2 Literaturübersicht

2.1 Salzstress bei Pflanzen

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Aufgrund ihrer Reaktion auf hohe Salzkonzentrationen werden die Pflanzen in zwei Gruppen untergliedert. Halophyten bzw. „Salzpflanzen“ wachsen auf natürlichen Salzböden und schließen ihren gesamten Lebenszyklus dort ab, während Glykophyten bzw. „Süßpflanzen“ deutlich weniger Salz tolerieren. Meistens reagieren glykophytische Pflanzen oberhalb einer Schwellenkonzentration von Salz mit Verminderung des Wachstums, Abnahme der Trockenmasse und Blattverfärbung (TAIZ und ZEIGER 2000). Extreme Salzbelastung führt zu Hemmung des Spross- und Wurzelwachstums, Abnahme der Blattfläche, Abschwächung und Verspätung des Austriebs von Knospen und Wurzel-, Knospen-, Blattrand- und Sprossspitzennekrosen, sowie Vertrocknung ganzer Sprossbereiche. Widerstandsfähige Arten sind einerseits vor unmittelbarer Salzschädigung besser geschützt, andererseits werden Wachstum und Ertrag bei ihnen weniger beeinflusst als bei empfindlichen Arten (LARCHER 1994). Die Testpflanze Tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), eine der wichtigsten und meist verbreiteten Kulturpflanzen in der Welt, ist ein Glykophyt und wird vorwiegend im Mittelmeerraum kultiviert, wo Salinität ein fortschreitendes Problem ist. Sie wurde von MAAS und HOFFMANN (1977) und MAAS (1986) als mäßig empfindlich gegenüber Salzstress klassifiziert.

Hohe Na+- und Cl--Konzentrationen im apoplastischen Raum führen zu Veränderungen des thermodynamischen Gleichgewichts von Wasser und Ionen mit hyperosmotischem Stress, ionischem Ungleichgewicht und Toxizität als Folgen (NIU et al. 1995). Na+-Toxizität repräsentiert den größten ionischen Stress in Verbindung mit hoher Salzbelastung, obwohl manche Pflanzen auch gegenüber Cl- empfindlich sind, das hauptsächliche Anion in salzhaltigen Böden. Na+ hat eine stark hemmende Wirkung auf die Aktivität vieler Enzyme, die bei hohem Na+/K+-Verhältnis ausgeprägter ist. (XIONG und ZHU 2004). Über die Wirkung hoher Cl- _Konzentrationen ist wenig bekannt, da sie meistens mit allgemeinen Salzschädigungen auftreten, werden aber in Verbindung gebracht mit einem physiologischen K+-Mangel (HAJ-BAKRI 1996). Der alkalische pH-Wert von Salzböden hat teilweise, zusätzlich zu der Ionentoxizität, negative Folgen auf das pflanzliche Wachstum. Das niedrige osmotische Potenzial der salzhaltigen Lösungen hemmt die Wasseraufnahme der Pflanzen und führt dadurch zu „physiologischer Trockenheit“. Für Halophyten, die tolerant gegenüber Na+-Toxizität sind, könnte osmotischer Stress der wichtigste Grund der Wachstumshemmung sein. Oxidativer Stress kann als sekundärer Stress bei Pflanzen durch hohe Salinität neben der Akkumulation von toxischen oder unerwünschten Substanzen und Störungen der Ernährung, sowie des zellulären Metabolismus ausgelöst werden und ist eine bedeutende Einschränkung für die pflanzliche Salztoleranz (XIONG und ZHU 2004). Das belegen auch die Untersuchungen von MITTOVA et al. (2002) bei der kultivierten Tomate und der verwandten salztoleranten Art Lycopersicon pennellii nach Exposition in 100 mM NaCl. Sie zeigen, dass L. pennellii zwarkeine vererbbare Toleranz gegenüber oxidativen Stress besitzt, durch die Hinaufregulation des antioxidativen Systems aber toleranter wird gegenüber salzinduziertem oxidativen Stress. Und auch die Untersuchungen von DELUMEAU et al. (2000) bei der Tomate und der salztoleranten Art Lycopersicon pimpinellifolium unterstreichen die erheblichen Auwirkungen des oxidativen Stress auf die Salztoleranz von Pflanzen. SHALATA und NEUMANN (2001) berichten, dass der Zusatz von Ascorbinsäure in einer mit 300 mM NaCl angereicherten Nährlösung die Überlebensrate von Tomatensämlingen von 0 % auf ca. 50 % ansteigen ließ. Die Anwendung von Ascorbinsäure führte zu einer Verminderung der Akkumulation von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen, ein Maß für den oxidativen Stress, in Wurzel-, Spross- und Blattgewebe, ein Hinweis auf die schützende Wirkung von Vitamin C gegenüber salzinduzierter Lipidperoxidation durch aktive Sauerstoffverbindungen.

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Nach XIONG und ZHU (2004) ist die Abnahme des zellulären K+-Gehaltes bei Salzbelastung ein generelles Phänomen, das verantwortlich sein kann für die Wachstumsreduzierung und die verminderte Vitalität der Pflanzen. Aufgrund der ähnlichen physikochemischen Eigenschaften von Na+ und K+ haben hohe Na+-Konzentrationen eine hemmende Wirkung auf die K+-Aufnahme in der Wurzel, und können so zu gestörter K+-Ernährung der Pflanzen führen, die von entscheidender Bedeutung ist für die Aufrechterhaltung des Turgors und des Membranpotentials und die Aktivität vieler Enzyme. Das ist in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von RUS et al. (2001), die durch Expression des HAL1 Gens, das in Hefen die K+/Na+ Selektivität erleichtert und die zelluläre Salztoleranz erhöht, die salzinduzierte Ertragsreduzierung in Tomatenpflanzen minimieren konnten.

Darüber hinaus können die physiologischen Veränderungen, die bei Pflanzen durch Exposition zu Salzbedigungen induziert werden, auch zu Ertragsminderungen führen. Die Untersuchungen von MAVROGIANOPOULOS et al. (2002) zeigen, dass ein hoher, das ganze Wurzelsystem von Tomatenpflanzen belastender Salzstress, eine Ertragsreduzierung aufgrund des niedrigen Wassergehaltes der Früchte herbeiführt, was auf eine osmotische Regulierung zurückzuführen ist. Bei Pflanzen mit geteiltem Wurzelsystem, deren eine Hälfte reines Wasser und die andere salzhaltige Nährlösung (100 mM NaCl) aufnimmt, wurde eine Ertragsabnahme beobachtet, die auf einer Hemmung der Fruchttrockenmasse basiert, was auf einen Mangel an osmotischer Anpassung hinweist. Die durch NaCl induzierte physiologische Stressreaktionen in Tomatenfrüchten waren Gegenstand der Untersuchungen von BALIBREA et al. (1999a). Die Ertragsminderungen in Tomatenpflanzen unter dem Einfluss von NaCl beruhen vorwiegend auf einer Abnahme der Akkumulationsrate der Trockenmasse während der frühen Wachstumsphase der Frucht, 15-35 Tage nach der Anthese. Eine partielle Wiederherstellung des Wachstums trat jedoch während der späten Phase der Fruchtentwicklung ein, 35-45 Tage nach der Anthese. Der Salzstress bewirkte eine Saccharoseakkumulation im apoplastischen und symplastischen Raum bis 15 mM, eine Ansäuerung und Na+-Akkumulation im Apoplast, sowie eine vorübergehende Erhöhung des Stärkegehaltes. Die Abnahme des apoplastischen pH-Wertes führte zu einer Aktivitätsverminderung der unlöslichen sauren Invertase, was in Zusammenhang mit der Saccharoseakkumulation gebracht wurde und in einem limitierenden Schritt für das Fruchtwachstum unter mäßigen (70 mM) und hohen (150 mM) Salzbedingungen resultierte.

Außerdem kann Salinität speziell bei Tomatenpflanzen negative Folgen auf die Fruchtqualität haben, durch Erhöhung der Prädisposition gegenüber Blütenendfäule (BER). BROWN und HO (1993) untersuchten die Aufnahme und Verteilung von Ca++ bei abgetrennten Tomatenfrüchten von Sorten mit unterschiedlicher Anfälligkeit gegenüber BER, eine physiologische Störung der Tomate, die in Verbindung mit einem lokalisierten Ca++-Mangel im distalen Teil der Frucht gebracht wird. Der basipetale IAA-Abfluss aus abgetrennten Früchten wurde gleichzeitig mit der Ca++-Aufnahme ermittelt, um eine mögliche Beteiligung von IAA in der Ca++-Aufnahme oder der BER-Häufigkeit zu erforschen. Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Prädisposition der Pflanzen gegenüber BER und die Ca++-Aufnahme und Verteilung innerhalb der Frucht oder den IAA-Abfluss aus der Frucht ermittelt werden. Es wird jedoch eine Beteiligung von IAA in der Xylementwicklung in Verbindung mit BER vermutet. Nach DORAIS et al. (2001) wird die Anfälligkeit von Tomatenfrüchten gegenüber BER auf einen Koordinationsmangel zwischen beschleunigter Zellstreckung und unzulänglicher Ca++-Versorgung aufgrund von mangelnder Xylementwicklung in der Frucht zurückgeführt. Eine Erhöhung des Salzgehaltes durch Zusatz von NaCl in der Nährlösung führt bei Tomatenfrüchten zu Erhöhung der BER-Häufigkeit und des Na+-Gehaltes, sowie Abnahme der Größe, des K+- und N-Gehaltes und der Konzentration von titrierbaren Säuren. Durch Anpassung der Klimafaktoren im Gewächshaus, wie Temperatur, rel. Luftfeuchte und CO2-Gehalt kann den negativen Folgen der hohen Salzbelastung auf den Ertrag und die Fruchtqualität, wie BER, entgegengewirkt werden.

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Obwohl Salzstress den marktfähigen Ertrag von Tomatenpflanzen begrenzt, ermöglicht ein etwas höherer Salzgehalt in der Nährlösung die Regulierung der pflanzlichen Wasserverfügbarkeit und die Verbesserung der organoleptischen Fruchtqualität durch Erhöhung von Fruchttrockenmasse, gelösten Stoffen, Fructose, Glucose, titrierbaren Säuren, flüchtigen Verbindungen, Mineralien, Carotin und Vitamin C. Durch Verwendung von NaCl zur Erhöhung des EC (electrical conductivity)-Wertes werden süße Früchte mit intensivem Geschmack und Aroma erzielt (DORAIS et al. 2001).

Nach HAJ-BAKRI (1996) sind die vorwiegend verwendete Maßnahmen zur Minderung des Salzstress auf die Pflanzen folgende:

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Die Einführung von salztoleranten Sorten mit Hilfe von traditioneller Züchtung und neueren biotechnologischen Methoden ist aber ein relativ langwieriger Prozess und wenige praktische Erfolge sind bis jetzt erzielt worden (CAYUELA et al. 2001). Selbst bei der Tomate, eine Pflanze mit salztoleranten Verwandten hat sich die Entwicklung von toleranten Sorten als sehr schwierig erwiesen. Außerdem ist diese Methode, sowie auch die Entwicklung eines Drainagesystems, als wichtigste Maßnahmen gegen hohe Salinität, aus ökonomischer Sicht sehr aufwendig und die Anwendung von Wachstumsregulatoren, zumindest bei Gemüse, nur begrenzt zugelassen.

Über diese klassischen Maßnahmen hinaus, zeigen erste Erfahrungen, dass ein Einsatz von nützlichen, die Pflanzenwurzeln besiedelnde Mikroben erfolgreich sein kann bei der Minderung von Salzstress auf die Pflanzen. So demonstrieren ZIMMER et al. (1999) den positiven Einfluss einer Behandlung von Bohnen mit Bacillus subtilis auf die Salztoleranz der Pflanzen in Anwesenheit von leichtem Stress (50 mM NaCl). Die Anwendung des Stammes FZB24 führte zu Förderung der Spross- und insbesondere der Wurzelfrischmasse in Abhängigkeit von der Behandlungsart. Eine Samenbehandlung führte zu höherer Biomasseproduktion als eine Wurzelbehandlung der Sämlinge und deshalb wird auf die Wichtigkeit einer frühen Applikation hingewiesen, sodass die Bakterien ausreichend Zeit zur Verfügung haben, die Wurzeln zu kolonisieren. Die Toleranzinduktion scheint mehr von der Aktivität der Zellen des Bakteriums abhängig zu sein, als von der Populationsdichte. Weiterhin zeigten in Ägypten durchgeführte Tests von BOCHOW et al. (2001a) unter ariden Klimabedingungen in salzhaltigem Boden (52 mmol/l) und Bewässerung mit salzhaltigem Grundwasser (83 mmol/l) eine beachtliche salztoleranzerhöhende Wirkung von B. subtilis FZB24 bei jeweils zwei Aubergine- und Paprikasorten. Die Wurzelbakterisierung bewirkte bei Aubergine Ertragserhöhungen bis zu 550 % und bei Paprika bis zu 429 % gegenüber der Salzkontrolle und der schädliche Effekt der Versalzung auf den Ertrag konnte so, um ungefähr die Hälfte bei Aubergine bzw. ein Viertel bei Paprika, reduziert werden. Die bemerkenswerte Wirkung der Pflanzenbakterisierung auf die Salztoleranz konnte auch auf die Fruchtfrischmasse, die prozentuale Fruchttrockenmasse und die Anzahl der Früchte pro Pflanze bei allen Sorten ermittelt werden. Es wurden jedoch primär Pflanzenart- und sekundär Sorten-spezifische Unterschiede beobachtet. Die positive Wirkung einer Applikation von B. subtilis auf die pflanzliche Salztoleranz unter NaCl-Versalzung bestätigen auch die Ergebnisse von SALEH et al. (2003). Die vergleichende Untersuchungen zur Verbesserung der Salztoleranz von Artischocken unter Anwendung von B. subtilis, Ca++ und Mikronährstoffen (Fe, Mn und Zn) zeigen, dass die Applikation des Bakteriums die besten Ergebnisse erbrachte im Vergleich zu den restlichen Maßnahmen, unter Erhöhung des Ertrags, des vegetativen Wachstums, der stömatären Leitfähigkeit, der photosynthetischen Rate und der Transpirationsrate der Pflanzen.

Es erscheint von grundsätzlichem Interesse, die Wirkmechanismen einer Salzstresstoleranz erhöhender Wirkung die Pflanzenwurzeln besiedelnder Mikroben, die insbesondere des wachstumsfördernden Rhizobakteriums B. subtilis,aufzuklären.

2.2  Bacillus subtilis als PGPR

2.2.1 Wurzeleffekte von Bacillus subtilis

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Zu den letzten 20 Jahren ist die Verwendung von plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR, Pflanzenwachstum-fördernde Rhizobakterien) zur nachhaltigen Kultivierung von landwirtschaftlich genutzten Flächen in verschiedenen Regionen der Welt exponentiell gestiegen. PGPR haben eine wesentliche Auswirkung auf das pflanzliche Wachstum durch Verbesserung der Nährstoffaufnahme, Pathogenunterdrückung aufgrund der Produktion von Antibiotika und Siderophoren oder antagonistisch wirkender Substanzen und/oder aufgrund der Produktion von biologisch aktiven Substanzen wie Auxine und andere Phytohormone. Das Spektrum der Bakterien, die das pflanzliche Wachstum fördern können ist umfassend und beinhaltet neben Bacillus sp. verschiedene Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Xanthomonas und Serratia Arten (KHALID et al. 2004). B. subtilis (Ehrenberg) Cohn gehört taxonomisch zu der Familie Bacillaceae der Eubacteria. Er ist ein strikt aerobes, mesophiles Bakterium mit Temperaturoptimum zwischen 30°C und 45°C und benötigt keine Wachstumsfaktoren. Seine Zellen sind stäbchenförmig, beweglich und relativ klein (0,7-0,8 x 2-3 µm) mit lateralen Flagellen versehen und bilden runde oder irreguläre Kolonien. Er produziert Amylasen und Proteasen und bildet ohne Aufschwellen der Zellwände ovale, dünnwandige, resistente Endosporen (0,8 x 1,5-1,8 µm), die zentral in der Zelle liegen (COOK und BAKER 1989). Die Fähigkeit des Bakteriums zur Bildung von widerstandsfähigen Endosporen ist besonders ausgeprägt unter ungünstigen Bedingungen (KNOTT et al. 1995). Nach KREBS et al. (1998) sind nützliche Vertreter von Bacillus-Arten in Deutschland besonders Stämme der Spezies B. subtilis und B. amyloliquefaciens (FZB-Stämme). Da jedoch die beiden eng verwandten Formen früher nicht differenziert wurden (SNEATH 1986), sollen beide Spezies als B. subtilis geführt werden.

Die antagonistische Wirkung des Rhizobakteriums wurde in vitro und in vivo hauptsächlich gegenüber bodenbürtigen pilzlichen Pathogenen, wie Fusarium spp. (KREBS et al. 1998, SCHMIEDEKNECHT et al. 2001), Pythium spp. (GROSCH und JUNGE 1996, KREBS et al. 1998), Rhizoctonia solani (SCHMIEDEKNECHT 1993, SCHMIEDEKNECHT et al. 1994, 1995, 1996, KREBS et al. 1998), Sclerotinia sclerotiorum (KREBS et al. 1998, SCHMIEDEKNECHT et al. 2001) und Bakterien wie Streptomyces scabies (SCHMIEDEKNECHT et al. 1994, 1995, 1996, KREBS et al. 1998), Agrobacterium tumefaciens, Clavibacter spp. und Xanthomonas spp. (KREBS et al. 1998) beobachtet. Eine erfolgreiche Bekämpfung von Pseudomonas syringae pv. lachrymans und Erwinia tracheiphila durch die Behandlung von Gurkenpflanzen im Gewächshaus mit dem B. subtilis-StammGB03 belegen z. B. die Untersuchungen von RAUPACH und KLOEPPER (1998). Und auch gegen Mischinfektionen der Pflanzen mit P. syringae pv. lachrymans und Colletotrichum orbiculare konnte dieser Stamm erfolgreich angewendet werden. Es wird auch eine gute Kombinierbarkeit des Bakteriums mit anderen PGPR in der Bekämpfung dieser Pathogene sowohl im Gewächshaus, als auch unter Feldbedingungen demonstriert. Die Untersuchungen von KIM et al. (1997) zeigen als weiteres Beispiel eine hohe Effektivität von Bacillus sp. L324-92 in der Bekämpfung von Gaeumannomyces graminis var. tritici, Rhizoctonia solani, Pythium irregulare und Pythium ultimum bei Weizenpflanzen.

Mit Hilfe von B. subtilis erscheint auch eine Resistenzverbesserung von Pflanzen möglich. Eine gezielte Erhöhung der pflanzlichen Widerstandsfähigkeit aufgrund von exogenen Faktoren ohne Veränderung des Genoms wird als induzierte Resistenz bezeichnet. Die Resistenzinduktion aktiviert schnell ein bereits in Pflanzen vorhandenes, latentes oder wenig ausgeprägtes Potenzial an Abwehrmechanismen ohne negativen Einfluss auf die Ertragsleistung. Sie kann durch Vorinokulation mit Pathogenen, Apathogenen, Endophyten und durch Anwendung abiotischer Induktoren oder Metaboliten pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs - auch von B. subtilis -ausgelöst werden (SCHÖNBECK et al. 1993). Obwohl die induzierte Resistenz eine wichtige Rolle bei der Erhaltung von Pflanzen in der Natur einnimmt, blieb sie weit unerkannt bis vor 3 Jahrzehnten. Doch die Erforschung dieses Phänomens, unter Anwendung von molekularen und biochemischen Methoden brachte Klarheit über seine weite Verbreitung, denn die induzierte Resistenz wurde nachgewiesen in fast allen bis jetzt getesteten Pflanzen und ihre Wirkungsmechanismen überlappen sich teilweise mit Mechanismen, bei denen einzelne Resistenzgene die Grundlage bilden (BOCHOW et al. 2001b). Die Resistenzinduktion bringt einige Vorteile mit sich: Ein breiteres Wirkungsspektrum und höhere Erträge im Vergleich zu der Züchtung resistenter Sorten, die oftmals die Erträge von anfälligen Pflanzen nicht erreichen, Ausschluss von ökotoxikologischen Auswirkungen und kein Selektionsdruck auf Pathogene (SCHÖNBECK und KRASKA 1994). Im Gegenteil zu der biologischen Bekämpfung von Pathogenen, welche nur auf Antibiose oder Konkurrenz basiert, können induziert resistente Pflanzen diese Fähigkeit behalten, auch wenn die Dichte der induzierenden bakteriellen Population schon abgenommen hat. Der Grund dafür kann in der lang anhaltenden Erhöhung der pflanzlichen Abwehrfähigkeit gegenüber verschiedenen Pathogenen bei Aktivierung der Abwehrmechanismen liegen, oder dass auch kleine Populationsdichten stetig als Signalquellen dienen (KILIAN et al. 2000). Es wird davon ausgegangen, dass die erhöhte Resistenz der Pflanzen auf veränderter Genexpression basiert. In vielen Fällen ist die Resistenzinduktion begleitet von der Induktion verschiedener PR-Proteine (pathogenesis-related proteins), dann wird sie als systemisch erworbene Resistenz (SAR, systemic acquired resistance) bezeichnet. In anderen Fällen steht die Resistenzinduktion aber nicht in Verbindung mit der Akkumulation von PR-Proteinen, dann wird sie als induzierte systemische Resistenz (ISR, induced systemic resistance) bezeichnet (LEEMAN et al. 1996). Die Akkumulation von PR-Proteinen ist eine ubiquitäre pflanzliche Reaktion gegenüber eindringende Pathogene und wird induziert unabhängig von einer spezifischen Wirkung auf das Pathogen (BOCHOW et al. 2001b).

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Eine weitere wichtige Aktivität des wurzelkolonisierenden Bakteriums B. subtilis ist ein Hervorrufen (Induktion) von Toleranz gegenüber Stresseinflüssen bei den behandelten Pflanzen, verbunden mit Förderung des pflanzlichen Wachstums (BOCHOW et al. 1996). In mehrjährigen Gewächshausversuchen an Kartoffelpflanzen erbrachte die Anwendung verschiedener B. subtilis-Stämme Verminderung des Befalls durch Rhizoctonia solani und Streptomyces scabies bis zu 63 % bzw. 70 % und in Freilandversuchen konnte eine Befallsreduzierung bis zu 50 % bzw. 67 % im Vergleich zur Kontrolle erreicht werden. Die bakterisierten Pflanzen zeigten besseres Wachstum und höhere Vitalität und hatten um durchschnittlich 16 % höhere Erträge (SCHMIEDEKNECHT et al. 1998). Die Behandlung von Tomatenpflanzen in Hydrokultur mit den B. subtilis-Stämmen FZB13 und FZB44 bewirkte eine Toleranzinduktion gegenüber Pythium aphanidermatum unter deutlicher Verzögerung der Krankheitsentwicklung zu Beginn der Kultur und führte zur Verminderung der Ertragsverluste (GROSCH et al. 1999).

Toleranz- und/oder Resistenzinduktion bei Pflanzen durch B. subtilis konnte oft auch nach Anwendung von Kulturfiltraten des Rhizobakteriums beobachtet werden. So führte die Behandlung von Gerstepflanzen mit B 50, einem proteinreichen Kulturfiltrat aus B. subtilis, zu einer Resistenzinduktion gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei (STEINER et al. 1988, OERKE et al. 1989, KRASKA und SCHÖNBECK 1993, KEHLENBECK et al. 1994, KEHLENBECK und SCHÖNBECK 1995). Die Anwendung desselben Kulturfiltrats bei Weizenpflanzen induzierte eine Toleranzerhöhung sowohl gegenüber dem pilzlichen Erreger Erysiphe graminis, als auch gegenüber Aphidenbefall durch Rhopalosiphum padi (WITTMANN und SCHÖNBECK 1996). Die Toleranzinduktion war mit Verschiebungen der Attraktionswirkung des „pathologischen“ Sinks zugunsten des natürlichen Sinks verbunden.

Darüber hinaus konnte die wachstumsstimulierende und ertragsfördernde Wirkung von B. subtilis auch in Abwesenheit eines Stressfaktors festgestellt werden. GROSCH und GROTE (1998) konnten nach Bakterisierung von Tomatenpflanzen in geschlossener Hydrokultur mit B. subtilis FZBA eine erhebliche Ertragssteigerung, sowie eine Verbesserung der Wurzeltrockenmasse der Pflanzen beobachten.

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Schließlich verdienen die schon genannten Toleranzerhöhungen gegenüber Salzstress nach einer Pflanzenbehandlung mit B. subtilis (ZIMMER et al. 1999, BOCHOW et al. 2001a) noch einmal betont zu werden.

2.2.2 Stoffwechselprodukte von Bacillus subtilis

Sämtliche Wirkungen von B. subtilis wie Antagonismus, Pflanzenwachstumsförderung, sowie Resistenz- und Toleranzinduktion bei den behandelten bzw. besiedelten Pflanzen dürften von freigesetzten Stoffwechselprodukten der Bakterien herrühren, die gegenüber anderen (pathogenen) Organismen und dem Pflanzenstoffwechsel entsprechend aktiv sind. Bisher bekanntes soll dargestellt werden.

Eine Besonderheit von Bacillus sp. sind als Stoffwechselprodukte mit breitem Wirkungsspektrum Antibiotika (KIM et al. 1997). Innerhalb der B. subtilis-Gruppe, die aus B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis und B. amyloliquefaciens besteht, können verschiedene Antibiotika unter aeroben Bedingungen produziert werden, vorwiegend hydrophile Oligopeptide (Bacilysin, Chlorotetain, Rhizocticine) in der logarithmischen Vermehrungsphase und Lipopeptide (Antibiotika der Iturin-Gruppe, Fengymycine) in der stationären Phase, während der Sporulation. Anders als die Lipopeptide, sind die Oligopeptide im Boden nicht stabil. Unter diesen Antibiotika wird Bacilysin wegen der Regelmäßigkeit des Vorkommens als taxonomisch wichtig für diese Gruppe betrachtet (LOEFFLER et al. 1990). B. amyloliquefaciens DSM 10273 produziert auch Iturin-ähnliche Peptide, mit antifungalen, antiviralen, antibakteriellen, Nematoden hemmenden und phytoeffektiven Eigenschaften (KREBS et al. 1996). Eine Wirksamkeit der gereinigten Peptide dieses Typs hinsichtlich der pflanzlichen Wachstumsförderung liegt in dem Bereich <10 µg/ml (KREBS 2003). Die antifungale Aktivität von B. subtilis ist hauptsächlich von Nährstoffgehalt, pH-Milieu und Temperatur abhängig (KREBS et al. 1998, SCHMIEDEKNECHT et al. 2001). So zeigte B. subtilis die maximale antifungale Aktivität gegenüber Phytophthora cactorum zwischen 21°C und 28°C und bei einem pH-Wert zwischen 5,0 und 8,0 (GUPTA und UTKHEDE 1986).

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Intensive Studien über den toleranzerhöhenden Wirkungsmechanismus von B. subtilis (DOLEJ 1998, BOCHOW und DOLEJ 1999) haben gezeigt, dass dieser nicht nur auf die klassische Induktion durch spezielle bakterielle Proteine basiert, die die pflanzlichen Abwehrmechanismen elizitieren.Anscheinend wird auch das pflanzliche Wachstum stimuliert, durch die Freilassung von exogenen bakteriellen Metaboliten mit Hormoncharakter wie Präkursoren (Indol-3-pyruvat, IPyA) der Auxinsynthese, die in Kulturfiltraten des Bakteriums nachgewiesen wurden, welche von der Pflanze aufgenommen werden und ihre Auxinsynthese antreiben können, als ein Teil des pflanzlichen Regulierungssystems für Wachstumserhöhung und Verbesserung der Gesundheit. Diese Hypothese könnte die relativ unspezifische Aktivität des Bakteriums auf das pflanzliche Wachstum und die Wirkung auf sowohl biotische, als auch abiotische Stressoren erklären (BOCHOW et al. 2001a). Und auch andere Untersuchungen weisen auf eine Implikation von Auxinen in dem Wirkungsmechanismus von B. subtilis hin, der Wachstumstimulierung und Toleranzinduktion gegen biotischen und abiotischen Stressfaktoren herbeiführt. Die Ergebnisse von GUPTA et al. (2000) zeigen, dass sowohl das Kulturfiltrat aus der Übergangsphase des B. subtilis-Stammes FZB14, als auch eine daraus gewonnene Fraktion, Tr-C, einerseits das Wurzelwachstum von Tomatenpflanzen in Abwesenheit des biotischen Stressfaktors stimulierten und andererseits Resistenz gegenüber Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici induzieren konnten. Darüber hinaus beobachteten sie weitgehende Ähnlichkeit zwischen den Eigenschaften von Tr-C und IPyA und schlussfolgern, dass die Fraktion Tr-C einen Elicitor enthält, der Ähnlichkeit mit IPyA hat und an der Signalauslösung und -transduktion oder an der Aktivierung eines Abwehrgens beteiligt ist. IAA (Indol-3-essigsäure) stimulierte zwar das Wurzelwachstum, konnte aber keine erhebliche Induktion von systemischer Resistenz gegenüber Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici hervorrufen. ALEMAYEHU (1997) demonstrierte mittels klassischer Biotests und Kallusgewebe- und Zellsuspensionskulturen, dass Kulturfiltrate der B. subtilis-Stämme FZB24 und FZB14 und deren Fraktionen zum Teil Auxin- und Cytokininaktivität aufzuweisen scheinen, die im Zusammenhang gesetzt wird mit der Wachstumsförderung von pflanzlichen Zellen bzw. pflanzlichem Gewebe und der Erhöhung der Stresstoleranz gegenüber dem unspezifischen Toxin Fusarinsäure, das von Fusarium spp. produziert wird.

MERKYS et al. (1974) demonstrieren eine intensive Auxin-Synthese durch ihren B. subtilis-Stamm 7. Am 3. und 4. Kultivierungstag des Bakteriums wurde eine Erhöhung des Gehaltes an freier Indol-3-essigsäure (IAA) im Medium beobachtet, die schließlich 120 µg/100 ml Nährlösung erreichte. Danach nahm die Auxinkonzentration im Medium graduell ab. Da aber der Versuch IAA innerhalb der Zellen von B. subtilis sowohl in freier Form, als auch gebunden mit einfachen Proteinen oder Nukleoproteinen zu messen erfolglos blieb, schlussfolgern die Autoren, dass IAA nicht in den Zellen des Bakteriums akkumuliert, sondern direkt im Nährmedium ausgeschieden wird. Und auch IDRIS (2002) konnte IAA in Kulturfiltraten der Stämme FZB24, FZB37, FZB42 und FZB45 nachweisen und so belegen, dass B. subtilis/amyloliquefaciens fähig ist Auxin zu produzieren, jedoch nur unter bestimmten Wachstumsbedingungen der Bakterien, d. h. niedrige Temperatur (22°C), niedrige Durchlüftung (75 rpm) und Dunkelheit. Als detaillierte Befunde (IDRIS et al. 2004) ergab sich für die Kulturfiltrate der B. amyloliquefaciens-Stämme FZB24, FZB42 und FZB45 2 nmol/l, 10,8 nmol/l und 1,8 nmol/l IAA und für das Kulturfiltrat des B. subtilis-Stammes FZB37 1,3 nmol/l IAA. Neben IAA wurde die Bildung weiterer Wachstumshormone beobachtet. In Kulturfiltraten, die in den oben genannten Bedingungen hergestellt wurden, konnte die Produktion von Indol-3-acetonitril (IAN) und einer Substanz mit Molekulargewicht 173,9 mit Auxin-ähnlichen Bio-Effekten nachgewiesen werden, was bei 37°C und 200 rpm produzierten Kulturfiltraten nicht möglich war. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass B. subtilis/amyloliquefaciens-Stämme unter bestimmten Wachstumsbedingungen IAA produzieren können über einen biochemischen Weg, in dem IAN auch produziert und/oder verwendet und katalysiert wird durch Nitrilasen, um in Auxin umgewandelt zu werden. Untersuchungen von KHALID et al. (2004) unterstreichen die Effektivität Auxin produzierender PGPR auf die pflanzliche Wachstumsförderung. Sie demonstrieren nach Inokulation von Weizensämlingen mit Bakterien, welche von der Rhizosphäre von Weizenpflanzen isoliert wurden, dass die effektiveren Auxin-Produzenten die beste Wirkung zeigten. Die Auxinbildung in vitro korrelierte signifikant mit dem Wachstum der Weizensämlinge unter axenischen Bedingungen, insbesondere mit der Wurzel- und Sprossmasse, was auf eine Verbesserung des Wurzelsystems durch die PGPR gebildeten Auxine mit nachfolgender Erhöhung der Biomasseproduktion schließen lässt. KLOEPPER et al. (1991) betrachten die Produktion von Phytohormonen und phytohormonell aktiven Metaboliten als mögliche Ursache für die Förderung des pflanzlichen Wachstums durch Bakterien, welche die Rhizosphäre von Pflanzen kolonisieren.

Ein weiterer wachstumsfördernder Mechanismus des B. amyloliquefaciens-Stammes FZB45 bei Pflanzen, allerdings nur unter P-Mangel, ist die Produktion von Phytase, wie die Untersuchungen von IDRIS (2002) belegen. Phytat ist die wichtigste pflanzliche P-Speicherform, die aber von der Pflanze fast nicht abgebaut werden kann. Unter P-Mangel-Bedingungen und bei Vorhandensein von Phytat kann jedoch die P-Verfügbarkeit der Pflanze durch die Phytase, dievon FZB45 produziert wird, erhöht werden.

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Untersuchungen über die Fähigkeit von B. subtilis FZB24 pflanzliche Wurzeln zu kolonisieren zeigen, dass das Wachstum der Bakterien in der Rhizosphäre, also dem Bereich nahe der Wurzeloberfläche, unmittelbar nach der Kolonisierung der Wurzeln bakterisierter Tomatensamen beginnt und letztlich eine 0,4-0,8 mm dicke Schicht von bakteriellen Zellen um die Wurzeln gebildet wird. Die enge Verbindung von B. subtilis mit pflanzlichen Wurzeln wurde auch mittels rasterelektonenmikroskopischen Aufnahmen bestätigt, die eine direkte Anheftung der Zellen des Bakteriums an die Rhizodermis von Erbsenwurzeln zeigen (KILIAN et al. 2000). Darüber hinaus wurden Unterschiede in der Kolonisierung der verschiedenen Wurzelteile gefunden. Die Wurzelspitzen, welche den physiologisch aktivsten Teil der Wurzel repräsentieren, werden vorwiegend durch B. subtilis kolonisiert (ZIMMER et al. 1998). Offensichtlich erfolgt die Bildung der Metaboliten durch B. subtilis nur aus einer Interaktion mit der Pflanze und die aktuelle Metaboliten gelangen direkt in den pflanzlichen Zellstoffwechsel.

Die Gewinnung der Stoffwechselprodukte von Bakterien zu Untersuchungszwecken erfolgt meistens aus dem Kulturfiltrat der Bakterien. Bei Instabilität dieser Stoffwechselprodukte, wie im Fall der Auxine, wird die Verwendung technischer Analoga bevorzugt, was wir auch bei unserer Arbeit praktizierten.


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15.12.2005