Steup, Andreas : Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Die Zielfindung von auswachsenden Neuronen

Ramón y Cajal beschrieb erstmals den Wachstumskolben als terminale Struktur einer neuronalen Zelle . Er entwickelte Theorien über neurotrophe Faktoren, über die Mechanismen des axonalen Wachstums und schlug für die Wegfindung von Axonen einen chemotaktischen Mechanismus vor, durch den die Axone beim Auswachsen zu ihren spezifischen Zielgebieten geführt werden. Demzufolge werden die Wachstumskolben der Axone durch den Gradienten eines diffusiblen Faktors gelenkt, der vom Zielgebiet sezerniert wird . Neben sezernierten und diffusiblen Proteinen wurden auch membranständige Faktoren als Leitmoleküle axonalen Wachstums beschrieben . Diese Leitmoleküle können sowohl attraktive als auch repulsive Eigenschaften haben. Gemeinsam definieren diese Faktoren die Regionen, die die Axone während ihrer Wegfindung passieren können sowie ihre Zielgebiete, in denen sie terminieren und synaptische Kontakte ausbilden. Die sezernierten Faktoren üben ihren Einfluß über größere Entfernungen aus und leiten dadurch die Axone durch das Gewebe. Die membranständigen Leitmoleküle wirken lokal und dienen vorwiegend der Kollateral- und Synapsenbildung. So wurden im trigeminalen System Faktoren beschrieben, die auch über größere Distanzen attraktiv wirken , ebenso in der Pons . Im Rückenmark konnte gezeigt werden, daß die Bodenplatte einen attraktiven Faktor sezerniert, der kommissurale Axone zur Mittellinie leitet . Für einige Faktoren, wie zum Beispiel die


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Semaphorine und die Netrine, gilt, daß sie sowohl attraktive wie auch repulsive Eigenschaften besitzen können. Die jeweilige Wirkung eines Faktors hängt im wesentlichen von der Rezeptorausstattung des axonalen Wachstumskolbens sowie der intrazellulären Signaltransduktion ab.
Der neuronale Wachstumskolben ist ein komplexes, hoch dynamisches Zellelement. Er dient der Integration von Informationen über die attraktiven und repulsiven Moleküle, die den Wachstumskolben umgeben. Er wird in eine organellenreiche zentrale Region und eine organellenarme periphere Region unterteilt. In der peripheren Region werden die dynamischen Lamellipodien und Filopodien gebildet. Die durch Aktinfaserbündel stabilisierten fingerartigen Filopodien wachsen in verschiedene Richtungen aus und retrahieren bei repulsiver Umgebung. Die Lamellipodien zeichnen sich durch kurze, ungeordnete Aktinfasern aus, die netzartig verteilt sind und der Stabilisierung und Anheftung des Wachstumskolben im umliegenden Gewebe dienen . Im Wachstumskolben befinden sich Rezeptoren, die die attraktiven oder repulsiven Signale von neuronalen Leitmolekülen an die zytosolisch gelegene Signaltransduktionskaskade weitergeben . Die Eigenschaften von Mitgliedern zweier Genfamilien dieser Leitmoleküle, den Semaphorinen und den Netrinen, wurden in den letzten Jahren genauer untersucht.


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1.2 Leitmoleküle axonalen Wachstums

1.2.1 Semaphorine und Neuropiline

Die Familie der Semaphorine bildet mit mindestens 30 Mitgliedern eine der umfangreichsten Gruppen von Leitmolekülen für axonales Wachstum. Charakteristisch für die Semaphorine ist eine 500 Aminosäuren lange Semaphorindomäne, die in Invertebraten und Vertebraten konserviert ist. Die Mitglieder der Invertebraten- und Vertebratensemaphorine umfassen sieben Klassen, die durch carboxyterminal zur Semaphorindomäne gelegene Domänen unterschieden werden. Die viralen Semaphorine bilden die achte Klasse der Genfamilie . Die Semaphorine der Klassen 2 (Invertebraten) und 3 (Vertebraten) sind sezernierte Proteine, die der Klassen 1 (Invertebraten) und 4 bis 7 (Vertebraten) sind membranständige Proteine (Abb. 1). Die Semaphorine der Klassen 2, 3 und 4 und 7 haben im Anschluß an die Semaphorindomäne eine Immunglobulindomäne vom C2-Typ. Die Semaphorine der Klasse 7 sind durch Glykosylphosphatidylinositol (GPI) extrazellulär an der Membran verankert (Abb. 1). Die Vertreter der Klasse 1 und 6 besitzen carboxyterminal nur die Transmembrandomäne. Die Semaphorine der Klasse 5 besitzen als ein besonderes Merkmal im Anschluß an die Semaphorindomäne eine Wiederholungssequenz von sieben Typ 1 Thrombospondineinheiten, der die Transmembrandomäne folgt (Abb. 1). Die viralen Semaphorine umfassen zwei sezernierte Vertreter, die entweder eine verkürzte Semaphorindomäne (SEMAVA) oder eine zusätzliche carboxyterminale Ig-Domäne (SEMAVB) besitzen (Abb. 1).


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Das erste Semaphorin wurde unter dem Namen Collapsin-1 (Sema3A) mit Hilfe eines Kollabierungsassaya für Wachstumkolben unter Verwendung von Zellmembranen aus Hühnchengehirnen isoliert . Sema3A, ein sezerniertes Semaphorin der Klasse 3, wirkt als Leitmolekül, das die Wachstumsrichtung von Axonen beeinflußt. Die Sekretion und repulsive Aktivität von Sema3A auf Neurone der sensorischen Hinterwurzelganglien konnte mit Hilfe von Kokulturexperimenten in einer Kollagenmatrix gezeigt werden . Sema3A wird als nicht-diffusible, membranständige Vorform synthetisiert. Die sezernierte Domäne wird von einer Furin-ähnlichen Protease abgespalten. Außerdem muß Sema3A als Homodimer vorliegen, um biologisch aktiv zu sein (Abb. 2) .
Sema3A kann sowohl attraktiv wie auch repulsiv auf Wachtumskolben wirken. Während der repulsive Effekt für das axonale Wachstum von Hinterwurzelganglien oder entorhinalen Fasern in der Ratte eine Rolle spielt, ist eine attraktive Wirkung auf diese Axone bisher nur in Zellkulturexperimenten nachgewiesen worden . Die Richtungsänderung ist unabhängig von der extrazellulären [Ca2+] und wird durch cGMP oder Proteinkinase G (PKG) reguliert. Der repulsive Effekt von Sema3A kann durch die Aktivierung von PKG in einen attraktiven konvertiert werden . Im Gegensatz dazu kann eine durch NT-3-induzierte Attraktion durch die Inhibierung von PKG in Repulsion umschaltet werden .

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Abb. 1: Die Semaphorin-Familie neuronaler Leitmoleküle. Die Semaphorine definieren sich über eine 500 Aminosäuren lange homologe Region, die Semaphorindomäne, die in Invertebraten und Vertebraten konserviert ist.

Die Mitglieder der Invertebraten- und Vertebratensemaphorine umfassen sieben Klassen; die achte Klasse beinhaltet die viralen Semaphorine (V). Die Semaphorine der Klassen 2 und 3 sind sezernierte Proteine, die der Klassen 1 und 4 bis 7 sind Transmembranproteine .


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Die Expressionsmuster von Sema3A legten die Vermutung nahe, daß dieser Faktor auch eine Rolle bei dem Auswachsen verschiedener motorischer Neurone spielt. Die Bodenplatte des Rückenmarks leitet beispielsweise spinale und craniale motorische Axone durch einen repulsiven Mechanismus von der Mittellinie zu ihren Austrittspunkten und rekombinantes Sema3A läßt Wachstumskolben aus ventralen Rückenmarksexplantaten kollabieren .
Die verschiedenen Semaphorine im Rückenmark von Hühnchen, Maus und Ratte zeigen differentielle Expressionsmuster. Bereits am Embryonaltag 9 (E9) der Entwicklung des Mäuseembryos läßt sich die Expression von Sema5B im Neuroepithelium entlang der Neuroaxis nachweisen . Kurz nachdem postmitotische Neurone auftreten, werden Sema3A und Sema5A und nach E11,5 die meisten murinen Semaphorine im Rückenmark exprimiert . In den Embryonen von Maus und Huhn werden die Semaphorine Sema3A und Sema3D hauptsächlich im ventralen Teil des Rückenmarks exprimiert. Expression von Sema3C findet sich am ventralen Pol des Vorderhorns und überlappt teilweise mit der Expression von Sema3A . Dies legt nahe, daß es für neuronale Subpopulationen spezifische repulsive Faktoren gibt, die das Einwachsen von sensorischen Afferenzen ins Rückenmark kontrollieren. Ein Faktor, der aufgrund seines Expressionsmusters dafür in Frage kommt, ist Sema3A. Dieser Faktor besitzt in Kokultur repulsive Eigenschaften auf NGF-stimulierte, jedoch nicht auf NT3-stimulierte Axone, die von E14 Maus- oder Ratten-Hinterwurzelganglien stammen . Werden die Hinterwurzelganglien jedoch zu einem früheren Zeitpunkt entnommen (E12,5-E13,5), entfällt diese Spezifität, d.h. auch NT3-abhängige Axone werden von

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Sema3A abgestoßen . Daher muß für diesen Faktor angenommen werden, daß er sensible Afferenzen räumlich in verschiedene Regionen des Rückenmarks lenkt, und das Einwachsen von Kollateralen in das Rückenmark zu einem falschen Zeitpunkt unterbindet .
Für insgesamt drei Semaphorine, Sema3A, Sema3C und Sema3F, die alle aus der gleichen Klasse von sezernierten Semaphorinen stammen, wurden Rezeptoren im Nervensystem der Säuger beschrieben . Zuerst wurde der Sema3A-Rezeptor, Neuropilin-1 (NP-1), beschrieben, ein Membranprotein, das ursprünglich mit dem Namen A5 als Oberflächenprotein von Zellen isoliert worden war. Es wurde im Neuropil von Xenopus laevis, Huhn und Maus nachgewiesen. NP-1 fördert axonales Wachstum und wurde später als Leitmolekül beschrieben . Sema3A bindet mit hoher Affinität an NP-1. Antikörper, die gegen die Ektodomäne von NP-1 gerichtet waren, blockierten die repulsive Aktivität von Sema3A auf sensorische Neurone der Ratte . Die Semaphorindomäne ist für die Bindung notwendig, und, nach ihrer Dimerisierung, auch ausreichend für die repulsive Aktivität, die von Ig- und basischen Aminosäure-Domänen potenziert wird . Basierend auf diesen Daten wurde ein Zwei-Komponentenmodell des Semaphorinrezeptors vorgeschlagen, das aus einem Teil mit niedriger und einem Teil mit hoher Affinität bestehen soll . Der hochaffine Teil dieses Rezeptorkomplexes besteht demnach aus Neuropilin und einem noch unbekannten Partner. Dieses Modell wird durch die Tatsache unterstützt, daß Neuropiline nur einen sehr kurzen zytoplasmatischen Carboxyterminus besitzen, der keinerlei Homologie zu bekannten Signaltransduktionsdomänen aufweist.

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Das zu NP-1 homologe Neuropilin-2 (NP-2) ist ein hochaffiner Rezeptor für Sema3C und Sema3F. Es bindet dagegen nur mit niedriger Affinität an Sema3A . Die Neuropiline sind hoch konserviert und bestehen extrazellulär aus drei Domänen: a1/a2, b1/b2 und MAM (Abb. 2) . Die a1/a2-Domänen besitzen Homologien zur CUB-Domäne (C1r/s-Komplementdomomäne), während die b1/b2-Domänen Homologien mit den Koagulationsfaktoren V und VIII (FV/VIII) aufweisen.
Homologe Sequenzen zur MAM-Domäne wurden in der Tyrosinphosphatase Mu, A5/Neuropilin und Meprin, einer Metalloendopeptidase, gefunden . Sowohl für die a1/a2- als auch die MAM-Domäne wird eine Rolle in Protein-Protein-Interaktionen vermutet . Neuropilin fördert neuronales Wachstum und induziert nach Transfektion die Zellaggregation von Fibroblastenzellen . In diesen Experimenten wirkte Neuropilin als heterophiles, Kalzium-unabhängiges Zelladhäsionsmolekül, das über seine b1/b2 Domäne an Oberflächenmoleküle von L-Zellen bindet . Sowohl die Semaphorindomäne als auch der Carboxyterminus interagieren mit NP-1 (Abb. 2) . An der Signaltransduktion sind Multimere aus NP-1 und NP-2 beteiligt. Experimente mit funktionellen Antikörpern gegen Neuropilin zeigten, daß die beiden Neuropiline Homo- bzw. Heterooligomere bilden können. Die repulsive Wirkung von Sema3A wird durch Homooligomere aus NP-1 vermittelt. Dagegen wird die Repulsivität von Sema3C und Sema3F von Homooligomeren, bestehend aus NP-2-Rezeptoren, vermittelt.

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Abb. 2: Modell der Interaktion der sezernierten Klasse 3 Semaphorine mit ihren Rezeptoren, den Neuropilinen.

Die Neuropiline 1 und 2 sind homolog aufgebaut und bestehen aus den a1/2-, b1/2-, der MAM- sowie einer Transmembrandomäne. Die Semaphorine 3A und 3C sind nur als Dimere biologisch aktiv.

Ob Heterooligomere aus NP-1 und NP-2 auch die repulsive Wirkung eines oder mehrerer Semaphorine übertragen können, ist jedoch unklar. Die für die Oligomerisierung wichtigen Abschnitte liegen zum Teil in der MAM-Domäne (Abb. 2) . Kürzlich ist es gelungen, einen direkten intrazellulären Bindungspartner von NP-1 zu identifizieren, welcher wahrscheinlich ein Teil des propagierten Rezeptorkomplexes ist ;. Dieser Faktor wird NP-1-interagierendes Protein


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(NIP) genannt und enthält eine zentrale PSD-95/Dlg/ZO-1-Domäne (PDZ) sowie eine carboxyterminale Acyl-Carrier-Domäne. Die drei letzten C-terminalen Aminosäuren (S-E-A-COOH, single letter code) von NP-1 sind hoch konserviert und für die Bindung an die PDZ-Domäne von NIP verantwortlich . Außerdem wurden verschiedene Mitglieder der Plexin-Familie als direkte Bindungspartner für die Neuropiline identifiziert, zuerst in Drosophila melanogaster ;, dann auch in Vertebraten . Dabei zeigte sich, daß plexin-A1 nicht direkt an Sema3A bindet, jedoch an NP-1. Der dabei entstehende plexin-A1/ NP-1-Komplex besitzt eine höhere Sema3A-Bindungsaffinität als NP-1 alleine. Die carboxyterminale Domäne von plexin-A1 ist in vitro für die Signaltransduktion mitverantwortlich. Daher wird auch von plexin-A1 angenommen, daß es ein Teil des NP-1-Rezeptorkomplexes von Sema3A ist . Erst kürzlich wurde das Bild dieses Rezeptorkomplexes um ein weitere Komponente erweitert. Das membranständige Glycoprotein L1, ein Zelladhäsionsmolekül, geht eine stabile Bindung mit NP-1 ein, wobei die extrazellulären Domänen direkt aneinander binden . L1 ist ein notwendiger Bestandteil des Rezeptorkomplexes, um die repulsive Wirkung von Sema3A weiterzuleiten. Die repulsiven Eigenschaften anderer Semaphorine, zum Beispiel Sema3C, sind jedoch von L1 unabhängig .


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1.2.2 Netrine und seine Rezeptoren

Die Netrine gehören zu einer Familie von neuronalen Leitmolekülen, die, ähnlich wie die Semaphorine, sowohl attraktive als auch repulsive Eigenschaften besitzen . Mitglieder dieser Familie wurden unabhängig voneinander aus Vertebraten- und Invertebratengewebe isoliert. Schon in den siebziger Jahren wurden mehr als 30 Gene, die an Zell- und Axonmigration beteiligt sind, in Mutanten von Caenorhabditis elegans identifiziert . Drei von diesen Genen, unc-5, unc-6 und unc-40 (unc=uncoordinated; für unkoordiniertes Wachstum der Wachstumskolben bei den Mutanten) sind bei der Leitung und Migration von Zellen und Axonen entlang der dorsoventralen Achse beteiligt . Während unc-6 als sezerniertes Leitmolekül wirkt, sind unc-5 und unc-40 Rezeptoren (s.u.). Zwei unc-6-homologe Vertreter der Netrin-Familie, Netrin-1 und Netrin-2, wurden aus Gehirnen von Gallus gallus isoliert. Sie werden in der Bodenplatte des Rückenmarks bzw. dem ventralen Rückenmark exprimiert und wirken attraktiv auf kommissurale Axone des Rückenmarks . Allen Netrinen ist ein Bereich mit Sequenzhomologie zu Laminin gemein. Laminin ist ein Bestandteil der Basalmembran, welcher das neuronale Wachstum stimuliert . Es besteht aus drei verschiedenen Ketten (alpha [A-Kette], beta [B1-Kette], gamma [B2-Kette]), die ein heterotrimeres Molekül bilden. Die Netrine besitzen Homologien zu zwei Domänen jeder Lamininkette, den Domänen V und VI. Die drei Lamininketten binden über die Domäne VI aneinander. Die Domäne V besitzt mehrere Abschnitte, die Homologien zu EGF aufweisen, und die möglicherweise als Bindungsstellen für Integrine oder andere Rezeptoren dienen. Am aminoterminalen Ende von Netrin befindet sich ein Signalpeptid, das von einer


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Laminin B2-ähnlichen Domäne VI gefolgt ist. Daran schließen sich drei Laminin B2-ähnliche Domänen V an. Die carboxyterminale Sequenz der Netrine unterscheidet sich von Laminin. Dort befindet sich eine unc-6-ähnliche Domäne C, die bei neutralen pH-Werten positiv geladen ist . Die Netrine besitzen keine Transmembrandomäne (Abb. 3A), was auf ein sezerniertes Protein hinweist, das mit Komponenten der extrazellulären Matrix oder der Zelloberfläche interagiert . Netrin kann möglichgerweise über die zu Laminin homologe Domäne VI mit Laminin interagieren. Die Laminin B2-ähnliche Domäne V enthält EGF-ähnliche Sequenzwiederholungen (V-1, V-2, V-3), von denen jedoch nicht bekannt ist, ob sie auch als Bindungspartner für Rezeptoren auf der Zelloberfläche des Wachstumskolben dienen . Durch Analyse von Unc-6-Mutanten konnte in Caenorhabditis elegans festgestellt werden, daß die Domänen V-3 und C für Stabilität und Aktivität von Netrin verantwortlich sind, während Mutationen der Domäne VI zu einer Fehlverteilung von Netrin führten . Die Netrin-Domäne V-2 ist notwendig für die dorsale, aber nicht ventrale Leitaktivität von Netrin, möglicherweise indem es mit dem Netrin-Rezeptor Unc-5 interagiert .
Interessanterweise haben Netrine, ähnlich wie die Semaphorine, sowohl attraktive wie auch repulsive Eigenschaften. Netrine wirken attraktiv auf kommissurale Axone, die zur Mittellinie wachsen. Sobald diese Axone die Mittellinie überquert haben, übt Netrin-1 einen repulsiven Effekt auf sie aus. Außerdem ist Netrin-1 ein attraktives Leitmolekül für retinale Axone . In bilateral-symmetrischen Tieren ist die Bildung der kommissuralen Projektionen eines

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der frühesten Ereignisse in der Entwicklung des Nervensystems. Die kommissuralen Projektionen verbinden die beiden Körperhälften und sind entlang der gesamten Längsachse des Tieres vorhanden. Entlang der Mittellinie befinden sich spezialisierte Zellen, die für die Orientierung der kommissuralen Fasern Leitmoleküle synthetisieren . Sowohl Vertebraten wie auch Invertebraten exprimieren Netrine entlang der Mittellinie . Verschiedene Leitmechanismen, die von Caenorhabditis elegans über Drosophila melanogaster bis zu Vertebraten konserviert sind, sind für das Wachstum auf die Mittellinie hin und das Überschreiten dieser verantwortlich. Netrin-1-abhängige Attraktion über große Entfernungen leitet die kommissuralen Axone zur Mittellinie hin , wogegen dieser Faktor nach dem Kreuzen repulsiv wirkt . Netrine sind an der Zielfindung von verschiendenen Axonpopulationen in Vertebraten beteiligt. Netrin-1 übt auf spinale kommissurale Axone in vitro dieselbe attraktive Wirkung aus, wie die Bodenplatte des Rückenmarks . Die motorischen Axone des Nervus trochlearis werden dagegen von Netrin-1 abgestoßen, d.h. es liegt ein repulsiver Effekt vor .
Die Rezeptoren der Netrine werden in zwei Genfamilien zusammengefaßt. Eine Gruppe enthält die Rezeptoren der Unc-40/DCC Familie, zur zweiten Gruppe gehören die Rezeptoren der Unc-5-Familie, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll . Die Rezeptoren der DCC-Familie (deleted in colorectal cancer) zeichnen sich durch vier Immunoglobulin- und sechs Fibronectin-Typ-III-ähnliche Domänen als extrazellulären Anteil aus (Abb. 3B). Der zytoplasmatische Teil des Rezeptors ist wenig konserviert.

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Abb. 3: Schematische Darstellung der Struktur des neuronalen Leitmoleküles Netrin-1 (A) und seines Rezeptors deleted in colorectal cancer (B; DCC).

Die DCC-Familie umfaßt Unc-40 in Caenorhabditis elegans, DCC und Neogenin in Vertebraten sowie Frazzled in Drosophila melanogaster . DCC und Neogenin sind Netrin-1-bindende Proteine und Antikörper gegen DCC blockieren den wachstumfördernden Effekt von Netrin-1 auf kommissurale Axone in vitro . Weitere Hinweise auf DCC als Netrin-1 Rezeptor wurden aus mutierten Mäusen ohne funktionellen Netrin-1-Rezeptor erhalten. Diese DCC-/- Mäuse zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie Netrin-1-defiziente Tiere . Die Anzahl der kommissuralen Axone, die die Bodenplatte im


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Rückenmark erreichen, ist in DCC-/- Mäusen stark reduziert. Weiterhin finden sich schwere Defekte im Gehirn der DCC-/- Mäuse. Die Fasern der hippokampalen Kommissur und das Corpus callosum fehlen, außerdem ist die anteriore Kommissur reduziert . Im Rückenmark von Rattenembryonen wird DCC von kommissuralen Axonen exprimiert, und, in geringem Maße, auch von mesenchephalen motorischen Neuronen des Nervus trochlearis. Durch immunohistochemische Methoden wurde das DCC-Protein auf den Axonen und Wachstumskolben von kommissuralen Neuronen nachgewiesen. Die Koexpression von DCC/Neogenin und Unc-5 resultiert möglicherweise in einem molekularen Schalter, der eine attraktive Netrin-1-Reaktion des Wachstumskolben in eine repulsive Reaktion umschaltet . Dieser molekulare Schalter wäre nach diesem Modell nicht nur von dem Rezeptortyp abhängig, sondern wird auch von den Konzentrationen verschiedener second messenger moduliert. Im Falle von Netrin-1 kann die Richtungsänderung der Neurone durch Entzug von Ca2+ blockiert werden . Der kritische Faktor, der festlegt, ob die Reaktion attraktiv oder repulsiv ist, ist das Niveau der zytosolischen cAMP oder der Proteinkinase A-Aktivität (PKA). Die Inhibierung von PKA konvertiert einen attraktiven Effekt, der von Netrin-1, BDNF, NGF und ACh ausgelöst wird, in eine repulsive Wachstumsreaktion, während die Aktivierung von PKA, einen repulsiven Effekt, der durch Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG) ausgelöst wird, in Attraktion umkehrt .


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1.3 Die hippokampale Formation der Ratte als Modell

Die hippokampale Formation der Ratte wird morphologisch in sechs Hauptregionen unterteilt (Abb. 4). Dazu gehören: der Gyrus dentatus, der eigentliche Hippokampus, der in die Cornu ammonis Regionen eins bis drei unterteilt wird (CA1-CA3), das Subikulum, das Präsubikulum, das Parasubikulum, die oft zum subikulären Komplex zusammengefaßt werden, und der entorhinale Kortex. Der entorhinale Kortex projiziert über den Tractus perforans in den Gyrus dentatus, den Hippocampus und das Subikulum. Die Projektionen in den Gyrus dentatus und nach CA3 werden hauptsächlich durch Zellen der Schicht II des entorhinalen Kortex gebildet. Die Projektionen nach CA1 und in das Subikulum stammen dagegen von Zellen in der Schicht III. Die Axone der Körnerzellen, die Moosfasern, projizieren nach CA3 und sind Bestandteil von Kollateralen, die in der polymorphen Schicht des Gyrus dentatus terminieren. Die Zellen der polymorphen Schicht, vor allem die Mooszellen, bilden Assoziationsfasern, die an den proximalen Dendriten der Körnerzellen des gesamten Gyrus dentatus terminieren. Die Projektionen der Pyramidenzellen aus CA3 umfassen sowohl Kollaterale zu anderen CA3-Pyramidenzellen als auch die Schaffer-Kollateralen, die zu den Pyramidenzellen von CA1 projizieren als Teil der Assoziationsfasern (Abb. 5) . Im folgenden soll die Architektur der für diese Arbeit wichtigsten Felder des Hippokampus, seiner typischen neuronalen Zellen und Projektionen, näher erläutert werden.

1.3.1 Der Gyrus dentatus

Der Gyrus dentatus besteht aus drei Schichten. Die am nächsten zur hippokampalen Fissur gelegene Schicht heißt Molekularschicht (Stratum moleculare) und enthält


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Interneurone und Astrozyten, aber keine Projektionsneurone. Sie wird in drei Teile unterschieden, der äußeren, mittleren und inneren Molekularschicht.

Abb. 4: Schematische Darstellung der hippokampalen Formation einer adulten Ratte in einem horizontalen Schnitt durch den temporalen Pol des Hippokampus mit anliegendem entorhinalen Kortex.

Graue Flächen repräsentieren vor allem Zellkörper, weiße Flächen stellen die Gebiete dar, in denen hauptsächlich Zellfortsätze (Dendriten und Axone) zu finden sind. Im Cornu ammonis und Gyrus dentatus ist beispielhaft die Morphologie der Dendritenbäume von Projektionsneuronen gezeigt. A Alveus, CA1 Cornu ammonis Region 1, CA3 Cornu ammonis Region 3, F Fimbria, Fh Fissura hippokampi, Fr Fissura rhinalis, Pm Pia mater, S Subikulum, Sg stratum granulosum, Sl Stratum lucidum, Slm Stratum lacunosum moleculare, Sm Stratum moleculare, So Stratum oriens, Sr Stratum radiatum. (Mit freundlicher Genehmigung von Dr. E. Simbürger.)


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Die Molekularschicht besteht zum größten Teil aus den Dendriten der Körnerzellen (Projektionsneurone), Korbzellen (Interneuronen) und den axonalen Endigungen der entorhinalen, kommissuralen und septalen Afferenzen in dieser Schicht. Auf die Molekularschicht folgt die Körnerzellschicht (Stratum granulosum), die hauptsächlich aus den Somata der namensgebenden Körnerzellen aufgebaut ist. Beide Schichten geben dem Gyrus dentatus, abhängig von der Schnittebene, eine typische U-förmige Struktur, die die dritte Schicht, den Hilus, einfaßt (Abb. 4) .

Abb. 5: Schematische Darstellung der wichtigsten Projektionen zwischen entorhinalem Kortex und Hippokampus sowie innerhalb des Hippokampus.

Pfeile stellen die Projektionsrichtungen dar, die im Falle der hippokampalen Formation hauptsächlich unidirektional verlaufen. CA1 Cornu ammonis Region 1, CA3 Cornu ammonis Region 3, EK entorhinaler Kortex, GD Gyrus dentatus, PaS ParaSubikulum, PrS PräSubikulum, S Subikulum.

Im Hilus befindet sich eine Vielzahl verschiedener neuronaler Zelltypen. Die kommissuralen und Assoziationsfasern projizieren sowohl von der ipsi- als auch von der kontralateren polymorphen Schicht zur inneren Molekularschicht des Gyrus dentatus. Ein Teil dieser Afferenzen stammen aus der CA3-Region . Zudem verlaufen die Moosfasern durch den Hilus nach CA3. Weitere,


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extrinsische, Afferenzen in die hippokampale Formation stammen aus dem medialen Septum. Diese Projektionen erreichen die hippokampale Formation hauptsächlich über die Fimbria/Fornix. Septale Fasern terminieren in allen Regionen des Hippokampus und, besonders ausgeprägt, in der Molekularschicht des Gyrus dentatus .

1.3.2 Cornu ammonis

Das Cornu ammonis (Ammonshorn; CA1-3) ist laminar organisiert. Die am weitesten innenliegende Zellschicht ist das Stratum pyramidale, das im wesentlichen aus Pyramidenzellen besteht. Die Pyramidenzellen von CA3 bilden Kollaterale, die sowohl ipsi- als auch kontralateral in die Cornu ammonis-Region projizieren. Die kontralateral nach CA1-3 und dem Gyrus dentatus ziehenden Fasern werden kommissurale Projektionen genannt. Die ipsilateralen Projektionen von CA3 nach CA3, von CA3 in den Gyrus dentatus sowie vom Hilus in den Gyrus dentatus sind assoziativen Fasern. Die ebenfalls ipsilateralen Projektionen von CA3 nach CA1 werden Schaffer-Kollaterale genannt (Abb 5). Darauf folgt das Stratum oriens, welches durch den Alveus begrenzt wird. Durch eine zellfreie Schicht oberhalb der Pyramidenzellschicht von CA3, dem Stratum lucidum, verlaufen die Moosfasern. Auf das Stratum lucidum von CA3 und den Pyramidenzellschichten von CA1 folgt das Stratum radiatum, die auch suprapyramidale Region genannt wird (Abb. 4). Die am weitesten oberflächliche Region des Cornu ammonis ist das Stratum lacunosum moleculare (Abb. 4), in dem unter anderem die Fasern des Tractus perforans aus der Schicht III des entorhinalen Kortex terminieren .


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1.3.3 Der entorhinale Kortex

Der entorhinale Kortex, unterteilt in einen lateralen und einen medialen Anteil , besteht wie die übrigen Kortexbereiche des Gehirns aus sechs Schichten (Abb. 4). Im folgenden wird nur auf die Schichten II und III eingegangen, die für die Projektionen in den Hippokampus wesentlich sind.
In Schicht II des entorhinalen Kortex befinden sich Sternzellen, Pyramidenzellen, multipolare und horizontale Zellen. Die Axone der Sternzellen sowie der Pyramidenzellen bilden den Teil des Tractus perforans, welcher in den DG projiziert. Die Axone der Pyramidenzellen in Schicht III projizieren nach CA1 und in das Subikulum (Abb. 5) und bilden Kollaterale in den Schichten I und III. Multipolare, fusiforme, horizontale, bipolare und Sternzellen senden ebenfalls axonale Fasern über den Tractus perforans in den Hippokampus.
Sowohl der Hippokampus als auch der Gyrus dentatus werden sehr stark vom entorhinalen Kortex innerviert. Der Tractus perforans terminiert im Cornu ammonis . Die Axone der Zellen aus Schicht II und III ziehen durch die weiße Substanz zur alveolaren Oberfläche des Hippokampus und bilden dort das „angular bundle“ (Abb. 11A). Von dort ziehen sie durch das Subikulum und bilden den Tractus perforans, d.h. die Axone “perforieren“ das Subikulum. Die Fasern durchqueren die Pyramidenzellschicht des Subikulums und kreuzen die hippokampale Fissur, um in den Gyrus dentatus einzutreten, bzw. um sich in den Molekularschichten des Subikulums und des Hippokampus zu verzweigen. Die Fasern aus der Schicht II des entorhinalen Kortex, die in den Gyrus dentatus projizieren, terminieren ausschließlich in den äußeren zwei Dritteln der Molekularschicht, wo sie asymmetrische Synapsen ausbilden (Abb. 11A). Die Mehrzahl der synaptischen Kontakte wird mit den dendritischen Dornen (“spines“)


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der Körnerzellen geknüpft, einige auch mit Parvalbumin-/GABA-positiven Neuronen . Fasern, die aus dem lateralen entorhinalem Kortex stammen, terminieren im äußersten Drittel der Molekularschicht des Gyrus dentatus, während die Fasern aus dem medialen entorhinalen Kortex in den darunter liegenden Teilen der mittleren Molekularschicht ihre synaptischen Kontakte ausbilden. Eine ähnliche Aufteilung der synaptischen Terminierungen findet sich auch in der CA3-Region, in der die lateralen entorhinalen Fasern im oberflächlich liegenden Teil des Stratum lacunosum moleculare (SLM) terminieren, die Fasern aus dem medialen entorhinalen Kortex jedoch in den tieferen Anteilen des SLM . Die nach CA1 projizierenden Fasern stammen aus Schicht III und terminieren innerhalb des gesamten SLM von CA1. Mediale entorhinale Fasern ziehen in den proximalen Teil von CA1, während die lateralen entorhinalen Fasern weiter distal, an der Grenze zum Subikulum, terminieren .


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1.4 Fragestellung

In der vorliegen Arbeit wurde untersucht, welche Rolle die sezernierten Klasse 3 Semaphorine Sema3A und Sema3C sowie ihre Rezeptoren Neuropilin-1 und Neuropilin-2 in der Entwicklung der afferenten, efferenten und intrinsischen Projektionen des Hippokampus der Ratte spielen. Weiterhin wurde untersucht, welchen Einfluß Netrin-1 und sein Rezeptor DCC auf die Entwicklung dieses Systems haben. Dazu wurde zunächst die Expression der genannten Faktoren durch in-situ-Hybrisierungen mit radioaktiv markierten Sonden ermittelt. Anschließend wurden funktionelle in vitro Zellkulturstudien durchgeführt, bei denen Explantate neuronalen Gewebes mit Zellaggregaten, die die genannten Moleküle sekretieren, in einer dreidimensionalen Kollagenmatrix ko-kultiviert wurden. Hierbei wurde überprüft, inwiefern die sezernierten Faktoren repulsiv oder attraktiv auf das Wachstum von neuronalen Fasern wirken.


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