytometrie wurden diese Zellen dann zum einen nach ihren CD hin sortiert und zum zweiten auf ihre Zytokinproduktion hin untersucht. Ähnlich wie am Tag 8 der Schwangerschaft wurden die Zytokine von CD4+ und CD8+ Zellen produziert. Es konnte auch kein signifikanter Unterschied in dem prozentualen Anteil von CD4+ als auch CD8+ Zellen zwischen den verschiedenen Gruppen feststellt werden. In der Milz der Mäuse, die mit Zn-PP behandelt wurden, konnte eine signifikante Reduktion der Zytokine TNF-α, IFN-γ und IL-4 im Vergleich zu den anderen 3 Gruppen beobachtet werden (Tab. X). In der Dezidua hingegen zeigten TNF-α und IFN-γ eine signifikante Reduktion im Vergleich zu der Abortkontrollgruppe und der Co-PP behandelten Gruppe.

Tabelle 10: Th1/Th2 Zytokine Produktion in Abortmäusen (Abort) und normalen schwangeren Mäusen (NS), im Vergleich mit Co-PP oder Zn-.PP behandelten Abortmäusen am 14. Tag der Schwangerschaft. Dargestellt ist die prozentuale Anteil der positiven Zellen als Median. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des MannWhitney-U Tests (*: p<0,05, **: p<0,01) ermittelt.

Milz 

a) NS (n=5)

b) Abort (n=5)

c) Co-PP (n=6)

d) Zn-PP (n=4)

Zytokine

TNF-α

1,36 (d*)

0,92 (d*)

1,63 (d**)

0,49

IFN-γ

1,09 (d*)

0,81 (d*)

1,06 (d**)

0,29

IL-10

1,02

0,54

1,42 (d**)

0,67

IL-4

0,48 (d*)

0,49 (d*)

0,48 (d*)

0,12

CD-Marker

CD4

10,61

7,65

10,21

10,84

CD8

9,53

6,65

7,83

8,16

CD25

1,81

1,51

2,05

0,70

CD4/CD25

1,01

0,78

0,99

0,56

Dezidua 

a) NS (n=5)

b) Abort (n=5)

c) Co-PP (n=6)

d) Zn-PP (n=4)

Zytokine

TNF-α

1,83

4,25 (d*)

2,85 (d**)

1,07

IFN-γ

2,46

3,05 (d*)

3,87 (d**)

0,90

IL-10

1,72

2,19

1,90

3,93

IL-4

0,99

1,54

0,95

2,78

CD-Marker

CD4

2,14

2,79

5,43

9,67

CD8

5,46

4,71

17,43

11,28

CD25

1,91

4,52

3,77

9,14

CD4/CD25

2,38

5,85

3,30

3,01

↓83

Bei der Analyse der Th1/Th2 Ratio in der Milz (Abb. 22) und in der Dezidua (Abb. 23) zeigte sich, dass die TNF-α/IL-10 Ratio (Abb. 22A) in der Zn-PP behandelten Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen in der Milz signifikant reduziert war. Bei der Ratio von IFN-γ/IL-4 (Abb. 22B) konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. In der Dezidua konnte ebenso ein Rückgang der TNF-α/IL-10 Ratio in der Zn-PP Gruppe beobachtet werden, jedoch war dieser nicht signifikant (Abb. 23A). Die IFN-γ/IL-4 Ratio zeigte auch in der Dezidua keine Unterschiede (Abb. 23B).

Abbildung 22: Th1/Th2 Ratio der Milz in Abortmäusen (Abort) und normal-schwangeren Kontrollmäusen (NS) im Vergleich mit Co-PP oder Zn-.PP behandelten Abortmäusen am 14. Tag der Schwangerschaft. Dargestellt ist die Ratio von A) TNF-α/IL-10 und B) IFN-γ/IL-4 als Box plots (Mediane). Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des MannWhitney-U Tests (*: p<0,05, **: p<0,01) ermittelt.

Abbildung 23: Th1/Th2 Ratio der Milz in Abortmäusen (A) und normal-schwangeren Kontrollmäusen (NS) im Vergleich mit Co-PP oder Zn-.PP behandelten Abortmäusen am 14. Tag der Schwangerschaft. Dargestellt ist die Ratio von A) TNF-α/IL-10 und B) IFN-γ/IL-4 als (als Box plots (Mediane). Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des MannWhitney-U Tests ermittelt.

 

5.2.3.3 Real-Time RT-PCR von TNF-α und TGF-ß am Tag 8 und 14 der Schwangerschaft

↓84

Zur Analyse der TNF-α mRNA wurde eine Real-Time RT-PCR durchgeführt. Hierzu wurde aus der Plazenta RNA gewonnen und in cDNA umgeschrieben. Die spezifische Gensequenz der cDNA von TNF-α wurde dann mit Hilfe entsprechender Primer amplifiziert und mit Hilfe einer spezifischen Sonde sichtbar gemacht. An beiden untersuchten Tagen der Schwangerschaft konnte eine erhöhte, wenn auch nicht signifikante Menge an TNF-α mRNA in den Tieren beobachtet werden (Abb. 24 A und B), die mit Co-PP behandelt wurden, wenn man sie mit der Abortkontrollgruppe verglich. Die Analyse der Proben zeigte sowohl am Tag 8 (Abb. 24A) als auch am Tag 14 (Abb. 24B) der Schwangerschaft tendenziell reduzierte Mengen von TNF-α mRNA in den Tieren, die mit Zn-PP behandelt wurden, im Vergleich zu den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden. Am Tag 8 der Schwangerschaft konnten auch reduzierte Mengen von TNF-α mRNA in der Zn-PP Gruppe im Vergleich mit der Abortkontrollgruppe beobachtet werden (Abb. 24A)

Abbildung 24: Die Daten von TNF-α mRNA 2 - cT sind als Box plots (Mediane) dargestellt. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Withney-U Tests durchgeführt A) TNF-α mRNA 2 - cT  am Tag 8 der Schwangerschaft B) TNF-α mRNA 2 - cT am Tag 14 der Schwangerschaft.

Um einen möglichen Einfluss von Th3-Zytokinen bzw. deren Interaktion mit HO im Laufe eines HO induzieren Schwangerschaftsschutzes zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Real-Time RT-PCR TGF-ß untersucht (Tab. IX).

↓85

Hierbei zeigte es sich, dass am Tag 8 der Schwangerschaft keinen signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen auftraten. Am Tag 14 der Schwangerschaft konnte man hingegen signifikant erhöhte Mengen an TGF-ß in der Zn-PP Gruppe beobachten, wenn man sie mit der normalen Schwangerschaftsgruppe verglich.

Tabelle 11: Die Daten von TGF-ß mRNA 2 - cT sind als Mediane dargestellt. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Withney-U Tests (*P < 0,05) durchgeführt.

TGF-ß

a) Abort (n=5)

b) Co-PP (n=4)

c) Zn-PP (n=3)

Tag 8 der Schwangerschaft

0,63

0,32

0,82

TGF-ß

a) NS (n=6)

b) Abort (n=6)

c) Co-PP (n=6)

d) Zn-PP (n=5)

Tag 14 der Schwangerschaft

0,18

0,25

0,29

1,63 (a*)

5.2.4 iNOS und eNOS Expression nach der Behandlung von Abortmäusen mit Co-PP oder Zn-PP

5.2.4.1  Proteinexpression-Analyse von iNOS und eNOS mittels IHC am Tag 14 der Schwangerschaft

Die Zellen der in Paraffin eingebetteten Plazenten wurden auf ihre gruppenspezifische Expression von iNOS und eNOS hin untersucht. In den Zelltypen der Plazenta konnte sowohl bei iNOS als auch bei eNOS kein Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden (Tab. XII, Abb. 25). Nur die Riesenzellen und die Dezidua zeigten nach der Behandlung mit Co-PP eine signifikant erhöhte Expression von iNOS und eNOS im Vergleich mit der normalen Schwangerschaftsgruppe bzw. der Kontrollgruppe für den spontanen Abort.

↓86

Tabelle 12: iNOS und eNOS Expression in verschiedenen Zelltypen der Plazenta und der Dezidua, dargestellt als Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten werden als Mediane dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05).

iNOS

a) NS (n=4)

b) Abort (n=5)

c) Co-PP (n=5)

d) Zn-PP (n=5)

Dezidua

1,75(c*)

2,00(c*)

3,25

2,50

Riesenzellen

0,25

0,00(c*)

0,75

0,75

Spongiotrophoblasten

1,50

1,00

1,25

1,75

Labyrinthzellen

1,00

0,50

1,25

1,00

eNOS

Dezidua

3,75(b*)

1,75(c*)

2,50

2,75

Riesenzellen

0,50(c*)

0,50

1,00

0,50

Spongiotrophoblasten

1,00

1,00

1,75

1,25

Labyrinthzellen

1,00

1,50

1,75

1,25

Abbildung 25: Repräsentative IHC-Bilder der Plazenta. Um iNOS und eNOS optisch auch voneinander zu unterscheiden, wurden verschiedene Chromogene zur Visualisierung verwendet. A und B) iNOS positive Riesenzelle (RZ), Deziduazellen (Dez) und Spongiotrophoblasten an der Feto-maternalen Grenze (AEC-Färbung, rötliche Färbung) A) Co-PP behandelte Tiere B) Zn-PP behandelte Tiere. C und D) HO-2 positive Riesenzelle (RZ), Deziduazellen (Dez) und Spongiotrophoblasten (Sp) (DAB-Bärbung, bräunliche Färbung) C) Co-PP behandelte Tiere D) Zn-PP behandelte Tiere

5.2.4.2 iNOS und eNOS Proteinexpression-Analyse mittels Western-Blot am 14. Tag der Schwangerschaft

Die spezifischen Proteinbanden der beiden Moleküle wurden nach einem Western-Blot auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht. Die Ratio wurde aus der Intensität der Banden von iNOS oder eNOS gegen die Intensität der Beta-Actin Banden berechnet. Die Western-Blot Analyse zeigte eine reduzierte Expression von iNOS und eNOS der Abortgruppe im Vergleich zu der normalen Schwangerschaftsgruppe. Die Ergebnisse vom ersten Tierversuch konnten jedoch nur zum Teil bestätigt werden, da die reduzierte Expression nicht signifikant war. In den Tieren, die mit Co-PP und Zn-PP behandelt wurden, konnte keine Veränderung in der Expression von iNOS und eNOS beobachtet werden (Abb 26A und 26B).

↓87

Abbildung 26: zeigt die Ratio von A) eNOS/ Beta-actin und B) iNOS/ Beta-actin. Die Intensität der Banden wurde mit Hilfe eines Computerprogramms (Imagequant TL Programm) bestimmt. Die Daten werden als Box plots (Mediane) dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests errechnet

5.2.4.3 Real-Time RT-PCR von iNOS und eNOS nach der Behandlung mit Co-PP oder Zn-PP am 8 und 14 Tag der Schwangerschaft 

Um mögliche Unterschiede in der Expression von iNOS und eNOS zwischen Tag 8 und Tag 14 der Schwangerschaft zu untersuchen, wurde eine Real-Time RT-PCR durchgeführt. Es konnten keine Unterschiede in der Expression von iNOS und eNOS zwischen den Gruppen am Tag 14 der Schwangerschaft beobachtet werden (Tab. XIII). Am Tag 8 der Schwangerschaft konnte man lediglich in der Co-PP Gruppe eine leichte Erhöhung der mRNA von iNOS feststellen.

Tabelle 13: Die iNOS und eNOS mRNA 2 - cT Raten der Plazenta sind als Mediane dargestellt. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Withney-U Tests durchgeführt.

Tag 8 der Schwangerschaft

a) Abort (n=5)

b) Co-PP (n=4)

c) Zn-PP (n=3)

eNOS

/

0,098

0,092

0,098

iNOS

/

0,001

0,009

0,002

Tag 14 der Schwangerschaft

a) NS

(n=6)

a) Abort (n=6)

b) Co-PP (n=6)

c) Zn-PP (n=5)

eNOS

0,041

0,021

0,058

0,129

iNOS

0,025

0,030

0,020

0,016

5.2.5 Beeinflussung der Apoptose nach der Behandlung mit Co-PP bzw. Zn-PP

5.2.5.1  TUNEL-Analyse in der Plazenta von Co-PP bzw. Zn-PP behandelten Mäusen

↓88

Der HO wurden anti-apoptotische Eigenschaften zugeschrieben. Um zu untersuchen, ob der HO induzierte Schwangerschaftsschutz in Verbindung mit diesen anti-apoptotischen Eigenschaften steht, wurde eine TUNEL-Analyse durchgeführt, durch die man die Anzahl der apoptotische Zellen nachweisen kann. Die Anzahl der apoptotischen Kerne/mm² wurde bestimmt, um die Apoptosis-Rate in der Plazenta zu ermitteln. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen (Abb. 27A). Es konnten jedoch Tendenzen beobachtet werden. So war die Anzahl von apoptotischen Zellen in der Abortkontrollgruppe (Abb.27C) im Vergleich zur normalen Schwangerschaftsgruppe erhöht. Die Tiere, die mit Co-PP behandelt wurden, zeigten einen deutlichen Rückgang des Medians der Apoptosis-Rate im Vergleich zu den Mäusen der Abortkontrollgruppe. Die mit Zn-PP behandelten Tiere zeigten keinen Unterschied zu der Abortkontrollgruppe (Abb. 27D).

Abbildung 27: (A) Die Anzahl der apoptotischen Zellen in plazentalem Gewebe. Die Daten sind als Box plots (Mediane) dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt. (B) Negativ Kontrolle bei der keine Enzym-Lösung verwendet wurde. (C) und (D) zeigen die typischen rot angefärbten apoptotischen Zellkerne in der Abortgruppe (C) und der Zn-PP behandelten Gruppe (D)

5.3 HO in dem Mausmodell für Präeklampsie 

Eine weitere sehr ernste Schwangerschaftskomplikation ist die Präeklampsie. Die bisherigen Studien über HO und dessen Rolle während dieser Schwangerschaftskomplikation sind im Gegensatz zum spontanen Abort sehr widersprüchlich. Barber et al. (2001) konnte nur sehr geringe Expression von HO-1 bei Frauen mit Präeklampsie beobachten, Ahmed et al. (2000) hingegen beobachtete signifikant reduzierte Mengen von HO-1 in Patientinnen mit Präeklampsie, im Vergleich zu normal-schwangeren Frauen. Zenclussen et al. (2003) konnte zwar ebenfalls einen Rückgang in der HO-1 Expression beobachten, welcher aber nicht signifikant war.

↓89

Weiterhin existieren keine Daten über die HO Expression im Tiermodell für Präeklampsie. Ziel dieses Versuches war es daher, die Rolle von HO in einem Mausmodell für Präeklampsie zu untersuchen und durch eine Induktion bzw. Reduktion der HO Expression mit Hilfe einer Behandlung mit Co-PP bzw. Zn-PP zu untersuchen, ob HO einen direkten Einfluss auf die Symptome der Präeklampsie nehmen kann.

5.3.1  Die Präeklampsie-Gruppe und die normale Schwangerschaftsgruppe zeigen keine Unterschiede in der Implantationsrate

Balb/c Weibchen wurden mit C57BL/6 Männchen verpaart. Am Tag 10 und 12 der Schwangerschaft wurde die Kontrollgruppe mit PBS behandelt, die Mäuse der Präeklampsiegruppe (PE) erhielten hingegen 3 x 107 aktivierte Th1 Zellen i.v. injiziert. Am Tag 14 der Schwangerschaft wurden die Mäuse getötet, die Anzahl der Implantationen und die Abortrate dokumentiert und Organe für weitere Versuche gewonnen. Die Implantationsrate war bei beiden Gruppen gleich, auch die Abortrate zeigte keine Unterschiede (Abb. 28). Die Aborte, die in Abb. 28 A dargestellt sind, traten am Tag 8 der Schwangerschaft auf und sind daher nicht mit den Präeklampsie-ähnlichen Symptomen in Verbindung zu bringen.

Abbildung 28: Die Daten werden als Box plots (Mediane) dargestellt. A) Abortrate B) Anzahl aller Implantationen zwischen bei normalen Schwangerschaft Mäusen und bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen. Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Withney-U Tests durchgeführt.

5.3.2 Blutdruckverlauf bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen 

↓90

Um untersuchen zu können, ob die Injektion von aktivierten Zellen bei den Mäusen Präeklampsie-ähnliche Symptome auslöst, wurde bei den Mäusen während der gesamten Schwangerschaft der Blutdruck dokumentiert, wobei die Messung des Blutdrucks alle zwei Tage erfolgte. Bereits drei Wochen vor der Verpaarung der Mäuse wurden diese auf die Prozedur des Blutdruckmessens hin trainiert, um zu verhindern, dass durch den Stress der Blutdruckmessung zu hohe Blutdruckwerte gemessen werden. Zum Blutdruckmessen wurde den Mäusen am Schwanz eine Blutdruckmanschette angelegt und der Blutdruck mit Hilfe des Blutdruckmessgerätes von TSE-Systems automatisch bestimmt. Die Messungen wurden 10-mal durchgeführt, um einen geeigneten Mittelwert zu erhalten. Im Verlauf der gesamten Schwangerschaft konnte bei den Tieren der Kontrollgruppe ein relativ konstanter Blutdruck, der etwa bei 125 mmHg lag, beobachtet werden. Am Ende der Schwangerschaft hingegen konnte ein Rückgang des Blutdruckes beobachtet werden (Abb. 29). Der Rückgang des Blutdruckes am Ende einer Schwangerschaft ist normal und kann auf das Anwachsen des Embryonen zurückgeführt werden und der damit verbundenen Vergrößerung der Blutgefäße, wodurch es zu einem geringen Blutdruck kommt. Der Blutdruckverlauf der Präeklampsiegruppe war bis zum Tag 10 der Schwangerschaft mit dem der Kontrollgruppe vergleichbar. Nach der Injektion am Tag 10 und 12 kam es zu einem signifikanten Anstieg des Blutdruckes, der bis zum Ende der Schwangerschaft nicht mehr zurückging (Abb. 29).

Abbildung 29: Blutdruckverlauf in mmHg der Kontrollgruppe (untere Kurve) im Vergleich mit dem Blutdruckverlauf der Mäuse mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen (obere Kurve). Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05 and ***: p < 0,001. Die Pfeile zeigen Tag 10 und 12 der Schwangerschaft, an denen den Tieren Th1-Zellen bzw. PBS injiziert wurde.

5.3.3 Histologische Veränderung in der Niere und der Plazenta bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen

Zur Analyse von möglichen histologischen Veränderungen, die durch die Behandlung mit aktivierten Th1-Zellen auftreten könnten, wurden während der Präparation der Mäuse die Nieren und die Plazenten gewonnen. Die Gewebe wurden anschließend in Paraffin eingebettet und geschnitten.

↓91

Die 5-7µm dicken Schnitte wurden deparaffinisiert und anschließend wurden die Zellkerne mit Hämalaun und das Zyotosol mit Eosin gefärbt. Unter dem Mikroskop wurde dann die Histologie der Plazenta und der Niere der Kontrollgruppe (Abb. 30 A und C) mit der Histologie der Mäuse, die mit aktivierten Th1 Zellen behandelt wurden (Abb. 30 B und D), verglichen. Die Untersuchung zeigte, dass es durch eine Injektion aktivierter Th1 Zellen zu starken Veränderungen in der Plazenta und der Niere kam (Abb. 30 B und D). Sowohl in der Plazenta als auch in den Nieren der Mäuse mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen konnten Hämorraghien und in der Niere zusätzlich noch eine Desorganisation der Glomerulie beobachtet werden (Abb. 30D).

Die Stärke der Veränderungen wurde beispielhaft für die Plazenta bestimmt. Die Bestimmung erfolgte blind von zwei unabhängigen Beobachtern, wobei drei Kriterien festgelegt wurden, um die Veränderungen zu bestimmen: die Fläche der Hämorraghien in der Plazenta, die Lymphozyteninvasion in der Plazenta und die morphologischen Veränderungen der Plazenta. Für die Veränderungen wurde eine Skala von 0 bis 6 festgelegt, wobei 0 für keine Hämorraghie, keine Lymphozyteninvasion und eine normale plazentale Morphologie steht und 6 für die größte Fläche an Hämorraghien, die massivste Lymphozyteninvasion und stärkste Veränderung der Morphologie.

Tabelle 14: Histologische Veränderungen in der Plazenta A) Normal-schwangere Mäuse B) in Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen, dargestellt als stärke der Veränderungen. Die Daten werden als Median dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05)

a) NS (n=7)

b) PE(n=8)

Hämorraghie

1,00 (*b)

4,00

Lymphozyteninvasion

0,50 (*b)

2,00

Morphologische Veränderungen

0,00 (*b)

2,00

↓92

Abbildung 30: HE-Färbungen von A) einer Plazenta aus einer normal-schwangeren Maus B) einer Plazenta aus einer Maus mit präeklampsie-ähnlichen Symptomen C) einer gesunden Niere einer Balb/c Maus. D) einer Balb/c Mausniere, die mit aktivierten Th1-Zellen behandelt wurde, um Präeklampsie-ähnliche Symptome auszulösen. Die Hämorraghien, Lymphozyteninfiltration und die Desorganisation der Glomerulie in den Geweben werden durch Pfeile markiert.

5.3.4 HO Expression in Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen

5.3.4.1  HO Expression in plazentalen Zellen

In 5-7µm dicken Plazentaschnitten wurde mittels eines spezifischen HO-1 Antikörpers die Expression von HO-1 in den verschiedenen Zelltypen bestimmt. Die Intensität der Färbung wurde hierbei als Maß für die Expression angesehen. Die immunhistochemischen Untersuchungen zeigten jedoch keine Unterschiede in der Expressionsrate von HO-1, wenn man die beiden Gruppen miteinander verglich (Tab.XV und Abb. 31).

Tabelle 15: HO-1 Expression in verschiedenen Zelltypen der Plazenta und der Dezidua, dargestellt als Farbintensität der spezifischen Färbung. Die Daten werden als Mediane dargestellt. Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt.

HO-1

a) NS (n=8)

b) PE (n=6)

Dezidua

0,75

1,25

Riesenzellen

5,5

5,5

Spongiotrophoblasten

1,25

1

Labyrinthzellen

4

4

↓93

Abbildung 31: Repräsentative HO-1 Färbung in einer A) Plazenta einer normal trächtigen Balb/c Maus und B) einer Balb/c Mausplazenta mit Präeklampsie-ähnliche Symptomen.

5.3.4.2 RT-PCR Analyse von HO-1 in der Plazenta und der Dezidua 

Um die HO-1 mRNA zu untersuchen, wurde eine Real-Time RT-PCR durchgeführt. Aus der Plazenta und der Dezidua wurde die RNA gewonnen. Diese wurde in cDNA umgeschrieben und mittels spezifischer HO-1 Primer und Sonde wurde die spezifische Gensequenz von HO-1 amplifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die mRNA Menge von HO-1 sowohl in der Plazenta (Abb. 32A) als auch in der Dezidua (Abb. 32B) in beiden Versuchsgruppen vergleichbar ist.

Abbildung 32: Die Daten der HO-1 mRNA 2 - cT A) in der Plazenta B) in der Dezidua sind als Box plots (Mediane) dargestellt Die statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Withney-U Tests durchgeführt.

5.3.5 Th1/Th2 Zytokinproduktion in der Dezidua im Mausmodell für Präeklampsie

↓94

Nach der Stimulierung der isolierten Lymphozyten mit Ionomycin und PMA zur Zytokinproduktion wurden die Lymphozyten mit spezifischen, fluoreszierenden Antikörpern markiert und anschließend wurde die Anzahl der positiv gefärbten Zellen im Durchflusszyotmeter gemessen. Die Analyse zeigte, dass der prozentuale Anteil der beiden Th1-Zytokine IFN-γ und TNF-α in der Gruppe mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen signifikant erhöht war, im Vergleich zu den normal-schwangeren Mäusen (Abb. 33 A und B). Bei den Th2-Zytokinen IL-10 und IL-4 konnte eine reduzierte Anzahl positiver Zellen in den Präeklampsiemäusen beobachtet werden, die Reduktion war jedoch nicht signifikant (Abb. 33 C und D).

Abbildung 33: Th1/Th2 Zytokine Produktion in der Kontrollgruppe im Vergleich mit den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen. Der prozentuale Anteil der positiven Zellen werden als Box plots (Mediane) dargestellt. A) prozentualer Anteil der IFN-γ positiven Zellen B) prozentualer Anteil der TNF-α positiven Zellen C) prozentualer Anteil der IL-10 positiven Zellen und D) prozentualer Anteil der IL-4 positiven Zellen. Die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe des MannWhitney-U Tests (*: p<0:05) ermittelt.

5.3.6 Einfluss einer Co-PP oder Zn-PP Applikation auf den Blutdruckverlauf im Mausmodell für Präeklampsie

Um einen möglichen Einfluss von HO-1 Hoch- oder Runterregulierung bei Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen zu beobachten, wurden diese mit Co-PP, um die HO-1 hoch zuregulieren, oder mit Zn-PP, um die Expression von HO-1 und HO-2 zu reduzieren, behandelt. Die Injektion von Co-PP bzw. Zn-PP erfolgte i.p. am Tag 10 der Schwangerschaft. Die Behandlung der Mäuse führte bei beiden Gruppen gleich nach der Injektion zu einem Anstieg des Blutdruckes, von 116 auf 158 mmHg bei Zn-PP und von 136 auf 168 mmHg bei Co-PP Applikation. Der Blutdruck viel aber bereits am 12. Tag der Schwangerschaft wieder ab (Abb. 34). Die Tiere die mit Co-PP behandelt wurden, wiesen am Ende der Schwangerschaft einen ähnlich hohen Blutdruck auf, wie die Mäuse die nur mit Th1-Zellen behandelt wurden. Die Tiere, die mit Zn-PP behandelt wurden, zeigten einen stark reduzierten Blutdruck am Ende der Schwangerschaft, der sogar noch unter dem der normal-schwangeren Tiere lag. Das die Applikation mit Co-PP und Zn-PP keinen Einfluss auf den Blutdruck nimmt könnte bedeuten, das die Hämoxygenase bei der Ausbildung von Präeklampsie-ähnlichen Symptomen keine Rolle spielt.

↓95

Abbildung 34: Blutdruckverlauf in mmHg der Kontrollgruppe (rosa), der Präeklampsiegruppe (blau), der Gruppe die mit Co-PP behandelt wurde (grün) und der Zn-PP behandelten Mäuse (braun). Die Signifikanz wurde mit Hilfe des Mann-Whitney-U Tests ermittelt (*:p < 0,05 and ***:p <0,001. Die Pfeile zeigen Tag 10 und 12 der Schwangerschaft, an denen den Tieren Th1-Zellen bzw. PBS injiziert wurde.

 


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06.02.2008