Steup, Andreas : Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

23

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 In situ Hybridisierungen

2.1.1 Gewebepräparation

Ratten der Wistar Inzucht Linie wurden zu verschiedenen Zeitpunkten der embryonalen und postnatalen Entwicklung dekapitiert<1>, anschließend wurden die Gehirne entnommen und in der Gasphase von flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Am Kryostaten wurden bei -20 °C horizontale Schnitte (20µm) angefertigt und auf mit Aminoperoxysilan beschichtete Objektträger aufgezogen. Die Schnitte wurden 5 min bei RT getrocknet und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

2.1.2 Vorbereitung der Kryostatschnitte für die in situ Hybridisierungen

Zunächst wurden die Schnitte auf den Objekträgern mit 4% (w/v) PFA fixiert. Die weitere Behandlung unterschied sich im Hinblick auf die verwendeten radioaktiven Sonden. Für die Verwendung von markierten Oligonukleotiden wurden die Schnitte in 0,1 M PBS gewaschen und dehydriert. Für die Verwendung von radioaktiv markierter, in vitro synthetisierter, mRNA (Riboproben) wurden die Schnitte nach der Fixierung für 30 min in 0,1 M HCl bei RT inkubiert und in 0,1 M PBS gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte für 30 min in 0,1 M Triethanolamine


24

(pH 8,0) azetyliert, in 0,1 M PBS gewaschen und zuletzt dehydriert.

2.1.3 Verwendung von Oligonukleotiden für die radioaktive in-situ-Hybridisierungen:

Neuropilin-1 (GenBank: AF016296): es wurde ein antisense-Oligonukleotid mit der Sequenz 5´ TCG GGA ACT CTG ATT GGA TGG TGC TGT CTA TAA TGG TTG GCT TCT 3´, komplementär zu den Basen 2033 bis 2077 der cDNA verwendet.
Neuropilin-2 (AF016297): es wurde ein antisense-Oligonukleotid mit der Sequenz 5´ AAA TCT TTG TCA TCC TCA AAG CTG CAG TTT TCC CCA CAC T 3´, komplementär zu den Basen 2185 bis 2224 der cDNA verwendet.
DCC (RNU68725): es wurde ein antisense-Oligonukleotid mit der Sequenz 5´ GCT TAC TTT GAT ACT CCT TGA ATT ACC CAC TTC CAG AGA GA 3´, komplementär zu den Basen 2218 bis 2259 der cDNA verwendet.
Die Oligonukleotide (0,3 pmol) wurden gemäß den Herstellerangaben unter Verwendung von terminaler Transferase (Boehringer Mannheim, Deutschland) mit [alpha-35S]dATP (DuPont NEN, Boston) radioaktiv endmarkiert. Für die Hybridisierungen wurden die markierten Sonden mit Hybridisierungsmix gemischt (0,3 pmol/ ml; 50% Formamid, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 2x SSC, 5 mM EDTA, 10% Dextransulfat, 5x Denhardts Lösung, 10 mM DTT, 2 mg tRNA). Die Hybridisierung erfolgte für 16 h bei 42 °C in einer feuchten Kammer. Nach dem Waschen (2x 30 min in 1x SSC bei 56 °C und 1x 5 min in 0,5x SSC bei RT) wurden die Schnitte dehydriert und für eine Woche einem Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm ausgesetzt (Autoradiographie). Zur genaueren Analyse wurden die Schnitte mit Kodak NTB-2 Foto-Emulsion überschichtet (“dippen“) und


25

2 Wochen bei 4 °C exponiert. Nach der Entwicklung (Kodak D19) wurden die Schnitte mit Toluidinblau gegengefärbt. Als Kontrolle wurden die in-situ-Hybridisierungen unter Zugabe von einem 50-fachen Überschuß an unmarkiertem Oligonukleotiden zur radioaktiv markierten Probe durchgeführt. Die Schnitte wurden gleich behandelt.

2.1.4 Verwendung von Riboproben

Für die Herstellung der Sema3A- und Sema3C-Riboproben wurde die Plasmide pBK-CMVSemD und pBK-CMVSemE , welche die Sequenzen von Sema3A bzw. Sema3C enthalten, verwendet. Für die Netrin-1 Riboprobe wurde der Vektor pBK-CMVnetrin-1 , der die cDNA von netrin-1 enthält, verwendet. Die Vektoren wurden mit den Restriktionsenzymen SmaI oder SpeI zur Linearisierung inkubiert. Die linearisierten Vektoren, die als Matrize für die Generierung von sense- bzw. antisense-Sonden dienten, wurden gemäß Herstellerangaben in einem Reaktionsansatz mit T3-RNA-Polymerase oder T7- RNA-Polymerase (Boehringer Mannheim, Germany) inkubiert, um unter Zugabe von [alpha-35S]dUTP markierte sense- (T3) bzw. antisense-Sonden (T7) herzustellen. Die T7-generierten RNAs dienten als spezifische Probe, die T3-generierten als Kontrolle. Die Proben wurden anschließend mit DNaseI inkubiert, mit 1/10 Vol. 2 M NaOH hydrolysiert und mit 2/10 Vol. 1 M Essigsäure neutralisiert. Die Hybridisierung erfolgte für 16 h bei 52 °C in einer feuchten Kammer. Nach dem ersten Waschen (1 x 5 min in H2O bei RT) wurden die Schnitte mit 20 µg/ml RNase-A in TNE Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 1mM EDTA) für 15 min bei 37 °C inkubiert. Das abschließende Waschen erfolgte: 1 x 5 min in H2O bei RT,


26

2x 30 min in 1 x SSC bei 56 °C und 2 x 30 min in 0,1 x SSC bei 56 °C, 1 x 5 min in H2O bei RT. Nach dem Dehydrieren wurden die Schnitte für eine Woche einem Kodak X-OMAT AR Röntgenfilm ausgesetzt (Autoradiographie). Zur genaueren Analyse wurden die Schnitte mit Kodak NTB-2 Foto-Emulsion überschichtet (“dippen“) und 2 Wochen bei 4 °C exponiert. Nach der Entwicklung (Kodak D19) wurden die Schnitte mit Toluidinblau gegengefärbt.

2.2 Zell- und Gewebekulturexperimente

2.2.1 Präparation von Gewebeexplantaten aus embroynalen Gehirnen:

Schwangere Ratten der Wistar Inzucht Linie wurden zwischen den Zeitpunkten E19 und E21 der Entwicklung ihrer Embryonen mit einer Mischung aus 25% Ketavet, 6% Rompun und 2,5% Vetranquil in einer 0,9%igen NaCl-Lösung (2,5 ml/kg Körpergewicht i.p.) anästhesiert und dekapitiert. Die Embryonen wurden dem Muttertier entnommen, dekapitiert und das Gehirn entnommen<2>. Die weitere Präparation fand in eiskaltem PBS oder HBSS statt. Von den Gehirnen wurden mit einem Vibratom in eiskaltem PBS 400 µm dicke horizontale Schnitte angefertigt. Anschließend wurde in eiskaltem HBSS von den Schnitten der Hippokampus und der benachbarte entorhinale Kortex abgetrennt. Der Hippokampus wurde in seine Felder (CA1, CA3 und Gyrus dentatus) aufgeteilt. Aus dem entorhinalen Kortex wurden Explante der Schichten II/III entnommen. Zusätzlich wurden aus E21 Gehirnen


27

Explantate des medialen Septums präpariert.

2.2.2 Kokulturexperimente

Kulturen von 293 Zellen (ATCC CRL 1573) wurden in 250 ml Kulturflaschen angezogen. Bei einer Wachstumsdichte von 75% auf der Oberfläche der Kulturflasche wurden sie transient mit einer Mischung aus 12 µg Plasmid DNA (Sema3A [pBKFlagSemD], Sema3C [pBKFlagSemE], ; netrin-1 [pBKFlagnetrin-1], zur Verfügung gestellt von A. W. Püschel) und 48 µl PerFect Lipid Pfx-4 (Invitrogen) transfiziert. Als Kontrolle diente das Plasmid pBK-CMV, das in gleicher Weise und Menge transfiziert wurde. Aus den transfizierten Zellen wurden Hängetropfenkulturen angelegt. Dazu wurden die Zellen trypsiniert und in 500 µl 10% FCS in DMEM Medium (GIBCO BRL) geerntet. 25 µl der Zellsuspension wurden auf die Deckel von 6-Loch-Kulturplatten pipettiert und über Kopf hängend über Kulturmedium für 16 h bei 37 °C inkubiert. Durch die Schwerkraft sammeln sich die Zellen in dem Tropfen und bilden ein Aggregat. Diese Zellaggregrate wurden in eine drei-dimensionale Kollagen-Matrix eingebracht. Das dafür notwendige Kollagengel wurde aus Typ I Kollagen (aus Rattenschwanz; Sigma C7661) hergestellt, welches in 0,1 M Essigsäure mit einer Endkonzentration von 2 mg/ml gelöst wurde. Diese Kollagenlösung wurde mit MEM Medium (GIBCO BRL) gemischt und durch Zugabe von Rekonstituierungspuffer (2,2% NaHCO3 in 0,8 M NaOH) neutralisiert. Die verschiedenen Explantate wurden in die Kollagenmatrix eingebracht und in unmittelbarer Nähe der Zellaggregate positioniert. Nach dem Auspolymerisieren des Kollagens (30 min bei 37 °C) wurde Kulturmedium hinzugefügt (Neurobasalmedium


28

mit 10% FCS, 1% Penicillin/Streptomycin, 2% B27, 0,5 mM L-glutamine [GIBCO BRL], 10 µM Cytosin-Arabinosid [SIGMA]). Die Kokulturen wurden für 2 Tage bei 35 °C und 4% CO2 inkubiert. Als Kontrollen für die Expression und Wirkung der zu untersuchenden Faktoren wurden folgende Ko-Kulturen angelegt: Hinterwurzelganglien von E14 und Explantate des entorhinalen Cortex von E21 Ratten als Positivkontrolle für die funktionelle Expression von Sema3A . Die auswachsenden Neurite dieser Ganglien sollten von Sema3A abgestoßen werden. Als Positivkontrolle für die funktionelle Expression Sema3C (abstoßender Effekt) wurden E13 sympathische Ganglien der Ratte benutzt , für die funktionelle Expression von Netrin-1 (attraktiver Effekt) wurden E13 Explantate der Deckplatte von Ratten verwendet .
Die Effekte der sezernierten Faktoren Sema3A, Sema3C und Netrin-1 auf das Auswachsen der neuronalen Explantate wurden in jeweils drei unabhängig durchgeführten Experimenten untersucht. Zur Auswertung wurde das Gebiet, in dem das Auswachsen von Neuriten beobachtet wurde in eine proximale (dem Zellaggregat zugewandte) und eine distale (dem Zellaggregat abgewandte) Hälfte unterteilt. Das Auswachsmuster wurde als attraktiv eingestuft, wenn in der proximalen Hälfte des Explantates eine höhere Faserdichte als in der distalen Hälfte beobachtet wurde. Dagegen wurde das Auswachsmuster als repulsiv bewertet, wenn die Faserdichte in der proximalen Hälfte geringer war als in der distalen bzw. wenn keine Fasern in der proximalen Hälfte beobachtet werden konnten. Radiales Auswachsen wurde als gleiche Faserdichte in beiden Hälften des Explantates definiert. Die Wachstumseffekte wurden an einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet und fotografisch dokumentiert. Die Daten wurden blind ausgewertet und in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Fußnoten:

<1>

Die Organentnahme war laut Tierversuchsantrag T0115/97 genehmigt.

<2>

Die Organentnahme war laut Tierversuchsantrag T0115/97 genehmigt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Mon Oct 7 10:50:54 2002