6 Diskussion

↓97

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die getesteten Stoffwechselprodukte der Bacillus subtilis-Stämme FZB24 und FZB41 eine Erhöhung der Salztoleranz bei der Testpflanze Tomate herbeiführen können unter dem Einfluss einer starken Salzbelastung. Allerdings war die positive Wirkung der getesteten Gruppen der Stoffwechselprodukte Kulturfiltrat, Fraktionen der Kulturfiltrate, Peptidextrakt und Auxine auf die pflanzliche Toleranz gegenüber hoher Salinität sehr differenziert und unterschiedlich stark ausgeprägt.

Die aber zweifellos vorhandene Wirkung dieser Stoffwechselprodukte von B. subtilis kann einerseits auf einen direkten Einfluss dieser Substanzen auf das Entstehen von Salzschäden, andererseits auf einen indirekten Einfluss auf den pflanzlichen Metabolismus beruhen, z. B. durch Auslösen oder Fördern von Resistenz- bzw. Toleranzmechanismen.

6.1 Wirkung des Kulturfiltrats

Das getestete Kulturfiltrat aus der fermentativen Übergangsphase des Stammes FZB24 hatte eine erkennbare, konzentrationsabhängige Wirkung, da es bei der Anwendung der 0,1 %-Konzentration tendenziell eine leichte Wachstumsförderung und der 1 %-Konzentration eine leichte Wachstumshemmung, sowohl im Spross als auch in der Wurzel der Sämlinge unter dem Einfluss von 150 mM NaCl bewirkte.

↓98

Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von DOLEJ (1998). Er beobachtete bei Tomatensämlingen, die ebenfalls mit der 0,1 %-Konzentration des Kulturfiltrats aus der Übergangsphase des Stammes FZB24kultiviert wurden, allerdings in Abwesenheit eines Stressfaktors, eine leichte Wachstumsstimulierung des Sprosses und der Wurzel. Die Anwendung der 1 %-Konzentration bewirkte dagegen eine leichte Wachstumsdepression im Spross und in der Wurzel der Pflanzen. Eine ähnliche, ebenfalls konzentrationsabhängige Wirkung hatte auch das Kulturfiltrat aus der Übergangsphase des Stammes FZB14 auf das Wachstum der Sämlinge. Allerdings induzierten hier die beiden Kulturfiltrate eine erhebliche Toleranzerhöhung gegenüber dem biotischen Stressfaktor Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici, da sie einen deutlich verzögerten Pathogeneseablauf zeigten, insbesondere bei der 0,1 %-Konzentration. GUPTA et al. (2000) belegen eine erhebliche Förderung des Wurzelwachstums von Tomatensämlingen durch Anwendung des Kulturfiltrats aus der Übergangsphase des Stammes FZB14 in 0,1 %-Konzentration, während die Anwendung der 1 %-Konzentration das Wurzelwachstum negativ beeinflusste. Und auch hier konnte durch die Anwendung dieses Kulturfiltrats in 0,1 %- und insbesondere in 1 %-Konzentration eine signifikante Resistenz- oder Toleranzerhöhung gegenüber Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici induziert werden.

Die Ergebnisse von ALEMAYEHU (1997) bei Tomatenkalluskulturen zeigen ebenfalls eine höhere Wirksamkeit der 0,1 %-Konzentration des Kulturfiltrats aus der Übergangsphase des Stammes FZB14, im Vergleich zu der 1 %-Konzentration, hinsichtlich der Wachstumsförderung. Hier induzierte die 0,1 %-Konzentration des Kulturfiltrats, ähnlich wie in der vorliegenden Arbeit, eine nur leichte Toleranzerhöhung gegenüber dem Stressor, in diesem Fall dem unspezifischen Toxin Fusarinsäure, das auch von Fusarium spp. produziert wird.

Nach DOLEJ (1998) können die Lipopeptide, die von B. subtilis produziert werden, mit ansteigender Konzentration eine toxische Wirkung auf das pflanzliche Wachstum ausüben und zu Überlagerungseffekten mit anderen Metaboliten führen. Zu derselben Schlussfolgerung führen auch die Ergebnisse von ALEMAYEHU (1997), der eine negative Beeinflussung der Auxin- und Cytokininaktivität bei komplexen Kulturfiltraten mit zunehmender Kulturdauer beobachtet hat. Deshalb könnte die höhere Effektivität der 0,1 %-Konzentration des getesteten Kulturfiltrats hinsichtlich der wachstumsfördernden und toleranzerhöhenden Wirkung, im Vergleich zu der 1 %-Konzentration, auf eine niedrigere Konzentration der ungünstig wirkenden Lipopeptide zurückgeführt werden.

↓99

Bei den Untersungen von STEINER et al. (1988) führte die Behandlung von Wintergerste mit B 50, einem proteinreichen Kulturfiltrat aus B. subtilis, zu einer Resistenzinduktion gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei unter erheblicher Verminderung der Kleistothezienbildung des Pathogens. Die Resistenzinduktion erwies sich als sortenspezifisch, aber unabhängig von der Anfälligkeit und dem Ertragspotential der Pflanzen. Es wird, zumindest teilweise, auf eine verzögerte Blattseneszenz zurückgeführt. OERKE et al. (1989) konnten durch die Anwendung desselben Kulturfiltrats eine Resistenzinduktion bei Winter- und Sommergerste gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei erreichen. Eine häufigere Applikation des Kulturfiltrats hatte keinen Einfluss auf die Resistenzinduktion und eine verzögerte Reifung wird mit der höheren Ertragsbildung der induziert resistenten Pflanzen in Verbindung gebracht. Auch KRASKA und SCHÖNBECK (1993) erzielten eine Resistenzinduktion bei Gerste gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei durch die Behandlung der Pflanzen mit B 50. Bei den induziert resistenten Pflanzen konnte keine Wachstumsförderung festgestellt werden, aber ein um 11,5 % verminderter DNA-Methylierungsgrad im Vergleich zur Kontrolle, der möglicherweise mit der Resistenzinduktion in Zusammenhang steht. Die Behandlung von Wintergerste mit B 50 bewirkte auch bei den Untersuchungen von KEHLENBECK et al. (1994) eine Resistenzinduktion gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei unter erheblicher Erhöhung des Kornertrags und des Stärkegehaltes der Körner. Die erhöhte Toleranz beruht wahrscheinlich auf eine höhere Assimilationsrate der induziert resistenten Pflanzen und eine verzögerte Abnahme der Aktivität der assimilierenden Blattfläche. KEHLENBECK und SCHÖNBECK (1995) konnten ebenfalls durch die Anwendung von B 50 bei Wintergerste eine Resistenzerhöhung gegenüber Erysiphe graminis f. sp. hordei heibeiführen. Die Resistenzinduktion führte auch hier zu signifikanter Förderung des Kornertrags und des Stärkegehaltes der Körner. Die Fahnenblätter der induziert resistenten Pflanzen zeigten höhere Assimilationsraten über einen längeren Zeitraum im Vergleich zu den unbehandelten Pflanzen bei etwa gleichem Befall. Außerdem war die Verlagerung von markiertem CO2 aus den Fahnenblättern in die Ähren nicht beeinflusst von dem Pathogen.

Nach WITTMANN und SCHÖNBECK (1996) führte die Behandlung von Weizenpflanzen mit B 50 zu einer Toleranzinduktion sowohl gegenüber Erysiphe graminis unter erheblicher Erhöhung des Tausendkorngewichts und des Strohertrags als auch gegenüber Rhopalosiphum padi unter signifikanter Erhöhung des Kornertrags. Die Toleranzinduktion war mit Verschiebungen der Attraktionswirkung des „pathologischen“ Sinks zugunsten des natürlichen Sinks verbunden, was zu einer höheren Biomasseproduktion führte. Während nach Induktorbehandlung der Auxin-Gehalt junger Ähren in Abwesenheit von Aphiden unverändert blieb, war er nach R. padi-Befall verdoppelt. Diese Erhöhung des Auxin-Gehaltes führte zu einer positiven Beeinflussung der Anzahl der Endospermzellen und zu höheren Erträgen.

Da das komplexe Kulturfiltrat die Gesamtheit aller Substanzen beinhaltet, die von B. subtilis produziert werden, wie z. B. Auxine, Enzyme, Proteine und Peptide, kann der beobachtete positive Effekt der niedrigen Konzentration sowohl auf einen direkten Einfluss auf das Entstehen von Salzschäden, als auch auf eine Toleranzinduktion gegenüber Salzstress beruhen. Um näheren Einblick zu gewinnen, untersuchten wir den Effekt zum einen von Proteinen und Peptiden und zum anderen von Auxinen auf das pflanzliche Wachstum unter Stressbedingungen.

6.2 Wirkung von Proteinen und Peptiden

↓100

Die getesteten Fraktionen aus den Kulturfiltraten des Stammes FZB24 hatten generell auch einen positiven, konzentrationsabhängigen Einfluss auf das Spross- und Wurzelwachstum der Sämlinge unter dem Einfluss der hohen Salzbelastung. Insbesondere zeigten die Fraktionen batch-50 2 % und 14-16 20 % aus dem Kulturfiltrat der Übergangsphase, die durch Elution in 50 %-Acetonitril mittels batch-Trennung bzw. 20 %-Acetonitril mittels batch-Trennung und nachfolgender Elution ebenfalls in 20 %-Acetonitril mittels Säulen-Trennung, sowie die Fraktionen 19-25 0,2 %, 26-31 0,2 % und 32-36 2 % aus dem Kulturfiltrat der 19. h, die durch Elution in 10 %-, 20 %- bzw. 30 %-Acetonitril mittels Säulen-Trennung gewonnen wurden, eine positive Wirkung auf das Wachstum und die Toleranz der Testpflanzen gegenüber Salinität. Da die Natur der Peptide in den Fraktionen der Kulturfiltrate unterschiedlich ist (SCHUSTER 2005) konnte kein Zusammenhang zwischen der Konzentration der Peptide in den Fraktionen und der Wachstumsstimulierung und Toleranzerhöhung der Sämlinge gegenüber Salzstress ermittelt werden.

Auch der Peptidextrakt des Stammes FZB41 hatte einen fördernden, konzentrationsabhängigen Einfluss auf das Wachstum der Tomatensämlinge unter Salzbedingungen. Die höchste angewandte Konzentration von 100 µg/ml hatte dagegen eine toxische Wirkung, die sich in einer Wachstumshemmung des Sprosses und der Wurzel widerspiegelte. Die nächste Konzentration von 10 µg/ml hatte jedoch einen positiven Einfluss auf das Wachstum der Pflanzen und mit abnehmender Konzentration wurde eine zunehmend positive Wirkung beobachtet bis zur Konzentration von 0,1 µg/ml, welche den größten wachstumsstimulierenden und toleranzerhöhenden Einfluss zeigte. Weitere Verdünnungen bis zur Konzentration von 0,001 µg/ml führten zu einer Abnahme des weiterhin positiven Einflusses auf das Wachstum der Sämlinge. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit der Mitteilung von KREBS (2003), dass die Wirksamkeit der gereinigten Iturin-ähnlichen Peptide, welche auch von B. amyloliquefaciens DSM 10273 produziert werden (KREBS et al. 1996), hinsichtlich der pflanzlichen Wachstumsförderung in dem Bereich <10 µg/ml liegt.

Da es in der Literatur keine Hinweise auf einen direkten Einfluss von Peptiden und Proteinen auf das Entstehen von Salzschäden gibt, kann die positive Wirkung der Peptide, die von B. subtilis-Stämmen produziert werden nur mittelbar auf eine Toleranzinduktion durch Wachstumsverbesserung der Pflanzen zurückgeführt werden.

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Eine unmittelbare Resistenz- bzw. Toleranzinduktion bei Pflanzen durch Stoffwechselprodukte von B. subtilis gegenüber abiotischen Stressoren ist noch nicht untersucht worden, gegen biotische Stressoren aber in der Literatur oft beschrieben. So beobachtete DOLEJ (1998) durch die Anwendung der Subfraktion G3, die nach Essigsäureethylesterextraktion aus dem Kulturfiltrat der fermentativen Übergangsphase eines FZB B. subtilis-Stammes gewonnen wurde mit nachfolgender HPLC-Trennung, eine Wachstumsstimulierung bei Tomatensämlingen und eine Resistenzinduktion gegenüber Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici. Die positive Wirkung der G3 Fraktion variierte jedoch mit der angewandten Konzentration. Die Untersuchungen von ALEMAYEHU (1997) bei Suspensionskulturen mit Wildtomatenzellen bestätigen die wachstumsfördernde und insbesondere die toleranzerhöhende Wirkung gegenüber Fusarinsäure dieser Fraktion aus dem Kulturfiltrat des Stammes FZB14 und belegen eine Auxin-ähnliche Aktivität.

GUPTA et al. (2000) konnten mittels Gelchromatographie eine Fraktion, Tr-C, aus dem Kultrufiltrat der Übergangsphase des B. subtilis-Stammes FZB14 gewinnen, deren Anwendung in 2 %-Konzentration eine erhebliche Stimulierung des Wurzelwachstums von Tomatensämlingen und auch eine signifikante Resistenz- oder Toleranzerhöhung gegenüber Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici induzierte. Die 1 %-Konzentration von Tr-C zeigte jedoch keine vergleichbare Wirkung. Eine beobachtete Ähnlichkeit zwischen den Eigenschaften von Tr-C und Indol-3-pyruvat (IPyA) führte zu der Schlussfolgerung, dass Tr-C einen Elicitor enthält, der IPyA ähnelt und an der Signalauslösung und -transduktion oder der Aktivierung eines Abwehrgens beteiligt ist.

Auch KILIAN et al. (2000) demonstrieren die toleranzerhöhende Wirkung des Stammes FZB24 gegenüber biotischen Stressoren. Sie vertreten die Meinung, dass die Produktion von Proteasen durch B. subtilis zu einer Freilassung von Fragmenten aus pflanzlichen Zellwänden führen könnte, die als Signalstoffe für eine Resistenzinduktion dienen.

6.3 Wirkung von Auxinen

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Die von uns getesteten Auxine hatten insgesamt deutlich erkennbare positive Effekte auf das Wachstum, die Adventivwurzelbildung und den Wassergehalt der Testpflanzen, abhängig von der Auxin-Form, der Konzentration und der Applikationsmethode.

Die Auxin-Präkursoren bewirkten eine deutliche Salztoleranzerhöhung bei der Testpflanze, die durch eine Stimulierung des Spross- und Wurzelwachstums und der Adventivwurzelbildung (Bewurzelungsrate, Wurzelanzahl und Wurzellänge), sowie durch eine Erhöhung des Wassergehaltes im Spross und in der Wurzel der Testpflanzen unter Salzstress erkennbar war. Das Auxin selbst bzw. die IAA zeigte positive Effekte nur hinsichtlich einer Induktion neuer Wurzeln unter Salzstress, durch eine Förderung der Bewurzelungsrate und der Wurzelanzahl im Test zur Bestimmung der Adventivwurzelbildung, während die Wurzellänge bei den getesteten Hypokotylsegmenten negativ beeinflusst wurde. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass die Abgabe von Auxin-Präkursoren durch B. subtilis bei Besiedlung der Pflanze eine verstärkte Biosynthese des Phytohormons innerhalb der Pflanze induzieren könnte. Eine höhere IAA-Biosynthese in der Pflanze, die möglicherweise direkt in der bakterisierten Wurzel stattfindet, die nach TAIZ und ZEIGER (2000) mit ein Ort der IAA-Biosynthese ist, könnte trotz Salzstress ein verbessertes Wurzelwachstum bei den Pflanzen bewirken und folglich eine höhere Wasseraufnahme, wie durch die Erhöhung des Wassergehaltes gezeigt werden konnte.

Verständnis für diesen toleranzerhöhenden Prozess ließe sich aus der pflanzlichen Auxin-Biosynthese ableiten. Die IAA-Biosynthese erfolgt bei Pflanzen vorwiegend in den Apikalmeristemen des Sprosses, in jungen Blättern und reifenden Früchten und, wenn auch in geringeren Raten, in reifen Blättern und Wurzelspitzen. Es ist vielfach bewiesen, dass Pflanzen Tryptophan (TRP) über mehrere Stoffwechselwege in IAA umwandeln (TAIZ und ZEIGER 2000). Unter diesen Stoffwechselwegen ist die L-TRP-abhängige IAA-Biosynthese die am meisten charakterisierte Umwandlung (FRANKENBERGER und ARSHAD 1995). Radioaktive Markierungen in Zusammenhang mit der Beobachtung, dass D-TRP das Sämlingswachstum effektiver stimulierte als L-TRP, führten zu der Hypothese, dass das D-Isomer für die pflanzliche IAA-Synthese verwendet wird. Neuere Untersuchungen zeigen aber, dass die Pflanzen nur L-TRP in IAA umwandeln können (NORMANLY et al. 1995). Der bedeutendste Tryptophan-abhängige Biosyntheseweg ist der Indol-3-pyruvat (IPyA)-Weg (Abb. 33), in dem TRP zu IPyA desaminiert und dann zu Indol-3-acetaldehyd (IAAld) decarboxyliert wird (TAIZ und ZEIGER 2000). Das Enzym IPyA-Decarboxylase wandelt IPyA in IAAld um, das schließlich in IAA metabolisiert wird. Ein alternativer Weg der IAA-Biosynthese könnte in manchen Pflanzen über den Tryptamin (TAM)-Weg verlaufen, d. h. über Decarboxylierung von TRP zu TAM und nachfolgender oxidativer Desaminierung zu IAAld, welches dann direkt in IAA metabolisiert wird (NONHEBEL et al. 1993). DE LUCA et al. (1989) haben das Enzym TRP-Decarboxylase, welches die Umwandlung von L-TRP zu TAM katalysiert, sequenziert und kloniert. Im Indol-3-acetonitril (IAN)-Weg wird TRP zuerst in Indol-3-acetaldoxim (IAOX) und dann in IAN metabolisiert (TAIZ und ZEIGER 2000). Dann wird IAN durch das Enzym Nitrilase in IAA umgewandelt (NORMANLY et al. 1997). Da aber die Verbreitung von Nitrilase begrenzt ist, wird die Bedeutung dieses Enzyms als gering eingestuft (NONHEBEL et al. 1993). IAN und andere Zwischenprodukte des IAN-Stoffwechselweges wurden hauptsächlich in der Familie Brassicaceae nachgewiesen, weshalb dieser Reaktionsweg von geringer Bedeutung zu sein scheint (NORMANLY et al. 1995). Manche pflanzenassoziierten Mikroorganismen, wie evtl. auch B. subtilis, nutzen auch den IAN-Weg um IAA zu synthetisieren. Sie wandeln IAN in IAA um durch eine Nitrilase, oder eine Nitril-Hydratase und eine Amidase (NORMANLY et al. 1997). Manche phytopathogene Bakterien, wie Pseudomonas savastanoi und Agrobacterium tumefaciens, nutzen den Indol-3-acetamid (IAM)-Weg. In diesem Biosyntheseweg wird TRP durch das Enzym TRP-Monoxygenase in IAM umgewandelt, welches dann durch die IAM-Hydrolase in IAA metabolisiert wird. Die Auxine, die von diesen Bakterien gebildet werden erzeugen oft krankhafte morphologische Veränderungen bei den Wirtspflanzen (TAIZ und ZEIGER 2000).

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Unterschungen mit TRP-Mutanten haben kürzlich die Existenz eines TRP-unabhängigen IAA-Biosyntheseweges gezeigt, der sich wahrscheinlich bei Indol oder seiner Vorstufe Indol-3-glycerinphosphat vom TRP-abhängigen Biosyntheseweg verzweigt (NORMANLY et al. 1995). Das verändert jedoch nicht die Tatsache, dass viele Pflanzen TRP in IAA umwandeln können, teilweise in wichtigen Mengen für den pflanzlichen Auxinhaushalt (BANDURSKI et al. 1995).

Abb. 33: Tryptophan-abhängige Biosynthesewege der Indol-3-essigsäure

Nach SCHNEIDER et al. (1972) könnte die Indol-3-essigsäure (IAA)-Biosynthese in der Tomate über den Tryptamin (TAM)-Weg erfolgen, da sie Tryptophan (TRP), TAM, IAA und in geringer Menge auch das unstabile Indol-3-acetaldehyd (IAAld) in Tomatensprossen nachweisen konnten. Und obwohl der Nachweis von Indol-3-pyruvat (IPyA) und Indol-3-acetonitril (IAN) erfolglos war, wird der IPyA-Weg nicht ausgeschlossen aufgrund der Unstabilität von IPyA und der damit verbundenen Schwierigkeiten. Sie berichten, dass Tomatenpflanzen die höchsten IAA-Gehalte in vegetativem Gewebe aufweisen. COONEY und NONHEBEL (1991) vertreten die Meinung, dass IPyA der wichtigste oder einzige Präkursor in Tomatensprossen sein könnte, da IPyA der meist markierte Bestandteil war und auch in ähnlichen Mengen mit IAA nachgewiesen wurde. TAM konnte ebenfalls isoliert und charakterisiert werden und ist deshalb auch ein mögliches Zwischenprodukt der IAA-Biosynthese in der Tomate, jedoch nicht das hauptsächliche, wie durch Deuterium-Markierung demonstriert wurde. Indol-3-acetaldoxim (IAOX) konnte nicht nachgewiesen werden, könnte jedoch in geringen Mengen, ein nativer Bestandteil der Tomate sein. Nach NONHEBEL et al. (1993) ist IPyA ein nativer Bestandteil der Tomate und wahrscheinlich der Hauptpräkursor von IAA, denn die Markierungsrate von IPyA war exakt vereinbar mit der Markierungsrate von IAA, das deckt sich interessanterweise mit unseren Versuchserfahrungen. TAM wurde ebenfalls als endogener Bestandteil der Tomate nachgewiesen und kann bei exogener Applikation sogar in IAA umgewandelt werden, zeigte aber eine ähnliche Markierungsrate wie die von IAA und ist deshalb wahrscheinlich kein Präkursor des Phytohormons, sowie IAOX, dessen Nachweis erfolglos war. TRP ist dagegen ein IAA-Präkursor in der Tomate.

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Bei der Wurzelapplikation der Auxin-Präkursoren in unseren Versuchen wurde unter Salzstress insgesamt eine Förderung des Wurzelwachstums durch hohe Konzentrationen und des Sprosswachstums durch niedrige Konzentrationen beobachtet. Bei der Blattaplikation dagegen stimulierten die hohen Konzentrationen das Sprosswachstum. Das deutet auf eine unterschiedliche Sensitivität des Sprosses und der Wurzel gegenüber den getesteten Auxinen hin.

Es zeigte sich in unseren Tests auch deutlich eine toleranzerhöhende Wirkung bei der Wurzelapplikation der IAA-Präkursoren, die erhebliche Wachstumsverbesserungen beim Spross und bei der Wurzel der Pflanzen bewirkte, während die Blattapplikation nennenswerte Auswirkungen ausschließlich beim Spross zeigte. Die fehlende systemische Wirkung der IAA-Präkursoren bei der Blattapplikation beruht möglicherweise auf der Empfindlichkeit dieser Substanzen gegenüber Licht und Sauerstoff, da davon ausgegangen werden kann, dass die IAA-Präkursoren diesen Faktoren mehr ausgesetzt waren bei dieser Applikationsart. Außerdem wurde in unseren Tests kein Benetzungsmittel verwendet und in Verbindung mit der kürzeren Einwirkungsdauer der Substanzen bei der Blattapplikation kann eine verminderte Aufnahme der Testsubstanzen angenommen werden.

Auch andere Untersuchungen demonstrieren eine Erhöhung der Salztoleranz bei monokotylen Pflanzen durch Samenbehandlung mit natürlichen und synthetischen Auxinen oder Zusatz der Substanzen in das Medium. So konnten DARRA und SAXENA (1973) die Salztoleranz von Mais durch Samenbehandlung mit IAA erhöhen. Die Samenquellung erfolgte in 50-300 ppm IAA und die Samen wurden anschließend in Böden mit niedriger (E. C. 2,35 x 103), mäßiger (E. C. 5,85 x 103) und hoher Salinität (E. C. 8,2 x 103) gesät. Die IAA-Behandlung führte zu teilweise erheblichen Erhöhungen des Ertrags, der Aufnahme von N, P, K+, Ca++ und Mg sowie der Halmproduktion im Verhältnis zur Kontrolle. Die Na+-Aufnahme wurde dagegen negativ beeinflusst. Auch Untersuchungen von FRANKE und HASSANEIN (1976) belegen eine positive Beeinflussung der Salztoleranz von Mais durch Saatgutbehandlung mit Naphthylessigsäure (NAA). Durch Samenquellung in 50-380 ppm α-NAA und anschließender Übertragung in Gefäßen mit 0,1-0,3 % NaCl erzielten sie teilweise signifikante Erhöhungen der Sprosstrockenmasse der Pflanzen gegenüber der Kontrolle im Stadium der Keimung, des Auflaufs und der Jugendentwicklung. Die deutlichste positive Wirkung wurde bei hoher Substratversalzung beobachtet. Durch Einquellen von Karyopsen in α-NAA-Lösungen erzielte ROTH (1981) erhebliche Erhöhungen der Wurzeltrockenmasse von Sommerweizen bei 0,1 und 0,2 % NaCl, während die Sprosstrockenmasse negativ beeinflusst wurde. BASTIANPILLAI et al. (1982) berichten über eine Salztoleranzerhöhung bei Weizen nach Samenbehandlung und nachfolgender Blattapplikation von 1-NAA im Gewächshaus. Der positive Effekt von 1-NAA war jedoch auf die Bestockung der Pflanzen beschränkt. Eine Erhöhung der Salztoleranz durch 1-NAA konnte auch bei Gerste und Reis durch Samenbehandlung erzielt werden. Bei Gerste wurde durch Applikation von 500 und 1000 ppm 1-NAA die Wurzeltrockenmasse bei 0,1 und 0,2 % NaCl gefördert. Bei Reis konnte nur bei 0,1 % NaCl sowohl die Spross-, als auch die Wurzeltrockenmasse positiv beeinflusst werden (ROTH 1985). Die positive Wirkung von 490 µM TRP und 5,7 µM IAA nach Zusatz im Medium auf die Kallusregeneration von 2 japonica- und 2 indica-Reissorten mit unterschiedlicher Salztoleranz bei 50 mM und 100 mM NaCl demonstrieren LUTTS et al. (1999). Beide NaCl-Konzentrationen hatten eine stark hemmenden Einfluss auf die Regerationshäufigkeit bei allen Sorten, zeigten jedoch keinen deutlichen Effekt auf die Bewurzelung der Pflänzchen. TRP stimulierte die Sprossregeneration (Regenerationshäufigkeit und Anzahl der Pflänzchen/regenerierten Kallus) und die nachfolgende Überlebensrate der regenerierten Pflänzchen bei allen Sorten und beiden NaCl-Konzentrationen. IAA dagegen reduzierte die Sprossregeneration, stimulierte aber die Wurzelregeneration bzw. Bewurzelungsrate bei allen Sorten und beiden NaCl-Konzentrationen.

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Bei niederen Pflanzen wie Meeresalgen Caloglossa leprieurii, Rhizoclonium implexum und Bostrychia binderi und die Frischwasseralge Pithophora sp. zeigte sich eine IAA-Behandlung durch Zusatz im Medium ebenfalls effektiv in der Erhöhung der Salztoleranz (NOWAK et al. 1988).

Auch bei dikotylen Pflanzen gibt es Hinweise über eine Implikation von Auxinen in pflanzliche Salztoleranz. LE DILY et al. (1990) unterstreichen die Bedeutung von Auxinen und Cytokininen bei der Salztoleranz von Zuckerrüben. 68 mM NaCl stimulierten das Wachstum von Zuckerrüben-Kallus, der bis zu 137 mM NaCl tolerierte. Das Wachstum von Auxin- und Cytokinin-unabhängigem Kallus dagegen, wurde unter 34 mM NaCl stimuliert, während 68-274 mM NaCl hemmend wirkten oder letal waren. Die NaCl-Empfindlichkeit des Auxin- und Cytokinin-unabhängigen Kallus beruht nicht auf mangelnder Regulierung des osmotischen Potenzials. Vielmehr wird als Ursache ein Wasserverlust betrachtet, der durch die Senkung des osmotischen Potenzials entsteht in Verbindung mit Veränderungen der Membranpermeabilität. Einen weiteren Hinweis auf die Rolle von Auxin in der pflanzlichen Salztoleranz geben die Untersuchungen QAZI und HASNAIN (1994). Sie transformierten das Ti-Plasmid virulenter salztoleranter Stämme von Agrobacterium tumefaciens in Kalli von Brassica oleracea. Konjugationstests zeigten dass die Salztoleranz der verwendeten Stämme durch dieses Plasmid vermittelt wurden. Die transformierten Kalli waren salztolerant und hatten ohne Zusatz von Auxin im Medium 2fach bis 4,5fach höheren Auxingehalt als die Kontroll-Kalli unter Zusatz von Auxin. Zudem wurden zusätzliche Polypeptide in den transformierten Kalluskulturen nachgewiesen.

Im Gegensatz zu den positiven Effekten, die durch Samenbehandlung oder Zusatz von Auxinen im Medium festgestellt wurden, zeigen die Ergebnisse von SALAMA et al. (1981), dass eine Blattapplikation von 50 ppm IAA auf Tomatenpflanzen dem negativen Effekt von Salzstress (-3, -7 und -10 bars, NaCl und CaCl2) nicht entgegenwirken konnte. Die salzinduzierte Erhöhung der Na+-Konzentration in der Pflanze war jedoch durch IAA verhindert. Die K+-Konzentration zeigte einen unregelmäßigen Trend, ebenso wie die Mg-Konzentration, wurde aber gefördert durch IAA. Die Ca++-Konzentration wurde erhöht durch Salz und blieb unverändert nach IAA-Applikation.

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Obwohl wenig Informationen zur Verfügung stehen über Auxinwirkungen in Stress- oder Abwehrreaktionen (CHEONG et al. 2002), lassen einige Untersuchungen auf Interaktionen zwischen den molekularen Mechanismen schließen, die in der Auxinwirkung und den pflanzlichen Reaktionen gegenüber Trockenheit beteiligt sind. Auxin-unempfindliche Mutanten aus Arabidopsis thaliana zeigten z. B. differenzierte Proteinexpression gegenüber Trockenheit im Vergleich zum Wildtyp (LEYMARIE et al. 1996).

Nach SEAL et al. (2001) führte eine Entwässerung durch Behandlung mit 250 mM NaCl oder Saccharose oder Exposition in Luftströmung bei einer Auxin-autotrophen, nur unter Zusatz von 6-Benzylaminopurin (BAP) kultivierten Suspensionskultur aus Arachis hypogea, zu einem Verlust der zellulären Wachstumsfähigkeit. Im Gegensatz dazu konnten Zellen, die unter Zusatz von NAA und BAP kultiviert wurden ihr normales Wachstum nach einer solchen Behandlung fortsetzen. Eine Behandlung der Auxin-autotrophen Kultur mit NAA konnte das Wachstum dieser Zellen komplett wiederherstellen und ihre Stressempfindlichkeit ausschalten. NAA konnte den Stress nicht vermeiden, führte aber zu einer erhöhten Stresstoleranz durch die Unterstützung bei der Erholung nach dem Wasserverlust.

Andere Untersuchungen, wie die von CHEN und SINGH (1999), lassen auf Interaktionen zwischen Auxinwirkung und generellen Stressreaktionen schließen. Glutathion-S-Transferasen (GSTs) sind multifunktionelle Enzyme mit wichtigen Funktionen in pflanzlichen Stressreaktionen und so genannte ocs Elemente sind Enhancer-Sequenzen in manchen Pathogen- und GST-Promotoren. Das ocs Element im GST6 Gen aus Arabidopsis thaliana, welches eine Rolle in der Expression des GST6 Gens, insbesondere in Wurzelgeweben, spielt, ist induzierbar durch 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4D).

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Einen direkten Einfluss von Auxin auf die pflanzliche K+-Aufnahme, die nach XIONG und ZHU (2004) durch hohe Na+-Konzentrationen generell gehemmt wird und mitverantwortlich ist für die Wachstumshemmung und die verminderte Vitalität salzgestresster Pflanzen, belegen die Untersuchungen von PHILIPPAR et al. (1999). Sie isolierten 2 K+-Kanäle, ZMK1 und ZMK2, aus Maiskoleoptilen und charakterisierten sie. Mittels Auxanometer konnte das Streckungswachstum von Maiskoleoptilen nach Applikation verschiedener Indol-3-essigsäure (IAA)-Konzentrationen unter gleichzeitiger mRNA-Isolierung gemessen und gezeigt werden, dass die Transkription von ZMK1,nicht ZMK2, abhängig ist von der IAA-Konzentration. In speziellen Untersuchugen wurde eine zeitabhängige Erhöhung der Dichte der aktiven einwärts-gleichrichtenden K+-Kanäle durch 1-Naphthylessigsäure (1-NAA) beobachtet und als wahrscheinlichste Erklärung für dieses Phänomen eine auxininduzierte Erhöhung der Anzahl der aktiven Kanäle als Folge einer Fusion von neu synthetisierten K+-Kanälenim Plasmalemma angeführt. PHILIPPAR et al. (2004) demonstrieren auch eine Erhöhung der Transkriptabundanz der einwärts-gleichrichtenden K+-Kanäle der Shaker-Familie KAT1 und KAT2 nach Exposition von Arabidopsis-Sämlingen in 10 µM IAA oder 1-NAA. Die Ergebnisse lassen auf eine Beteiligung der Regulierung von KAT1 durch Auxin in dem Streckungswachstum von Arabidopsis thaliana schließen. Da in Kotyledonen, Blätter und Hypokotylen aus A. thaliana hohe Auxinkonzentrationen zu Zellteilung und niedrige Auxinkonzentrationen zu Zellstreckung führen (LJUNG et al. 2001), ist die Expression von KAT1 in etiolierten Hypokotylen mit niedriger Auxinkonzentration und Zellstreckung verbunden.

In unseren Tests zu Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen wurde in Abwesenheit von Salz ein endogener IAA-Gehalt von 2,04 nmol/g Trockenmasse nach 2-tägiger Kultivierung der Segmente gemessen oder 35,7 ng/g Frischmasse, da bei dem verwendeten Material 1 g Trockenmasse 10 g Frischmasse entspricht und IAA ein Molekulargewicht von 175,2 g hat. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit den Untersuchungen von WIGHTMAN und LIGHTY (1982), die einen IAA-Gehalt von 37 ng/g Frischmasse in 6 Wochen alten Tomatensprossen ermittelt haben. SCHNEIDER et al. (1972) berichten von einem vergleichbaren IAA-Gehalt von 50 ng/g Frischmasse in 6 Wochen alten Tomatensprossen. COONEY und NONHEBEL (1991) konnten dagegen einen IAA-Gehalt von durchschnittlich nur 7,9 ng/g Frischmasse in 4-5 Wochen alten Tomatensprossen ermitteln.

Obwohl Hypokotylsegmente aus Tomaten für den Auxin-Stoffwechsel untypisch sind, da sie eine relativ geringe IAA-induzierte Streckung zeigen und keine Hemmung des Streckungswachstums bei hohen IAA-Konzentrationen aufweisen (KELLY und BRADFORD 1986), zeigte der Test eine salzinduzierte Hemmung des IAA-Gehaltes. Das deckt sich mit den Ergebnissen von EL-ANTABLY et al. (1994), die den endogenen Gehalt von Auxinen bei Tomatenblättern 15-105 Tagen nach der Umpflanzung bei 3000 ppm, 4000 ppm und 5000 ppm NaCl ermittelt haben. Sie demonstrieren eine stärker werdende, jedoch nicht signifikante Hemmung des endogenen Gehaltes von Auxinen mit Erhöhung der NaCl-Konzentration in verschiedenen Wachstumsphasen. Darüber hinaus konnten sie erhebliche Erhöhungen von Auxin-Inhibitoren messen, mit steigender Tendenz bei höheren NaCl-Konzentrationen und fortschreitendem Alter der Pflanzen. Auch NAQVI und ANSARI (1974) konnten eine Abnahme des Auxingehaltes in Maiskoleoptilen von etwa 28 % unter Salzstress (0,4 w/v NaCl) messen. Nach MUNNS (1993) beschleunigt die fortschreitende Akkumulation von Salzen in älteren Blättern die Seneszenz und der Verlust dieser Blätter führt zu gestörter Versorgung von Phytohormonen oder Assimilaten in den wachsenden Regionen, was eine Beeinträchtigung des Wachstums zu Folge hat.

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Die Hemmung des endogenen Auxin-Gehaltes in pflanzlichen Geweben scheint eine generelle oder zumindest weit verbreitete Stressreaktion zu sein, nicht nur im Verbindung mit Salinität, sondern auch mit anderen abiotischen Stressfaktoren wie z. B. Wasserstress, Kälte und Verwundung. So verweisen GUINN und BRUMMETT (1988) auf eine Erhöhung der IAA-Esterbildung unter gleichzeitiger Abnahme des freien IAA-Gehaltes in Samenkapseln von Baumwollpflanzen und ihren Trennungsschichten nach Wasserstress. MICHAELI et al. (1999) konnten eine Hemmung des freien IAA-Gehaltes in Trennungsschichten und Blattspreiten von Ixora coccinea nach einer 3-tägigen Kältebehandlung bei 7°C messen. Die Abnahme des IAA-Gehaltes wird, zumindest teilweise, auf erhöhte IAA-Decarboxylierung und reduzierte Transportfähigkeit von Auxin zurückgeführt, die durch sekundären oxidativen Stress ausgelöst werden. Da über die Akkumulation von H2O2 nach Exposition in unterschiedliche Stressbedingungen berichtet wird, ist oxidative Decarboxylierung von IAA in gestresstem Gewebe zu erwarten, oder jedes Mal wenn sich H2O2 akkumuliert. Nach CHEONG et al. (2002) führt auch Verwundung zu Hemmung des endogenen IAA-Gehaltes durch die Aktivierung von Genen, die IAA-Glucosyltransferasen codieren, Enzyme die verantwortlich sind für die Bildung von IAA-Zucker-Verbindungen. Außerdem induziert Verwundung eine Abschwächung der Expression des Nitrilase codierenden Gens, das die Umwandlung von Indol-3-acetonitril (IAN) zu Indol-3-essigsäure (IAA) katalysiert und zur erhöhten Expression eines Gens führt, das in der negativen Regulierung der IAA-Signalkette beteiligt ist.

COHEN und BANDURSKI (1982) vertreten die Meinung, dass sich eine IAA-Konjugation während der Samenreifung und unter Bedingungen ereignet, die eine Veränderung der pflanzlichen Wachstumsrate herbeiführen. Eine exogene Applikation von Auxinen, wie IAA und Auxin-Präkursoren zu intakten Pflanzen oder pflanzlichen Segmenten führt ebenfalls zur Konjugation. Exposition zu Licht oder Ethylen führte zu Stimulierung der Auxin-Konjugation, allerdings nur bei manchen Pflanzen, während andere keine Reaktion zeigten. Nach NORMANLY et al. (1995) ist der größte Teil von IAA in pflanzlichem Gewebe an Zuckern, Peptiden, Aminosäuren oder myo-inositol durch Ester- oder Amidbindungen gebunden, obwohl die Natur der IAA-Konjugate für die meisten pflanzlichen Arten noch unbekannt ist. In Mutanten oder transgenen Pflanzen, die IAA akkumulieren, bleibt der Gehalt an freier IAA normal, während die gebundene IAA akkumuliert wird. Das führt zur Annahme, dass freie IAA die biologisch aktive Form ist und die IAA-Konjugation einen Mechanismus für die Regulierung des Phytohormons darstellt.

Unsere Tests zur Ermittlung der Aufnahme und des Transportes von Auxinen belegen, dass die Abnahme des endogenen IAA-Gehaltes unter Salzbedingungen durch eine exogene IAA-Applikation kompensiert werden kann, was auch für die IPyA zutreffend ist, allerdings in geringerem Maß. Außerdem zeigt die Dynamik des IAA-Gehaltes eine zeitliche Verlagerung des positiven Effektes von exogen applizierter IAA und IPyA unter Salzstressbedingungen.

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Folglich könnte eine IAA- oder IAA-Präkursoren-Abgabe des Rhizobakteriums B. subtilis an die Pflanze bei Wurzelbesiedlung, die beobachtete Salztoleranzerhöhung herbeiführen.

6.4 Pflanzliche Anpassungsmöglichkeiten an Salzstress

In unserem Gewächshausversuch scheint eine Ursache für die geringere Wirksamkeit der getesteten Auxine, hinsichtlich der Wachstumsförderung, in der nur kurzzeitigen Einwirkung (6 Tage) und der Salzapplikation zu liegen, die stufenweise erfolgte, um ein Absterben der Pflanzen zu vermeiden. Anfangs wurden die Sämlinge im Gewächhaus einer NaCl-Konzentration von 50 mM ausgesetzt, die nach 3 Tagen auf 100 mM erhöht wurde und diese anfängliche Exposition der Pflanzen in einer zur Hälfte reduzierten NaCl-Konzentration könnte zu einer Adaptation bei den Tomatenpflanzen geführt haben, wie z. B. Untersuchungen von CAYUELA et al. (2001) belegen. ROMERO-ARANDA et al. (2001) zeigten ebenfalls, dass eine Salz-Vorbehandlung von Tomatensämlingen im Saatbeet zu einer Toleranzerhöhung gegen weiteren Salzbedingungen im Feld oder Gewächshaus führten. Sie untersuchten die Beteiligung physiologischer Prozesse der Wachstumshemmung und der verminderten Wasseraufnahme bei Pflanzen unter Salzstress.

Auch die Behandlung von Sämlingen mit Polyethylenglycol (PEG) führte in Untersuchungen von BALIBREA et al. (1999b) zu einer Salztoleranzerhöhung bei Tomatenpflanzen.

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Bei den adaptierten Pflanzen gegenüber Salinität scheint die Erhöhung der K+-Aufnahme eine generelle physiologische Reaktion zu sein. WATAD et al. (1991) demonstrierten z. B. eine Erhöhung der Aufnahmefähigkeit von K+ in NaCl adaptierten Zellen von Nicotiana tabacum/gossii im Vergleich zu nicht-adaptierten.

Nach PALLADINA und SIMCHUK (2005b) erscheint das Plasmalemma als erste zelluläre Barriere gegen Salzstress, konkret gegenüber osmotischem Stress und Ionentoxizität, die durch Salzstress hervorgerufen werden. Diese Wirkung ist abhängig von der H+-ATPase, deren Aktivität in salzgestressten Maissämlingen gemessen wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass Exposition der Sämlinge gegenüber 50 mM NaCl die Aktivität der H+-ATPase stimulierte und gleichzeitig zu einer Erhöhung der K+-Aufnahme führte. Exposition zu 100 mM NaCl induzierte dagegen eine Abnahme der Aktivität der H+-ATPase im Plasmalemma dieser Zellen, und bewirkte eine Wachstumshemmung bei den Maissämlingen und nach PALLADINA und SIMCHUK (2005a) auch eine Verminderung der K+-Aufnahme. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit Ergebnissen von SHANNON et al. (1987) und gibt einen Einblick in den Vorgang einer begrenzten Adaptation von Pflanzen an mäßigen Salzstress.


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15.12.2005