Einleitung

Maligne Tumorerkrankungen (Neoplasien) unterscheiden sich durch destruktives und invasives Wachstum von normalen Körperzellen. Grundlagen für die Entstehung von neoplastischen Veränderungen ist die Akkumulation somatischer Mutationen zu Beginn und während der Tumorprogression, beispielsweise Chromosomeninstabilitäten, Basenmutationen, Deletionen und Insertionen. Diese können die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsupressorgenen zur Folge haben. Aber auch epigenetische Veränderungen wie z.B. DNA-Methylierung spielen im Tumorgeschehen eine Rolle. Als Folge dieser genetischen Varianz kommt es zu den folgenden Zellveränderungen:

fehlendes Ansprechen des Tumors auf wachstumsinhibierende Signale
Immortalität
Aktivierung von mitogenen Signaltransduktionswegen
fehlende Apoptose
Invasivität und Metastasenbildung

Im Jahre 2002 sind nach einer Entwicklungsstudie des Robert Koch-Instituts mehr als 200 000 Menschen in der Bundesrepublik Deutschland den Folgen einer Tumorerkrankung erlegen (Robert Koch Institut, 2006). Damit stellen maligne Neoplasien die zweithäufigste Todesursache dar, die Tendenz ist weiter steigend. Die hohe Inzidenz und Mortalität maligner Erkrankungen lassen den hohen Stellenwert, der der Prävention , der Diagnose und der Therapie zukommt, erkennen. Ziel der biomedizinischen Forschung ist es, die bestehenden Therapiekonzepte stetig zu verbessern bzw. sie durch neue Ansätze, die vor allem auf molekularbiologischer Ebene angreifen, zu ersetzen.

Die Behandlung von Malignomen erfolgt im Wesentlichen mittels operativer, strahlen- und / oder chemotherapeutischer Verfahren. Zur Effektivitätssteigerung der Behandlung wird in einem multimodalen Therapieschema vornehmlich eine Kombination der verschiedenen Verfahren eingesetzt (Dold et al., 1993). Im folgenden Abschnitt soll das Hauptaugenmerk auf die medikamentöse Behandlung mit antineoplastischen Substanzen (Chemotherapie) gerichtet werden (Kap. 1.1).

Chemotherapie

Eine Chemotherapie ist indiziert, wenn durch chirurgische Resektion der Tumor nicht vollständig erfaßt werden kann bzw. bestrahlende Maßnahmen keine Wirkung mehr zeigen. Auch zur adjuvanten bzw. neoadjuvanten Behandlung von Metastasen und hämatopoetischen Neoplasien stellt der Einsatz von Chemotherapeutika einen unverzichtbaren Bestandteil der Behandlung dar. Als Grundlage für diese Therapieform dient die Annahme, daß der Anteil an sich teilenden Zellen (Wachstumsfraktion) in einem Tumor größer ist als in normalem Gewebe (Pfreundschuh, 1999). Dementsprechend werden in der Chemotherapie Medikamente eingesetzt, die zytostatisch (potentiell reversibel) oder zytotoxisch (irreversibel) auf Zellteilungsvorgänge einwirken. Der Übergang zwischen zytostatischer und zytotoxischer Wirkung ist von der Dosierung abhängig, so daß für diese chemisch heterogene Substanzgruppe im allgemeinen der Begriff Zytostatika verwendet wird. Nach ihrem Wirkmechanismus werden Zytostatika u. a. in Alkylantien, Antimetabolite, Antibiotika, Mitosehemmstoffe, Enzyme und Hormone eingeteilt (Pfreundschuh, 1999; Wagener, 1996).

Aus der Vielzahl von Zytostatika sollen im folgenden Abschnitt zwei Vertreter, die in dieser Arbeit Verwendung fanden, vorgestellt werden.

Daunorubicin und Doxorubicin

Das aus Streptomyces peucetius gewonnene Antibiotikum Daunorubicin (Dubost et al., 1963) gehört zu der Substanzklasse der Anthrazykline. Strukturmerkmal ist ein vom polyzyklischen Naphtacen abgeleitetes Ringsystem mit einem an Ring A α-glykosidisch gebundenen Didesoxyaminozucker (Daunosamin). Doxorubicin, das 14-Hydroxy-Analogon von Daunorubicin, wurde 1969 erstmals aus der Mutante Streptomyces peucetius var. caesius isoliert und wird heute aus Daunorubicin synthetisiert (Arcamone et al., 1969).

Abbildung 1: Strukturformeln von Daunorubicin und Doxorubicin

Beide Anthrazykline besitzen ein breites antitumorales Spektrum; sowohl epitheliale als auch mesenchymale Tumoren sprechen auf diese Substanzen an. Anwendung finden sie bei der Therapie von Akuter Myeloischer Leukämie (AML), Akuter Lymphatischer Leukämie (ALL) sowie beim Mamma- und Bronchialkarzinom (Booser et al., 1994). Die Wirkung dieser Substanzen ist bei exponentiell wachsenden Zellen am stärksten, wobei Zellen in der S- und der G₂-Phase des Zellzyklus am empfindlichsten reagieren (Pratt et al., 1994). Eine Vielzahl von molekularen Mechanismen sind einzeln oder synergistisch an der therapeutischen und toxischen Wirkung beteiligt. So interkalieren Daunorubicin bzw. Doxorubicin in die Basenpaare des DNA-Doppelstranges und erhöhen dadurch die Stabilität der DNA, was zu einer Hemmung der DNA-Synthese und der DNA-abhängigen RNA-Synthese führt (Aubel-Sadron et al., 1984). Weiterhin werden Helikasen sowie die DNA-Topoisomerase I und II inhibiert. Auch scheint die Bildung von toxischen Intermediaten und die Interaktion mit der Zellmembran eine wichtige Rolle für deren Toxizität zu spielen (Tritton, 1991). Diese Eigenschaften sind auf die Bildung von alkylierenden Substanzen zurückzuführen, die an Proteine, Lipide und DNA binden können. Endergebnis aller zellulären Veränderungen ist die Einleitung des programmierten Zelltods, der Apoptose (Ling et al., 1993).

Zytostatikaresistenz von Tumorzellen

In der klinischen Praxis manifestiert sich das Problem, daß bei einer Vielzahl von Tumorentitäten die eingesetzte Chemotherapie nur unzureichend, vorübergehend oder gar nicht die zu erwartende Wirkung entfaltet. Zurückzuführen ist dies auf eine verminderte Empfindlichkeit der Zellen gegenüber den angewendeten Zytostatika, d.h. die Zellen haben eine Zytostatikaresistenz (Chemotherapie- bzw. Chemoresistenz) ausgebildet. Dabei wird unterschieden zwischen einer primären oder intrinsischen Resistenz, die per se besteht und der sekundären oder erworbenen Resistenz, die durch die Chemotherapie induziert wurde (Pastan et al., 1987).

In der klinischen Praxis kann man beobachten, daß rund die Hälfte aller Malignome nicht auf eine Chemotherapie anspricht. Ein gutes Drittel der anfänglich zytostatika-sensitiven Tumoren entwickelt im Laufe der Behandlung eine sekundäre Resistenz. Die Selektion bzw. Induktion einer resistenten Subpopulation innerhalb eines Tumors ist vermutlich der limitierende Faktor innerhalb der Chemotherapie und führt zu deren verminderten Effektivität.

Eine große Bandbreite von zellulären Mechanismen ist ursächlich für die Ausbildung einer Zytostatikaresistenz. Diskutiert werden neben unspezifischen Faktoren wie Hypoxie und langsamem Tumorwachstum die folgenden molekularen Mechanismen (Borst et al., 2002; Gottesman, 2002):

verminderte Aufnahme bzw. verstärkter Auswärtstransport des Zytostatikums
intrazellulär verminderte Aktivierung oder vermehrte Inaktivierung des Substrates
Veränderungen der Zielstrukturen auf qualitativer und quantitativer Ebene
erhöhte Reparaturkapazität der Zelle
Umschaltung auf Ersatzstoffwechsel
Veränderungen in Zellzyklus-Kontrollen und Modulation der Apoptose
räumliche Trennung des Zytostatikums vom Wirkort durch Kompartimentierung

Geht man näher auf den ersten Aufzählungspunkt ein, so muß man zuerst die Aufnahme von Zytostatika in die Zelle ausführlicher betrachten.

Zwei wichtige Mechanismen der Substanzaufnahme sollen im Folgenden betrachtet werden:

Hydrophile Substanzen, wie z.B. Nukleosidanaloga und Antifolate gelangen nur über entsprechende Transporter, Carrier oder hydrophile Poren in die Zellen. Resistenz in Bezug auf diese Substanzen beruht u. a. auf Mutationen innerhalb des Transportvehikels und einem damit verbunden Funktions- oder Lokalisationsdefekt. Es kommt dabei zur Ausbildung einer einfachen Zytostatikaresistenz (single agent resistance), da nur eine bestimmte Substanzklasse davon betroffen ist.
Hydrophobe Substanzen, wie z.B. die Naturstoffe Vinblastin, Daunorubicin, Etoposid und Paclitaxel hingegen diffundieren entsprechend des Konzentrationsgefälles über die Plasmamembran in die Zelle, ohne dabei einen Transporter zu benötigen. Die einzige Möglichkeit, die Substanzkonzentration in der Zelle zu verringern, ist dabei der verstärkte aktive Transport aus der Zelle heraus in den extrazellulären Raum (Übersicht: Ambudkar et al., 1999). Beteiligte Komponenten an diesem Auswärtstransport sind ABC ( A TP- b inding c assette)–Transporter, die eine Vielzahl von Substanzen unterschiedlichster Struktur und Wirkungsweise transportieren (Shen et al., 1998). In malignen Neoplasien führt unter anderem ihre gesteigerte Transkription bzw. Amplifikation zur Ausbildung der sogenannten pleiotropen Zytostatikaresistenz oder auch Multidrugresistenz ( m ulti d rug r e sistance, MDR).

ABC-Transporter

Die ABC-Transporterfamilie stellte eine der größten Proteinfamilien dar und importiert bzw. exportiert ein großes Spektrum an Substanzen einschließlich Peptiden, Ionen, Sacchariden, Lipiden, Medikamenten und Xenobiotika (Borst et al., 1999; Hipfner et al., 1999). Mitglieder dieser Proteinfamilie finden sich in allen Organismengruppen (Archaea, Bacteria und Eukarya) und zeichnen sich durch ihre gemeinsame strukturelle Organisation aus. Während es bei den Prokaryoten sowohl Importer- als auch Exporter-Typen gibt, existieren bei den Eukaryoten nur exportierende ABC-Proteine (Saurin et al., 1999). Ein typischer funktionell aktiver ABC-Transporter besteht aus zwei hydrophoben Transmembrandomänen (TMD) und zwei hydrophilen, zytoplasmatischen Nukleotid-Bindungsdomänen (NBD, ATP-Bindungskassette). Während die hochkonservierte ATP-Bindungskassette die Grundlage für einen energiegekoppelten Substrattransport entgegen eines Konzentrationsgradienten ist, erfolgt die Substraterkennung, –bindung und der –transport über Bereiche innerhalb der Transmembrandomäne (Higgins, 1992; Schneider and Hunke, 1998).

Bisher sind 48 humane ABC-Transporter identifiziert worden. Die Gene kodieren entweder für einen vollständigen Transporter, der aus zwei TMDs und zwei NBFs besteht, oder nur für einen Halbtransporter (Dean et al., 2001). Durch die Bildung eines Homo- bzw. Heterodimers kann aus dem letztgenannten ein funktionell aktiver Transporter gebildet werden. Entsprechend ihrer Sequenz- und Strukturhomologien werden die Gene der humanen ABC-Transporter in sieben Unterfamilien (ABCA bis ABCG) unterteilt. Nachfolgend soll nur auf einige Vertreter näher eingegangen werden.

Zur ABCB Gruppe gehört das humane Transportprotein P-Glykoprotein (MDR1), dessen nähere Beschreibung im Kap. 1.4 erfolgt (Chen et al., 1986). Dem P-Glykoprotein sowohl genetisch als auch biochemisch eng verwandt ist das MRP (multidrug resistance associated protein; ABCC1)–Transportersystem. Dieses 190 kDa große, membranständige Protein wurde erstmals in einer zytostatika-resistenten Bronchialkarzinomzellinie, in der P-Glykoprotein nicht nachgewiesen werden konnte, beschrieben. Es wird sowohl in Tumorzellen als auch im Normalgewebe exprimiert (Cole et al., 1992) und transportiert mit Glutathion oder Anionen konjugierte Substanzen (Loe et al., 1996; Borst et al., 1999). In den folgenden Jahren wurden weitere Mitglieder der MRP-Familie entdeckt, die nach Abschluß des humanen Genomprojekts 10 Mitglieder umfaßt, von denen aber nur 6 bisher näher charakterisiert wurden (Übersichten in Dean et al., 2001; Gottesman, 2002). Der Ende der neunziger Jahre beschriebene Halbtransporter BCRP (breast cancer resistance protein; ABCG2) besteht aus sechs Transmembrandomänen und einer Nukleotidbindungsstelle (Doyle et al., 1998; Miyake et al., 1999). Der in der zellulären Plasmamembran vorliegende Halbtransporter bildet mit sich selbst ein funktionell aktives Homodimer, welches eine große Bandbreite von hydrophoben Substanzen transportieren kann und die Resistenz gegenüber Mitoxantron und Topotecan vermitteln kann (Brangi et al., 1999; Litman et al., 2000; Rocchi et al., 2000).

Neben ihren vielfältigen physiologischen Funktionen spielen ABC-Transportproteine auch eine wichtige Rolle bei der Entstehung oder Therapie menschlicher Erkrankungen. Für eine erbliche Erkrankung, die auf den Defekt eines ABC-Transporters beruht ist die Zystische Fibrose (Mukoviszidose)zu nennen. Mutationen und ein damit verbundener Funktionsverlust des Chlorid-Ionenkanals CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) sind ursächlich für dieses Leiden (Gadsby et al., 2006). Ein für die Therapie von Neoplasien wichtiger Befund ist, daß für Mitglieder aus der Unterfamilie B, C und G ein Zusammenhang zur Zytostatikaresistenz in Tumorzellenhergestellt werden konnte (Tabelle 1; Gottesman und Pastan, 1993).

Gen

Lokalisation

Chemotherapie-Substrate

MDR1/P-Gp (ABCB1)

Darm, Leber, Niere, Plazenta, Blut-Hirn-Schranke

Doxorubicin, Daunorubicin, Vincristin, Paclitaxel

MRP1 (ABCC1)

ubiquitär

Vincristin, Doxorubicin, Daunorubicin, Kolchizin

MRP2/cMOAT (ABCC2)

Leber, Niere, Darm

Cisplatin, Etoposid, Methotrexat, Vincristin, Mitoxantron

BCRP (ABCG2)

Plazenta, Darm, Brust, Leber

Mitoxantron, Daunorubicin, Doxorubicin, Topotecan

Tabelle 1: ABC-Transporter assoziiert mit Zytostatikaresistenz (modifiziert nach Gottesman und Pastan, 1993)

Resistenzen gegenüber den vorstehend beschriebenen Zytostatika Daunorubicin und Doxorubicin wurden vor allem im Zusammenhang mit der Überexpression von MDR1 (Arnal et al., 2000), MRP (Benderra et al., 2000) und LRP (Den Boer et al., 1999) gefunden.

P-Glykoprotein (ABCB1, MDR1)

Das 1976 erstmals in Kolchizin-resistenten CHO (Chinese hamster ovary)–Zellen beschriebene transmembranständige P (Permeabilitäts)–Glykoprotein zählt zu den am besten untersuchten ABC-Transportern (Juliano et al., 1976).

Das humane P-Glykoprotein wird durch das auf dem Chromosom 7q21.1 gelegene MDR1 Gen kodiert und spielt als Mitglied der ABC-Transporterfamilie in der Eliminierung und Detoxifikation von diversen Substanzen eine wichtige Rolle (Schinkel, 1997; Johnson et al., 2001). In einer Vielzahl von humanen zytostatika-resistenten Tumorzellinien konnte eine Überexpression des MDR1 Genprodukts nachgewiesen werden (Kartner et al. 1983; Riordan et al., 1985). Desweiteren stellt P-Glykoprotein den ersten klonierten ABC-Transporter dar, für den durch Transfektion in Tumorzellen die Generierung eines MDR-Phänotyps (klassische Multidrugresistenz) gezeigt werden konnte (Shen et al., 1986; Ueda et al., 1987).

Lokalisation und Funktion

Das 170 kDa große Membranprotein besteht aus 1280 Aminosäuren (Abbildung 2), die zwei nahezu homologe Hälften mit je sechs Transmembransegmenten und einer ATP-Bindungskassette bilden. Eine flexible Polypeptidkette (linker Region) verbindet die beiden Bereiche miteinander. Posttranskriptionelle Modifikation des Proteins findet in Form von Glykosylierung und Phosphorylierung statt (Higgins et al., 1997).

Abbildung 2: Darstellung der zweidimensionalen Struktur (verändert nach Ambudkar et al., 2003) und Funktion von P-Glykoprotein (verändert nach Hoffmeyer et al., 2000)

Eine physiologische P-Glykoprotein-Expression findet sich in der apikalen Membran von Epithelzellen, wie z.B. der Leber, Niere, der Blut-Hirn-Schranke und in der Plazenta (Thiebaut et al., 1987; Cordon-Cardo et al., 1989; Lum et al., 1995). Vornehmlich findet sich der Transporter also in Geweben, die eine exkretorische bzw. sekretorische Funktion ausüben oder denen eine besondere Schutzfunktion zukommt, aber auch in Leukozyten sowie in CD34⁺ Stammzellen des Knochenmarks konnte eine Expression von P-Glykoprotein nachgewiesen werden (Klimecki et al., 1994; Gottesman et al., 1996).

Das Spektrum der von P-Glykoprotein transportierten Substanzen ist groß, allen gemeinsam ist ihr hydrophober bzw. amphiphatischer Charakter sowie ihre positive Ladung bei physiologischem pH-Wert (Tabelle 2).

Substanzklasse

Beispiele

Zytostatika

Vinca Alkaloide (Vinblastin)

Anthrazykline (Doxo-, Daunorubicin)

Paclitaxel, Topotecan

Antibiotika und zytotoxische Substanzen

Kolchizin, Ethidiumbromid, Puromycin

Steroide

Aldosterol, Cortisol

zyklische und lineare Peptide

Valinomycin, Gramicidin

HIV Proteaseinhibitoren

Ritonavir, Indinavir

Immunsuppressiva

Cyclosporin A

andere Substanzen

Rhodamin 123, Digoxin (Herzglykosid)

Tabelle 2: Beispiele für Substanzen, die durch P-Glykoprotein transportiert werden.

Neben der intrinsischen MDR1-Expression können auch externe Faktoren zur Induktion der MDR1-Genexpression führen. Die Charakterisierung des MDR1 Genpromotors führte zum Nachweis von definierten Sequenzbereichen, die durch solche Induktoren angesprochen werden und zur verstärkten Transkription des Gens führen (Jin et al., 1998; Labialle et al., 2002). Zu diesen Induktoren gehören auch Bestandteile der multimodalen Krebstherapie, wie Zytostatika und Strahlung (Chin et al., 1990; Kioka et al., 1992; Chaudhary et al., 1993).

Für eine Vielzahl von Tumorentitäten, wie z. B. Tumoren des Gastrointestinaltrakts (Leber, Pankreas), das Mammakarzinom und Tumoren des hämatopoetischen Systems (Leukämie, Lymphom) konnte eine Korrelation zwischen der MDR1-Überexpression und dem Ansprechen auf die Chemotherapie hergestellt werden (Trock et al., 1997; Leith et al., 1999). Demzufolge ist das Bestreben in der biomedizinischen Forschung groß, über die Hemmung des P-Glykoprotein-abhängigen Zytostatikatransports eine positive Wirkung auf den Erfolg einer Chemotherapie auszuüben.

Überwindung der P-Glykoprotein-abhängigen Multidrugresistenz „Chemosensitizer“ / MDR-Modulatoren

In den letzten zehn Jahren wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um den P-Glykoprotein-abhängigen Resistenzphänotyp aufzuheben. Hauptaugenmerk lag anfänglich auf der Inhibierung der Transportfunktion durch Substanzen, die auch gleichzeitig Transportsubstrate für P-Glykoprotein sind und durch kompetitive Hemmung agieren. In vitro konnten mehrere Substanzgruppen als potentielle Modulatoren identifiziert werden. Dazu gehören unter anderem Kalzium-Kanalblocker (z. B. Verapamil), Immunsuppressiva (z. B. Cyclosporin A), Calmodulin-Antagonisten, Antiarrhythmika und Steroidhormone. In klinischen Studien konnten diese Effekte jedoch nicht reproduziert werden, da z. B. Cyclosporin A und Verapamil durch ihre geringen Bindungsraten an P-Glykoprotein nur bei sehr hohen Serumkonzentrationen ihre Wirkung entfalten. Diese hohen Dosen führten jedoch zu massiven toxischen Nebenwirkungen und pharmakokinetischen Interaktionen mit anderen ABC-Transportern und Enzymen (Krishna et al., 2000, Ferry et al., 1996). Auch neuere und verbesserte MDR-Modulatoren vermochten in allen bisherigen klinischen Studien nicht zu überzeugen, so daß sie bisher noch nicht in Standardtherapieschemata aufgenommen wurden. Ein weiteres Manko dieser Substanzen stellte das Phänomen dar, daß Tumorzellen gegen die eingesetzten MDR-Modulatoren eine sogenannte tertiäre Resistenz entwickeln können.

RNA-Technologien zur Genregulation

Neben der Weiterentwicklung von niedermolekularen MDR-Modulatoren mit reduzierter Toxizität, werden auch andere alternative Wege zur Aufhebung der durch P-Glykoprotein hervorgerufenen Multidrugresistenz verfolgt. Dazu gehören auf RNA-Technologie-basierende gentherapeutische Strategien in Form der Applikation von Antisense-Oligonukleotiden (ASO) bzw. Ribozymen, die gegen die mRNA von MDR1 gerichtet sind. Unter Nutzung dieser Techniken konnte 1989 erstmals die MDR1 mRNA-Expression durch den Einsatz von Methylphosphonat Antisense-Oligonukleotiden erfolgreich moduliert werden (Vasanthakumar et al., 1989). In weiteren Ansätzen mit Ribozymen und Antisense-Oligonukleotiden konnte die MDR1 mRNA-Expression moduliert werden (Liu et al., 1996; Kobayashi et al., 1994). Durch ein von Holm und Kollegen konstruiertes und in die daunorubicin-resistenten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB eingebrachtes Hammerhead-Ribozym wurde eine Erniedrigung der MDR1mRNA-Expression erreicht, die mit einer Reversion des Resistenz einherging (Holm et al., 1994; Holm et al., 1995).

Eine weitere Methode zur selektiven und spezifischen Geninhibition auf posttrankriptioneller Ebene stellt die neue und zur Zeit intensiv untersuchte RNA-Interferenz Technologie dar. In dem sich anschließenden Kapitel soll näher auf den zugrundeliegenden Mechanismus und seine Nutzung in der biomedizinischen und molekularbiologischen Grundlagenforschung eingegangen werden, da er in dieser Arbeit Anwendung fand.

RNA-Interferenz

RNA-Interferenz ist ein evolutionär konservierter Mechanismus, der sich in Pflanzen, Drosophila melanogaster über Caenorhabditis elegans (C. elegans) bis hin zum Säugetier findet. Funktionell wird durch doppelsträngige RNA (dsRNA) eine Degradation der komplementären, zellulären RNA induziert und die Translation des entsprechenden Proteins reprimiert. Dieser posttranskriptionelle Vorgang erfolgt sequenzspezifisch und dient erstens dem Schutz des Genoms vor Transposons sowie exogenen Nukleinsäuren (Replikationsintermediate in der viralen Vermehrung) und zweitens der Regulation der Genexpression durch endogene micro RNAs (miRNAs) (Übersicht: Hannon, 2002).

Das oben beschriebene Phänomen konnte erstmals bei dem Versuch, die Farbe von Petunien zu intensivieren, beobachtet werden. Bei dieser Studie kam es durch das Einschleusen des Gens für ein Enzym der Anthocyansynthese statt zu einer Farbintensivierung zu einer Aufhellung der Blütenpigmentierung durch die Reduktion des endogenen farbstoffproduzierenden Enyzms (Napoli et al., 1990). Dieses pflanzliche Phänomen, dessen Grundlagen bis dahin noch nicht verstanden waren, bezeichnet man als Cosuppression oder PTGS (posttranscriptional gene silencing). Ähnliche Beobachtungen konnten auch in Pilzen gemacht werden. Dort sprach man vor der Beschreibung des RNA-Interferenz Mechanismus von Quelling (engl. unterdrücken). Die Aufklärung dieser Beobachtungen und die Prägung des Begriffs RNA-Interferenz erfolgt durch Fire et al. Sie konnten in der Nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) erstmals belegen, daß es durch 300 - 1000 bp lange doppelsträngige RNAs zu einer spezifischen und effektiven Inhibition der Genexpression kommt (Fire et al., 1998). Dabei zeigte sich, daß die dsRNA zehnmal wirkungsvoller als die Applikation einer einzelsträngigen Sense- oder Antisense-RNA war.

Genereller Mechanismus (Mammalia)

Der erste Schritt (Initiationsschritt) in dieser zellulären Kaskade (Abbildung 3) ist die Prozessierung von zytoplasmatischer, doppelsträngiger RNA in 21-23 nt lange Fragmente, den sogenannten siRNAs (small interfering RNA). Dies erfolgt durch das Enzym Dicer, welches eine katalytische RNase III Domäne und eine dsRNA Bindungsdomäne (dsRBD) enthält (Cerutti et al., 2000). Charakteristisch für die gebildeten siRNAs sind die durch die Prozessierung entstandenen Modifikationen in Form eines 5’-Monophosphats, einer 3’-Hydroxylgruppe und einem zwei Nukleotide langen Überhang am 3’-Terminus (Zamore et al., 2000; Conrad et al., 2002). Nun erfolgt die ATP-abhängige Entwindung der siRNA durch eine Helikase und die Inkorporation in den sogenannten „RNA induced silencing complex“ (RISC). Der nun separat vorliegende antisense-Strang dient als Matrize zur Lokalisation und Bindung der sequenzhomologen RNA durch Watson-Crick-Basenpaarung. Die sich anschließende endonukleolytische Spaltung erfolgt ausgehend vom 5’-Terminus zwischen dem 10. und 11. Nukleotid. Der Abbau wird durch Exonuklease-Aktivitäten komplettiert (Elbashir et al., 2001; Scherr et al., 2003). Neben der dsRNA, die durch exogene Faktoren wie Viren in den Organismus gelangt, gibt es weiterhin endogene dsRNA, die wichtige regulatorische Funktionen innerhalb der Zelle ausübt. Diese sogenannten miRNAs haben eine Größe von 22 Nukleotiden und werden aus etwa 70 Nukleotid langen pre-miRNAs mit einer imperfekten Haarnadelstruktur durch den Dicer prozessiert. Durch partielle oder komplette Bindung der miRNAs an die mRNA kommt es zu einer Translationshemmung (bei 50 - 85 % Homologie) oder zur Degradation (bei 100% Homologie) derselben (Bartel, 2004). Komponenten dieser Kaskade sind noch an weiteren Prozessen wie der Bildung von Heterchromatin beteiligt, welche durch repeat associated small interfering RNAs (rasiRNAs) oder heterochromatischen RNAs ausgelöst wird, was zu einer transkriptionellen Gensuppression führen kann (Lippmann und Martienssen, 2004)

Abbildung 3: Genereller Mechanismus der RNA-Interferenz (verändert nach Schwarz et al., 2003) Endogene pre-miRNA oder exogene dsRNA werden im ersten Schritt durch den Dicer in 21-23 nt lange Fragmente geschnitten. Diese sogenannten siRNAs werden anschließend durch eine Helikase entwunden und in den RISC inkorporiert. Der nun separat vorliegende antisense-Strang dient als Matrize zur Lokalisation und Bindung der sequenzhomologen RNA durch Watson-Crick-Basenpaarung. Die endonukleolytische Spaltung erfolgt ausgehend vom 5’-Terminus zwischen dem 10. und 11. Nukleotid. Der Abbau wird durch Exonuklease-Aktivitäten komplettiert.

Bedeutung der RNA-Interferenz für die Forschung

Nach der Entdeckung des RNA-Interferenz Mechanismus wurde sehr schnell sein Potential für die funktionelle Genomanalyse erkannt, entsprechende Methoden entwickelt und erfolgreich in Protozoen und vielen höheren Eukaryoten zur Regulation der mRNA-Expression genutzt (Montgomery et al., 1998; Waterhouse et al., 1998; Cogoni et al., 1999). In humanen Zellen konnte jedoch der Mechanismus lange Zeit nicht genutzt werden, da lange dsRNAs in diesen Zellen zur sequenzunabhängigen Aktivierung des antiviralen Interferonsystems führt, wodurch es zu einer Phosphorylierung der Proteinkinase PKR und im weiteren Verlauf zur unspezifischen Hemmung der Proteinbiosynthese kommt. Die ebenfalls aktivierte 2’-5’-Oligoadenylat-Synthetase verursacht ferner eine unspezifische Hydrolyse der mRNA und rRNA durch die Aktivierung der RNase L, was letzten Endes zum Zelltod führt (Stark et al., 1998). Mit fortschreitenden Verständnis sowohl auf genetischer als auch biochemischer Ebene ließen sich die Prozesse, die zur RNA-Interferenz führen, entschlüsseln. Es zeigte sich, daß dsRNAs von 21 bis 28-Nukleotidlänge (siRNAs) die sequenzspezifische Degradation der mRNAs „lenkt“. Die Aufklärung der Struktur von siRNAs bereitete den Weg für den Einsatz in humanen Zellen. Den tatsächlichen Durchbruch brachten aber Studien von Elbashir und Tuschl, die zeigen konnten, daß synthetische dsRNAs von 21 nt Länge, die direkt in die humane Zelle eingebracht werden, zu einer sequenzspezifischen Hemmung der Genexpression führt. Seitdem können „knock-down“ Phänotypen in Mammalia-Zellen auf verschiedene Arten hergestellt werden (Elbashir et al., 2001). Zum einen können synthetische siRNAs exogen mit Hilfe diverser Transfektionsreagenzien in die Zelle eingebracht werden. Da jedoch synthetische siRNAs bis dato noch relativ teuer sind und der daraus resultierende Phänotyp nur etwa 7-10 Replikationszyklen erhalten bleibt, ist man in jüngster Vergangenheit auf Vektoren, die siRNAs oder sogenannte shRNAs (short hairpin RNA) exprimieren, übergegangen (Elbashir et al., 2002; Holen et al., 2002; Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002). Dadurch ist die Möglichkeit gegeben, stabil transfiziert Zellen zu selektionieren, die auch nach mehreren Monaten noch eine effiziente Gensuppression zeigen (Abbildung 4). Die Etablierung der RNA-Interferenz als Technik zur gezielten Modulierung der Expression von humanen Genen in vitro folgten recht schnell erste Berichte über Anwendungen im Mausmodell. So konnte durch die Übertragung von sequenzhomologen siRNAs über die hydrodynamische Injektion in die Schwanzvene von Mäuse diverse Reportergene inhibiert werden (McCaffrey et al., 2002; Lewis et al., 2002).

Abbildung 4: Schematische Darstellung verschiedener Arten, aktive siRNA in die Zelle einzubringen bzw. zu generieren (nach Wacheck und Vornlocher, 2003).

Zielstellung der vorliegenden Arbeit

Bei der Therapie von neoplastischen Erkrankungen gibt es zwei grundlegende Probleme zu lösen. Erstens müssen die molekularen Mechanismen der Tumorprogression aufgeklärt werden, um spezifischere Behandlungsschemata mit geringeren Nebenwirkungen anbieten zu können. Zweitens ist die Modulierung von bereits bekannten Krebs- und Resistenz-assoziierten Faktoren in einem gentherapeutischen Ansatz zur Unterstützung und Verbesserung der konventionellen Therapie von entscheidender Bedeutung.

In der vorliegenden Arbeit wurde sich mit dem zweiten Punkt und hier im Speziellen mit dem ABC-Transporter MDR1/P-Glykoprotein, für den ein Zusammenhang zur Zytostatikresistenz in Tumorzellen gezeigt werden konnte, beschäftigt. Ziel war die Modulierung der Genexpression mittels RNA-Interferenz zur Reversion des Multidrugresistenz-Phänotyps sowohl in vitro als auch in vivo. Als Modellsystem für diese Untersuchungen wurden drei humane Karzinomzellinienpaare, bestehend aus einer parentalen, sensiblen sowie einer resistenten P-Glykoprotein-überexprimierenden Sublinie, ausgewählt.

Die folgenden Fragestellungen sollten bearbeitet werden:

Kann durch chemisch synthetisierte anti-MDR1 siRNAs die Expression der MDR1 mRNA und des P-Glykoproteins moduliert werden?
Wie verändern sich die Zellen nach der Modulation hinsichtlich ihrer Resistenz gegenüber den Selektionszytostatika?
Ist die Ausprägung und Dauer der Inhibition Zelltyp- und/oder Zielsequenz-abhängig?
Kann eine dauerhafte und vollständige posttranskriptionelle Inhibition der MDR1 mRNA-Expression durch shRNA-exprimierende Vektoren erreicht werden?
Kann dadurch eine komplette Aufhebung der Zytostatikresistenz erreicht werden?
Kann in den aus der chemoresistenten Mammakarzinomzellinien MaTu/ADR-abgeleiteten Maustumoren durch die intratumorale Applikation von anti-MDR1 shRNA-kodierende Vektoren die Genexpression von MDR1 inhibiert werden? Wie stark ist diese Inhibition und wann ist sie am stärksten?
Führt die intratumorale Applikation von anti-MDR1 shRNA-kodierenden Vektoren mittels Jet-Injektion im in vivo-Modell zu einer Sensitivierung der Zellen? Kommt es unter der Gabe von Doxorubicin zur Remission des Tumorwachstums?

In der nachfolgenden Projektskizze findet sich eine grobe Übersicht über die einzelnen Strategien, die zur Überwindung des P-Glykoprotein-abhängigen Resistenzphänotyps verfolgt wurden.