Im Kapitell 3.1 konnte demonstriert werden, daß der P-Glykoprotein-abhängige MDR-Phänotyp durch synthetische siRNAs effektiv moduliert werden kann. In allen drei Zellmodellen führte die sequenzspezifische Degradation der MDR1 mRNA zu einer Abnahme des transmembranständigen Transportproteins, was wiederum eine drastische Resensitivierung der ursprünglich multidrug-resistenten Karzinomzellinien gegenüber Anthrazyklinen zur Folge hatte.

Beide siRNA Duplexe zeigten eine signifikant erhöhte Gensuppressionsaktivität in der daunorubicin-resistenten Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene. Überdies war in diesem Zellmodell die Reversion des Anthrazyklinresistenz stärker ausgeprägt als in den beiden anderen.

Desweiteren zeigte die siRNA MDR-B in allen drei untersuchten Zellinien eine erhöhte chemosensitivierende Aktivität. Für die gastrointestinalen Tumormodelle (EPP85-181RDB und EPG85-257RDB) kann dies mit der additiven antisense-Wirkung des MDR-B antisense-Strangs erklärt werden. Dieser MDR-revertierende Effekt korreliert mit dem verringerten Gehalt an MDR1 mRNA und Protein in diesen Kontrollzellen. Als weitere Erklärungsmöglichkeit ist die Zugänglichkeit des Zielmoleküls für die siRNAs anzuführen. Während die siRNA MDR-A nach den damals in der Literatur üblichen Empfehlungen synthetisiert worden ist (Elbashir et al., 2001), wurde die siRNA MDR-B homolog zu einer gut definierten Hammerhead-Ribozymschnittstelle, die unter Einbeziehung der Sekundärstruktur der Ziel-mRNA erfolgte, ausgewählt (Holm et al., 1994). Inwieweit die Zugänglichkeit der mRNA tatsächlich einer Rolle für den effizienten Einsatz von siRNAs spielt, ist zur Zeit noch Gegenstand der Diskussion (Harborth et al., 2001; Vickers et al., 2003). In unserer Arbeitsgruppe konnte an zwei weiteren Resistenz-assoziierten ABC-Transportern (BCRP und cMOAT) ähnliche Beobachtungen wie oben beschrieben gemacht werden. In diesen Studien waren gleichermaßen siRNAs, die gegen eine gut untersuchte Ribozymschnittstelle gerichtet waren aktiver als siRNAs gegen konventionell ausgesucht Zielsequenzen (Priebsch et al., akzeptiert; Materna et al., im Druck).

Das Ausmaß der posttranskriptionellen Inhibition war in den hier verwendeten Karzinomzellinien unterschiedlich stark ausgeprägt. Die Reduktion der MDR1 mRNA-Expression bewegte sich in einem Rahmen von 65 % bis 91 % und hielt zwischen drei und fünf Tage an. Die Sensitivierung lag dabei in einem Bereich von 48 % bis 89 % und ist vergleichbar mit der chemosensitivierenden Aktivität von Hammerhead-Riboyzm-kodierenden Vektoren gegen resistenz-assoziierte Faktoren (Holm et al., 1994; Kobayashi et al., 1994 und Kowalski et al., 2002). Zum Zeitpunkt des Einreichens stellten die Ergebnisse für die gastrointestinalen Tumorzellinien die erste Arbeit dar, die erfolgreich darlegen konnte, daß ein resistenz-assoziierter Faktor durch siRNAs effektiv und spezifisch reprimiert werden kann und dies zu einer Chemosensitivierung der Zellen führt (Nieth et al., 2003). Eine im gleichen Zeitraum von Wu et al. publizierte Arbeit konnte durch zwei exogene anti-MDR1 siRNAs in multidrug-resistenten Mammakarzinom- und Ovarialkarzinomzellinien ebenfalls die Sensitivität gegenüber Doxorubicin um 67 % bis 92 % erhöhen (Wu et al., 2003). Die siRNA-abhängigen Effekte ließen sich indessen nur über 48 Stunden aufrechterhalten. Einer der verwendeten siRNA Duplexe war zudem gegen einen ähnlichen Bereich auf der MDR mRNA, wie die siRNA MDR-A, gerichtet. Auf die MDR1 mRNA Referenzsequenz NM_000927 bezogen erkannte deren siRNA einen Bereich von 508 - 528 nt innerhalb der Konsensus-Sequenz im Vergleich zum Bereich 503 – 523 nt der siRNA MDR-A. In der 61-fach doxorubicin-resistenten Ovarialkarzinomzellinie verringerte diese siRNA die Anthrazyklinresistenz um 80 % und in der 300-fach resistenten Mammakarzinomzellinien um 92 %. Ein direkter Vergleich der beiden Konstrukte bezüglich ihrer Effektivität ist aufgrund der sehr unterschiedlichen experimentellen Ansätze und Modellsysteme abschließend nicht möglich.

In keiner bisher veröffentlichten Studie konnte durch anti-MDR1 siRNAs eine komplette Inhibition der MDR1 mRNA-Expression und der Chemoresistenz erreicht werden (Übersicht: Lage, 2006).

Die Verwendung von chemisch synthetisierten siRNAs stellt wie oben gezeigt eine sehr gute Methode zur Herstellung und Untersuchung von „knockdown“ Phänotypen dar. Aufgrund der unterschiedlichen zellulären Gegebenheiten ist diese Methode jedoch in ihrer Wirkstärke begrenzt und nur von temporärer Natur. Um diese Nachteile zu umgehen, wurde Strategien zur effektiven und dauerhaften Expression endogener dsRNAs in humane Zellen entwickelt (Tuschl et al., 2002). Diese Systeme verwenden entweder Plasmide oder virale Vektoren, die eine Expressionskassette tragen, welche shRNAs produzieren. Diese werden in der Zelle anschließend durch den Dicer in die entsprechenden siRNAs prozessiert (Brummelkamp et al., 2002; Siolas et al., 2005). Eine Alternative stellt die separate Expression des sense- und antisense-Strangs dar, welche in der Zelle zu einer funktionellen siRNA hybridisieren (Miyagishi et al., 2002; Lee et al., 2002). Für die Transkription der shRNAs werden zumeist humane RNase P (H1)-RNA-, U6-snRNA-, oder Val-tRNA-Promotor verwendet, die von der RNA-Polymerase III abgelesen werden (Brummelkamp et al., 2002; Paul et al., 2002; Kawasaki et al., 2003). Neuere Arbeiten zeigen, daß die Expression von shRNAs den anderen endogenen Strategien und der Nutzung von siRNAs vorzuziehen ist, da die Inkorporation und Prozessierung durch den Dicer positive Auswirkungen auf die Effizienz der Genrepression haben (Miyagishi et al., 2003; Siolas et al., 2005).

Die oben genannten Ergebnisse verdeutlichen, daß die durch MDR1 hervorgerufene Multidrugresistenz in vitro via RNA-Interferenz nicht nur moduliert, sondern auch überwunden werden kann. Die klinische Relevanz des ABC-Transporters läßt nun aber die Frage aufkommen, inwieweit siRNA-basierende Methoden in einem gentherapeutischen Ansatz zur Unterstützung einer Chemotherapie entwicklungsfähig sind. Ein notwendiger Schritt zur Klärung dieser Frage war es deshalb, die Effektivität der hier verwendeten shRNA-kodierenden Vektoren im Versuchstier zu untersuchen. Als Tumormodell wurde die Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR, die sich aufgrund der klinischen Relevanz von Brustkrebs und der u. a. standardmäßigen Behandlung mit Doxorubicin als besonders geeignet herausstellte, verwendet.

Die Applikation des sehr wirksamen shRNA MDR-C-kodierenden Plasmids erfolgte mittels Jet-Injektion, einer effizienten Methode zum intratumoralen Transfer kleiner Mengen nackter DNA (Walther et al., 2002). Diese Methode zeichnet sich durch die hohe Geschwindigkeit, mit der die Einzelapplikationen erfolgen, aus, wodurch eine gute Penetrierung der Haut und des darunterliegenden Gewebes erreicht wird. Alle notwendigen Parameter für die in vivo Injektion sind in vorangegangen Untersuchungen bereits ausgetestet worden (Walther et al., 2006).

In den Mäusen konnte durch intratumorale Applikation des anti-MDR1 shRNA kodierenden Vektors eine komplette Wiederherstellung der Chemosensitivität gegenüber Doxorubicin in dem resistenten Tumormodell erreicht werden. Die Effizienz der kombinierten Gen- und Chemotherapie wird durch die Verminderung des in vivo Tumorwachstums auf das Volumen des von der sensiblen Zellinien-abgeleiteten Tumors reflektiert. Die Injektion des Ausgangsvektors (psiRNA-hH1) hatte keine das Tumorwachstum hemmende Wirkung. Die Analyse von Tumorschnitten nach der Injektion des anti-MDR1 shRNA Vektors zeigte die Erniedrigung der mRNA und Proteinmenge über einen Zeitraum von drei Tagen mit einem Maximum von 92 % (mRNA Expression) am zweiten Tag.

Die RNA-Interferenz-abhängigen Genrepression von murinem bzw. humanem MDR1 wurde bisher in zwei Studien in vivo untersucht. Zum einen erzielten Pichler und Kollegen durch retrovirale anti-MDR1 shRNA Vektoren eine verminderte Aktivität der Effluxpumpe (Pichler et al., 2005). Der Nachweis im Tumorimplantat erfolgte dabei am lebenden Tier über die direkte Verfolgung (bioluminescence imaging) des Renilla Luciferasefluorophors, Coelenterazin, welches ein Transportsubstrat von P-Glykoprotein ist. In einem weiteren Versuch wurde das MDR1-Firefly Luciferase (MDR1-FLuc) Fusionskonstrukt über somatischen Gentransfer mittels hydrodynamischer Infusion in die Leber der Maus eingebracht. Im Vergleich zu Kontrollmäusen kam es durch die MDR1-spezifische shRNA zu einer 4-fach erniedrigten Biolumineszenz des Reporterproteins. Es wurde damit der Nachweis erbracht, daß die in vivo Applikation der shRNA kodierenden Vektoren sowohl im Tumorimplantat als auch in der Leber zu einer Inhibition der MDR1 mRNA-Expression und dessen Funktion führen. Die zweite Arbeit beschäftigte sich mit der Inhibition der murinen mdr1a und mdr1b Gentranskripten(Matsui et al., 2005). Durch die large-volumen und high-speed Injektion von siRNAs bzw. siRNA-exprimierenden Vektoren gegen mdr1a, konnte das mRNA Niveau in der Leber im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant um 50 - 60% gesenkt werden. Die Reduktion des Proteingehalts war aber vergleichsweise gering. Ähnliche Effekte wurden bei Experimenten mit siRNA-exprimierenden Vektoren gegen mdr1a/mdr1b beobachtet.

Abschließend ist zu sagen, daß die in vivo Ergebnisse der vorliegenden Arbeit nicht nur die erstmalige Applikation eines nackten shRNA-exprimierenden Vektors in Krebszellen mittels Jet-Injektion darstellen, sondern auch die effektive Suppression der MDR1 mRNA und der Überwindung der zugrunde liegenden Multidrugresistenz in vivo darlegen.

Seit mehr als zwei Jahrzehnten werden Methoden zur Hemmung von P-Glykoprotein in multidrug-resistenten Tumorzellen, mit dem Ziel der Effektivitätssteigerung der Chemotherapie, intensiv untersucht (Ling et al., 1997). Diverse Strategien, dazu gehören pharmakologisch aktive Substanzen und Antikörper, wurden bisher verfolgt ohne den Weg vom Labor in die Klinik gefunden zu haben.

Durch den Einsatz exogener und endogener siRNAs konnte in der vorliegenden Arbeit über die Induktion der RNA-Interferenz die Expression von MDR1 gehemmt werden und eine Resensitivierung der Zellen in vitro und in vivo erreicht werden.

Die Ergebnisse aus der Applikation des anti-MDR1 shRNA-kodierenden Vektors in vivo lassen weiterhin das Potential dieser Strategie für die gentherapeutische Behandlung chemoresistenten Malignomen in Kombination mit antineoplastischen Substanzen erkennen. Bevor jedoch ein klinischer Einsatz zur Behandlung der MDR oder von Erkrankungen denkbar ist, gilt es noch mehrere Hindernisse zu überwinden. Zu allererst muß das Verständnis für den zugrunde liegenden Mechanismus noch vertieft werden, um die biologischen Grundlagen der Prozessierung durch den Dicer sowie der mRNA/siRNA-Erkennung zu verstehen und dadurch „off-target“ Effekte zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Schritt in der Entwicklung eines siRNA-basierenden Therapeutikums ist die Optimierung der pharmakokinetischen Eigenschaften von siRNA-Molekülen. Die Verwendung von bestimmten Sequenzmotiven und die chemische Modifikation am Oligonukleotid-Rückrat stellen dabei einen guten Ansatzpunkt dar, um die nötige Stabilisierung zu erreichen. Die zelluläre Aufnahme ist ebenfalls eine kritische Determinante, weshalb verstärkt an der Entwicklung von Trägermaterialien für die Verwendung in vivo geforscht wird. Das Spektrum reicht dabei von Polyethylenaminen über polymere Nanopartikel bis hin zu Liposomen. Neben der Gabe von synthetischen siRNAs und dem viralen Gentransfer besteht desweiteren die Möglichkeit der konstitutiven Induktion der RNA-Interferenz durch Plasmide oder viralen Expressionskassetten im Modellorganismus. Die erfolgreiche Anwendung von solchen Konstrukten in soliden Tumoren konnte bereits für HIV-Zielgene sowie die VEGF- und p53-RNA im Tierversuch gezeigt werden (Dykxhoorn et al., 2003; Read et al., 2003). Auf eine Therapie der P-Glykoprotein-abhängigen MDR bezogen ist die systemische Anwendung von Plasmidvektoren jedoch per se nicht möglich, da das Protein ubiquitär exprimiert wird und maßgeblich an der Detoxifikation von Xenobiotika und Neurotoxinen beteiligt ist. Alternative Strategien stellen die Weiterentwicklung von Vektoren mit Spezifität zu multidrug-resistenten Zellen und / oder eines kürzlich beschriebenen „replikationsdefizienten“ E1A-mutierten adenoviralen Vektors, der effizient und selektiv sich in P-Glykoprotein-überexprimierenden Karzinomzellen replizieren kann, dar (Labialle et al., 2005; Holm et al., 2004).

Einige der oben genannten Punkte wurden aufgegriffen und sind in unserer Arbeitsgruppe zur Zeit Gegenstand von umfangreichen Untersuchungen. Zum einen wurden mehrere siRNA MDR-B Derivate mit 2’O-Methyl-Modifikationen am sense- bzw. antisense-Strang konzipiert. In den gastrointestinalen Tumorzellinien wird gegenwärtig die Effektivität dieser Konstrukte mit der unmodifizierten siRNA verglichen werden. Ein weiterer Forschungsschwerpunkt ist die Inkapsulierung der verwendeten siRNAs in Polylactid-Co-Gylcolid (PLGA)-Nanopartikeln. In Zellkulturuntersuchungen soll geklärt werden, inwieweit die zelluläre Aufnahme dadurch verbessert werden kann und ob es zu einer Steigerung der siRNA-abhängigen Inhibition der MDR1-Expression kommt.

In der grundlagenorientierten und biomedizinischen Forschung ist die RNA-Interferenz Technologie zur funktionellen Genomanalyse und zur Generierung von „knockdown“ Tiermodellen bereits etabliert. Klinische Studien, so z.B. der Firma Alnylam zur siRNA-basierenden Behandlung der altersbedingten „feuchten“ Makulardegeneration, werden zeigen, inwieweit das gentechnische Verfahren der RNA-Interferenz in der Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden kann.