Für die Applikation von synthetischen siRNAs wurden zwei Duplexe mit Homologie zur MDR1 mRNA Konsensus-Sequenz konstruiert. Die siRNAs wurden zum einen nach den Literaturempfehlungen entwickelt (siRNA MDR-A), zum anderen, aufbauend auf den Erfahrungen mit der Ribozym-Technologie (siRNA MDR-B; gegen MDR1 Ribozymschnittstelle), hinsichtlich der Sekundärstruktur und damit der Zugänglichkeit der homologen Sequenz (Elbashir et al. 2001; Holm et al. 1994). Beide Zielsequenzen wurden weiterhin nach dem Muster AA(N19) ausgewählt und hatten einen GC-Gehalt von 33 % bis 38 %. Als Kontrollen dienten die Einzelstränge der siRNAs sowie für die Versuche in der Mammakarzinomzellinie eine anti-Luciferase (firefly) siRNA, die keine mRNA in der Zelle erkennt. In der Tabelle 11 sind die Zielsequenzen und deren Position in der MDR1 mRNA aufgelistet.

Duplex

Zielsequenz 5’ - 3’

Position auf der MDR mRNA ¹

siRNA MDR-A ²

AAG AAG GAA AAG AAA CCA ACU

nt 503 - 523

siRNA MDR-B ²

AAA AUG UUG UCU GGA CAA GCA

(gegen Ribozymschnittstelle)

nt 3050 - 3070

¹ Referenzsequenz NM_000927.2; ² Nieth et al., 2003

Tabelle 11:Übersicht über die verwendeten siRNAs

Die oben beschriebenen Daten zeigen eine starke temporäre Reduktion der MDR1 mRNA- und Protein-Menge in den siRNA transfizierten Zellen. Im Folgenden wurde untersucht, inwieweit die Inhibition der Genexpression von MDR1 Einfluß auf die Zytostatikresistenz der transfizierten Zellinien hat. Zu diesem Zweck wurde 24 Stunden nach der Behandlung mit anti-MDR1 siRNAs ein Zytotoxizitätsassays durchgeführt und die IC₅₀-Werte bestimmt (Fricker und Buckley, 1996; Voigt, 2005).

In beiden Tumorzellinien des Gastrointestinaltrakts (EPP85-181RDB und EPG85-257RDB) zeigte die siRNA MDR-B eine ausgeprägtere chemosensitivierende Aktivität als die siRNA MDR-A. Die 538-fache Resistenz der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB konnte durch die siRNA MDR-A auf 68-fach und durch siRNA MDR-B auf 57-fach gesenkt werden (Erniedrigung um 87 % bzw. 89 %). In der Magenkarzinomzellinie wurde im Vergleich zur EPP85-181RDB eine deutliche wenn auch geringe Sensitivierung der Zellen erreicht. So erniedrigte sich der Resistenzfaktor durch die siRNA MDR-A in diesem Zellmodell um 52 % von 595-fach auf 310-fach. Eine 42 %ige Reduktion der Resistenz von 595-fach auf 250-fach war Folge der Transfektion mit der siRNA MDR-B. Für die Kontrollen konnten Änderungen bezüglich der Resistenz für den MDR-B antisense-Strang gezeigt werden. Der chemosensitivierende Effekt betrug in der EPP85-181RDB 32 % und in der EPG85-257RDB 52 % (Abbildung 11 und 12).

Abbildung 11: Zytotoxitätsassay mit Daunorubicin in den siRNA transfizierten EPP85-181RDB

(A) Resistenzbestimmung der Zellinien und Transfektanten gegenüber Daunorubicin. Die jeweils unbehandelten Zellen wurden 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen. (B) Relative IC₅₀-Werte im Verhältnis zur sensitiven Zellinie EPP85-181P, die eins gesetzt worden ist. Die Signifikanzen wurden mit dem student’s t-Test (zweiseitig) in Bezug auf die EPP85-181RDB berechnet (ns= nicht signifikant; ** = p<0,01; *** = p<0,001 (nach Nieth et al., 2003)).

Abbildung 12: Zytotoxitätsassay mit Daunorubicin in den siRNA transfizierten EPG85-257RDB

(A) Resistenzbestimmung der Zellinien und Transfektanten gegenüber Daunorubicin. Die jeweils unbehandelten Zellen wurden 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen. (B) In diesem Balkendiagramm sind die relativen IC₅₀-Werte im Verhältnis zur sensitiven Zellinie EPG85-257P, die eins gesetzt worden ist, dargestellt. Die Signifikanzen wurden mit dem student’s t-Test (zweiseitig) in Bezug auf die EPG85-257RDB (ns= nicht signifikant; * = p<0,05; ** = p<0,01; *** = p<0,001) berechnet (nach Nieth et al., 2003).

In der zytostatika-resistenten Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR konnte mit beiden siRNAs eine Resensitivierung gegenüber Doxorubicin erreicht werden (Abbildung 13). Die Applikation der siRNA MDR-A führte zu einer Resistenzerniedrigung von 36-fach auf 10-fach (Reduktion um 72 %). Der Resistenzphänotyp konnte durch die siRNA MDR-B um 87 % in Bezug zu der Ausgangszellinie erniedrigt werden. Die einzelsträngigen siRNAs sowie die anti-Luciferase siRNA hatten keine Sensitivierung der Zellen zur Folge.

Abbildung 13: Zytotoxitätsassay mit Doxorubicin in den siRNA transfizierten MaTu/ADR

(A) Resistenzbestimmung der Zellinien und Transfektanten gegenüber Doxorubicin. Die jeweils unbehandelten Zellen wurden 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen. (B) In diesem Balkendiagramm sind die relativen IC₅₀-Werte im Verhältnis zur sensitiven Zellinie MaTu, die eins gesetzt worden ist, dargestellt. Die Signifikanzen wurden mit dem student’s t-Test (zweiseitig) in Bezug auf die MaTu/ADR (ns= nicht signifikant; ** = p<0,01) berechnet.

Nachstehend sind die Ergebnisse aus der MDR1 mRNA-Quantifizierung und der Resistenzbestimmung aller Tumorzellinien zusammengefaßt (Tabelle 12). Die Hemmung der MDR1 mRNA-Expression lag zwischen 65 und 91 % und die Repression der Resistenzphänotyps zwischen 48 – 89 %.

Reversion ¹

EPP85-181RDB

EPG85-257RDB

MaTu/ADR

siRNA MDR-A

der mRNA-Überexpression um

87 %²

87 %²

65 %³

des Resistenzphänotyps um

87 %

48 %

72 %

siRNA MDR-B

der mRNA-Überexpression um

91 %²

74 %²

77 %³

des Resistenzphänotyps um

89 %

58 %

87 %

Referenz

Nieth et al., 2003

Nieth et al., 2003

¹ in Bezug auf die resistente Zellinie

² Repression der MDR1 mRNA-Expression an Tag 2

³ maximale Repression der MDR1 mRNA-Expression

Tabelle 12: Vergleich des Resistenzphänotyps der untersuchten Karzinomzellinien nach der transienten Transfektion von anti-MDR1 siRNAs

Die Verwendung von chemisch synthetisierten anti-MDR1 siRNAs führte in den untersuchten Zellmodellen zu einer bis zu 89 %igen Aufhebung des Resistenzphänotyps (siehe Kap. 3.1 und Nieth et al., 2003). Da eine massive, aber keine vollständige Inhibition MDR1-Expression in den Zellmodellen erreicht werden konnte und sich diese nur über einen Zeitraum von maximal fünf Tagen aufrecht erhalten ließ, wurden humane Expressionssysteme entwickelt, welche endogen anti-MDR1 shRNAs (short hairpin RNAs) exprimieren. Ziel war es eine dauerhafte Aufhebung des MDR1-abhängigen Resistenzphänotyps zu erreichen. Zu diesem Zweck wurde das Vektorsystem psiRNA-hH1 (InvivoGen) ausgewählt, welches über einen RNA-Polymerase III-abhängigen H1 Promotor verfügt. Polymerase III Promotoren kontrollieren regulär in der Zelle die Transkription kurzer RNA-Moleküle ohne Poly-A-Schwanz (z.B. tRNAs), wodurch sie sich sehr gut für die Synthese von definierten shRNAs eignen. Eine Abfolge von fünf Thymidinen (T5-Terminationssignal) initiiert den Transkriptionsabbruch nach dem zweiten Uridin. Das entstandene Transkript weist am 3’-Ende einen 2 nt langen Überhang auf, der sich auch in synthetischen siRNAs wiederfindet und diese stabilisiert. Hinter diesen Promotor wurden zwei siRNA-kodierende Sequenzen (sense und antisense), die durch eine Verbindungsschleife (Loop) voneinander getrennt sind, kloniert. Nach der Expression nimmt das partielle selbst-komplementäre Transkript eine Haarnadelkonformation an, indem es interne Basenpaarungen ausbildet. Im Zytoplasma erfolgt anschließend die Prozessierung der shRNA durch den Dicer zu siRNAs (Abbildung 14).

Abbildung 14: Darstellung des Vektorsystems

(A) Sequenz der chemisch synthetisierten shRNA MDR-A DNA-Oligonukleotide mit einer schematischen Darstellung des Expressionssystems. (B) Voraussichtliche Struktur der transkribierten shRNA MDR-A, welche anschließend durch den intrazellulären Dicer in siRNAs prozessiert wird (nach Stege et al., 2004).

Für die hier durchgeführten Untersuchungen wurden shRNA-kodierende Vektoren mit verschiedenen Zielsequenzen und Größen der Verbindungsschleife hergestellt und transfiziert. Die shRNAs MDR-A und MDR-B entsprechen dabei in ihrer Zielsequenz den oben beschriebenen und bereits publizierten siRNAs (Nieth et al., 2003). Bei der Umsetzung der siRNA MDR-B in shRNA-kodierende Oligonukleotide ergab sich jedoch die theoretische Möglichkeit, daß es aufgrund einer am 3’-Ende der Zielsequenz (antisense) liegenden Abfolge von zwei Thymidinen zu einem verfrühten Transkriptionsabbruch kommt (Abbildung 15).

Abbildung 15: Sequenz der chemisch synthetisierten shRNA MDR-B DNA-Oligonukleotide

Die roten Sequenzbereiche stellen die BbsI-Überhänge der Oligonukleotide dar, während die blauen Bereiche Bestandteil des Vektors psiRNA-hH1 sind. T5 bezeichnet das Terminationssignal der RNA-Polymerase III. Unten ist die voraussichtliche Struktur der transkribierten shRNA MDR-B abgebildet.

Aus diesem Grund wurden zwei zusätzliche shRNAs (shRNA MDR-C und –D) konstruiert, deren Modulation in einer um zwei Nukleotide stromabwärts versetzte Zielsequenz bestand. Weiterhin wurde in der shRNA MDR-C die Verbindungsschleife auf 9 nt Länge vergrößert, um deren mögliche Einfluß zu untersuchen. Zur besseren Verständlichkeit sind nachstehend die verschiedenen shRNAs mit ihrer Bezeichnung und ihrer Zielsequenz aufgeführt (Tabelle 13). Als Kontrollvektoren für die anschließenden Transfektionsanalysen dienten neben dem Ausgangsvektor psiRNA-hH1 auch ein anti-GFP shRNA kodierender Vektor, dessen Transkript keine Zielsequenz in der mRNA der Zellen erkennt.

Konstrukt

Zielsequenz

Verbindungsschleife

shRNA MDR-A ¹

entspricht siRNA MDR-A; nt 503 - 528

CCACC²

shRNA MDR-B ¹

entspricht siRNA MDR-B; nt 5050 - 5070

CCACC²

shRNA MDR-C

veränderte siRNA MDR-B; nt 5052 – 5072

UUCAAGAGA

shRNA MDR-D

veränderte siRNA MDR-B; nt 5052 - 5072

CCACC²

¹ Stege et al., 2004; ² Jacque et al., 2002 ;³ Brummelkamp et al., 2002

Tabelle 13: Übersicht über die verwendeten shRNAs und ihrer Zielsequenz

Nach der Klonierung der shRNA-kodierenden Oligonukleotide in den eukaryotischen Expressionsvektor wurden die Bakterienklone anhand einer AseI Restriktion auf die Insertion kontrolliert. Nach dieser Restriktion sollten beim Ausgangsvektor, der zwei dieser Restriktionsschnittstellen trägt, zwei Fragmente von 1811 bp und 1127 bp Länge entstehen. In den shRNA-kodierenden Vektoren hingegen sollte es lediglich zu einer Linearisierung kommen. Ursache dafür ist die Entfernung der AseI Schnittstelle in der multiplen Klonierungsstelle durch eine der Klonierung vorausgegangenen Restriktion mit BbsI (Abbildung 16). Im Anschluß wurde die korrekte Insertion mittels Sequenzierung bestätigt.

Abbildung 16: Vektorkarte und Restriktionsanalyse verschiedener Bakterienklone

(A) Vektorkarte des psiRNA-hH1 Vektors mit Restriktionsschnittstellen (B) Zur Diskriminierung zwischen dem parentalen Expressionsvektor und shRNA-kodierenden Vektoren wurde ein AseI Verdau durchgeführt. Eine Insertion der shRNA Oligonukleotide hatte nur eine Linearisierung des Plasmids zur Folge, während der parentalen Vektor noch zwei Schnittstellen enthielt, die zu zwei Schnittprodukten führten.

Nach der Transfektion der shRNA-kodierenden Vektoren, des nicht modifizierten Ausgangsvektors psiRNA-hH1 und des anti-GFP shRNA-kodierenden Vektors in die Zellinien EPP85-181RDB, EPG85-257RDB und MaTu/ADR wurden jeweils 24 anti-MDR1 shRNA Transfektanten und jeweils 12 Kontrolltransfektanten (12 psiRNA-hH1 und 12 anti-GFP shRNA) mit Zeocin selektioniert und etabliert. Im Folgenden wurde die RNA aller Zellklone extrahiert und Northern Blot Analysen zur Untersuchung der MDR1 mRNA-Expression durchgeführt.

Alle Kontrolltransfektanten zeigten ein der Ausgangszellinien entsprechendes MDR1 mRNA-Niveau auf. In der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB konnte durch keine der shRNA Konstrukte eine Verminderung der MDR1 mRNA-Menge in den etablierten Klonen erreicht werden. Auch die Integration des shRNA MDR-B Expressionvektors führte in keinem Zellmodell zu einer Veränderung der MDR1 mRNA-Expression.

Durch Transfektion der Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB konnten zwei shRNA MDR-A Transfektanten mit einer fast kompletten Repression der MDR1 mRNA etabliert werden, 13 zeigten eine mittlere Expressionshöhe und bei neun Transfektanten wurde keine Veränderung zur resistenten Ausgangszellinie EPG85-257RDB detektiert. Ferner konnten sowohl in der Magen- als auch in der Mammakarzinomzellinie jeweils drei Transfektanten (shRNA MDR-C bzw. –D Vektor) mit einer starken Herrunterregulation der MDR1 mRNA-Expression, etabliert werden. Die verbliebenen Zellklone zeigten keine oder nur mäßige Effekte (Abbildung 17).

Zur Verbesserung der Übersichtlichkeit wurden für die nachfolgenden Experimente nur jeweils einer der anti-MDR1 shRNA Klone und jeweils einer der Kontrolltransfektanten (psiRNA-hH1 bzw. shRNA GFP) ausgewählt.

Abbildung 17: MDR1 mRNA-Expression in den shRNA-Transfektanten.

(A) Northern Blot Analyse zum Nachweis der MDR1 mRNA Inhibierung durch anti-MDR1 shRNAs in der Pankreaskarzinomzellinie. (B) Nachweis der MDR1 mRNA in der anti-MDR1 shRNA transfizierten EPG85-257RDB. (C) MDR1 mRNA-Expression in der resistenten Mammakarzinomzellinie nach Transfektion mit anti-MDR1 shRNAs.

Zum Nachweis der Insertion der Expressionsvektoren in die Effekttransfektanten wurde eine Vektor-spezifische PCR durchgeführt. Die verwendeten Primer binden stromauf- und stromabwärts der multiplen Klonierungsstelle auf dem Vektor, so daß anhand der Länge des PCR-Produkts zwischen Ausgangsvektor (psiRNAh-H1) und den shRNA-kodierenden Vektoren unterschieden werden kann.

Wie der Abbildung 18 zu entnehmen ist, konnte in den shRNA GFP bzw. shRNA-Transfektanten ein PCR-Produkt von 397 bp amplifiziert werden. Dieses PCR-Amplifikat entspricht dem des shRNA MDR-A kodierenden Vektors, welcher als Positivkontrolle mitgeführt worden ist. Die mit dem Ausgangsvektor transfizierte Zellinie und das Vektortemplate zeigten ein PCR-Produkt von 686 bp Länge. Aus den untransfizierten Ausgangszellinien konnte erwartungsgemäß kein PCR-Produkt amplifiziert werden.

Abbildung 18: Vektor- und Aldolase-spezifische PCR

Die Abbildung zeigt den Nachweis des shRNA-kodierenden Vektors in genomischer DNA mittels PCR (397 bp shRNA Transfektanten, 686 bp Ausgangsvektor). (A) Nachweis der Insertion für die shRNA-Transfektanten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB (B) sowie der Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR.

Die zelluläre Expression des transmembranständigen ABC-Transporters P-Glykoprotein wurde in den shRNA-exprimierenden Transfektanten mit zwei unterschiedlichen Methoden bestimmt. Zum einem wurde mittels Western Blot Analyse der Gehalt von MDR1 in den Zellinien sowie deren abgeleiteten Effektklonen bestimmt. Zum anderen erfolgte eine immunzytochemische Färbung der untersuchten Zellinien.

In Übereinstimmung mit den Daten zur MDR1 mRNA-Expression geht aus der Western Blot Analyse hervor, daß in den Kontrolltransfektanten es zu keinen Veränderungen des Proteingehalts gekommen ist. Dies gilt für beide Zellinien. Die Transfektion von shRNA-kodierenden Vektoren führte in beiden Zellinien zu einer starken Reduktion des zellulären P-Glykoproteingehalts (Abbildung 19).

Abbildung 19: Bestimmung des P-Glykoproteingehalts mittels Western Blot

(A) Bestimmung des Proteingehalts von P-Glykoprotein (170 kDa, obere Banden) mit Hilfe des mAb C219 und zur Ladekontrolle mit Aktin mit dem mAb anti-Aktin (42 kDa, untere Bande) in den Effekttransfektanten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB. (B) Zellulärer Gehalt an P-Glykoprotein in den Transfektanten der Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR.

Mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers gegen P-Glykoprotein (mAb C219) erfolgte der immunzytochemische Nachweis in den untersuchten Zellen. Für die resistente Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB konnte eine starke Überexpression von P-Glykoprotein (MDR1) im Vergleich zur sensiblen Zellinie nachgewiesen werden. Gleiches trifft auch für die Kontrolltransfektanten, die den unmodifizierten Ausgangsvektor psiRNA-hH1 bzw. shRNA GFP exprimieren, zu. Im Gegensatz dazu konnte in allen anti-MDR1 shRNA-Effektklonen nur eine geringe oder gar keine P-Glykoprotein-Expression detektiert werden (Abbildung 20).

Abbildung 20: Immunzytochemischer Nachweis des P-Glykoproteins

Die Expression des ABC-Transporters P-Glykoprotein in der Magenkarzinomzellinie und den Transfektanten wurde immunzytochemisch mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers C219 detektiert.

Durch die immunzytochemische Detektion von P-Glykoprotein konnte gezeigt werden, daß in der resistenten Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR der ABC-Transporter im Vergleich zur sensiblen Zellinie stark überexprimiert ist. Die Kontrolltransfektanten zeigten ebenfalls eine starke membranständige Färbung. Die anti-MDR1 shRNA-Effektklone hingegen zeigten eine stark verringerte P-Glykoprotein-Expression (Abbildung 21).

Abbildung 21: Immunzytochemischer Nachweis des P-Glykoproteins

Die Expression des ABC-Transporters P-Glykoprotein in der Mammakarzinomzellinie und den Transfektanten wurde immunzytochemisch mit Hilfe von mAb C219 detektiert.

Nachfolgend wurde untersucht, inwieweit die Repremierung der MDR1 mRNA durch endogene anti-MDR1 shRNAs Auswirkungen auf den Resistenzphänotyp hatten. Zu diesem Zweck wurden die sensitiven und die resistenten Sublinien in einem Zytotoxizitätsassay mit den Transfektanten verglichen sowie die IC₅₀-Werte berechnet. Anhand der ermittelten IC₅₀-Werte konnten im Anschluß die Resistenzniveaus gegenübergestellt werden.

In der shRNA MDR-A Transfektanten der Magenkarzinomzellinie konnte eine komplette Reversion des Resistenzphänotyps durch endogene shRNAs erreicht werden. In der Transfektante shRNA MDR-C wurde die Resistenz ebenfalls auf das Niveau der sensitiven Zellinie gesenkt. Die anti-MDR1 shRNA-Expression führte in dem shRNA MDR-D Klon zu einer 92 %igen Reduktion der Resistenz. Bei den Kontrollvektoren konnte kein signifikanter Einfluß auf die Sensitivität gegenüber Daunorubicin nachgewiesen werden (Abbildung 22).

Abbildung 22: Zytotoxizitätsassay mit Daunorubicin

(A) Resistenzbestimmung der Zellinien und Transfektanten gegenüber Daunorubicin. Die jeweils unbehandelten Zellen wurden 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen. (B) Relative IC₅₀-Werte im Verhältnis zur sensitiven Zellinie EPG85-257P, die eins gesetzt worden ist. Die Signifikanzen wurden mit dem student’s t-Test (zweiseitig) in Bezug auf die EPG85-257RDB berechnet (ns= nicht signifikant; *** = p<0,001).

In den shRNA MDR-C exprimierenden Transfektanten der Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR konnte eine starke Resistenzerniedrigung um 89 % erreicht werden. Die shRNA MDR-D Effekttransfektante zeigte eine annährend komplette Reversion des Resistenzphänotyps mit einer Reduktion um 95 % auf 5 % des ursprünglichen Niveaus. Die Kontrollen, bestehend aus der Vektortransfektanten (psiRNA-hH1) und der anti-GFP shRNA Transfektanten, zeigten keine signifikanten Veränderungen bezüglich der Sensitivität der Zellen gegenüber Doxorubicin (Abbildung 23).

Abbildung 23: Zytotoxizitätsassay mit Doxorubicin

(A) Resistenzbestimmung der Zellinien und Transfektanten gegenüber Doxorubicin. Die jeweils unbehandelten Zellen wurden 100 % gesetzt und die weiteren Werte in Relation zu diesem Ausgangswert berechnet. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen. (B) In diesem Balkendiagramm sind die relativen IC₅₀-Werte im Verhältnis zur sensitiven Zellinie MaTu, die eins gesetzt worden ist, dargestellt. Die Signifikanzen wurden mit dem student’s t-Test (zweiseitig) in Bezug auf die MaTu/ADR berechnet (ns= nicht signifikant; *** = p<0,001).

In Tabelle 14 sind die ermittelten IC₅₀-Werte und die Resistenzfaktoren für alle untersuchten Zellinien zusammengefaßt. Die angegebenen IC₅₀-Werte stellen Mittelwerte mit Standardfehler aus drei unabhängigen Versuchen dar. Bei der Berechnung der Resistenzfaktoren wurde jeweils der Mittelwert der sensitiven Zellinie als Bezug gewählt. Die Signifikanz hingegen wurde im Vergleich zur der resistenten Ausgangszellinie mit dem ungepaarten, zweiseitigen student’s t-Tests berechnet (ns= > 0,05 nicht signifikant; * = p<0,05; ** = p<0,01 und *** = p<0,001).

Transfektanten

IC ₅₀ -Wert [nM]

Resistenzfaktor [x-fach]

EPG85-257P

26,29 ± 3,76

1,00 ± 0,14

***

EPG85-257RDB

7385,00 ± 521,30

280,90 ± 19,83

-

EPG85-257RDB psiRNA-hH1

7128,00 ± 1673,00

271,00 ± 63,70

ns

EPG85-257RDB shRNA GFP

5413,00 ± 766,20

205,90 ± 29,14

ns

EPG85-257RDB shRNA MDR-A

20,55 ± 4,71

0,45 ± 0,16

***

EPG85-257RDB shRNA MDR-C

26,35 ± 10,23

1,00 ± 0,39

***

EPG85-257RDB shRNA MDR-D

612,40 ± 52,86

23,31 ± 2,02

***

MaTu

15,91 ± 1,56

1,00 ± 0,1

***

MaTu/ADR

463,90 ± 13,09

29,16 ± 0,82

-

MaTu/ADR psiRNA-hH1

449,80 ± 91,40

28,29 ± 2,63

ns

MaTu/ADR shRNA GFP

434,30 ± 25,25

25,69 ± 2,63

ns

MaTu/ADR shRNA MDR-C

61,94 ± 18,11

3,84 ± 1,14

***

MaTu/ADR shRNA MDR-D

21,51 ± 2,18

1,35 ± 0,14

***

Tabelle 14: IC₅₀-Werte und Resistenzfaktoren der untersuchten Zellinien

Zunächst wurde der Einfluß des via Jet-Injektion applizierten shRNA MDR-C kodierenden Vektors auf die Expression der MDR1 mRNA in Mäusetumoren untersucht. Zu diesem Zweck wurde den Mäusen 1 × 10⁷ Zellen der doxorubicin-resistenten Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR subkutan transplantiert. 19 Tage nach der Transplantation, dies entsprach einem Tumordurchmesser von 6 mm, wurden die Expressionsvektoren (psiRNA-hH1 oder shRNA MDR-C) mittels Jet-Injektion (4 × 10 µg/ 10 µl) in den Tumor eingebracht. Nach einem, zwei und drei Tagen wurden die Mäuse getötet, der Tumor isoliert, Schnitte hergestellt und RNA isoliert. Anschließend wurde die MDR1 mRNA-Expression mittels real-time RT-PCR quantifiziert.

Abbildung 25 zeigt, daß der Ausgangsvektor keinen signifikanten Effekt auf die MDR1 mRNA-Expression hatte. In dem shRNA MDR-C exprimierenden Tumorgewebe hingegen konnte eine zeitabhängige Reversion der MDR1 mRNA-Expression erreicht werden. Die maximale Repression der MDR1 mRNA war am 2. Tag mit einer 92 %igen Reduktion im Bezug auf das Ausgangsniveau nachweisbar.

Abbildung 25: Quantifizierung der MDR1 mRNA-Expression in Tumorgeweben

Dargestellt ist die relative MDR1 mRNA-Expression, normalisiert auf die GAPDH mRNA-Expression. Die MDR1/GAPDH Ratio der MaTu/ADR wurde 100 gesetzt. Die Signifikanzen wurden mit dem ungepaartem, zweiseitigen student’s t-Test in Bezug auf die MaTu/ADR (ns= nicht signifikant; * = p<0,05; ** = p<0,01) berechnet (nach Stein et al., eingereicht).

Ausgehend von dem oben genannten Versuchsaufbau wurde aus den gleichen Tumorbereichen Schnitte für den immunchemischen Nachweis von P-Glykoprotein hergestellt. Die Detektion des membranständigen Proteins mit dem monoklonalen Antikörper C219 zeigte für diejenigen Tumoren, die aus den mit dem Ausgangsvektor (psiRNA-hH1) behandelten Mäusen entnommen worden sind, eine gleichbleibend starke Färbung. Im Kontrast dazu führte die Applikation des shRNA MDR-C kodierenden Vektors zu einer starken Reduktion der P-Glykoprotein-Synthese (Abbildung 26). Zusammengefaßt führte die intratumorale Jet-Injektion des anti-MDR1 shRNA Vektors sowohl zu einer Inhibtion der mRNA-Expression als auch der Proteinsynthese in den Tumoren der Mäuse.

Abbildung 26: Immunhistochemische Färbung von P-Glykoprotein mit mAb C219

Nachweis von P-Glykoprotein in MaTu/ADR-abgeleiteten Tumoren nach Jet-Injektion des shRNA MDR-C kodierenden Vektors oder des Ausgangsvektors (psiRNA-hH1). Exemplarische Darstellung eines Tieres pro Gruppe an Tag 1, 2 und 3 nach intratumoraler Injektion (nach Stein et al., eingereicht).

Im Folgenden wurde mit sechs verschiedenen Behandlungsschemata (siehe Abbildung 27) an jeweils sechs Mäusen pro Gruppe der Einfluß der Expression der shRNA MDR-C untersucht. Zu diesem Zweck transplantierte man immundefizienten Mäusen subkutan Zellen der P-Glykoprotein-exprimierenden Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR bzw. der chemosensiblen MaTu. Nach 19 Tagen und nach 27 Tagen erfolgte die intratumorale Applikation des shRNA MDR-C kodierenden Expressionsvektors bzw. des nicht modifizierten Kontrollvektors (psiRNAh-H1) mittels low-volume Jet-Injektion (Walther et al., 2002). Die Behandlung der Tiere mit 8 mg/kg Doxorubicin oder PBS wurde intravenös an den Tagen 22 und 30 durchgeführt. An den Tagen 0, 19, 22, 27, 30, 33, 36 und 40 erfolgte jeweils die Bestimmung des Tumorvolumens.

Die Injektion des shRNA MDR-C-exprimierenden Vektors kombiniert mit der Doxorubicingabe (shRNA MDR-C i.t. + Doxo i.v.; ●) führte im Vergleich zur Kombinationstherapie bestehend aus dem Kontrollvektor und Doxorubicin (psiRNA-hH1 i.t. + Doxo i.v.; ▲;* p= 0,0156) bzw. PBS und Doxorubicin (PBS i.t. + Doxo i.v.; ■; ** p=0,0156) zu einer signifikanten Repression des Tumorwachstums. Am vierzigsten Tag war das Tumorvolumen derjenigen Versuchsgruppe, welche mit dem shRNA MDR-C Vektor und dem Doxorubicin behandelt worden ist, um 50 % reduziert im Vergleich zur Kontrollgruppe mit dem Ausgangsvektor und der Doxorubicinbehandlung. Versuchsgruppen, die den shRNA-Expressionsvektor (shRNA MDR-C i.t. + PBS i.v.; ○) bzw. den Ausgangsvektor (psiRNA-hH1 i.t. + PBS i.v.; △) intratumoral appliziert bekommen haben, zeigten nach der Gabe von PBS keine Änderungen im Tumorwachstum im Vergleich zu den nur mit PBS behandelten Mäusen (PBS i.t. + PBS i.v.; □). Besonders hervorzuheben ist, daß das Tumorvolumen in der shRNA MDR-C/Doxo-Gruppe auf das Niveau der mit Doxorubicin behandelten MaTu-abgeleiteten Tumoren (PBS i.t. + Doxo i.v.; ◆) herabgesenkt war (Abbildung 27).

Abbildung 27: Abnahme des Tumorwachstums in der Maus nach kombinierter Applikation des shRNA MDR-C kodierenden Vektors und Doxorubicin im Verlauf von 40 Tagen

Die folgenden Behandlungsschemata wurden angewendet:
MaTu PBS i.t. + PBS i.v. (◊); MaTu PBS i.t. + Doxo i.v. (◆)
MaTu/ADR PBS i.t. + PBS i.v. (□); MaTu/ADR PBS i.t. +Doxo i.v. (■)
MaTu/ADR psiRNA-hH1 i.t. + PBS i.v. (△); MaTu/ADR psiRNA-hH1 i.t. + Doxo i.v. (▲)
MaTu/ADR shRNA MDR-C i.t + PBS i.v. (○); MaTu/ADR shRNA MDR-C i.t. + Doxo i.v. (●).

Die intratumorale Applikation erfolgte an den Tagen 19 und 27, während die intravenöse Behandlung der Mäuse mit PBS bzw. Doxorubicin an den Tagen 22 und 30 durchgeführt wurde (nach Stein et al., eingereicht).