eingereicht an der

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

• 1 Einleitung

  • 1.1  Chemotherapie

    • 1.1.1  Daunorubicin und Doxorubicin

  • 1.2  Zytostatikaresistenz von Tumorzellen

  • 1.3 ABC-Transporter

  • 1.4 P-Glykoprotein (ABCB1, MDR1)

    • 1.4.1  Lokalisation und Funktion

    • 1.4.2  Überwindung der P-Glykoprotein-abhängigen Multidrugresistenz

      • 1.4.2.1 „Chemosensitizer“ / MDR-Modulatoren

      • 1.4.2.2 RNA-Technologien zur Genregulation

  • 1.5 RNA-Interferenz

    • 1.5.1  Genereller Mechanismus (Mammalia)

    • 1.5.2 Bedeutung der RNA-Interferenz für die Forschung

  • 1.6  Zielstellung der vorliegenden Arbeit

• 2 Materialien und Methoden

  • 2.1  Materialien

    • 2.1.1  Biologisches Material

      • 2.1.1.1 Antikörper

      • 2.1.1.2 Humane Karzinomzellinien

      • 2.1.1.3 Bakterienstämme und Plasmide

    • 2.1.2 Chemikalien und Fertiglösungen

    • 2.1.3  Enzyme

    • 2.1.4 Kits

    • 2.1.5 Geräte

    • 2.1.6 Nukleinsäuren

    • 2.1.7  Radionukleotide

    • 2.1.8 Software

    • 2.1.9 Verbrauchsmaterialien

  • 2.2  Methoden

    • 2.2.1  Sterilisierung von Geräten und Lösungen

    • 2.2.2 Methoden der eukaryotischen Zellkultur

      • 2.2.2.1 Kultivierung von humanen Karzinomzellen

      • 2.2.2.2 Einfrieren und Auftauen von humanen Karzinomzellen

      • 2.2.2.3 Transfektion humaner Karzinomzellinien

        • 2.2.2.3.1 Transiente Transfektion mittels Oligofectamine (Invitrogen)

        • 2.2.2.3.2 Stabile Transfektion mittels SuperFect (Qiagen)

      • 2.2.2.4 Zytotoxizitätsassay mittels Sulforhodamin B (SRB)

    • 2.2.3  in vivo Experimente

      • 2.2.3.1 Intratumorale (i.t.) in vivo-Injektion von anti-MDR1 shRNA-kodierenden Plasmiden

      • 2.2.3.2 RNA-Isolation aus Maustumoren und Quantifizierung der MDR1 Expression mittels real-time RT-PCR

      • 2.2.3.3 Immunhistochemie

    • 2.2.4  Mikrobiologische Methoden

      • 2.2.4.1 Transformation von Bakterien

        • 2.2.4.1.1 TOPO10 (Invitrogen)

        • 2.2.4.1.2 GT116 (InvivoGen)

      • 2.2.4.2 Präparation von Plasmid-DNA aus Escherichia coli

        • 2.2.4.2.1 Isolierung über das Qiagen Miniprep Kit

        • 2.2.4.2.2 Isolierung mittels EndoFree Maxi Kit für die Injektion in NMRI:nu/nu Mäuse

    • 2.2.5 Molekularbiologische Methoden

      • 2.2.5.1 Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentrationen

      • 2.2.5.2 Behandlung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

      • 2.2.5.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)

        • 2.2.5.3.1 PCR mit AmpliTaqGold™ DNA Polymerase

        • 2.2.5.3.2 Real time-RT-PCR im LightCycler

      • 2.2.5.4 Aufreinigung von PCR-Produkten

      • 2.2.5.5 Agarose-Gelelektrophorese

      • 2.2.5.6 Präparative Isolierung von DNA-Fragmenten

      • 2.2.5.7 Automatische Sequenzierung

      • 2.2.5.8 Isolierung von genomischer DNA

    • 2.2.6  RNA-Techniken

      • 2.2.6.1 RNA-Isolation mittels RNeasy mini Kit (Qiagen)

      • 2.2.6.2 Northern Blot Analyse

        • 2.2.6.2.1 Auftrennung von RNA

        • 2.2.6.2.2 Transfer

        • 2.2.6.2.3 Radioaktive Sondenmarkierung

        • 2.2.6.2.4 Hybridisierung

      • 2.2.6.3 Expressionsnachweis

        • 2.2.6.3.1  Isolierung von miRNA

        • 2.2.6.3.2 Auftrennung

        • 2.2.6.3.3 Radioaktive Hybridisierung

      • 2.2.6.4 Reverse Transkription

    • 2.2.7 Proteintechniken

      • 2.2.7.1 Isolierung von Gesamtproteinen

      • 2.2.7.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

      • 2.2.7.3 Western Blot Analyse

        • 2.2.7.3.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

        • 2.2.7.3.2 Transfer (semi-dry)

        • 2.2.7.3.3 Antikörper-Reaktion und Detektion mittels Chemolumineszenz

      • 2.2.7.4 Immunzytochemischer Nachweis von P-Glykoprotein

• 3 Ergebnisse

  • 3.1  Posttranskriptionelle Genregulation durch exogene siRNAs

    • 3.1.1  Auswahl der Zielsequenzen

    • 3.1.2 siRNA-abhängige Inhibition der MDR1 mRNA-Expression und Proteinsynthese

      • 3.1.2.1 Qualitative Analyse mittels Northern und Western Blot

      • 3.1.2.2 Quantitative Analyse der MDR1 mRNA-Expression

    • 3.1.3 Reversion des Resistenzphänotyps durch siRNAs

  • 3.2  Posttranskriptionelle Genregulation durch anti-MDR1 shRNA-kodierende Vektoren in stabilen Transfektanten

    • 3.2.1  Konstruktion eines Vektors zur endogenen Expression von shRNAs

    • 3.2.2  MDR1-Expression in den stabilen Transfektanten

    • 3.2.3 Nachweis der Expressionsvektoren in den Effekttransfektanten

    • 3.2.4 Effekte auf die P-Glykoprotein-Synthese

    • 3.2.5 Verhalten der Ausgangszellinie und der Transfektanten bei Zytostatikabehandlung

  • 3.3  In vivo Applikation des shRNA MDR-C-kodierenden Vektors in MaTu/ADR abgeleiteten Tumoren

    • 3.3.1  Quantifizierung der MDR1 mRNA-Expression im Tumorgewebe

    • 3.3.2 Immunhistochemischer Nachweis von P-Glykoprotein im Tumor

    • 3.3.3 Chemosensitivierung von MaTu/ADR-abgeleiteten Maustumoren nach der Applikation des shRNA MDR-C kodierenden Vektors

• 4 Diskussion

  • 4.1  Modulation der MDR1 Biosynthese mittels anti-MDR1 siRNAs

  • 4.2  Anwendung von shRNA exprimierenden Vektoren in vitro

    • 4.2.1  Auswahl des Vektorsystems und der Zielsequenzen

    • 4.2.2 Generierung stabiler Transfektanten

    • 4.2.3 Funktionelle Untersuchungen der Effekttransfektanten

      • 4.2.3.1 Reversion des P-Glykoprotein-abhängigen Resistenzphänotyps

  • 4.3 Anwendung von shRNA exprimierenden Vektoren in vivo

  • 4.4  Schlußbetrachtung

• Glossar

• Literaturverzeichnis

• Danksagung

• Lebenslauf

• Publikationen

• Selbständigkeitserklärung

• Tabelle 1: ABC-Transporter assoziiert mit Zytostatikaresistenz (modifiziert nach Gottesman und Pastan, 1993)

• Tabelle 2: Beispiele für Substanzen, die durch P-Glykoprotein transportiert werden.

• Tabelle 3: Humane Karzinomzellinien

• Tabelle 4: Verwendete Bakterienstämme

• Tabelle 5: Verwendete Plasmide

• Tabelle 6: Sequenzen der für die PCR verwendeten Oligonukleotide

• Tabelle 7: Sequenzen der für die shRNA Klonierung verwendeten Oligonukleotide

• Tabelle 8: Sequenzen der verwendeten siRNAs

• Tabelle 9: Hybridisierungstemperaturen (T_H) der verwendeten Primer

• Tabelle 10: Auflistung der für den Western Blot eingesetzten Lösungen und die Dauer ihrer Anwendung

• Tabelle 11:Übersicht über die verwendeten siRNAs

• Tabelle 12: Vergleich des Resistenzphänotyps der untersuchten Karzinomzellinien nach der transienten Transfektion von anti-MDR1 siRNAs

• Tabelle 13: Übersicht über die verwendeten shRNAs und ihrer Zielsequenz

• Tabelle 14: IC₅₀-Werte und Resistenzfaktoren der untersuchten Zellinien

• Abbildung 1: Strukturformeln von Daunorubicin und Doxorubicin

• Abbildung 2: Darstellung der zweidimensionalen Struktur (verändert nach Ambudkar et al., 2003) und Funktion von P-Glykoprotein (verändert nach Hoffmeyer et al., 2000)

• Abbildung 3: Genereller Mechanismus der RNA-Interferenz (verändert nach Schwarz et al., 2003)

• Abbildung 4: Schematische Darstellung verschiedener Arten, aktive siRNA in die Zelle einzubringen bzw. zu generieren (nach Wacheck und Vornlocher, 2003).

• Abbildung 5: Vektorkarte von psiRNA-hH1zeo (www.invivogen.comwww.invivogen.com)

• Abbildung 6: Charakterisierung der siRNA-abhängigen Erniedrigung des MDR1 mRNA und P-Glykoprotein Niveaus in der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181RDB

• Abbildung 7: Charakterisierung der siRNA-abhängigen Erniedrigung des MDR1 mRNA und P-Glykoprotein Niveaus in der Magenkarzinomzellinie EPG85-257RDB

• Abbildung 8: Charakterisierung der siRNA-abhängigen Erniedrigung des MDR1 mRNA und P-Glykoprotein Niveaus in der Mammakarzinomzellinie MaTu/ADR.

• Abbildung 9: Quantifizierung der siRNA-abhängigen MDR1 mRNA-Repression

• Abbildung 10: Quantifizierung der siRNA-abhängigen MDR1 mRNA-Repression

• Abbildung 11: Zytotoxitätsassay mit Daunorubicin in den siRNA transfizierten EPP85-181RDB

• Abbildung 12: Zytotoxitätsassay mit Daunorubicin in den siRNA transfizierten EPG85-257RDB

• Abbildung 13: Zytotoxitätsassay mit Doxorubicin in den siRNA transfizierten MaTu/ADR

• Abbildung 14: Darstellung des Vektorsystems

• Abbildung 15: Sequenz der chemisch synthetisierten shRNA MDR-B DNA-Oligonukleotide

• Abbildung 16: Vektorkarte und Restriktionsanalyse verschiedener Bakterienklone

• Abbildung 17: MDR1 mRNA-Expression in den shRNA-Transfektanten.

• Abbildung 18: Vektor- und Aldolase-spezifische PCR

• Abbildung 19: Bestimmung des P-Glykoproteingehalts mittels Western Blot

• Abbildung 20: Immunzytochemischer Nachweis des P-Glykoproteins

• Abbildung 21: Immunzytochemischer Nachweis des P-Glykoproteins

• Abbildung 22: Zytotoxizitätsassay mit Daunorubicin

• Abbildung 23: Zytotoxizitätsassay mit Doxorubicin

• Abbildung 24: Expression der siRNA in der stabilen shRNA MDR-C Transfektanten der Mammakarzinomzelline MaTu/ADR

• Abbildung 25: Quantifizierung der MDR1 mRNA-Expression in Tumorgeweben

• Abbildung 26: Immunhistochemische Färbung von P-Glykoprotein mit mAb C219

• Abbildung 27: Abnahme des Tumorwachstums in der Maus nach kombinierter Applikation des shRNA MDR-C kodierenden Vektors und Doxorubicin im Verlauf von 40 Tagen