Steup, Andreas : Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Semaphorine

3.1.1 Semaphorine und ihre Rezeptoren werden während der Entwicklung in der hippokampalen Formation der Ratte exprimiert

Die Expression des Sema3A-Rezeptors Neuropilin-1 (NP-1) im Hippokampus wurde mittels radioaktiver in-situ-Hybridisierung untersucht. Vom embryonalen Entwicklungsstadium E17 an wurden starke Hybridisierungssignale in der hippokampalen Anlage und dem entorhinalen Kortex gefunden (Abb. 6A). Zum Zeitpunkt P0 waren die Expressionssignale von NP-1 stark im ausdifferenzierten Hippokampus in der Pyramidenzellschicht der CA3-Region und schwächer in der CA1-Region, der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus, dem Subiculum sowie den Schichten II und III des entorhinalen Kortex lokalisiert (Abb. 6B, E-H). Die Intensität des Hybridisierungssignals nahm zu P7 hin ab und war zu späteren Zeitpunkten nicht mehr detektierbar. Desweiteren wurde die Expression von Sema3C und seinem Rezeptor Neuropilin-2 (NP-2) im Verlauf der Entwicklung des Hippokampus untersucht. Es wurde keine Expression von Sema3C vor Embryonaltag 15 (E15) in der hippokampalen Anlage beobachtet (Abb. 7A). Von E 17 an wurde Sema3C im Hippokampus exprimiert. Vom Stadium P1 an konnte Sema3C in den gut unterscheidbaren Regionen des Hippokampus, der Pyramidenzellschicht von CA1-3 und dem Gyrus dentatus detektiert werden (Abb. 7B).


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Abb. 6 (vorherige Seite): Expression von Neuropilin-1 im entorhinalen Kortex und Hippokampus (A, B Autoradiogramm; E-H gedippte Schnitte), Diagramm der Expression von Sema3A im Hippokampus (C), schematische Darstellung der Anatomie des Tractus perforans und der Moosfaserprojektion (D).

<A NAME=@Seite31@></A><HR><P CLASS=@PAGENUMBER@ ALIGN=RIGHT>31</P>

Das Expressionmuster von Neuropilin-1 wurde durch radioaktive in-situ-Hybridisierung auf Kryostatschnittpräparaten von E17 (A) und P0 (B, E-H) Rattengehirnen visualisiert. Von E17 an wird Neuropilin-1 im EC, Subiculum und der Anlage des Hippokampus exprimiert (A). Spezifische Signale wurden in den Schichten II und III des EC gefunden (E; höhere Vergrößerung in F). Zum Zeitpunkt P0 wurde ein starkes Expressionssignal in CA3 gefunden, während das Signal in CA1, Subiculum, DG und EC schwächer war (B). In der Körnerzellschicht des DG wurde Expression von Neuropilin-1 gefunden (G; höhere Vergrößerung in H). Zum Vergleich: Skaliora et al. (1998) fanden um P0 Expression von Sema3A in der Zielregion des Tractus perforans, der Molekularschicht des DG und an der Verbindungsstelle zwischen CA1 und Subiculum (C).
CA Cornu ammonis, dg Gyrus dentatus, ec entorhinaler Kortex, gl Körnerzellschicht, MF Moosfasern, pp Tractus perforans, sub Subiculum, hip Hippokampus. Vergrößerung: E=33x, F=130x, G=23x, H=46x.

Dieses Expressionsmuster bestand ohne Änderungen von postnatal bis zum adulten Stadium (Abb. 7C). Die Expression des Sema3C-Rezeptors NP-2 war ab E17 detektierbar. Bei P1 konnte das Signal sowohl in der CA-Region als auch im Gyrus dentatus gefunden werden (Abb. 7D). Im entorhinalen Kortex konnte kein NP-2-Signal detektiert werden (Abb. 7E). Die Expression von NP-2 im Gyrus dentatus und der CA-Region konnte bis zur spät-postnatalen Entwicklung (P19) gefunden werden (Abb. 7F).


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Abb. 7: Expression von Sema3C (A-C) und seinem Rezeptor Neuropilin-2 (D-F) im Rattengehirn während der Entwicklung, durch radioaktive in-situ-Hybridisierung visualisiert.

Zum Zeitpunkt E15 der Embryonalentwicklung war die Expression von Sema3C im Kortex aber nicht in der hippokampalen Anlage detektierbar (A). Bei P1 war das Signal weiterhin im Kortex präsent und zusätzlich im DG und in der CA-Region des Hippokampus detektierbar (B). Im adulten Stadium waren weiterhin starke Sema3C-Expressionssignale im DG und CA1-CA3 detektierbar (C). In DG und CA3 wurde ab P1 ein starkes Hybridisierungssignal für Neuropilin-2 gefunden, während das Signal in CA1 schwächer war (D). Im EC war zu diesem Zeitpunkt kein Expressionssignal detektierbar (E, Pfeilkopf). Dieses Expressionsmuster war bis in späte postnatale Stadien (P19) zu beobachten (F). A,D sind mediale sagitale Schnitte; E ist ein lateraler sagittaler Schnitt; B,C,F sind horizontale Schnitte; DG Gyrus dentatus, CA Cornu ammonis, Cx Kortex, EK entorhinaler Kortex, hip Hippokampus.


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3.1.2 Semaphorine und ihre Rezeptoren sind an der Entwicklung der hippokampalen Projektionen der Ratte als neuronale Leitmoleküle beteiligt

Um die Effekte der sezernierten Semaphorine Sema3A und Sema3C zu untersuchen, wurden Kokulturen von Aggregaten von 293-Zellen (siehe II.2.2.), die entweder Sema3A oder Sema3C sezernierten, und neuronalen Gewebeexplantaten angelegt. Diese wurden in einer drei-dimensionalen Kollagenmatrix kultiviert. In den Kontrollkulturen (Abb. 9A1, B1, C1; Abb. 10A1, C, D) wurden die Zellaggregate mit dem Kontrollplasmid pBK-CMV transfiziert. Die neuronalen Explantate zeigten in diesen Kulturen radiales Auswachsen der Neuriten. Zellaggregate, die Sema3A-sezernierten, inhibierten dagegen das neuronale Wachstum von Axonen aus dem Gyrus dentatus, den CA1- und CA3-Regionen sowie aus dem entorhinalen Kortex auf der proximaler Seite der Explantate (Abb. 9A2, B2, C2; Abb. 10A2; Tab. 1). Das Wachstum der Neuriten auf der distalen Seite der Explantate wurde nicht von Sema3A beeinflußt. Die Neuriten von Explantaten aus dem medialen Septum zeigten keine Wachstumshemmung durch die Kokultur mit Sema3A-sekretierenden Zellaggregaten (Abb. 10B2 and Tab. 1).

Im Gegensatz dazu hatte Sema3C eine repulsive Wirkung auf die auswachsenden Neuriten von Explantaten aus dem medialen Septum und der CA1-Region (Abb. 9B3; Abb. 10B3; Tab. 1). Verglichen mit den Kontrollkulturen (Abb. 9A1, B1, C1; Abb. 10A1, C, D), wurde kein Einfluß von Sema3C auf Explantate aus dem Gyrus dentatus, der CA3-Region und dem entorhinalen Kortex gefunden (Abb. 9A3, C3; Abb. 10A3; Tab. 1).


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Tab. 1 (nächste Seite): Differentielle Auswachsmuster neuronaler Explantate der hippokamplaen Formation in der Kokultur. Semiquantitive Auswertung der differentiellen Auswachsmuster von Explantaten aus dem entorhinalen Kortex, dem Gyrus dentatus, dem Cornu ammonis und dem medialen Septum, die mit Sema3A-, Sema3C- oder Netrin-1 sekretierenden Zellaggregaten oder mit Kontrollzellaggregaten (mock) kokultiviert wurden. Die Zahlen repräsentieren die Anzahl der individuellen Explantate, die das jeweilige Auswachsmuster unter den untersuchten Kulturbedingungen zeigten. Die fett gedruckten Zahlen zeigen das bevorzugte Auswachsmuster unter den jeweiligen Kulturbedingungen an. Die Daten stammen jeweils aus drei voneinander unabhängig durchgeführten Ko-Kulturexperimenten. Das Gebiet, in dem das Auswachsen von Neuriten beobachtet wurde, wurde in eine proximale (dem Zellaggregat zugewandte) und eine distale (dem Zellaggregat abgewandte) Hälfte unterteilt. Radiales Auswachsen bedeutet gleiche Faserdichte in beiden Hälften des Explantates. Repulsion bedeutet eine höhere Faserdichte in der distalen Hälfte des Explantates als in der proximalen Hälfte. Attraktion bedeutet eine höhere Faserdichte in der proximalen Hälfte des Explantates als in der distalen Hälfte. CA1, CA3 Cornu ammonis Regionen, DG Gyrus dentatus, EC entorhinaler Kortex


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Explantat

Kokultur

radiales Auswachsen

Repulsion

Attraktion

EC

mock (n=33)

32

1

0

 

Sema3A (n=18)

4

14

0

 

Sema3C (n=28)

22

6

0

 

Netrin-1 (n=24)

24

0

0

Explantat

Kokultur

radiales Auswachsen

Repulsion

Attraktion

DG

mock (n=11)

10

1

0

 

Sema3A (n=9)

1

8

0

 

Sema3C (n=17)

14

3

0

 

Netrin-1 (n=12)

0

0

12

Explantat

Kokultur

radiales Auswachsen

Repulsion

Attraktion

CA1

mock (n=27)

26

1

0

 

Sema3A (n=24)

5

19

0

 

Sema3C (n=12)

0

12

0

 

Netrin-1 (n=27)

26

1

0

Explantat

Kokultur

radiales Auswachsen

Repulsion

Attraktion

CA3

mock (n=23)

23

0

0

 

Sema3A (n=16)

3

13

0

 

Sema3C (n=22)

14

8

0

 

Netrin-1(n=19)

0

0

19

Explantat

Kokultur

radiales Auswachsen

Repulsion

Attraktion

Septum

mock (n=30)

30

0

0

 

Sema3A(=8)

8

0

0

 

Sema3C (n=11)

0

11

0

 

Netrin-1 (n=22)

22

0

0


36

3.2 Netrin

3.2.1 Netrin-1 und sein Rezeptor DCC werden während der Entwicklung der hippokampalen Formation der Ratte exprimiert

Die Expressionsmuster von Netrin-1 und DCC wurden durch radioaktive in-situ-Hybridisierung untersucht.

Abb. 8: Expression von Netrin-1 (A-C) und seinem Rezeptor DCC (D-F) im Rattengehirn während der Entwicklung, durch radioaktive in-situ-Hybridisierung visualisiert.

Zum Zeitpunkt E17 der Embryonalentwicklung (A) wurde Netrin-1 Expression im Kortex gefunden, während in der hippokampalen Anlage kein Signal detektierbar war. Zum Zeitpunkt P1 (B), wurde Netrin-1 mRNA sowohl im Kortex als auch im Hippokampus lokalisiert, wobei das stärkste Signal im CA3 auftrat. Zu einem späteren Zeitpunkt der postnatalen Entwicklung (P8) wurde ein deutliches Expressionssignal in der CA1-3 Region beobachtet, während im DG ein schwächeres und im EC kein Signal detektiert werden konnte (C). Expression des Rezeptors DCC war ab E15 in der hippokampalen Anlage detektierbar (D). Ab P1 (E) wurden starke Expressionssignale im DG und CA1-CA3 gefunden, die bis P5 (F) detektiert werden konnten. A-C, F sind horizontale Schnitte; D,E sind saggitale Schnitte; CA Cornu ammonis, Cx Kortex, DG Gyrus dentatus, EK entorhinaler Kortex, hip Hippokampus.


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An Embryonaltag E17 konnte die Expression von Netrin-1 ausschließlich im Neokortex des Rattengehirnes festgestellt werden (Abb. 8A). Ab P1 wurde Netrin-1 auch im Hippokampus, mit einem starken Signal in CA3 und schwächer im Gyrus dentatus, exprimiert, während im entorhinalen Kortex keine Expression detektierbar war (Abb. 8B). Zu späteren postnatalen Entwicklungsstadien (P8) wurde Netrin-1 weiterhin in den CA-Regionen und dem Gyrus dentatus exprimiert (Abb. 8C). Dies setzte sich bis zum adulten Stadium fort. Die Expression des Rezeptors DCC konnte ab E15 in der hippokampalen Anlage nachgewiesen werden (Abb. 8D). Nach der Entwicklung der hippokampalen Felder (P1) wurde DCC in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus und der Pyramidenzellschicht von CA3 detektiert (Abb. 8E). Dieses Expressionsmuster konnte bis P5 (Abb. 8F) beobachtet werden. Die Intensität des Expressionssignals nahm während der weiteren postnatalen Entwicklung ab. Im adulten Gehirn wurde DCC in den beschriebenen Regionen nur noch schwach exprimiert.


38

Abb. 9: Die neuronalen Leitmoleküle Sema3A, Sema3C und Netrin-1 beeinflussen differentiell das Auswachsen von Neuriten aus Hippokampus-Explantaten.

Explantate aus dem DG (A1-A4), der CA1-Region (B1-B4) oder der CA3-Region (C1-C4) von E19-E21 Rattenembryos wurden mit Zellaggregaten, die Sema3A (A2, B2, C2), Sema3C (A3, B3, C3) oder Netrin-1 (A4, B4, C4) sekretieren oder mit Kontrollzellaggregaten (A1, B1, C1) kokultiviert. Sema3A zeigte einen repulsiven Wachstumseffekt auf Axone von DG-, CA1- und CA3-Explantate (A2, B2, C2), verglichen mit dem radialen Auswachsen von Neuriten bei den Kontrollkulturen (A1, B1, C1). Sema3C hatte dagegen nur auf Explantate aus der CA1-Region einen repulsiven Effekt (B3), aber nicht auf Explantate aus der DG- oder der CA3-Region (A3, C3). Netrin-1 zeigte einen attraktiven Wachstumseffekt auf Axone von DG- und CA3-Explantate (A4, C4). CA Cornu ammonis, DG Gyrus dentatus. Phasenkontrastaufnahmen. Skalierung: 100 µm.


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3.2.2 Netrin-1 und sein Rezeptor DCC sind an der Entwicklung der hippokampalen Projektionen der Ratte als neuronale Leitmoleküle beteiligt

Zur Untersuchung der Wirkung des sezernierten Proteins Netrin-1 auf neuronale Explantate wurden mit diesem Faktor transfizierte Zellaggregate mit Explantaten der verschiedenen hippokampalen Regionen, des medialen Septums und des entorhinalen Kortex in eine Kollagenmatrix eingebettet. In den Kontrollkulturen wurde radiales Auswachsen der Explantate aller Subregionen beobachtet (Abb. 9A1, B1; C1; 10A1, B1Tab.1). Die Explantate der CA1-Region, des entorhinalen Kortex und des medialen Septums wurden in ihrem Auswachsen von Netrin-1 nicht beeinflußt. Ihre Fasern zeigten radiales Wachstum (Abb. 9B4; 10A4, B4). Dagegen zeigten die Fasern von Explantaten des Gyrus dentatus und der CA3-Region ein bevorzugtes Wachstum auf das Netrin-1-sekretierenden Zellaggregat hin (Abb. 9A4, C4; Tab. 1). Dies zeigte sich in einer höheren Anzahl und Dichte von Fasern auf der proximalen Seite des Explantats, während nur sich wenige Fasern auf der distalen Seite des Explantats befanden.


40

Abb. 10 (vorherige Seite): Die neuronalen Leitmoleküle Sema3A, Sema3C und Netrin-1 beeinflussen differentiell das Auswachsen von Neuriten aus Explantaten des EC und dem medialen Septum.


<A NAME=@Seite41@></A><HR><P CLASS=@PAGENUMBER@ ALIGN=RIGHT>41</P>

Explantate aus dem EC (A1-A4) oder medialen Septum (B1-B4) von E19-E21 Rattenembryonen wurden mit Zellaggregaten, die Sema3A (A2, B2), Sema3C (A3, B3) oder Netrin-1 (A4, B4) sekretieren oder mit Kontrollzellaggregaten (A1, B1) kokultiviert. Sema3A zeigte, im Vergleich zur Kontrolle (A1), einen repulsiven Wachstumseffekt auf Axone des EC (A2). Weder Sema3C (A3) noch Netrin-1 (A4) besaßen einen Einfluß auf das radiale Auswachsen von EC-Neuriten. Sema3C zeigte repulsive Wachstumseffekte auf Fasern des medialen Septums (B3), während weder Sema3A noch Netrin-1 einen Einfluß auf das radiale Auswachsen der Neuriten besaß (B2, B4). In (C) sind auswachsende Axone von EC-Explantaten gezeigt, die mit Kontrollzellaggregaten kokultiviert wurden. In (D) ist eine höhere Vergrößerung von (C) gezeigt. Die Pfeile zeigen die Wachstumskolben. CA Cornu ammonis, EC entorhinaler Kortex, DG Gyrus dentatus. Phasenkontrastaufnahmen. A,B: Skalierung: 100 µm. C. Skalierung: 10µM. D: Skalierung: 30µM


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Mon Oct 7 10:50:54 2002