Für die Transfektion von humanen Tumorzellen mit siRNA Duplexen wurde im ersten Schritt die Konzentration der siRNA Einzelstränge auf 50 µM eingestellt. In der Hybridisierungsreaktion wurden 30 µl jedes Einzelstrangs mit 15 µl 5 x Hybridisierungspuffer versetzt, bei 90 °C für 1 min denaturiert und anschließend für 1 h bei 30 °C inkubiert. Für die eigentliche Transfektionsreaktion wurden 10 µl siRNA Duplexe (20 µM) mit 175 µl OptiMEM versetzt (Angaben je Kavität einer 6-well Platte). In einem zweiten Eppendorfgefäß wurden 12 µl OptiMEM mit 3 µl Oligofectamine versetzt. Beide Lösungen wurden 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. An die Vereinigung der beiden Lösungen schloß sich eine 20 minütige Inkubation bei Raumtemperatur an. In der Zwischenzeit wurden die zu transfizierenden Zellen mit 1 x PBS gewaschen und mit 800 µl OptiMEM versetzt. Nun wurden 200 µl der Lösung hinzugegeben (Konzentration in der Kavität = 200 nM) und für vier Stunden im Brutschrank inkubiert. Eine längere Inkubationszeit wurde nicht gewählt, da bekannt ist, daß die Aufnahme von siRNAs ihr Maximum nach 2–4 h erreicht (Holen et al., 2002). Zur Beendigung der Transfektionsreaktion wurden 500 µl Zellkulturmedium mit 30 % FKS zugegeben.

Die zu transfizierenden Zellen wurden in 6-well Platten so ausgesät, daß zwei Kavitäten für die Transfektion zur Verfügung standen sowie zwei für die Kontrollen: Die Kultivierung erfolgte bis zu einer Konfluenz von 50 bis 70 %. Im ersten Schritt der Transfektion (Angaben je Kavität) wurden 2 µg Plasmid-DNA mit 65 µl OptiMEM gemischt, die Lösung auf 75 µl mit 10 mM Tris-HCl (steril) aufgefüllt und gut vermischt. Nach der Zugabe von 10 µl Superfect und 5-maligem Auf- und Abpipettieren wurde das Gemisch zur Komplexbildung für 10 min bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit wurden die Zellen mit 1 × PBS gewaschen. Nach der Inkubationszeit wurde das Gemisch mit 500 µl OptiMEM versetzt und vorsichtig zu den Zellen gegeben. Die sich anschließende Inkubation dauerte drei Stunden und erfolgte im Brutschrank bei 37 °C. Danach wurden die Zellen im Mikroskop begutachtet, zweimal mit 1 × PBS gewaschen und mit dem für die Zellinie spezifischen Medium ohne Zytostatikum versetzt. Einen Tag nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen und eine Kavität mit den untransfizierten Ausgangszellen, mit Selektionsmedium (Medium mit 400 µg/ml Zeocin) versetzt. Nach dem Absterben der unter Zeocin laufenden untransfizierten Ausgangszellen wurden die transfizierten Zellen auf 10 cm² Schalen expandiert. Herangewachsene Zellklone wurden mit einer Pipettenspitze gepickt und in einer 12-well Platte unter Zeocin-Einfluß weiterkultiviert.

Zur Klonierung von PCR-Produkten in kompetente E. coli Bakterien wurde das TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen verwendet.

Für die TOPO Cloning-Reaktion wurden 4 μl des PCR-Produktes eingesetzt, mit 1 µl Salzlösung und 1 μl pCR^®2.1-TOPO-Vektor versetzt und für 5 min bei RT inkubiert. Für die Transformationsreaktion wurden die chemisch kompetenten Bakterien (TOP10) mit 2 μl TOPO Cloning-Reaktionsansatz versetzt und für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 30 sec bei 42 °C hitzegeschockt und 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 250 μl SOC-Medium wurden die Zellen zur Ausbildung der Ampicillinresistenz bei 37 °C für 60 min geschüttelt. 50-100 μl der Bakterienzellsuspension wurden auf entsprechend vorgewärmten LB-Agar-Platten mit Carbenicillin (100 µg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Kolonien gepickt und analysiert.

LB-Medium

Bacto^® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

Bacto^® Trypton

1,0 % (w/v)

NaCl

0,6 % (w/v)

in ddH₂O

SOC-Medium

Bacto^® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

Bacto^® Trypton

2 % (w/v)

NaCl

10 mM

KCl

2,5 mM

MgCl₂

10 mM

MgSO₄

10 mM

Glukose

20 mM

in ddH₂O

LB-Agar

LB-Medium

Bacto^® Agar

1,5 % (w/v)

Zur Konstruktion von shRNA-exprimierenden Vektoren wurde das Plasmid psiRNA-hH1zeo der Firma InvivoGen verwendet (Abbildung 4). Dieses Plasmid wurde speziell zur Expression kurzer synthetischer Oligonukleotide entwickelt und hat eine Größe von 2938 bp. Auf dem Vektor befinden sich bei 2565 bp und 2904 bp zwei BbsI-Schnittstellen sowie zwei AseI-Schnittstellen, die bei 2595 bp und 784 bp lokalisiert sind. Weiterhin enthält er ein LacZ Gen, welches eine spätere Unterscheidung möglicher positiver Bakterienklonen mittels Blau/Weiß-Selektion zuläßt. Die Zeocinresistenz wird dem Plasmid durch das Sh bleGen von Streptoa l loteichus hindustanus verliehen, welches für ein Protein kodiert, das an Zeocin bindet, wodurch es seine DNA-spaltende Aktivität verliert. Diese Kriterien sind für die spätere Selektion positiver Bakterien- bzw. Zellklonen von entscheidender Wichtigkeit.

Abbildung 5: Vektorkarte von psiRNA-hH1zeo (www.invivogen.comwww.invivogen.com)

Im ersten Schritt wurde der Vektor mittels BbsI geschnitten (Kap. 2.2.5.2) und das entstandene 2640 bp große Vektorfragment über Gelextraktion isoliert (Kap. 2.2.5.5). Die Oligonukleotide wurden hybridisiert, indem je 2 µl der Oligonukleotide (25 µM) mit 6 µl 0,5 M NaCl und 20 µl ddH₂O gemischt und bei 80 °C für 2 min inkubiert wurden.

Ligationsansatz:

geschnittener Vektor

100 ng

hybridisierte Oligonukleotide

1 µl

T4 Polynukleotidkinase

1 U

10 x Ligationspuffer

2 µl

ddH₂O

ad 20 µl

Der obige Ansatz wurde bei 16 °C über Nacht inkubiert.

Für die Transformationsreaktion wurden 100 µl kompetente GT116 Bakterien mit 10 µl Ligationsansatz versetzt und für 30 min auf Eis gestellt. Ein 3 minütiger 42 °C heißer Hitzeschock machte die Bakterien aufnahmefähig für die Plasmide. Nach 10 min auf Eis wurden die Bakterien zur Resistenzausbildung mit 250 µl TY-Medium versetzt und eine Stunde im 37 °C Schüttler inkubiert. Im Anschluß wurden 150 µl Bakterienlösung auf vorgewärmte TY-Agarplatten mit 25 µg/ml Zeocin gebracht und über Nacht im 37 °C Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden Kolonien gepickt und analysiert.

TY-Medium

Bacto^® Hefeextrakt

0,5 % (w/v)

Bacto^® Trypton

2,0 % (w/v)

NaCl

0,6 % (w/v)

in ddH₂O

TY-Agar

TY-Medium

1 ×

Bacto^® Agar

1,5 % (w/v)

X-Gal

40 µg/ml

Zeocin

25 µg/ml

Die Präparation von Plasmid-DNA aus dem Escherichia coli Stamm GT116 bzw. aus dem Escherichia coli Stamm TOP10 erfolgte aus 37 °C Übernachtkulturen, die in 5 ml LB-Medium mit Zeocin (25 µg/ml) bzw. Carbenicillin (100 µg/ml) angezogen wurden.

Am nächsten Tag wurde 500 µl der Übernachtkultur mit 500 μl Glyzerin versetzt und als Glyzerindauerkultur bei –80 °C gelagert.

Die Präparation von Plasmid-DNA wurde unter Zuhilfenahme des QIAprep Miniprep Kits von Qiagen entsprechend der Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

Für die Präparation von Plasmid-DNA für den Einsatz im in vivo-Modell wurde das EndoFree Maxi Kit von Qiagen verwendet.

Die Präparation der Plasmid-DNA aus dem Escherichia coli Stamm GT116 erfolgte aus einer 37 °C Übernachtkultur, die in 500 ml TY-Medium mit 25 µg/ml Zeocin angeimpft wurde. Nach der Anlage von Stammkulturen wurden die restlichen Bakterien bei 6000 x g (Beckman, Rotor JLA 10.50) und 4 °C für 15 min pelletiert und in 20 ml mit RNaseA versetztem P1 Puffer resuspendiert. Nach der Zugabe von 20 ml P2 Puffer und mehrmaligem Schwenken erfolgte eine 5 minütige Inkubationsphase bei RT. Nach der alkalischen Lyse wurden 20 ml P3 Puffer zu der Lösung hinzugegeben. Das Präzipitat, bestehend aus genomischer DNA, Proteinen, Zellmembranen und SDS, wurde zum größten Teil durch eine Zentrifugation (Beckman, Rotor JLA 10.50) bei 5000 rpm und 4 °C für 10 min entfernt. Der Rest wurde unter Zuhilfenahme der QIAfilter Cartridges entfernt. In der Zwischenzeit wurde die Qiagen-tip 500 Säule mit 10 ml QBT Puffer äquilibriert. Danach wurde das geklärte Lysat auf die Säule gegeben. Der Bindung der DNA an die Säule folgte die Waschprozedur, die aus zweimaligem Waschen mit je 30 ml QC Puffer bestand. Danach wurde die Plasmid-DNA mit 15 ml Puffer QF aus der Säule eluiert. Zur Fällung der Plasmid-DNA wurde 10,5 ml 2-Propanol zum Eluat gegeben, gut gemischt und bei 10000 rpm (Beckman, JA 20) und 4 °C für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen und abermals bei 10000 rpm für 10 min zentrifugiert. Abschließend wurde das Pellet unter der Sterilbank getrocknet und in sterilem, molekularbiologischem Wasser gelöst.

Zur Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion wurde die „hot start“ DNA-Polymerase AmpliTaqGold™ verwendet und der folgende Ansatz pipettiert:

AmpliTaqGold™

0,5 µl

1 U

Matrize (cDNA oder genomische DNA)

40-500 ng

dNTPs (je 10 mM)

0,5 µl

200 µM

5’-Primer (5 µM)

1,0 µl

200 nM

3’-Primer (5 µM)

1,0 µl

200 nM

10 x PCR-Puffer (mit 15 mM MgCl₂)

2,5 µl

1 x

ddH₂O

auf 25 µl

Die Amplifikation erfolgte im Thermocycler mit folgendem Programm:

1.

12 min

94 °C

Aktivierung des Enzyms

2.

30 sec

94 °C

Denaturierung der dsDNA

3.

30 sec

Tabelle 9

Hybridisierung der Primer

4.

60 sec

72 °C

Elongation der Primer durch die Polymerase

5.

10 min

72 °C

Extension

6.

∞

4 °C

Abkühlung

Die Schritte 2 bis 4 wurden je nach zu amplifizierendem Produkt 36- bzw. 45-mal durchlaufen.

5’ und 3’ Primer

T _H [°C]

PCR-Produkt-Länge

Verwendungszweck

Aldolase fwd/rev

56 °C

249 bp

Sonde für Northern Blot, Quantifizierung mittels real-time RT-PCR

MDR1 fwd/rev

58 °C

299 bp

Sonde für Northern Blot, Quantifizierung mittels real-time RT-PCR

OL381 fwd/rev

55 °C

397 / 686 bp

Insertkontrolle

Tabelle 9: Hybridisierungstemperaturen (T_H) der verwendeten Primer

Die LightCycler-Technologie bietet die Möglichkeit, aufgrund einer mitlaufenden Standardreihe mittels mathematischer Methoden auf die Ausgangsmolekülzahl in einer Probe für eine bestimmte Matrize zu schließen. Die PCR-Ansätze waren wie folgt zusammengesetzt:

ddH₂O

18 µl

DNA Master SYBR Green I

2,0 µl

1 x

MgCl₂ (25 mM)

2,4 µl

4 mM

5’-Primer (10 µM)

1,0 µl

500 nM

3’-Primer (10 µM)

1,0 µl

500 nM

cDNA

2,0 µl

Es wurde bei jedem Lauf eine Nullkontrolle (ddH₂O) und eine Standardreihe bestehend aus 6 bis 8 Proben (10er Verdünnungsstufen) mitgeführt. Vor jeder Quantifizierung wurde der spezifische Meßpunkt der jeweiligen PCR anhand der Schmelzkurve eines Probelaufs bestimmt. Die Meßtemperatur (T_Meß) wurde so ausgewählt, daß sie knapp vor dem Abschmelzen des PCR-Produkts lag. Bei dieser Temperatur liegen eventuell vorhandene Primer-Dimere bereits als DNA-Einzelstränge vor und gehen somit nicht in das Meßergebnis mit ein.

Zur Auftrennung von RNA wurde ein 1 %iges Agarosegel mit 1 x MOPS-Puffer und 6 % Formaldehyd gegossen. MOPS und Formaldehyd wurden erst nach dem Erhitzen und Abkühlen des Gemisches auf ca. 60 °C hinzugefügt.

5-10 μg RNA wurden mit RNA-Ladepuffer (NorthernMax von Ambion) auf ein Volumen von 20 µl gebracht, bei 65 °C für 10 min denaturiert und anschließend auf Eis gestellt.

Die Auftrennung der RNA in 1 x MOPS-Puffer erfolgte bei einer Spannung von 80 V, bis die Bromphenolblau-Bande ca. ¾ der Wegstrecke durchlaufen hatte.

25 x MOPS-Puffer

MOPS

5 M

Natriumazetat

12,5 M

EDTA

0,25 M

in ddH₂O

pH 7,0

Die Northern Blot Analyse wird zum Nachweis spezifischer RNA-Sequenzen in Gesamt-RNA angewendet. Dafür wurde 5-10 μg Gesamt-RNA wie oben beschrieben (Kap. 2.2.6.2.1) im Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und unter dem UV-Transilluminator die Integrität der RNA kontrolliert. Vor dem Transfer der RNA auf eine Nylonmembran wurde das Gel zweimal 10 min in ddH₂O gespült, um den Formaldehyd zu entfernen. Weiterhin erfolgte ein 30 minütiger Waschschritt mit 10 x SSC. Der Transfer erfolgte mittels „Reversem Kapillarblotting“ (Zhou et al., 1994). Zu diesem Zweck wurden auf eine 10 cm hohe Zelluloseschicht zwei gelgroße, in 10 x SSC getränkte Whatman-Papierstreifen gelegt. Darauf wurden die Nylon-Membran und das RNA-Gel geschichtet. Die Randbereiche wurden durch eine Folie abgedeckt, um Kurzschlüsse zu vermeiden. Es folgten zwei angefeuchtete Whatman-Papiere sowie ein in 10 x SSC getränkter Schwamm.

Der Transfer erfolgte über Nacht. Nach dem Abbau wurden der Größenstandard und die ribosomalen Banden auf der Membran markiert. Die Fixierung der RNA auf der Membran erfolgte für 3 min bei 120000 mJ/cm² im UV-Crosslinker.

20 x SSC

NaCl

3,0 M

Na₃-Citrat

0,3 M

in ddH₂O

pH 7,0

Als Sonden für die radioaktive Hybridisierung wurden mittels Megaprime^TM DNA Labelling System markierte PCR-Produkte verwendet. Zu diesem Zweck wurden 25 ng PCR-Produkt in einem Endvolumen von 28 μl mit DEPC-H₂O verdünnt, nach der Zugabe von 5 μl Random-Primern bei 95 °C für 5 min denaturiert und dann auf Eis gestellt. Anschließend wurden 10 μl Labelling Puffer, 2 μl Klenow-Fragment (1 U/μl) und 5 μl ³²P-dCTP hinzugefügt. Die Amplifikation des komplementären Stranges erfolgte für 30 min bei 37 °C unter Einbau von radioaktiv markiertem dCTP. Die Denaturierung der Sonde erfolgte durch eine 5-minütige Inkubation bei 95 °C. Danach wurde die Sonde auf Eis gestellt, um eine erneute Zusammenlagerung der Einzelstränge zu verhindern.

Für die radioaktive Hybridisierung wurde die ExpressHyb™ Hybridisierungslösung verwendet. Die Prähybridisierung der Membran (Kap. 2.2.6.2.2) erfolgte bei 58 °C für ca. 30 min. Für die Hybridisierung, die bei 58 °C über Nacht erfolgte, wurde die denaturierte Sonde hinzugefügt. Am nächsten Tag wurden die Blots zweimal 30 min bei 31 °C mit Waschpuffer 1 und zweimal 30 min bei 55 °C mit Waschpuffer 2 gewaschen. Schließlich folgte die Exposition von BIOMAX MR-Filmen durch die eingeschweißten Membranen bei –80 °C.

Zur Entfernung der Sonde vom Blot wurde eine 0,5 %ige SDS-Lösung hergestellt und aufgekocht. Die entsprechenden Membranen wurden in die heiße Lösung gegeben und für 30 bis 60 min in der sich abkühlenden Flüssigkeit belassen.

Waschpuffer 1

SSC (siehe Kap. 2.2.6.2.2)

2 x

SDS

0,1 %

in ddH₂O

Waschpuffer 2

SSC (siehe Kap. 2.2.6.2.2)

0,1 x

SDS

0,1 %

in ddH₂O

Die Isolierung von kleinen RNAs (mirVana^™ miRNA Isolation Kit; Ambion) erfolgte aus T25-Flaschen. Die Zellen wurden bei 70 % Konfluenz trypsiniert, in 1 x PBS gewaschen und pelletiert. Das Pellet wurde anschließend in 150 µl RNAlater ^® aufgenommen und bei -80°C gelagert. Nach dem Auftauen wurde die Zellsuspension abermals pelletiert und nach den Angaben des Herstellers weiterverarbeitet. Die Lagerung erfolgte bei -80°C.

Der Nachweis von prozessierten siRNAs erfolgte nach einem modifizierten Protokoll für die Northern Blot Analyse. Zur Auftrennung der angereicherten miRNA (2.2.6.3.1) bei 250 V wurden 2 µg miRNA in RNA-Ladepuffer bei 65 °C für 10 min denaturiert, anschließend auf Eis inkubiert und auf ein 15 %iges denaturierendes Acrylamid-Gel (siehe unten) in eine vertikalen Apparatur in 1 × TBE-Puffer aufgetragen.

15 %iges Trenngel

Acrylamid-Bis-Acrylamid (19:1)

10 ml

10 % APS

400 µl

Harnstoff

21 g

1 x TBE

5 ml

TEMED

40 µl

ddH₂O

1 x TBE

Borsäure

90 mM

EDTA

2 mM

Tris-Base

90 mM

Vor dem Transfer der miRNA auf eine Nylonmembran wurde das Gel einmal für 10 min in 10 x SSC inkubiert und mittels reverser Kapillarmethode über 24 h transferiert und UV-fixiert.

Als Sonden wurden 10 pmol der antisense DNA-Oligonukleotide (Tabelle 6) mittels T4 Polynukleotidkinase und ³²P-dATP nach Angaben des Herstellers endmarkiert.

Die Prähybridisierung der auf die Nylonmembran fixierten miRNA erfolgte bei 65 °C in einer Prähybridisierungslösung (6x SSC, 10x Denhardt´s Reagenz, 0,2 % SDS) für 1 h. Die eigentliche Hybridisierung der miRNA in 0,1x SSC, 5x Denhardt´s Reagenz und 0,2 % SDS mit 10 pmol radioaktiv markierter antisense DNA erfolgte für 16 h unter ständiger Rotation bei Raumtemperatur. Am Folgetag wurden die Membranen 2x 30 min bei RT mit einer Lösung bestehend aus 6x SSC und 0,2 % SDS gewaschen, um unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Die Exposition der hybridisierten Membranen bei –80 °C fand in Expositionskassetten mit Verstärkerfolien statt.

10 mg Gesamtproteine wurden in 2 x Proben-Puffer auf 20 µl verdünnt, 5 min bei 95 °C denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (nach Laemmli, 1970) erfolgte in einer vertikalen Elektrophorese-Apparatur in 1 x Laufpuffer zunächst für 30 min bei 63 V, danach bei 95 V bis die Bromphenolbande aus der Gelapparatur gelaufen war.

7,5 %iges Trenngel

Acrylamid-Bis-Acrylamid (19:1)

3,75 ml

10 % APS

150 µl

ddH₂O

8,4 ml

10 % SDS

200 µl

1 M Tris-HCl (pH 8,8)

7,5 ml

TEMED

15 µl

Zur Bildung einer ebenen Gelkante während der Polymersation wurde das Trenngel mit 2-Propanol überschichtet.

4,0 %iges Sammelgel

Acrylamid-Bis-Acrylamid (19:1)

1,0 ml

10 % APS

75 µl

ddH₂O

6,4 ml

10 % SDS

100 µl

0,5 M Tris-HCl (pH 6,8)

2,5 ml

TEMED

15 µl

10 x Laufpuffer

Glyzin

144 g

SDS

10 g

Tris-Base

30 g

ddH₂0

auf 1 Liter

Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Gesamtproteine wurde das Sammelgel abgetrennt. Trenngel, Zellulosenitrat-Membran und 2 Lagen Papier wurden in 1 x Transferpuffer äquilibriert.Der Transfer erfolgte in einer semi-dry Blotapparatur (Bio-Rad) bei 12 V für 60 min, wobei die Anordnung des Papiers, der Membran und des Gels nach den Vorgaben des Herstellers durchgeführt wurde.

1 x Transferpuffer

Glyzin

150 mM

Methanol

20 %

Tris-Base

25 mM

Die geblottete Membran wurde nach dem Transfer in eine Photoschale überführt und nacheinander mit den in der Tabelle 10 angegebenen Lösungen versetzt. Diese Schritte wurden bei Raumtemperatur unter ständigem Schwenken durchgeführt.

Anwendungsdauer

Substanzen/Lösungen

1 min

0,2 % [w/v] Ponceau-S in 1 % [v/v] Essigsäure

5 min

ddH₂O

2 h oder üN

Blockingpuffer (5 % [w/v] Milchpulver, 1 x TBST)

2 h oder üN

primärer Antikörper

Antikörperverdünnung: C219 1:100, x-Actin 1:5 000 in 1 % [w/v] Milchpulver in 1 x TBST

4 x 7 min

Waschen in 1 x TBST

1 h

sekundärer Antikörper in 1 x TBS 1:10 000 verdünnt

4 x 10 min

Waschen in 1 x TBST

2 x 5 min

Waschen in 1 x TBS

Tabelle 10: Auflistung der für den Western Blot eingesetzten Lösungen und die Dauer ihrer Anwendung

Die Detektion erfolgte mittels SuperSignal^® West Pico Chemiluminescent Substrate nach den Angaben des Herstellers. Die Exposition der Blots erfolgte auf Hyperfilm ECL.

Für eine erneute Antikörperinkubation eines Blots wurden die gebunden Antikörper mittels Western Blot Recycling Kit nach den Angaben des Herstellers entfernt und die Blots wie oben beschrieben weiterbehandelt.

1 x TBST

NaCl

150 mM

Tris-Base

7 mM

Tris-HCl

43 mM

Tween^® 20

0,05 % (v/v)

pH 7,4–7,6