4 Material und Methoden

4.1 Pflanzenmaterial und Anzucht

↓15

Axenische Kultur

Für die Anzucht der Tomatensämlinge wurden Samen der Sorte „Harzglut“ (Saatzucht Quedlinburg GmbH) 15 min mit NaOCl (2 % aktives Cl) sterilisiert und 3-mal mit sterilem Aqua dest. gespült. Danach wurden die Samen mit Hilfe einer Pinzette einzeln in Plastikschalen ausgesät, welche mit durch Leitungswasser befeuchtetem, sterilen Quarzsand (Körnung 0,6-1,2 mm) gefüllt waren. Anschließend wurden die Schalen in einen Klimaschrank (Heraeus HB 0714) gestellt bei 28 °C und 75 % rel. Luftfeuchte. Der Tag/Nacht Rhythmus betrug 16/8 h und die Belichtungsintensität 15 kLux. Die Aussaat wurde mit sterilem Leitungswasser gegossen. Nach 8 Tagen waren die Sämlinge versuchsbereit.

Die Zusammensetzung der Nährlösung erfolgte nach GÖHLER und DREWS (1986, zitiert in DOLEJ 1998) und wurde speziell für Tomatensämlinge modifiziert. Die Nährlösung wurde unter weitgehend axenischen Bedingungen hergestellt. Folgende Zusammensetzung wurde verwendet:

↓16

Ca(NO3)2 x 4H2O

0,88 g

NaH2PO4 x 2H2O

0,126 g

K2SO4

0,39 g

MgSO4 x 7H2O

0,31 g

C10H13O8N2Fe

3,1 mg

MnSO4 x 4H2O

1,01 µg

H3BO3

0,56 µg

CuSO4 x 5H2O

0,098 µg

ZnSO4 x 7H2O

0,124 µg

(NH4)6Mo7O24 x 4H2O

0,322 µg

Aqua dest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde mit 1N KOH auf 5,8 eingestellt.

↓17

Für die Tests mit Wurzelapplikation wurden die Tomatensämlinge nach 8-tägiger Anzucht mit sterilem Aqua dest. aus dem Quarzsand ausgeschwemmt und vorsichtig von anhaftenden Sandkörnchen befreit, um die Unversehrtheit der Wurzeln zu gewährleisten. Es wurden Sämlinge ausgewählt, die einen möglichst gleichen Phänotypus hatten.

Die Sämlinge wurden in Reagenzgläser (16 cm x ∅ 1,8 cm) kultiviert, die mit jeweils 22 ml der Nährlösung gefüllt waren. Die Menge der Nährlösung in den Reagenzgläsern war so kalkuliert, dass die Wurzeln völlig in die Nährlösung eintauchten. Der Nährlösung hinzugefügt war die entsprechende Testsubstanz. Nach dem Befüllen der Reagenzgläser wurden sie mit Nescofilm verschlossen und anschließend mit Hilfe einer heißen Impföse mit einem ca. 4 mm großen Loch in der Mitte versehen. Durch diese Öffnung wurden dann die Pflanzen in die Reagenzgläser eingeführt. Der Flüssigkeitsentzug der Testpflanzen wurde nach Bedarf mit einer definierten Menge sterilem Aqua dest. bzw. Nährlösung mittels einer 5 ml Einmalspritze ausgeglichen. Jede Behandlungsvariante beinhaltete 10 Pflanzen.

Im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Zusatz von Prüfsubstanzen (Kontrolle -) wurden die Sämlinge für 8 Tage im Klimaschrank kultiviert. Es wurde ein Tag/Nacht Rhythmus von 16/8 h, eine Temperatur von 24 °C am Tag und 19 °C in der Nacht und eine rel. Luftfeuchte von 75 % gehalten. Die Belichtungsintensität betrug 15 kLux.

↓18

Nach der 8-tägigen Kultivierung der Sämlinge wurde die Nährlösung mit einer 25 ml Pipette, welche an der Spitze mit einem feinen, sterilen Schlauch verlängert war, mittels einer elektronischen Pipettierhilfe (Pipetboy, Integra Biosciences) abgesaugt. Der Schlauch wurde hierzu 2-mal durch die Öffnung im Nescofilm-Verschluss bis zum Boden vom Reagenzglas eingeführt. Danach wurden auf dieselbe Weise 22 ml einer salzhaltigen Nährlösung der gleichen Zusammensetzung, jedoch ohne Prüfsubstanz, eingefüllt. Die NaCl-Konzentration der Nährlösung betrug 150 mM.

Im Vergleich zu einer Kontrollvariante ohne Zusatz von Prüfsubstanzen und Salz (Kontrolle -) und zu einer Kontrollvariante ohne Zusatz von Prüfsubstanzen aber mit Salz (Kontrolle +) wurden die Testpflanzen für 7 Tage unter den gleichen Bedingungen weiterkultiviert und nach insgesamt 15-tägigem Wachstum geerntet.

Auf dem gleichen Schema basieren die Tests mit Blattapplikation. Der einzige Unterschied zu der Wurzelapplikation ist, dass die Testsubstanzen nicht der axenischen Nährlösung beigefügt waren, sondern in Leitungswasser gelöst 2-mal auf die Blattoberfläche bis zur vollständigen Benetzung gesprüht wurden, und zwar am 1. und 3. Tag nach der Übertragung in die Reagenzgläser. Jede Behandlungsvariante beinhaltete ebenfalls 10 Pflanzen.

↓19

Sprosskultur

Die Tests der Sprosskultur, sowie die hormonanalytischen Untersuchungen wurden im Institut für Biologie, AG Angewandte Botanik, der HUB durchgeführt. Mein besonderer Dank gilt Dr. Ross für die Anweisung und die intensive Unterstützung!

Zur Desinfektion wurden Samen der Sorte „Moneymaker“ für 5 min in 0,2 % HgCl2 (Test zur Ermittlung der Adventivwurzelbildung) oder 2 % NaOCl (Test zur Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen) geschüttelt und nachfolgend 3-mal in sterilem Aqua dest. gespült. Dann wurden die Samen mittels einer Pinzette in Schraubdeckelgläsern (9 cm, ∅ 8 cm), welche steriles, hormonfreies Medium beinhalteten, einzeln ausgesät. Schließlich wurden die Gläser in einen klimatisierten Raum gestellt bei 23 ± 2 °C unter kontinuierlichem Weißlicht. Nach etwa 24 Tagen waren die Tomatensämlinge für die Sprosskultur einsatzbereit.

↓20

Das verwendete Nährmedium basiert auf dem MS-Medium nach MURASHIGE und SKOOG (1962). Es wurde die folgende Zusammensetzung verwendet:

KNO3

1,9 g

KH2PO4

0,17 g

NH4NO3

1,65 g

MgSO4 x 7H2O

0,37 g

CaCl2 x 2H2O

0,44 g

MnSO4 x 4H2O

22,3 mg

ZnSO4 x 7H2O

8,6 mg

CuSO4 x 5H2O

0,025 mg

Kl

0,83 mg

CoCl2 x 6H2O

0,025 mg

H3BO3

6,2 mg

Na2MoO4 x 2H2O

0,25 mg

FeSO4 x 7H2O

27,8 mg

Na2EDTA

37,3 mg

Myo-Inositol

0,1 g

Thiamin-HCl

0,4 mg

Saccharose

20 g

Gelrite

3,6 g

Aqua dest. ad 1 l

↓21

Der pH-Wert wurde mit 40 %-KOH auf 5,8 eingestellt.

Die Sprosskultur wurde auf sterilem Medium durchgeführt, das in Kulturgefäße (4,5 cm x ∅ 10 cm) gegossen wurde. Es wurden ca. 2 cm lange Hypokotylsegmente von durchschnittlich 24 Tage alten Pflanzen verwendet, die im Medium kultiviert wurden unter Zusatz der Prüfsubstanzen bzw. ohne Zusatz von Prüfsubstanzen in der Kontrolle. Alle Varianten wurden mit und ohne NaCl unter den gleichen Bedingungen weiterkultiviert. Jede Variante beinhaltete 25 Segmente im Test zur Ermittlung der Adventivwurzelbildung bzw. 45 Segmente im Test zur Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen.

Gewächshauskultur

↓22

Die Gewächshausversuche wurden im Fachgebiet Gemüsebau der LGF der HUB durchgeführt. Mein Dank gilt den Mitarbeitern des Fachgebiets für die freundliche Unterstützung!

Für die Kultivierung der Pflanzen im Gewächshaus wurden Samen der Sorte „Harzfeuer“ (Julius Wagner GmbH) entsprechend der axenischen Kultur, jedoch ohne Desinfektion angezogen.

Die verwendete Nährlösung wurde nach PENNINGSFELD und KURZMANN (1966) zusammengesetzt (modifiziert). Es wurde die folgende Zusammensetzung verwendet:

↓23

Ca(NO3)2

0,511 g

KNO3

0,332 g

Kalimagnesia (30% K,10% Mg)

0,336 g

KH2PO4

0,168 g

Fetrilon (13% Fe-Chelat)

5,2 mg

Na2B4O7

5 mg

MnSO4

2,5 mg

CuSO4

0,25 mg

ZnSO4

0,25 mg

NH4-Molybdat

0,05 mg

Aqua dest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde mit H2SO4 auf 5,5-6,3 eingestellt.

↓24

Die 8 Tage alten Tomatensämlinge wurden vorsichtig mit Leitungswasser aus dem Quarzsand ausgeschwemmt. Phänotypisch ähnliche Pflanzen wurden danach in Laborgläsern (8,5 cm x ∅ 9,5 cm) überführt, welche mit Quarzsand (Körnung 0,6-1,2 mm) gefüllt waren. Der Quarzsand war mit einer Lösung der entsprechenden Testsubstanz bis zur Sättigung durchnässt. Die Konzentrationseinstellung der Hormonlösungen erfolgte ebenfalls mit Leitungswasser. Das Gießverfahren wurde noch 2-mal wiederholt, im Abstand von jeweils 2 Tagen. Nach 6 Tagen waren die Sämlinge bereit für die Aufstellung im Gewächshaus.

Die Versuche wurden in Plastiktöpfen (13 cm x ∅ 21 cm) durchgeführt, die mit 3,5 l Nährlösung gefüllt waren. Jeder Topf war mit einem Deckel mit jeweils 4 Öffnungen versehen, durch welche die 14 Tage alten hormonbehandelten Sämlinge in die Nährlösung eingehängt wurden. Um eine geeignete Position der Pflanzen zu gewährleisten wurden sie mit Schaumstoffstückchen befestigt. Der Deckel war in der Mitte mit einer zusätzlichen Öffnung versehen, durch die ein Kapillarschlauch die Nährlösung mit Luft anreicherte, um die Algenbildung zu verhindern und das Wurzelwachstum zu stärken. Bei Bedarf wurde mit einer definierten Menge Nährlösung gegossen. Jede Behandlungsvariante beinhaltete 10 Pflanzen.

Die Versuchspflanzen wurden bei einer Temperatur von ∅ 22 °C und einer rel. Luftfeuchte von ∅ 37 % kultiviert. Die Mindestwerte für Temperatur und rel. Luftfeuchte betrugen 17,5 °C und 23 % und die entsprechenden Höchstwerte 30,5 °C und 70 %. Aufgrund technischer Probleme war eine Klimaregelung nur begrenzt möglich.

↓25

Die Salzapplikation erfolgte stufenweise, um ein Absterben der Pflanzen zu verhindern. 4 Tage nach dem Überführen der Tomatensämlinge im Gewächshaus wurde die Nährlösung ersetzt mit einer Nährlösung derselben Zusammensetzung, aber mit Zusatz von NaCl in der physiologischen Konzentration von 50 mM. Nach 3 Tagen wurde der Vorgang wiederholt und die Nährlösung erneut ausgetauscht. Die neue Nährlösung hatte eine Salzkonzentration von 100 mM.

Im Vergleich zu einer Kontrollvariante ohne Zusatz von Prüfsubstanzen und Salz (Kontrolle -) und zu einer Kontrollvariante ohne Zusatz von Prüfsubstanzen aber mit Salz (Kontrolle +) wurden die Testpflanzen für 20 Tage unter den gleichen Bedingungen (bezogen auf obige Durchschnittswerte) weiterkultiviert und nach insgesamt 33-tägigem Wachstum geerntet.

4.2 Stoffwechselprodukte von Bacillus subtilis

Die standardisierte Herstellung der Kulturfiltrate (KF), sowie ihre Fraktionierung und die Gewinnung des Peptidextraktes erfolgten durch die FZB Biotechnik GmbH Berlin, Hersteller des Pflanzenstärkungsmittels FZB24®, bei deren Mitarbeiter ich mich herzlich bedanke für die Hilfestellung.

↓26

Es wurden Stoffwechselprodukte der Stämme FZB24 und FZB41 verwendet. Das Lysotypieverhalten von FZB24 durch verschiedene Bakteriophagen ergab eine Zuordnung zu der Art Bacillus amyloliquefaciens (KREBS et al. 1998). Die Stammidentifizierung von FZB24 durch die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) bestätigte dieses Ergebnis (DSM ID 96-2). Die Stammidentifizierung von FZB41 durch die DSMZ ergab ebenfalls eine Zuordnung zu der Art B. amyloliquefaciens (DSM ID 96-1). Dennoch werden die beiden Stämme FZB24 und FZB41 nachfolgend als B. subtilis aufgeführt.

Herstellung der Kulturfiltrate

Für die Kultivierung der Bakterien wurde das synthetische Medium nach LANDY et al. (1948) mit folgender Zusammensetzung verwendet:

↓27

KH2PO4

1 g

KCl

0,5 g

MgSO4

0,5 g

Fe2(SO4)3 x 6H2O

0,15 mg

MnSO4 x H2O

5 mg

CuSO4 x 5H2O

0,16 mg

Glucose

20 g

L-Glutaminsäure

5 g

Aqua dest. ad 1 l

Der pH-Wert wurde nach dem Sterilisieren mit 3 N NaOH auf 7,0 eingestellt.

↓28

Die KF von FZB24 wurden aus der Übergangsphase des Fermentationsprozesses gewonnen. Die Kulturdauer betrug ca. 12 h. Die Kulturbedingungen waren: Temperatur 27°C, Schüttelfrequenz 220 rpm, Kulturgefäße 500 ml-Rundschüttelkolben mit je 150 ml Landy-Medium. Zum Zeitpunkt der Ernte hatte die Population eine Bakteriendichte von ca. 5x108 cfu/ml erreicht. Mittels Zentrifugation bei 9000 U/min für eine Dauer von 15 min. wurde der Überstand absepariert und anschließend durch Filtration mit einer Porengröße von 0,2 µm das Sterilfiltrat hergestellt.

Das Kulturfiltrat aus der Übergangsphase des Stammes FZB24 wurde in einem axenischen Test durch Wurzelbehandlung der Pflanzen in 1 %- und 0,1 %-Konzentration geprüft.

Fraktionierung der Kulturfiltrate

↓29

Die Peptidfraktionierung wurde an KF von B. subtilis FZB24 durchgeführt, die einerseits die Übergangsphase (Fermentationsphase) repräsentieren und andererseits nach der 19. h gewonnen wurden. Sie wurden nach Zentrifugation und Sterilfiltration lyophilisiert. Zur Anreicherung wirksamer Komponenten wurden die lyophilisierten KF in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,5, gelöst. Danach wurden sie mit dem Adsorberharz XAD-7 (Serva) behandelt, sowohl im batch als auch in der Säule das KF-Übergangsphase bzw. in der Säule das KF-19. h. Das Harz wurde dann mit Phosphatpuffer gewaschen und stufenweise mit 20%-, 50%-, 10%- und 20%-Acetonitril im KF-Übergangsphase bzw. mit 5%-, 10%-, 20%-, 30%- und 50%-Acetonitril im KF-19. h eluiert.

Die Eluate wurden schließlich im Vakuum eingeengt und deren Peptidgehalt durch HPLC (high performance liquid chromatography) bestimmt. Die LiChrospher-Säulen 100 RP-18 (5 µm) hatten die Abmessung 125 x 4 mm (Merck). Die Detektionswellenlänge betrug 220 nm. Zur Elution wurde ein Gradient mittels der folgenden Lösungen verwendet:

↓30

Die Zuordnung der durch Elution entstandenen KF-Fraktionen zu den verschiedenen Acetonitrilkonzentrationen ist in der Tabelle 1 dargestellt. Die Abbildung 1 verdeutlicht die Fraktionierung des KF aus der Übergangsphase.

Abb. 1: Peptidfraktionierung des Kulturfiltrats aus der Übergangsphase von FZB24

Tab. 1: Peptidfraktionierung der Kulturfiltrate aus der fermentativen Übergangsphase und der 19. h von FZB24 und Peptidgehalte der beiden Kulturfiltrate und der daraus entstandenen Fraktionen

KF/

KF-Fraktion

Elution durch

Acetonitril

Volumen

(ml)

Peptide

(mg/ml)

Peptide

(mg/ Fr.)

Ausgang

für

KF-Übergangsphase

-

1100

0,0242

26,6

batch-Trennung

Fraktion batch-20

20 %

9

0,62

5,6

Säulen-Trennung

Fraktion batch-50

50 %

3,96

2,51

9,94

-

Fraktion 8-13

10 %

2

0,33

0,66

-

Fraktion 14-16

20 %

2,7

1,34

3,62

-

KF-19. h

-

300

0,0498

14,94

Säulen-Trennung

Fraktion 12-18

5 %

2

0,028

0,056

-

Fraktion 19-25

10 %

2,1

0,011

0,023

-

Fraktion 26-31

20 %

2,2

0,51

1,12

-

Fraktion 32-36

30 %

2,3

4,72

10,86

-

Fraktion 37-41

50 %

2,8

1,07

3

-

↓31

Die KF-Fraktionen batch-50, 8-13 und 14-16 aus dem KF der Übergangsphase und die KF-Fraktionen 12-18, 19-25, 26-31, 32-36 und 37-41 aus dem KF der 19. h wurden in axenischen Tests durch Wurzelbehandlung der Pflanzen in 20 %-, 2 %- und 0,2 %-Konzentration geprüft.

Der hochangereicherte, antifungale Peptidextrakt (PE) von FZB41 hatte einen Gehalt an zyklischen Lipopeptiden von 47 %. Die von diesem Stamm gebildeten Lipopeptide entsprechen jenen, die von B. subtilis FZB24 synthetisiert werden, wie durch HPLC-Analyse nachgewiesen werden konnte (OCKHARDT 2003). Die Anreicherung der Peptide erfolgte durch methanolische Extraktion der sauren Peptidfällung (KREBS et al. 1996).

Der PE wurde in einem axenischen Test durch Wurzelbehandlung der Pflanzen in den Konzentrationen 100 µg/ml, 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml und 0,001 µg/ml geprüft.

↓32

Auxine

Es wurde die Wirksamkeit folgender Auxine getestet:

↓33

In den axenischen Tests wurden die Auxine sowohl durch Wurzelbehandlung (alle), als auch durch Blattbehandlung (TRP, IPyA, IAAld, IAA) der Pflanzen in den physiologischen Konzentrationen von 10-5 M, 10-7 M und 10-10 M geprüft. Im Test zur Ermittlung des Wassergehaltes wurden TRP, IPyA, IAAld und IAA lediglich in den Konzentrationen von 10-5 M und 10-10 M geprüft. Die angewandten Konzentrationen wurden hier und im Gewächshausversuch mittels einer Verdünnungsreihe hergestellt, die unmittelbar vor dem Einsetzen der Versuchspflanzen erfolgte.

Im Test der Sprosskultur zur Ermittlung der Adventivwurzelbildung wurden TRP, IPyA, IAAld und IAA in den Konzentrationen von 10-5 M und 10-7 M mit und ohne NaCl geprüft. Im Test der Sprosskultur zur Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen wurden IPyA und IAA in der Konzentration von 10-5 M ebenfalls mit und ohne NaCl geprüft.

Im Gewächshausversuch wurden TRP, IPyA, IAAld und IAA in den Konzentrationen von 10-5 M und 10-10 M geprüft.

4.3 Bestimmung der Prüfparameter

↓34

Erfassung der Wachstumsparameter

In den axenischen Tests wurde die Wirksamkeit der Behandlungen mit den Testsubstanzen anhand der Parameter Sprosslänge, -frischmasse, -trockenmasse, Blattfläche, Wurzellänge, -frischmasse und -trockenmasse ermittelt. Im Gewächshausversuch wurden dieselben Parameter ermittelt mit Ausnahme die Wurzellänge.

Die Trockenmasse wurde nach 48 h Trocknung bei 60 °C in den axenischen Tests und bei 60-65 °C im Gewächshausversuch bestimmt.

↓35

Die Blattfläche wurde mit einem optischen Gerät (Li Cor 3100 Area Meter) gemessen.

Die Wurzellänge wurde als absolute Wurzellänge nach NEWMAN (1966) kalkuliert. Dazu wurde das Wurzelsystem einer Pflanze auf einem 1x1 cm Raster gelegt innerhalb einer mit Wasser gefüllten Schale und die Anzahl der Schnittpunkte der Wurzeln mit den horizontalen und vertikalen Gitternetzlinien gezählt. Die Wurzellänge wurde dann nach folgender Formel errechnet:

R = absolute Wurzellänge

 

N = Anzahl der Schnittpunkte

 

A = Fläche des verwendeten Rasters

 

H = totale Länge aller Gitternetzlinien

↓36

Bestimmung des Wassergehaltes

Im axenischen Test wurden die Tomatensämlinge in Apex, Blätter, Kotyledonen, Stängel und Wurzel getrennt. Unmittelbar danach wurde die Frischmasse bestimmt und das Material bei -80 °C gelagert. Dann wurde das Material einer Lyophilisation bis zur Gewichtskonstanz unterzogen und anschließend die Trockenmasse bestimmt.

Im Gewächshaustest wurde die Frischmasse unmittelbar nach der Ernte und die Trockenmasse von Spross und Wurzel nach 48 h Trocknung bei 60-65 °C bestimmt.

↓37

Der Wassergehalt wurde nach KERKEB et al. (2001) mit folgender Formel errechnet:

Erfassung der Adventivwurzelbildung

↓38

In der Sprosskultur wurde die Adventivwurzelbildung der Hypokotylsegmente anhand der Parameter Bewurzelungsrate, Wurzelanzahl und Wurzellänge charakterisiert, die nach PINKER (1984) errechnet wurden:

%W = Bewurzelungsrate

W/S = Wurzelanzahl

W L = Wurzellänge

Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen

↓39

Nach 2, 4 und 6 Tagen wurden jeweils 15 Hypokotylsegmente den Kulturgefäßen der Sprosskultur entnommen und von basal anhaftenden Mediumresten befreit. Unmittelbar danach wurde die Frischmasse bestimmt und das Material bei -80 °C gelagert. Nach Vollendung der Probenentnahme wurden die Segmente einer Lyophilisation unterzogen, die bis zur Gewichtskonstanz durchgeführt wurde. Anschließend wurde die Trockenmasse bestimmt und das Material bis zur weiteren Aufarbeitung bei - 80 °C gelagert.

Zur Extraktion wurden die gefriergetrockneten Segmente mit einem Glasstab pulverisiert und mit 80 % (v/v) Methanol versetzt. Dem Methanol wurden pro Liter 100 mg Butylhydroxytoluol (Sigma Nr. B 1378) als Antioxidationsmittel zugesetzt. Es wurden 10 ml des Extraktionsmittels pro Gramm Frischmasse verwendet. Die Extraktion erfolgte über Nacht (mind. 12 h) bei 4 °C unter Lichtabschluss.

Alle nachfolgenden Arbeitsschritte wurden auf Eis durchgeführt.

↓40

Der Extrakt wurde vorgereinigt mittels einer Filtration durch einen Glasfaser-Vorfilter (Schleicher und Schüll, Nr. 6) mit Hilfe einer Vakuumpumpe. Danach wurde der Methanolanteil der Proben durch Zugabe von deionisiertem H2O auf 70 % gesenkt und eine Festphasenextraktion mittels PR18-Kartuschen (Amchro, Merck) mit Hilfe einer Vakuumpumpe durchgeführt. Anschließend wurden die methanolischen Extrakte in einer Vakuumzentrifuge (Univapo 100 H/Unijet ll) eingeengt. Die Endvolumina betrugen jeweils 500 µl.

Die HPLC-Reinigung wurde mit einer computergesteuerten Anlage der Firma Beckman durchgeführt. Sie bestand aus einem Pumpenmodul 125NM, einem UV-Detektor 166NM und der Software System Gold Version 8.10. Außerdem wurde eine Säulenheizung (W.O. electronic BFO-04) und ein Fraktionssammler (Pharmacia LKB Frac100) eingesetzt.

Alle verwendeten Lösungsmittel wurden durch einen 0,2 µm-Filter filtriert und unter Vakuum im Ultraschall entgast. Die HPLC-Trennung erfolgte mittels einer LiChrospher-Säule 100 RP 18, 10 µm, (Merck) bei einer Säulentemperatur von 45 °C durch eine Gradientenelution. Laufmittel waren Methanol, HPLC-grade (Roth) und TEAA (Triethylaminessigsäure)-Puffer, 40 mM, pH 3,5. Die Probeninjektion erfolgte mittels eines Injektors mit automatischem Signalgeber in eine 100 µl-Schleife. Das verwendete Elutionsprogramm ist folgendes:

↓41

Säule: Lichrosphere RP 18, 10 µm, 250-4 mm, mit Vorsäule (Merck)

Temperatur: 45 °C

Laufmittel: Methanol / TEAA-Puffer 40 mM, pH 3,5

↓42

Zeit

Methanol (%)

TEAA-Puffer (%)

Fluss (ml/min)

0

35

65

1,0

10

40

60

1,0

12

95

5

1,2

13

98

2

1,2

18

98

2

1,2

22

98

2

1,0

25

35

65

1,0

Die Detektion erfolgte bei 254 nm. Die Retentionszeit von IAA wurde durch Injektion von 2 µg IAA in 100 µl Methanol ermittelt.

Zur IAA-Bestimmung wurden lediglich die der Retentionszeit entsprechenden Fraktionen berücksichtigt und unter Stickstoff getrocknet. Die IAA-Fraktionen wurden anschließend mittels einer ätherischen Diazomethanlösung methyliert (SCHLENK und GELLERMANN 1960). Alle Proben wurden bis zum quantitativen Nachweis bei -80 °C gelagert.

↓43

Der Enzymimmuntest (ELISA) ist eine Methode zum quantitativen Nachweis von Antigenen. Eine definierte Menge von enzymmarkiertem Antigen konkurriert mit einer unbekannten Menge an freiem Antigen in der zu messenden Probe um einen spezifischen Antikörper, der an einer festen Phase adsorbiert ist. Durch eine Waschprozedur werden alle nicht gebundenen enzymgekoppelten und freien Antigene entfernt. Nach der Zugabe eines Enzymsubstrates wird die Enzymaktivität des gebundenen enzymmarkierten Antigens gemessen. Das ist ein Maß für den Antigengehalt der Probe.

Alle notwendige Lösungen für den immunologischen Nachweis wurden bei 4 °C aufbewahrt. Es wurden folgende Materialien benötigt:

↓44

Die Mikrotitrationsplatten wurden mit RAMIG-Lösung beschichtet (200 µl/Cup) und über Nacht im Kühlschrank bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten dekantiert, gewaschen und mit den monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 4 °C beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten dekantiert und 2-mal mit Leitungswasser gewaschen.

Der eigentliche Immuntest wurde wie folgt durchgeführt: Die Platten wurden mit einer IAA-Standardverdünnungsreihe, sowie mit den zu messenden Proben beschickt (in je 100 µl TBS-Puffer) und 1 h bei 4 °C inkubiert. Danach wurde der Antigen-Enzym-Komplex (Tracer) in einer Verdünnung 1:500 dazugegeben und der Ansatz bei 4 °C 3 h inkubiert. Der Ansatz wurde dekantiert und die Platten 2-mal mit Leitungswasser gewaschen. Anschließend wurden je Kavität 200 µl Paranitrophenylphosphat (1 mg/ml in NaHCO3-Puffer) aufgetragen und der Ansatz bei 37 °C 1 h inkubiert. Die photometrische Messung erfolgte bei λ=405 nm. Anhand der Eichkurve wurde der Antigengehalt der Proben errechnet. Alle Proben wurden 4-mal gemessen.

4.4 Statistische Auswertung

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows 9.0. Bei Vorliegen von Varianzhomogenität wurden die Messwerte durch einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) unter Anwendung des Tukey-Tests verrechnet. Bei nicht vorhandener Varianzhomogenität wurde der Kruskal-Wallis-Test, ein nicht parametrisches Verfahren für k unabhängige Stichproben, oder der Chi-Quadrat-Test, ein ebenfalls nicht parametrisches Verfahren für eine Stichprobe herangezogen. Es wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit 1. Art mit p≤0,05 zugelassen.

↓45

Die Auswertung der Daten für die Wurzelfrischmasse und die Wurzeltrockenmasse des Gewächshausversuchs erfolgte mit dem Statistikprogramm SAS unter Anwendung des Tukey-Tests. Es wurde auch hier eine Irrtumswahrscheinlichkeit 1. Art mit p≤0,05 zugelassen.

Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit verschiedenen Buchstaben (Tukey-Test und Kruskal-Wallis-Test) oder mit * (Chi-Quadrat-Test) gekennzeichnet. In allen Tabellen ist die Standardabweichung angegeben, sowie die Grenzdifferenz des Tukey-Tests für den einschlägigen Parameter.


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15.12.2005