6. Diskussion 

↓95

Die Schwangerschaft ist ein physiologischer Zustand, bei dem der Fetus von dem Immunsystem der Mutter als Selbst akzeptiert wird, obwohl der Fetus zusätzlich zu den mütterlichen auch väterliche Antigene exprimiert. Der Fetus wird daher als allogenes Transplantat angesehen, wobei Medawar schon 1953 drei verschiedene Hypothesen aufstellte, um die Akzeptanz der Feten zu erklären.

Dennoch kommt es häufig zu Problemen während der Schwangerschaft, die zum Verlust der Feten führt. Hierzu zählen Uterusfehlbildungen, Myome in der Gebärmutter, Infektionen (wie Röteln oder Toxoplasmose) im Frühstadium der Schwangerschaft, Medikamente, aber auch Genussgifte (Goerke 2002). Eine Fehlgeburt kann aber auch immunologischen Ursprungs sein, bei dem das Immunsystem der Mutter den Fetus als Fremd erkennt und ihn abstößt. Der spontane Abort und die Präeklampsie sind Schwangerschaftskomplikationen, bei denen ein immunologischer Hintergrund besteht.

↓96

Beim spontanen Abort wird der Fetus von der Mutter abgestoßen, bevor er selbständig lebensfähig ist (Pschyrembel 2004). Ein großer Anteil der habituellen Aborte kann auf eine unpassende oder falsche Immunantwort zurückgeführt werden (Coulam 1991). Nur selten sind habituelle Aborte auf infektiologische, medikamentöse oder genetische Ursachen zurückzuführen. Die genauen Vorgänge bei einem habituellen Abort sind jedoch bisher weitgehend unbekannt.

Boue und Mitarbeiter (1975) und Stephenson (1996) führen einen einmaligen Abort bei Frauen zu 50% auf chromosomale Anomalien der Zygote zurück. Der spontane Abort würde in solchen Fällen eine Art natürliche pränatale Selektion darstellen und eine abnormale Entwicklung des Feten verhindern.

Die Präeklampsie ist eine hypertensive Erkrankung der Spätschwangerschaft und tritt in der Regel erst nach der 20. Schwangerschaftswoche auf. Bei Frauen mit Präeklampsie kommt es zu einem erhöhten Blutdruck und Proteinurie. Neben thromboembolischen Komplikationen ist die Präeklampsie die häufigste Ursache für die maternale Mortalität.

↓97

Eine Vorhersage, ob es im Laufe einer Schwangerschaft zu einer Präeklampsie kommen kann, ist bisher nicht möglich, jedoch sind bestimmte Risikofaktoren bekannt. Schulz und Wacker (2002) sowie Einarsson und Mitarbeiter (2003) konnten nachweisen, dass Frauen, die bis kurz vor der Empfängnis physische Barrieren als Empfängnisverhütung verwendeten, ein höheres Präeklampsierisiko aufwiesen, als Frauen die ungeschützten Sex hatten bzw. medikamentöse Verhütungsmittel verwendeten. Das deutet darauf hin, dass bei Frauen aus einer Partnerschaft die kurze Kohabitationszeit aufweisen, ein höheres Risiko besteht im Laufe der Schwangerschaft Präeklampsie zu entwickeln.

Die Ergebnisse von Trupin und Mitarbeiter (1996) belegen, dass das Risiko einer Präeklampsie bei Frauen, welche Zweitgebärende sind, stark erhöht ist, wenn die Frau zwischen der ersten und zweiten Schwangerschaft den Partner wechselt und kurz darauf schwanger wird. Bei Frauen mit dem gleichen Partner hingegen sinkt das Risiko einer Präeklampsie bei der zweiten Schwangerschaft.

Bei Autoimmunerkrankungen der Frau besteht ebenfalls ein erhöhtes Risiko einer Präeklampsie. So kommt es bei 25% der Frauen, die an Lupus erythematodes erkrankt sind, zur Ausbildung einer Präeklampsie (Reister und Wagner 2002). Weitere Risikofaktoren sind Diabetes, Frauen mit dem Alter unter 18 und über 40, Frauen mit einem Körpermaßindex über 30 und Mehrlingsschwangerschaften. Die genauen Mechanismen, wie es zu einer Präeklampsie kommt, sind jedoch bis heute noch nicht vollständig geklärt.

↓98

Verschiedene Autoren (Ahmed et al. 2000, Barber et al. 2001, Zenclussen et al. 2003) beschrieben bei einer spontanen Fehlgeburt und bei der Präeklampsie eine verminderte Expression der Hämoxygenase (HO), jedoch ist die genaue Rolle von HO bei diesen beiden Schwangerschaftskomplikationen bisher nicht genau geklärt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die Rolle der Hämoxygenase in den beiden eben genannten Schwangerschaftskomplikationen genauer untersucht werden.

6.1  HO-1 und HO-2 werden am Tag 14 der Schwangerschaft in der Plazenta von Abortmäuse herunterreguliert.

Um die Rolle von HO bei einem spontanen Abort untersuchen zu können, wurde auf ein bereits etabliertes und anerkanntes Mausmodell für den spontanen Abort zurückgegriffen. Für eine normale Schwangerschaft wurden weibliche CBA/J Mäuse mit männlichen BALB/c Mäusen verpaart und für den spontanen Abort wurden weibliche CBA/J Mäusen mit männlichen DBA/2J Mäusen verpaart.

Das Modell wurde von Clark und Mitarbeiter (1980) erstmalig beschrieben und es wurde vorgeschlagen, dass die hohen Abortraten in der Verpaarungskombination CBA/J x DBA/2J auf die Unterschiede in den Nebenhistokompatibilitätskomplexen von DBA/2J und BALB/c zurückzuführen sind (Clark et al. 1980, Chaouat et al. 1988).

↓99

Clark und Mitarbeiter (1980) beschrieben, dass die Verpaarung von weiblichen CBA/J Mäusen mit männlichen DBA/2J Mäusen zu Abortraten zwischen 20%-50% führte. Bei der Verpaarung von CBA/J x DBA/2J konnte in dieser Arbeit eine Abortrate von 20% (Median) beobachtet werden. Die Abortrate war im Vergleich zu der Abortrate der Kontrollgruppe CBA/J x BALB/c, welche bei 0% (Median) lag, signifikant erhöht. Unsere Daten decken sich mit Daten von anderen Autoren weltweit (Clark et al. 1980, HO et al. 1994, Gorivodsky et al. 1998, Zenclussen et al. 2002), wobei die Höhe der Abortrate von der Art der Tierhaltung abhängig ist.

Um zu analysieren, ob es zwischen den Abortmäusen und den normal-schwangeren Mäusen einen Unterschied in der HO-1 und HO-2 Expression gibt, wurde die Proteinexpression von HO-1 und HO-2 in der Plazenta und der Dezidua beider Gruppen untersucht.

Die Immunhistochemische Analyse von HO-1 und HO-2 zeigte, dass sowohl in der Abortgruppe als auch in der Kontrollgruppe im Zytoplasma aller Zelltypen der Plazenta und im Zytoplasma der Dezidua HO-1 und HO-2 exprimiert wurde. Zenclussen und Mitarbeiter (2002) beschrieben bei Stress- oder Th1-induzierten mit DBA/2J verpaarten CBA/J Weibchen, eine ähnliche Expression von HO-1 und HO-2 in der Plazenta und in der Dezidua, was die Daten dieser Arbeit bestätigt.

↓100

In der Ratte hingegen konnte man ausschließlich in Trophoblastenzellen der Plazenta eine Expression von HO-1 und HO-2 beobachten. In der Dezidua konnte keine HO-1 oder HO-2 Expression nachgewiesen werden (Ihara et al. 1998).

Auch im Uterus und in der Plazenta des Menschen konnte eine Expression von HO-1 nachgewiesen werden (Acevedo et al. 1998, McLean et al. 2000, Yoshiki et al. 2000). Verschiedene Autoren beschrieben, dass es bei Schwangerschaftskomplikationen zu einer veränderten Expression von HO kommt (Ahmed et al. 2000, Wang und Yu 2002, Zenclussen et al. 2003). Zenclussen und Mitarbeiter (2003) zeigten, dass die Expression von HO-2 in Frauen mit spontanem Abort im Vergleich zu normal-schwangeren Frauen stark reduziert war. Daher ist zu vermuten, dass es auch in den CBA/J Weibchen des spontanen Abortmodells zu einer veränderten HO Expression kommt.

Die immunhistochemische Analyse konnte erstmalig zeigen, dass die Expression von HO-1 und HO-2 in allen Trophoblastenzellen, nicht aber in der Dezidua von Abortmäusen, im Vergleich mit den Kontrollmäusen signifikant reduziert war. Ihara und Mitarbeiter (1998) postulierten, dass hauptsächlich die Trophoblasten für den Häm-Metabolismus in der Plazenta verantwortlich sind, was die Daten dieser Arbeit bestätigen würde, da es bei den Abortmäusen ausschließlich in den Trophoblasten zu einer veränderten HO-1 und HO-2 Expression kommt.

↓101

Mittels Western-Blot-Analyse haben wir weiterhin die HO-1 und HO-2 Konzentration in Gewebe-Homogenisaten der Plazenta semi-quantitativ untersucht. Auch hier zeigte sich in der Plazenta eine signifikante Reduktion der HO-1 und HO-2 Expression in Abortmäusen, im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Bereits Mantovani und Mitarbeiter (1997) beschrieben, dass zu geringe Mengen an HO für das Gewebe an der feto-maternalen Grenze schädlich sind, da es zu einer vermehrten Ansammlung von freiem Häme kommt, welches per se giftig ist und gewebeschädigende Eigenschaften aufweist (Balla et al. 1991, 1993, 2003). Die erhöhten Abortraten sind möglicherweise auf zu viel freies Häme zurückzuführen. Zenclussen und Mitarbeiter (2002) postulierte hierzu folgendes Szenario: Durch die geringe Konzentration von HO an der feto-maternalen Grenze wird freies Häme unzureichend abgebaut. Als Folge dessen kommt es zur Schädigung von Endothelzellen und zu einer erhöhten Expression von Adhäsionsmolekülen in diesen Zellen, was zu einer erhöhten Menge an Th1-Zellen führt. Durch die erhöhte Anzahl an Th1-Zellen kommt es zu weiteren oxidativen Schäden.

Durch die geringere Expression von HO-1 und HO-2 kommt es zudem zu einer verminderten Bildung von CO, Bilverdin und freiem Eisen, welche beim Abbau von Häme entstehen. Allen drei Metaboliten werden schützende Eigenschaften nachgesagt (Stocker et al. 1987, Marks 1991, Sato et al. 2001, Vedernikov et al. 1989), sodass auch hier ein Grund für die erhöhten Abortraten zu suchen wäre. Diese Hypothese würde bedeuten, dass die verminderte Expression von HO-1 die Ursache für den erhöhten Abort ist und könnte somit genetischen Ursprungs sein. In diesem Zusammenhang konnte unsere Arbeitsgruppe (Wollenberg et al. in Vorbereitung) nachweisen, dass DBA/2J Männchen in den Testis höhere HO-1 mRNA Werte aufweisen als BALB/c Männchen. Die F1 Generation der Verpaarung weiblicher CBA/J mit männlichen DBA/2J könnte somit eine genetisch bedingte verminderte HO-1 Expression aufweisen, die zu den hohen Abortraten führt. Weiterhin beschrieben Denschlag und Mitarbeiter (2004), dass HO-1 die Ursache für den Abort sein kann. Die Autoren zeigten, dass es bei Frauen mit einem habituellen Abort zu einem Polymorphismus des HO-1 (GT)n Mikrosatelliten kommt, was zu einer verminderten HO-1 Expression führte.

Es muss jedoch noch geklärt werden, ob die verminderte Expression von HO-1 die Ursache oder die Konsequenz des murinen Abortes ist. Ist die reduzierte HO-1 Expression die Ursache des Abortes, so könnte man postulieren, dass eine Induktion der HO-1 den Feten vor einem spontanen Abort schützen kann.

6.2 Erhöhte Th1/Th2 Ratio in der Dezidua von Mäusen mit spontanem Abort im Vergleich zu normal-schwangeren Mäusen am Tag 14 der Schwangerschaft.

↓102

Erfolgreiche Schwangerschaften wurden mit einer erhöhten Th2-Zytokinproduktion in Verbindung gebracht (Lin et al. 1993, Joachim et al. 2002). Die Mechanismen, die dieser Beobachtung zugrunde liegen, sind aber bisher in der Reproduktionsimmunologie nicht geklärt.   Zur Analyse der Th1- und Th2-Zytokinproduktion in T-Zellen aus der Milz und der Dezidua wurden die T-Zellen mittels Durchflusszytometrie untersucht.

Die Analyse der Daten zeigte, dass wenn man die einzelnen Zytokine untersucht, es weder systemisch noch lokal zu einer veränderten Zytokinproduktion in Abortmäusen im Vergleich mit den Kontrollmäusen kommt. Bei der Analyse der Th1/Th2 Ratio zeigte sich, dass es in der Dezidua der Abortmäuse zu einer signifikanten Erhöhung der TNF-α/ΙL−10 Ratio kam. Aufgrund dieses Ergebnisses kann man vermuten, dass es bei einem Abort zu einer verminderten Th2 Antwort kommt, was sich mit den Ergebnissen anderer Studien deckt. Die Studien zeigten, dass ein spontaner Abort durch eine verminderte Th2-Zytokinproduktion und erhöhte Mengen von Th1 Zytokine charakterisiert war (Haimovici et al. 1991, Piccinni et al. 1998, Raghuphaty et al. 2000, Zenclussen et al. 2003).

In der Transplantationsimmunlogie konnte nachgewiesen werden, dass eine veränderte HO-1 Expression einen Einfluss auf die Th1/Th2-Zytokinproduktion hat. Eine erhöhte Expression an HO-1 führte bei Nierentransplantaten zu einer verminderten Th1 Zytokinproduktion (Tullius et al. 2002). Eine ähnliche Beobachtung konnten auch Woo und Mitarbeiter (2000) im Mausmodell für graft-versus-host-disease (GVHD) machen, wo es nach einer erhöhten HO-1 Produktion zu einer verminderten IFN-γ Produktion kam. Ke und Mitarbeiter (2000) konnten beweisen, dass eine erhöhte Th2-Zytokinproduktion bei Herztransplantationen in Zusammenhang mit einer erhöhten Expression von HO-1 steht.

↓103

Da der Fetus als intrauterines Allotransplantat angesehen wird, kann man vermuten, dass es im Laufe der Schwangerschaft ähnlich wie bei der Akzeptanz von Transplantaten zu einer Interaktion zwischen HO-1 und der Th1/Th2-Zytokinproduktion kommt. So konnten Acevedo und Mitarbeiter (1998) zeigen, dass es im Laufe einer normalen Schwangerschaft, welche mit einer erhöhten Th2-Zytokinproduktion in Verbindung gebracht wird (Lin et al. 1993, Joachim et al. 2002), zu einem signifikanten Anstieg der HO-1 Expression kommt. Bei Schwangerschaftskomplikationen hingegen, welche mit einer erhöhten Th1-Zytokinproduktion assoziiert wird (Lin et al. 1993, Clark et al. 1999), konnte ein signifikanter Rückgang der HO-1 Expression beobachtet werden (Ahmed et al. 2000, Zenclussen et al. 2003).

6.3 In Abortmäusen kommt es in der Plazenta und der Dezidua zu einer verminderten Expression von iNOS und eNOS am Tag 14 der Schwangerschaft 

Verschiedene Autoren postulierten eine Wechselwirkung zwischen dem NOS-System und dem HO-System (White und Marletta 1992, McMillan et al. 1992, Wang et al. 1994, Maines 1997, Datta et al. 2002). Stickstoff scheint besonders zu Beginn der Schwangerschaft eine Rolle zu spielen. Zu diesem Zeitpunkt kommt es durch erhöhte Mengen von NO zu einer Entspannung der glatten Muskulatur und des Myometriums, was eine Implantation der Blastozyste erleichtern sollte (Purcell et al. 1999). Aber auch am Ende der Schwangerschaft scheint NO eine wichtige Rolle zu spielen (Sladek et al. 1997, Purcell et al. 1999, Chwalisz und Garfield 2000). Die Expression von iNOS und eNOS in der Plazenta konnte in verschiedenen Spezies beobachtet werden (Casado et al.1997, Myatt et al. 1997, Purcell et al. 1997, Purcell et al. 1999). Purcell und Mitarbeiter. (1999) konnten innerhalb des Implantationsfensters in der Maus die Expression von iNOS und eNOS beobachten, was vermuten lässt, dass NOS und NO vor und während der Implantation in der Maus eine Rolle spielen. Die Ergebnisse von Gagioti und Mitarbeiter (2000) belegten, dass bei 3,5 Tage alten murinen Blastozysten, aber auch in Blastozysten, die 72 Stunden in Kultur gehalten worden waren, kein iNOS oder eNOS exprimiert wird. Dies würde bedeuten, dass die von Purcell und Mitarbeiter (1999) beobachteten iNOS und eNOS Expression nicht vom Blastozysten selbst ausgeht, sondern durch andere zelluläre Quellen erfolgt. Weiterhin zeigten Purcell und Mitarbeiter, dass iNOS und eNOS in Trophoblasten am Tag 7,5 der Schwangerschaft exprimiert werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass am Tag 14 der Schwangerschaft iNOS und eNOS in allen Zelltypen der Plazenta und der Dezidua exprimiert werden.

Mit Hilfe der immunhistochemischen Analyse konnte jedoch nur eine schwache Färbung gezeigt werden, was auf geringe Protein-Mengen an NOS am 14. Tag der Schwangerschaft hindeutet. Die Ergebnisse decken sich mit den Studien von Casado und Mitarbeiter (1997) und Gagioti und Mitarbeiter (2000). Diese Autoren wiesen in der Plazenta von Ratten nur sehr geringe Mengen an iNOS und eNOS nach. Weiterhin konnten Gagioti und Mitarbeiter (2000) zeigen, das am Tag 7,5 der Mausschwangerschaft die iNOS und eNOS-Expression von Riesenzellen sehr schwach waren, was ebenfalls auf geringe Protein-Mengen von iNOS und eNOS hinweist. Die Untersuchung von iNOS und eNOS in der Plazenta und der Dezidua mittels Western-Blot-Analyse bewies im Rahmen dieser Arbeit, dass es in den Tieren mit einer erhöhten Abortrate zu einer verminderten Expression von iNOS und eNOS kommt. Urban und Mitarbeiter (2001) zeigten, dass in Dezidua- und Trophoblastenzellen von Frauen mit einem spontanen Abort im Vergleich zu Frauen, die die Schwangerschaft künstlich abbrachen, die Expression von iNOS vermindert war. Daraus lässt sich schließen, dass die Expression von iNOS, besonders für den Zeitraum der Implantation, eine wichtige Rolle spielt.

↓104

Ein spontaner Abort beim Menschen beendet meist die Schwangerschaft, da bei der humanen Schwangerschaft im Durchschnitt nur ein Fetus ausgetragen wird. Mäusen hingegen tragen durchschnittlich 6-8 Feten aus. Aufgrund der hohen Anzahl der Feten kommt es nach einem Abort in der Maus nicht zu einem Abbruch der Schwangerschaft. Die Aborte werden von der trächtigen Maus resorbiert und der verblieben gesunden Feten werden ausgetragen.

Man könnte somit postulieren, dass die verminderte Expression von iNOS und eNOS, die am Tag 14 der Schwangerschaft in Abortmäusen beobachtet wurde, bereits während dem Zeitraum der Implantation einen Einfluss auf die Abortrate in den Mäusen haben könnte.

Lyoumi und Mitarbeiter (1998) zeigten, dass die Hemmung von NOS bei akuten Entzündungsreaktionen zu einer Verminderung der HO-1 mRNA in der Leber führt. Die Autoren postulierten, dass in der Leber von Ratten der cGMP-Signalweg die HO-1 mRNA Expression kontrolliert. Ein ähnlicher Zusammenhang konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden, wo es in der Plazenta von Abortmäusen sowohl zu einer Reduktion von iNOS und eNOS als auch zu einer Verminderung der HO-1 und HO-2 Expression kam. Somit könnte in der Plazenta von Abortmäusen, in Anlehnung an die Theorie von Lyoumi und Mitarbeiter (1998), HO durch den cGMP-Signalweg und somit über die Expression von NOS kontrolliert werden.

6.4 Die Behandlung mit Co-PP reguliert HO-1 hoch und führt zu verminderten Abortraten 

↓105

Die bisherigen Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass trächtige CBA/J Mäuse der Abortgruppe (mit DBA/2J verpaart) in der Plazenta signifikant weniger HO-1 und HO-2 exprimieren, als die Kontrollgruppe (siehe 6.1.2) und es wurde postuliert, dass eine erhöhte HO-1 Expression den Feten vor einem Abort schützen könnte.

Bei Nierentransplantationen in der Ratte konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression von HO-1, welche durch eine Behandlung mit Co-PP erreicht wurde, eine frühe inflammatorische Reaktion gegen das Transplantat stark verminderte und so die chronische Abstoßung der Transplantate verhinderte (Tullius et al. 2002). Martins und Mitarbeiter (2005) beschrieben in dem gleichen Transplantationsmodell, dass es in den dendritischen Zellen durch die erhöhte Expression von HO-1 zu einer verringerten Anzahl an CD4+ und CD8+ T-Zellen, aber auch zu einer verminderten Expression von MHC Klasse II Antigenen kommt. In Lebertransplantationen führte die Behandlung mit Co-PP ebenfalls zu einer verbesserten Akzeptanz des Transplantates (Kato et al. 2001, Redaelli et al. 2002). Bei Herztransplantationen in der Ratte konnte gezeigt werden, dass die Expression von HO-1, die durch eine Co-PP Applikation induziert wurde, durch die Zugabe von Zn-PP, einem Inhibtitor von HO-1 und HO-2, wieder reduziert werden konnte (Katori et al. 2002). Dies führte zu einer verminderten Akzeptanz des Transplantates. Tullius und Mitarbeiter (2002) beschrieben ebenfalls nach der Behandlung mit Zn-PP eine verminderte HO-1 Expression in Mäusen mit Nierentransplantaten.

Um zu untersuchen, ob eine Behandlung mit Co-PP oder Zn-PP einen ähnlich schützenden bzw. negativen Effekt auf die Abortrate hat wie auf Transplantate, wurde das murine Abortmodell verwendet.

↓106

Die immunhistochemische Analyse (IHC) zeigte, dass HO-1 und interessanterweise auch HO-2 in den Trophoblastenzellen der Co-PP behandelten Tiere signifikant hochreguliert waren. Co-PP wurde bisher nur als Induktor von HO-1 beschrieben (Kato et al. 2001, Redaelli et al. 2002, Tullius et al. 2002), sodass keine erhöhte Expression von HO-2 zu erwarten war, da HO-2 konstitutiv exprimiert wird. Zenclussen und Mitarbeiter (2002 und 2003) beobachteten in der Plazenta von schwangeren Frauen mit spontanem Abort und in Mäusen mit einem Th1 induzierten oder durch Stress ausgelösten Abort verringerte Mengen an HO-2. Die Daten dieser Arbeit lassen vermuten, dass HO-2 in der Plazenta nicht nur konstitutiv exprimiert wird, was auf eine schützende Funktion dieses Moleküls an der feto-maternalen Grenze hindeuten könnte. Weiterhin zeigte die IHC Analyse, dass es in der Dezidua zu keiner veränderten Expression von HO-1 und HO-2 nach der Behandlung mit Co-PP kommt. Dies lässt vermuten, dass die Dezidua beim Häm-Metabolismus an der feto-maternalen Grenze und bei der Ausbildung eines Abortes keine Rolle spielt. Die Western-Blot-Analyse zeigte ebenfalls, dass die Behandlung von Abortmäusen mit Co-PP in der Plazenta zu einer signifikant erhöhten Expression von HO-1 und HO-2 führt. Bei der RT-PCR Analyse hingegen konnten keine signifikanten Unterschiede in der HO-1 mRNA zwischen den einzelnen Gruppen beobachtet werden.

Die Behandlung mit Co-PP führte zu einem signifikanten Rückgang der Abortrate im Vergleich zu der Abortkontrollgruppe. Aufgrund der bisherigen Daten, kann der Rückgang der Abortrate in dieser Gruppe direkt auf eine erhöhte Expression von HO-1 und HO-2 zurückgeführt werden.

Ähnliche Beobachtungen konnten in einem anderen experimentellen Ansatz unserer Arbeitsgruppe gemacht werden, indem die Behandlung von Abortmäusen mit dem Adenovirus AdHO-1/GFP zu einer signifikanten Reduktion der Abortrate führte.

↓107

Dies bestätigt, dass die HO-1 Hochregulation den Fetus vor einem spontanen Abort schützen kann.

Die Behandlung mit Zn-PP, einem HO-1 und HO-2 Hemmer, führte zu einer stark erhöhten Abortrate. Somit konnte in dieser Arbeit abermals gezeigt werden, dass eine verringerte Expression von HO-1 nicht mit einer erfolgreichen Schwangerschaft in Verbindung gebracht werden kann. Anders als durch die Hypothese erwartet, konnte man jedoch am Tag 14 der Schwangerschaft in den Zn-PP behandelten Tieren im Vergleich zu der normalen Abortgruppe, keine reduzierten Mengen an HO-1 und HO-2 beobachten. Im Gegenteil, sowohl die immunhistochemische Analyse als auch die Western-Blot Analyse zeigten in der Plazenta erhöhte Mengen an HO-1 und HO-2.

Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtungen erbrachten Rodgers und Mitarbeiter (1996). Die Autoren beschrieben, dass die Hemmung der HO-Aktivität durch eine Zn-PP- Behandlung in neugeborenen Ratten nur 1-4 Tage anhielt und anschließend wieder anstieg.

↓108

Das untersuchte plazentale Gewebe stammte vom Tag 14 der Schwangerschaft, d.h. 10 Tage nach der Zn-PP-Behandlung. Die erhöhten Mengen an HO-1 und HO-2 am 14ten Tag der Schwangerschaft könnten dadurch erklärt werden, dass das Immunsystem der Tiere nach Ablauf der Wirkung von Zn-PP begann, die negativen Effekte der Zn-PP-Behandlung mit einer Erhöhung der HO-Expression wieder zu neutralisieren.

Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden einige der behandelten Tiere bereits am Tag 8 der Schwangerschaft, also 4 Tage nach der Behandlung mit Zn-PP, getötet und in der Plazenta die HO-1 Expression untersucht.

Am Tag 8 der Schwangerschaft ist die Entwicklung der Plazenta noch nicht vollständig abgeschlossen und unterscheidet sich daher morphologisch von einer Plazenta am Tag 14. Die Immunhistochemische Analyse des plazentalen Gewebes vom Tag 8 der Schwangerschaft ergab keine HO-1 Expression in dem Gewebe. Da jedoch verschiedene Autoren im Laufe der gesamten Schwangerschaft eine Expression von HO-1 und HO-2 beschrieben haben (Ihara et al. 1998, Odrcich et al. 1998 Lyall et al. 2000), deutet das Ergebnis eher auf technische Probleme hin, als das bei den Tieren kein HO exprimiert wird. Bei der Western-Blot Analyse konnte man ebenfalls aufgrund technischer Probleme kein HO nachweisen, daher konnte die Expression von HO-1 am Tag 8 der Schwangerschaft nur durch eine mRNA Analyse untersucht werden.

↓109

Die mRNA Analyse von HO-1 in plazentalem Gewebe vom Tag 8 der Schwangerschaft, also 4 Tage nach der Behandlung mit Co-PP bzw. Zn-PP, zeigte leicht verminderte, aber nicht statistisch signifikante Mengen an HO-1 mRNA in den Tieren, die mit ZnPP behandelt wurden im Vergleich zu der Abortkontrollgruppe. Die Menge an HO-1 mRNA in den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden, ist dagegen erhöht.

Die Menge an HO-1 mRNA am Tag 8 der Schwangerschaft war zwar nicht signifikant reduziert, dennoch bestätigen diese Daten die aufgestellte Hypothese. Nach dem Abklingen der Hemmung von HO-1 und HO-2, induziert durch eine Behandlung mit Zn-PP, versucht das Immunsystem der Tiere durch eine erhöhte Expression von HO den negativen Effekten der Behandlung entgegenzuwirken.

Die Analyse der HO-1 und HO-2 Expression lässt somit die Schlussfolgerung zu, dass zum einen eine erhöhte Expression von HO im Laufe der Schwangerschaft den Fetus vor einem spontanen Abort schützt und zum anderen, dass reduzierte Mengen von HO schädlich für das Überleben des Feten sind und einen spontanen Abort fördern. Im Folgenden werden mögliche Mechanismen anhand von Ergebnissen diskutiert.

6.4.1  Der therapeutische Effekt von Co-PP scheint nicht durch eine Veränderung der Th1/Th2/Th3 Antwort induziert zu werden 

↓110

Wie bereits gezeigt werden konnte, ist der spontane Abort, welcher in der Plazenta durch eine stark verminderte HO-1 Expression am Tag 14 der Schwangerschaft gekennzeichnet ist, durch eine erhöhte TNF-α/ΙL−10 Ratio charakterisiert (siehe 6.1.1).

Weiterhin wurde beschrieben, dass eine Behandlung mit Co-PP zu einer erhöhten Expression von HO-1 und zu einer verminderten Abortrate führt. Es ist bisher jedoch unklar, wie sich die Behandlung von Abortmäusen mit Co-PP auf die Th1 und Th2-Zytokinproduktion auswirkt.

Die Analyse der Th1/Th2 Ratio zeigte diesmal jedoch keine signifikanten Unterschiede in der TNF-α/ΙL−10 Ratio zwischen der Abortgruppe und der normalen Schwangerschaftsgruppe, sondern nur die Tendenz einer verminderten Ratio. Dies könnte auf die kleinere Anzahl an Proben zurückzuführen sein, die mittels Durchflusszytometrie untersucht wurden.

↓111

Um zu untersuchen, ob der durch die CO-PP-Behandlung induzierte HO-1 vermittelte Schutz einen Einfluss auf die Immunantwort hat, wurden nach der Stimulation mit PMA und Ionomycin in den Lymphozyten der Milz und der Dezidua die Th1 Zytokine INF-γ und TNF-α, die Th2 Zytokine IL-4 und IL-10 untersucht.

Interessanterweise zeigte die Analyse der Daten, dass die Behandlung von Abortmäusen mit Co-PP im Vergleich mit der Abortkontrollgruppe oder der normal-schwangeren Gruppe zu keiner veränderten Th2-Zytokinproduktion führt. Die verminderte Abortrate in den Mäusen, die mit Co-PP behandelt wurden, kann durch eine HO-1 induzierte Th2 Antwort erklärt werden.

Die Untersuchung der Th1-Zytokinproduktion ergab ebenfalls keine Unterschiede in den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden im Vergleich zu normal-schwangeren Mäusen oder PBS-behandelten Abortmäusen. Die Analyse der TNF-α mRNA mittels RT-PCR zeigte, dass in den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden, eine erhöhte Menge an TNF-α mRNA sowohl am Tag 8 als auch am Tag 14 der Schwangerschaft im Vergleich zu den Kontrollgruppen nachgewiesen werden konnte. Die Daten dieser Arbeit stehen somit im Gegensatz zu den von Tullius und Mitarbeiter (2002) beschriebenen Beobachtungen, dass es nach der Behandlung mit Co-PP bei Mäusen mit Nierentransplantaten zu einem Rückgang der TNF-α Produktion kommt. Die Daten deuten darauf hin, dass die Behandlung mit Co-PP in dem Pre-implantationsfensterzwar zu einer erhöhten Expression von HO-1 führt, aber nicht zu einer verminderten Th1/Th2 Zytokinproduktion. In einer Studie von M. Zenclussen und Mitarbeiter (2006) konnte nachgewiesen werden, dass CBA/J Weibchen, die nach einer Verpaarung mit DBA/2J Männchen mit dem Adenoviruskonstrukt AdHO-1/GFP behandelt wurden, reduzierten Abortraten aufweisen. Die Autoren zeigten weiterhin, dass die HO-1 Hochregulation zu einer erhöhten Th2-Zytokinproduktion in der Milz und in der Dezidua führt. Die Ergebnisse dieser Arbeit stehen somit im Gegensatz zu denen von M. Zenclussen und Mitarbeiter (2006). Eine Erklärung für die unterschiedliche Th2-Zytokinproduktion könnte die Art der HO-1 Induktion darstellen. Bei der HO-1 Gentherapie (M. Zenclussen et al. 2006) kommt es ausschließlich zu einer HO-1 Induktion. Somit kann nur die veränderte HO-1 Expression einen Einfluss auf die Zytokinproduktion nehmen. Bei der Co-PP-Applikation handelt es sich um eine therapeutische Behandlung, bei der neben HO-1 auch andere Moleküle beeinflusst werden. Daher ist davon auszugehen, dass auch andere Moleküle aktiviert oder gehemmt werden, die einen Einfluss auf die Zytokinproduktion haben.

↓112

Eine weitere Möglichkeit, wie eine erhöhte HO-1 Expression Einfluss auf das Immunsystem der trächtigen Tiere nehmen könnte, wären die Th3-Zytokine, z.B. TGF- β. Die Analyse von TGF-β erfolgte ausschließlich mittels RT-PCR. Die mRNA Analyse von TGF-β zeigte, dass am Tag 14 der Schwangerschaft die mit Co-PP behandelten Tiere keine Unterschiede in der TGF-β mRNA Menge im Vergleich zu den Kontrollgruppen aufwiesen. Daher ist zu vermuten, dass TGF-β auf die verminderte Abortrate keinen Einfluss hat. Die Regulation von TGF-β erfolgt jedoch auch posttranskriptional, z.B. durch Steroide (Kim et al. 1994), wodurch aufgrund der vorhandenen Daten nicht ausgeschlossen werden kann, dass TGF-β doch einen Einfluss auf die Abortrate hat. Darüber hinaus zeigten Dunker und Krieglstein (2002), dass TGF-β für das Überleben der Embryonen absolut notwendig ist. 

Somit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass es trotz einer erhöhten Th1-Zytokinproduktion zu einer verminderten Abortrate kommt, was gegen das starre Th1/Th2 Paradigma spricht.

Die Behandlung von Abortmäusen mit Zn-PP führte zu hohen Abortraten. Interessanterweise konnte man aber in diesen Tieren in der Milz und in der Dezidua eine verminderte Menge an IFN-γ und TNF-α beobachten. Auch die Analyse der TNF-α/IL-10 Ratio zeigte einen Rückgang der Ratio in den Tieren, die mit Zn-PP behandelt wurden. Bates (2002) beschrieb zwar im Zusammenhang mit habituellen Aborten bei Frauen eine verminderte IFN-γ–Produktion, doch konnte er, anders als in dieser Arbeit, erhöhte Mengen an Th2-Zytokinen beobachten. Die Ergebnisse dieser Arbeit stehen somit im Widerspruch zu den meisten anderen Studien, die bei spontanen Aborten erhöhte Mengen von Th1-Zytokine oder ein Ungleichgewicht der Th1/Th2 Ratio beobachten konnten (Lin et al. 1993, Wegmann 1993).

↓113

Die Studien von Rodgers und Mitarbeiter (1996) belegen, das die Wirkung von Zn-PP nach der Behandlung in der Leber von neugeborenen Ratten 1-4 Tage anhält, somit könnte die am Tag 14 der Schwangerschaft beobachtete Immunantwort eine indirekte Folge der Zn-PP Behandlung sein, ähnlich wie es bereits im Zusammenhang mit der leicht erhöhten HO-1 Expression in den Abortmäusen, die mit Zn-PP behandelt wurden (siehe 6.1.4), postuliert wurde. Die verminderte Expression von Th1-Zytokinen könnte eine Reaktion des Immunsystems der Mäuse auf die Zn-PP-Behandlung sein, um so den negativen Auswirkungen der Applikation entgegenzuwirken. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde die Th1/Th2-Zytokinproduktion am Tag 8 der Schwangerschaft, also 4 Tage nach der Behandlung mit Zn-PP, analysiert.

Die TNF-α und INF-γ Mengen in der Milz der Tiere, die mit Zn-PP behandelt wurden, zeigten am Tag 8 der Schwangerschaft keinen Unterschied zu den Kontrollmäusen. Die Analyse der TNF-α/IL-10 Ratio zeigte am Tag 8 der Schwangerschaft eine Tendenz zu einer verringerten Th1/Th2-Ratio in den Tieren, die mit Zn-PP behandelt wurden. Die Analyse der TNF-α mRNA mittels RT-PCR zeigte am Tag 8 der Schwangerschaft ebenfalls reduzierte mRNA Mengen an TNF-α in den Tieren, die mit Zn-PP behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass das Immunsystem der Mäuse sehr schnell auf die Zn-PP Applikation reagiert.

Eine Analyse des Th3-Zytokins TGF-β zeigte am Tag 14 der Schwangerschaft einen signifikanten Anstieg der TGF-β mRNA in den Tieren, die mit Zn-PP behandelt wurden. Man könnte somit auch hier vermuten, dass das Immunsystem der Maus auf die Behandlung mit Zn-PP reagiert und dessen negative Effekte mittels erhöhter Mengen an TGF-β mRNA neutralisiert. Da TGF-β aber hauptsächlich posttranskriptional reguliert wird, ist eine genaue Aussage über die Funktion von TGF-β nicht möglich und es sollte eine Analyse der TGF-β Proteinexpression folgen.

↓114

Die Daten zeigen, dass es trotz erhöhter Abortraten zu einer erhöhten Th2-Zytokinproduktion kommen kann, was dem Th1/Th2/Th3 Paradigma widerspricht.

Die Ergebnisse der Arbeit lassen zudem vermuten, dass bei einer Co-PP Applikation andere Faktoren als HO-1 einen Einfluss auf die Th1/Th2-Ratio haben und dass die verminderte Abortrate in diesen Tieren nicht mit den Veränderungen der Th1/Th2/Th3-Zytokinproduktion zusammenhängt.

6.4.2 Eine erhöhte HO-1 Expression nimmt keinen Einfluss auf CD4+CD25+ Zellen

Einen wichtigen Toleranz-Mechanismus in der Transplantationsimmunologie und auch während der Schwangerschaft stellen die regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) dar (Zenclussen 2006). Die CD4+CD25+ Treg-Zellen spielen bei der Unterdrückung einer Immunantwort gegenüber Fremdantigenen und bei der Erhaltung der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen eine zentrale Rolle. Sie sind daher in der Lage, immunpathologische Antworten, wie sie bei Autoimmunkrankheiten oder Allergien auftreten, zu hemmen und sind an der Akzeptanz von Transplantaten beteiligt (Maloy und Powrie 2001, Wood und Sakaguchi 2003). 

↓115

Die Wirkung der Treg-Zellen wird normalerweise zum einen über einen direkten Zell-Zell-kontakt und zum anderen durch die Produktion löslicher Mediatoren vermittelt (Maloy und Powrie 2001, Kingsley et al. 2002), wobei die genauen zugrunde liegenden Mechanismen immer noch nicht geklärt sind.

In dem murinen Abortmodell konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Treg-Zellen in den Abortmäusen im Vergleich zu normal-trächtigen Mäusen signifikant reduziert ist (Zenclussen et al. 2005). Weiterhin konnten die Autoren zeigen, dass der Transfer von CD4+CD25+ Zellen aus schwangeren CBA/J, die mit BALB/c Männchen verpaart wurden, in der Lage war, die Abortrate signifikant zu reduzieren. Zenclussen und Mitarbeiter (2006) zeigten weiterhin, dass es bei einem Transfer von Treg-Zellen in schwangeren Abortmäusen zu einem Anstieg an HO-1 und TGF-β in diesen Tieren kam. Die Autoren postulierten daher, dass die Treg-Zellen an der feto-maternalen Grenze eine Art tolerantes Mikromilieu schaffen, was sich positiv auf den Schwangerschaftsverlauf auswirkt. Eine weitere Studie dieser Arbeitsgruppe (Zenclussen et al. 2006) konnte nachweisen, dass die Treg-Zellen bereits sehr früh nach der Befruchtung im Bereich der Vagina generiert werden und dass die Treg-Zellen zu ihrer Aktivierung männliche Antigene benötigen.

Die Analyse der Lymphozyten aus der Milz und der Dezidua ergab im Rahmen dieser Arbeit sowohl am Tag 8 als auch am Tag 14 der Schwangerschaft keinen Unterschied in der Anzahl von CD4+CD25+ Zellen in den Tieren, die mit Co-PP bzw. Zn-PP behandelt wurden, im Vergleich zu den beiden Kontrollgruppen. Dies würde bedeuten, dass die HO-1 Expression keinen Einfluss auf die Anzahl von Treg-Zellen hat, was jedoch im Widerspruch zu anderen Studien steht, die den Einfluss der HO-1 Expression auf Treg-Zellen untersucht haben.

↓116

So beobachteten Yamashita und Mitarbeiter (2006), dass es nach Herztransplantationen, bei denen die Expression von HO-1 erhöht wurde, zu einer erhöhten Expression des Treg-Marker Foxp3, aber auch von TGF-β und CTLA4 kam, was darauf hindeutet, dass Treg-Zellen bei der verbesserten Akzeptanz des Transplantates eine Rolle spielen.

Choi et al. (2005) hingegen zeigte, dass Foxp3 (engl.: forkhead box P3) ein Marker für Treg-Zellen, dessen Expression mit der Aktivität der T-regulatorischen Zellen verbunden ist (Brunkow et al. 2001, Fontenot et al. 2003, Khattri et al. 2003), in der Lage sei, HO-1 zu induzieren, was bedeuten würde, dass die Treg-Zellen die HO-1 Expression induzieren, was im Gegensatz zu der Studie von Yamashita und Mitarbeiter (2006) steht.

Mitarbeiter der Arbeitsgruppe von PD Dr. Zenclussen konnten zeigen, dass es in der Plazenta von Abortmäusen, welche mit Co-PP behandelt wurden, zu einem signifikanten Anstieg der Neuropilin-1 mRNA kam, wenn man diese mit der mRNA in den Kontrollgruppen verglich. Abortmäuse, die mit Zn-PP behandelt wurden, zeigten keine Veränderungen der Neurophilin-1 mRNA Menge im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Die erhöhten Mengen an Neuropilin-1 in der Plazenta von Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden, lassen vermuten, dass es in der Plazenta dieser Tiere zu einer vermehrten Ansammlung von Treg-Zellen kommt.

↓117

Es ist daher anzunehmen, dass die am Tag 8 und 14 der Schwangerschaft gemessene CD4+CD25+-Lymphozytenpopulation hauptsächlich aus aktivierten Zellen besteht und dass daher keine Unterschiede in der Anzahl der CD4+CD25+-Zellen zwischen den Co-PP und Zn-PP behandelten Gruppen und den Kontrollgruppen beobachtet werden konnten.

6.4.3 Die iNOS und eNOS Expression am Tag 14 der Schwangerschaft weist keine Interaktion mit dem HO-System auf 

Ramsay und Mitarbeiter (1996) beschrieben, dass die Aktivität von NOS und somit die Menge an NO besonders im ersten Trimester der humanen Schwangerschaft eine Rolle spielt. Sladek und Mitarbeiter (1997) und Chwalisz und Garfield (2000) konnten zeigen, dass NO eine wichtige Funktion bei der Ovulation und Implantation übernimmt und somit eine vermehrte Aktivität von NOS zu diesem Zeitpunkt notwendig ist.

Maines (1997) beschrieb, dass es aufgrund des Häms, welches für die Synthese von NOS benötigt wird, einen Zusammenhang zwischen dem HO-System und dem NOS-System besteht. Die Daten der HO-1 und HO-2 Expression, die im Rahmen dieser Arbeit gezeigt wurden, lassen unter anderem vermuten, dass HO besonders zu Beginn der Schwangerschaft eine wichtige Rolle spielt, da eine Hochregulation von HO-1 mittels Co-PP zu diesem Zeitpunkt zu verminderten Abortraten führt.

↓118

In dieser Arbeit konnte bisher gezeigt werden, dass Abortmäusen, in denen man eine verringerte Expression von HO-1 und HO-2 im Vergleich zu normal-schwangeren Mäusen beobachten konnte, ebenfalls eine verringerte Expression von iNOS und eNOS aufwiesen.

Purcell und Mitarbeiter (1999) konnten ebenfalls bei der Maus zu Beginn der Schwangerschaft die Expression von iNOS und eNOS beobachten.

Diese Fakten ließen vermuten, dass eine erhöhte Expression von HO-1 ebenfalls zu einer vermehrten Aktivität des NOS-Systems führen sollte.

↓119

Die Expression von iNOS und eNOS konnte in der humanen Plazenta in den Trophoblasten nachgewiesen werden (Myatt et al. 1997). Nelson und Mitarbeiter (2000) konnten zeigen, dass erhöhte Mengen an eNOS mit einer erfolgreichen Schwangerschaft in Verbindung gebracht werden können und führten dies auf eine erhöhte Expression in den humanen Arterien des Uterus zurück. Die immunhistochemische Analyse dieser Arbeit zeigte in den Riesenzellen der Plazenta und in der Dezidua eine erhöhte iNOS und eNOS Expression in den Tieren, die mittels einer Co-PP-Behandlung vor einem Abort geschützt waren im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Produktion von iNOS und eNOS, induziert durch eine erhöhte Expression von HO-1, sich auf die Dezidua und die äußeren Bereiche der Plazenta konzentriert, um dort mittels der Freisetzung von NO die Blutgefäße zu erweitern, um so die Feten vor einem Abort zu schützen.

Die IHC-Daten konnten aber weder durch die Western-Blot Analyse, noch durch die Bestimmung der mRNA von iNOS und eNOS am Tag 8 und 14 der Schwangerschaft bestätigt werden. Beide Untersuchungsmethoden zeigten keine wesentlichen Unterschiede in der Proteinexpression bzw. der mRNA Menge zwischen den Tieren, die mit Co-PP bzw. Zn-PP behandelt wurden und den Kontrollgruppen.

Die unterschiedlichen Daten können dadurch erklärt werden, dass bei der IHC die erhöhte Expression von eNOS und iNOS in der Plazenta auf die Riesenzellen und die Dezidua beschränkt ist, beim Western-Blot und bei der RT-PCR aber die gesamte Plazenta untersucht wird.

↓120

Haddad und Mitarbeiter (1995) beschrieben ebenfalls eine spezifische iNOS Expression in Makrophagen der Dezidua und postulierten daher, dass diese Makrophagen der Dezidua für die NO Produktion am Ort der Implantation verantwortlich sind.

Die Daten würden somit darauf hindeuten, dass die Expression von iNOS und eNOS nicht durch eine veränderte Expression von HO-1 am Tag 14 der Schwangerschaft beeinflusst wird.

Im Laufe der Schwangerschaft wurde NO besonders im Zeitraum der Preimplantation und Implantation eine wichtige Funktion zugeschrieben (Gagioti et al. 2000, Nishikimi et al. 2001, Tranguch et al. 2003). Die Induktion der HO-1 Expression erfolgte am Tag 4 der Schwangerschaft, also während der Implantationsphase, so dass die Wechselwirkung zwischen dem NOS-System und HO-1 genau zu diesem Zeitpunkt erfolgt sein kann und daher am Tag 14 der Schwangerschaft keine Unterschiede mehr in der Expression erkennbar sind.

6.4.4 Die erhöhte Expression von HO-1 führt am Tag 14 der Schwangerschaft zu einer verminderten Apoptose und zu einem Anstieg der Expression anti-apoptotischer Moleküle

↓121

Die Apoptose spielt im Laufe der Schwangerschaft sowohl bei dem Aufbau bzw. der Neuordnung der Plazenta, aber auch bei der Entwicklung des Embryos, der sich im Laufe der Schwangerschaft ständig verändert, eine wichtige Rolle (Smith et al. 1997, Axt et al. 1999, Chan et al. 1999, Brill et al. 1999, Torry et al. 2003). HO-1 wurden sowohl anti-apoptotische als auch gewebsschützende Funktionen nachgesagt. Daher könnte die Apoptose ein weiterer Mechanismus sein, mit dessen Hilfe das HO-System den Feten vor einem Abort schützt

So zeigten Soares und Mitarbeiter (1998), dass eine erhöhte Expression an HO-1 Endothelzellen vor einer TNF-α induzierten Apoptose schützt. Aber auch HO-2 scheint anti-apoptotische Eigenschaften aufzuweisen, denn Basuroy und Mitarbeiter. (2006) zeigten erst kürzlich, dass HO-2 das kardiovaskuläre Endothelium vor einer TNF-α induzierten Apoptose bzw. einer Apoptose, die durch oxdiativen Stress induziert wurde, schützt. Es ist aber bisher nicht genau geklärt, wie HO das Gewebe vor Apoptose schützt. Jedoch scheint CO, was beim Abbau von Häme freigesetzt wird, hierbei eine wichtige Rolle übernimmt. So beschrieben Liu und Mitarbeiter (2002), dass CO die Freisetzung von Cytochrom c hemmt, wodurch die Aktivierung der Caspasenkaskade und NFκ-B blockiert wird, was die Zellen vor Apoptose schützt (Brouard et al. 2000/2002).

Die verminderten Abortraten, die man in den Tieren, die mit Co-PP behandelt wurden, beobachten konnte, könnten somit unter anderem durch eine verminderte Apoptosesrate zu erklären sein, die möglicherweise durch die erhöhte Expression von HO-1 ausgelöst wurde.

↓122

Um den möglichen Einfluss einer erhöhten HO-1 Expression, die durch eine Co-PP Applikation induziert wurde, auf die Apoptose zu untersuchen, wurde zum einen die Caspase-3-Aktivität bestimmt und zum anderen die Anzahl an apoptotischen Zellen ermittelt.

Die Untersuchung der Capsase-3-Aktivität erfolgte durch einen Mitarbeiter der Arbeitsgruppe. Es konnte ein leichter Rückgang der Caspase-3-Aktivität in den Tieren, die eine erhöhte HO-1 Expression zeigten, festgestellt werden. Sass und Mitarbeiter (2003) hingegen zeigten, dass die Hemmung der Caspase-3-Aktivität durch eine erhöhte Expression von HO-1 zu verminderten Leberschäden, welche durch Apoptose induziert wurden, führte.

Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte einen leichten, aber nicht signifikanten Rückgang in der Anzahl an apoptotischen Zellen in der Plazenta der Tiere, die durch eine erhöhte Expression von HO-1 vor einem Abort geschützt wurden im Vergleich zu den Kontrollgruppen. Die Behandlung mit Zn-PP hatte keinen Einfluss auf die Anzahl apoptotischer Zellen.

↓123

Unsere Daten deuten darauf hin, dass der HO-1 vermittelte Schutz durch eine verminderte Apoptosesrate in diesen Tieren erklärt werden kann.

Ähnliche Ergebnisse wurden von M. Zenclussen und Mitarbeiter (2006) erhoben. Die Autoren konnten zeigen, dass die Anzahl an apoptotischen Zellen in Abortmäusen, die nach einer Behandlung mit AdHO-1/GFP eine verminderte Abortrate aufwiesen, im Vergleich zu den Kontrollgruppen signifikant reduziert war.

Der Rückgang der apoptotischen Zellen war in dieser Arbeit im Gegensatz zu der Studie von M. Zenclussen und Mitarbeiter (2006) nicht signifikant, was auf die unterschiedliche Art der Behandlung zurückzuführen sein dürfte, da die Applikation von Co-PP, anders als bei der Gentheraphie mit HO-1, noch andere Signalwege aktivieren kann, die einen Einfluss auf die Apoptose nehmen könnten

↓124

Die Vorgänge im Verlauf der Apoptose werden unter anderem durch Mitglieder der Bcl2-Molekülfamilie moduliert, die man aufgrund ihrer Wirkung in pro- und anti-apoptotische Proteine unterteilt. Zu den pro-apoptotischen Molekülen gehören u.a. Bax, Bak, Bid, Bad. Zu den anti-apoptotischen Molekülen gehören u.a. Bcl-2, Bcl-xl, Bag-1. Ihre Funktion liegt in der Hemmung der Freisetzung von pro-apoptotischen Molekülen wie Cytochrom-c und in der Blockade der Aktivierung der Pro-Caspase 9.

Bag-1 wurde zuerst als ein Interaktionspartner des anti-apoptotischen Proteins Bcl-2 beschrieben und zählt heute zu der Bcl-2 Proteinfamilie (Takayama et al. 1995). Es wurde nachgewiesen, dass Bag-1 mit einer Vielzahl von Molekülen, wie Hitzeschockproteinen, Hormonrezeptoren, Signalmolekülen sowie auch mit Bcl-2, interagiert (Townsend et al. 2005). Schulz und Mitarbeiter (1997) zeigten, dass Bag-1 in der Lage war, die Caspase-Aktivität zu blockieren und dass diese Blockierung durch die Expression von Bcl-2 noch verstärkt wurde.

Mitarbeiter der Arbeitsgruppe konnten zeigen, dass es nach der Behandlung von Abortmäusen mit Co-PP im Vergleich zu den Kontrollgruppen in der Plazenta zu einem Anstieg der Bag-1 mRNA kommt.

↓125

Ähnliche Beobachtungen konnten nach einer HO-1 Induktion mittels Gentherapie in Abortmäusen gemacht werden, die zu einem signifikanten Anstieg der Bag-1 mRNA Menge führte (Zenclussen et al. 2006). Bei Lebertransplantaten konnten Coito und Mitarbeiter (2002) zeigen, dass eine erhöhte Expression von HO-1, induziert mittels Gentherapie, zu einer erhöhten Expression von Bag-1 führt.

Diese Daten lassen vermuten, dass eine erhöhte HO-1 Expression einen direkten Einfluss auf die Bag-1 Expression hat und dass die erhöhte Bag-1 Expression durch eine Reduktion der apoptotischen Zellen den Feten vor einem Abort schützt.

6.5 Zusammenfassung der HO-1 Daten beim Spontanabort

Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass das Häme-degradierende Enzym HO bei der spontanen Fehlgeburt eine wichtige Rolle übernimmt. Es wurde gezeigt, dass in Abortmäusen im Vergleich zu normal-trächtigen Mäusen, die HO-1 Expression signifikant reduziert ist. Die Hochregulation von HO-1 mittels einer Co-PP Applikation konnte den Feten vor einer immunologischen Abstoßung schützen. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass Zn-PP, ein HO-1 und HO-2 Hemmer die Abortrate hochreguliert, was erstmalig zeigt, dass eine verminderte HO-1 und HO-2 Expression nicht mit einer erfolgreichen Schwangerschaft vereinbar ist.

↓126

Entgegen unseren Erwartungen wurde der HO-1 induzierte Schutz vor einem Abort nicht durch eine veränderte Th1/Th2 Antwort hervorgerufen. Eine Interaktion zwischen dem des HO-Systems und dem NOS-Systems konnte nicht nachgewiesen werden.

Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es in Mäusen, die durch eine erhöhte Expression von HO-1 vor einem Abort geschützt sind, es zu einer verminderten Anzahl an apoptotischen Zellen kommt, wobei die Verminderung der apoptotischen Zellen auf eine erhöhte Expression von Bag-1, welches als Zytoprotektives Molekül fungiert, zurückzuführen ist.

6.6 Das HO-System in einem Mausmodell für Präeklampsie

6.6.1  Der Transfer von aktivierten Th1-Zellen führte zu Präeklampsie-ähnlichen Symptomen

Die Präeklampsie ist eine späte Schwangerschaftskomplikation, die bei etwa 10% aller Schwangerschaften auftritt (Robillard 2002, Klockenbusch 2005). Die Pathologie der Präeklampsie ist definiert als eine Gestationshypertonie in Verbindung mit einer Proteinurie im 24-Stunden Urin (> 0,3g Eiweiß). Um die mögliche Rolle von HO in der Präeklampsie zu untersuchen, wurde auf ein Mausmodell für Präeklampsie zurückgegriffen, welches von Zenclussen und Mitarbeiter (2004) zuerst beschrieben wurde.

↓127

In diesem Modell verursacht der Transfer von aktivierten Th1 Zellen in C57BL/6-verpaarte schwangere BALB/c Mäuse Präeklampsie-ähnliche Symptome, wie erhöhte Blutdruckwerte, Proteinurie und auch Schädigungen der Niere. Die Autoren zeigten, dass nicht-schwangere Mäuse, die mit aktivierten Th1-Zellen behandelt wurden, keine Präeklampsie-ähnlichen Symptome entwickelten, was darauf hindeutet, dass die Behandlung schwangerschaftsspezifisch ist und sich nur auf trächtige Mäuse auswirkt. Bei der Durchführung des Tierversuches konnte man im Rahmen dieser Doktorarbeit eine signifikante Erhöhung des Blutdruckes in den Tieren beobachten, die am Tag 10 und 12 der Schwangerschaft mit aktivierten Th1-Zellen behandelt wurden.

Zenclussen und Mitarbeiter (2004) zeigten, dass der Transfer von Th1 Zellen einen maximalen Blutdruck von 217 mmHg auslöst. Der maximale Blutdruck im Rahmen dieser Arbeit lag jedoch nur bei 149 mmHg. Der Blutdruck bei den normal-schwangeren Mäusen war hingegen vergleichbar mit den bereits publizierten Daten und lag während der gesamten Schwangerschaft um 120 mmHg.

Die unterschiedlich maximalen Blutdruckwerte zwischen den beiden Versuchen könnten auf veränderte Versuchsbedingungen zurückzuführen sein. Beide Versuche wurden in der gleichen Tierhaltung durchgeführt, aber zwischen den beiden Versuchen wechselte in der Tierhaltung das Futter von pelletiertem Futter zu extrodiertem Futter und die Streu der Käfige von der 8-15 Streu zur FS-14 Streu (Firma Sniff). Zu Beginn des Versuches wurde das Blutdruckmessgerät erneut kalibriert, sodass auch dies eine mögliche Quelle für die unterschiedlich maximalen Blutdruckwerte sein könnte.

↓128

Histologische Untersuchungen der Niere und der Plazenta zeigten massive Einblutungen in beiden Geweben. In der Niere kam es darüber hinaus zur histologischen Deorganisation in den Glomerulie und zur Lymphozyteninfiltration. Die histologischen Veränderungen der Gewebe und die erhöhten Blutdruckwerte zeigten, dass der Transfer der aktivierten Th1-Zellen bei den Mäusen Präeklampsie-ähnliche Symptome auslöste. Die hohen Abortraten, die man sowohl in den normal-schwangeren Mäusen als auch in den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen beobachten kann, weisen keinen immunologischen Hintergrund auf, da die beobachteten Abortereignisse bereits zwischen dem 7. und 8. Tag der Schwangerschaft auftraten, also bereits vor der Th1-Zellinjektion. Die beobachteten Aborte sollten vielmehr die Folge von Stress sein, der Aufgrund der Blutdruckmessung ausgelöst wurde, da diese jeden zweiten Tag erfolgte. 

6.6.2 Die Hämoxygenase scheint bei den Präeklampsie-ähnlichen Symptomen im Mausmodell keine Rolle zu spielen.

Beim Abbau des Häms durch HO-1 entsteht CO, was eine Erweiterung der Blutgefäße induziert, und Biliverdin, welches als ein endogenes Antioxidanz wirkt und die Gefäße und Fettsäuren vor Oxidation schützt (Maines 1997). Aufgrund dieser Abbauprodukte des Häm-Metabolismus kann man eine Rolle von HO-1 während der Präeklampsie postulieren.

Die Rolle von HO-1 und HO-2 ist jedoch bei der Präeklampsie im Gegensatz zum spontanen Abort relativ umstritten.

↓129

Ahmed und Mitarbeiter (2000) beschrieben signifikant reduzierte Mengen an HO-1 in der Plazenta von Patientinnen mit Präeklampsie im Vergleich zu normal-schwangeren Frauen im gleichen Schwangerschaftsmonat.

Im Synzytiotrophoblasten sowie in invasiven Trophoblasten Zellen konnte eine stark verminderte Expression von HO-2 bei Patientinnen mit Präeklampsie beobachtet werden im Vergleich zu schwangeren Frauen mit einer fetalen Wachstumshemmung, die sich im gleichen Schwangerschaftsmonat befanden (Zenclussen et al. 2003). Die Autoren beschrieben zudem einen Rückgang der HO-1 Expression, jedoch war dieser nicht signifikant.

Lash und Mitarbeiter (2003) beschrieben, dass es in den beschädigten Regionen der Plazenta von Patientinnen mit Präeklampsie zu einer verminderten Proteinexpression von HO-1 und HO-2 kommt im Vergleich zu den Regionen der gleichen Plazenta, die nicht beschädigt waren. Keine bzw. eine sehr geringe Expression von HO-1 in der Plazenta von Frauen mit Präeklampsie beobachten Barber und Mitarbeiter (2001). HO-2 konnte hingegen in Endothelzellen und Synzytiotrophoblasten Zellen nachgewiesen werden. Die Autoren zeigten weiterhin, dass die Expression von HO-2 in den Endothelzellen nicht jedoch in Synzytiotrophoblasten Zellen, von Präeklampsie-Patientinnen im Vergleich zu normal-schwangeren Frauen stark reduziert war.

↓130

McLaughlin und Mitarbeiter (2003) hingegen konnten eine erhöhte Expression von HO-1 in den Chorionzotten und der fetalen Membran in Präeklampsieschwangerschaften im Vergleich zu normalen Schwangerschaften beobachten.

Die bisherigen Daten über die Funktion von HO-1 beschränken sich auf Studien beim Menschen und zeigen kontroverse Ergebnisse. In dieser Arbeit sollte daher erstmalig die Expression von HO-1 in dem Mausmodell für Präeklampsie untersucht werden.

Die Immunhistochemische Analyse der Plazenta und der Dezidua ergab in allen Zelltypen keine Unterschiede in der HO-Expression zwischen den normal-schwangeren Mäusen und den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen.

↓131

Eine Untersuchung der HO-1 mRNA konnte ebenfalls keine Unterschiede zwischen den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen und den normal-schwangeren Mäusen aufweisen. Man könnte daher postulieren, dass das Mausmodell für Präeklampsie unzureichend ist, um immunologische Vorgänge bei einer Präeklampsie zu untersuchen. Im Rahmen des Tierversuches konnte von Mitgliedern der Arbeitsgruppe jedoch belegt werden, dass die eNOS Proteinexpression von der Menge an eNOS mRNA in den Tieren, die mit aktivierten Th1-Zellen behandelt worden waren, signifikant erhöht war im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die erhöhte Expression von eNOS in dem Mausmodell für Präeklampsie wäre demnach ein Kompensationmechanismus für den erhöhten Blutdruck, der als Folge einer unspezifischen Aktivierung des Immunsystems auftritt (Schmid et al. 2006).

Diese Daten lassen somit vermuten, dass das HO-System in dem Mausmodell für Präeklampsie eine untergeordnete Rolle spielt.

Um zu untersuchen, ob die HO-1 Hoch- bzw. Herrunterregulation einen Einfluss auf die Präeklampsie-ähnlichen Symptome hat, wurden die Tiere an den Tagen 10 und 12 der Schwangerschaft mit aktivierten Th1-Zellen behandelt und zusätzlich am Tag 10 der Schwangerschaft mit Co-PP bzw. Zn-PP behandelt um HO-1 hoch- bzw. herrunterzuregulieren.

↓132

Die Analyse der Blutdruckkurve zeigte, dass keine von den Behandlungen den Verlauf des Blutdrucks beeinflussen konnte. Die unterschiedlich hohen Blutdruckwerte der beiden Behandlungen am Tag 14 der Schwangerschaft waren nicht statistisch signifikant.

Diese Daten deuten darauf hin, dass bei dem Mausmodell für Präeklampsie die veränderte HO-1 Expression keinen Einfluss auf die Symptome hat und somit ist es unwahrscheinlich, dass HO-1 in dem Mausmodell für Präeklampsie eine Rolle spielt.

6.6.3 In Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen kommt es in der Dezidua zu einer erhöhten Produktion von Th1-Zytokinen 

Das Krankheitsbild der Präeklampsie ist unter anderem durch eine stark erhöhte inflammatorische Immunantwort charakterisiert. Saito und Mitarbeiter (1999) zeigten, dass in mononuklearen Zellen des peripheren Blutes von Frauen mit Präeklampsie mehr TNF-α, IFN-β und IL-2 produziert wird, als in mononuklearen Zellen normal-schwangerer Frauen. Zusätzlich konnte von Darmochwal-Kolarz und Mitarbeiter (1999) gezeigt werden, dass die Produktion von IL-10 in mononuklearen Zellen von Präeklampsie-Patientinnen signifikant reduziert ist.

↓133

Das Mausmodell für Präeklampsie beruht auf dem Transfer von aktivierten Th1-Zellen, daher war es auch nicht verwunderlich, dass es in den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen im Vergleich zu normal-schwangeren Mäusen in der Dezidua zu einem signifikanten Anstieg an TNF-α und IFN-γ kommt. Die Th2-Zytokine IL-4 und IL-10 waren in den Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen nur leicht reduziert.

Zenclussen und Mitarbeiter (2004) postulierten bei der Etablierung des Mausmodells für Präeklampsie, dass die Injektion von aktivierten Th1-Zellen zu einer erhöhten Produktion von Th1-Zytokinen in der trächtigen Maus führt. Durch die erhöhte Th1-Zytokinproduktion kommt es zur Stimulierung des Immunsystems der Maus und die mauseigenen Th0-Zellen entwickeln sich zu Th1-Zellen.

Die erhöhte Th1-Zytokinproduktion, die in dieser Arbeit in Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen an der feto-maternalen Grenze beobachtet wurde, steht im Gegensatz zu der Studie von Arriaga-Pizano und Mitarbeiter (2005). Die Autoren zeigten, dass ausschließlich im peripheren Blut von Frauen mit Präeklampsie, aber nicht im choriodezidualen Blut und im Nabelschnurblut eine Th1-Zytokindominanz vorliegt.

↓134

Dass es in Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptomen an der feto-maternalen Grenze zu einer erhöhten Th1-Dominanz kommt, könnte auf die künstliche Induktion der Präeklampsie-ähnlichen Symptome zurückzuführen sein. Allerdings konnten Zenclussen und Mitarbeiter (2004) durch die Markierung der transferierte Th1-Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff CFSE (Carboxy-Fluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester) nachweisen, dass an der feto-maternalen Grenze die meisten CCR5-positiven Zellen, wobei CCR5 einen Marker für Th1-Zellen darstellt, wirtseigene Zellen waren und nicht transferierte Th1-Zellen. Daher ist zu vermuten, dass die hohen Mengen an TNF-α und IFN-γ durch mauseigene Zellen produziert wurden und nicht durch die transferierten Zellen.

6.7 Zusammenfassung der HO-1 Daten beim murinen Modell für Präeklampsie 

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es in Mäusen mit Präeklampsie-ähnlichen Symptome zu keiner veränderten HO-1 Expression kommt. Sowohl die Induktion als auch die Hemmung der HO-1 haben keinen Einfluss auf die Präeklampsie-ähnlichen Symptome, sodass man postulieren kann, dass die HO-1 Expression bei der Ausbildung Präeklampsie-ähnlicher Symptome keine Rolle spielt.

In Rahmen des Tierversuches konnte zudem gezeigt werden, dass man mit dem Mausmodell für Präeklampsie, das von Zenclussen und Mitarbeiter (2004) erstmalig beschrieben wurde, in der Lage ist die molekularen Vorgänge, die während einer Präeklampsie auftreten, zu analysieren, da sowohl die Daten der HO-1 Expression sowie auch der eNOS Expression (Schmid et al. 2006) in diesem Mausmodell mit den Humandaten vergleichbar sind.


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06.02.2008