Steup, Andreas : Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

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Kapitel 4. Diskussion

Die Zielfindung von auswachsenden Neuronen ist für die Ontogenese des Gehirns ein wichtiger Vorgang. Nur bei einer korrekten Verschaltung der Gehirnareale durch die axonalen Bahnen ist die Funktionalität des Gehirns gewährleistet. In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluß verschiedener Moleküle auf die Wegfindung von afferenten, efferenten und intrinsischen Fasersystemen der hippokampalen Formation untersucht. Dazu wurden die Expressionsmuster und funktionellen Eigenschaften von Sema3A, Sema3C und Netrin-1 sowie die Expressionsmuster ihrer Rezeptoren ermittelt.

4.1 Die Semaphorine Sema 3A und 3C besitzen repulsive Eigenschaften auf verschiedene afferente hippokampale Projektionen

In den äußeren Molekularschichten des Gyrus dentatus terminieren Fasern des Tractus perforans (Abb. 11A). Diese Fasern innervieren die äußere Molekularschicht des Gyrus dentatus in einem dichten Band und sind deutlich abgegrenzt zu den Terminationszonen der kommissuralen und Assoziationsfasern . Hippokampale Regionen, die vom Tractus perforans während des Einwachsens in den Hippokampus vermieden werden, exprimieren Sema3A. Die Expression von Sema3A konnte in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus und an der Grenze zwischen Subiculum und CA1 nachgewiesen werden . Die Expressionsmuster des Sema3A-Rezeptors Neuropilin-1 sowie die repulsive Wirkung dieses Semaphorins auf Explantate aus dem entorhinalen Kortex weisen auf einen funktionellen Zusammenhang zwischen Sema3A und der


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Ausbildung des Tractus perforans hin . Die Expression von Sema3A in der inneren Molekularschicht des Gyrus dentatus hat nach diesem Modell einen repulsiven Effekt auf einwachsende entorhinale Fasern des Tractus perforans, welche den entsprechenden Rezeptor Neuropilin-1 exprimieren. Dadurch wird die innere Molekularschicht zur repulsiven Barriere für einwachsende Fasern, die sich in der äußeren Molekularschicht verzweigen und synaptische Kontakte ausbilden (Abb. 11A). Die Expression von Sema3A an der Verbindungsstelle zwischen Subiculum und CA1 hat möglicherweise die Funktion, die ipsi- und kontralateral projizierenden entorhinalen Fasern in Richtung auf die Pyramidenzellschicht zu leiten (Abb. 11A) . Zusätzlich konnte durch Bindungsstudien mit Sema3A, das mit alkalischer Phosphatase gekoppelt wurde, die Verteilung von Neuropilin-1 in den Terminationszonen extrinsischer Afferenzen gezeigt werden<3> . Dies war besonders in den Molekularschichten des Gyrus dentatus, dem Stratum lacunosum moleculare, dem Stratum oriens und der Fimbria sowie den Moosfasern der Fall. Neuropilin-1 wird in den Molekularschichten des Gyrus dentatus und in den CA-Regionen sowie den Moosfasern exprimiert . Axone von Explantaten aus diesen Regionen wurden durch die repulsive Wirkung von Sema3A in den Zellkulturexperimenten abgestoßen. Explantate aus dem medialen Septum wurden dagegen weder in repulsiver noch in attraktiver Weise in ihrem Wachstumsmuster von Sema3A beeinflußt. Neben der Funktion als Terminationszone für den Tractus perforans, wirkt die Molekularschicht

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möglicherweise auch als repulsive Barriere für die Moosfasern, um sie zur CA3-Region zu leiten (Abb. 11A). Durch den Wegfall dieser repulsiven Barriere nach der Denervierung des Gyrus dentatus können Moosfasern in die Molekularschicht einwachsen . Studien mit dem anterograd transportierten lipophilen Farbstoff DiI, die an fixierten Gehirnen von Sema3A-/- Mäusen durchgeführt wurden (Tracer-Studien), zeigten, daß sich auch der Tractus perforans und die Moosfaserprojektion ohne mit dieser Methode detektierbaren Veränderungen entwickeln (T. Skutella, unpublizierte Beobachtungen). Außerdem entwickeln sich weitere Projektionen, zum Beispiel die thalamokortikalen und die basalen Vorderhirnprojektionen, in Sema3A-/- Mäusen normal . Dies bedeutet, daß Sema3A nicht der ausschließliche Faktor ist, der an der Ausbildung dieser Projektionen beteiligt ist.

Die Kokulturstudien zeigen, daß Sema3C, ähnlich wie Sema3A, als neuronales Leitmolekül im Hippokampus wirken kann. Sema3C läßt in der Zellkultur auswachsende Fasern aus Explantaten des medialen Septum kollabieren. Auf entorhinale, CA3- sowie Gyrus dentatus-/ Hilus-Fasern hatte Sema3C dagegen keinen Einfluß. Die Transkripte von Sema3C und Neuropilin-2 wurden in topographisch abgegrenzten Gebieten des Hippokampus lokalisiert. Expression von Sema3C wurde in der Pyramidenzellschicht der CA-Region gefunden. Die Rezeptorbindungsstudien mit Sema3C, das mit alkalischer Phosphatase gekoppelt wurde, (AP-Sema3C) zeigen die Anwesenheit des Rezeptors Neuropilin-2 in der Fimbria/ Fornix, dem Stratum oriens und dem Stratum lacunosum moleculare <4>.


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Aufgrund der Expressionsmuster von Neuropilin-2 im Septum und von Sema3C im Hippokampus läßt sich die Hypothese aufstellen, daß Sema3C eine repulsive Barriere für septale Fasern darstellt, welche die Axone in der weißen Substanz entlang des Stratum oriens leitet bzw. die Terminationszone in CA1 und CA3 bildet. Zusätzliche attraktive Faktoren müssen jedoch vorhanden sein, um die septalen Fasern durch die repulsive Barriere in das Stratum radiatum zu leiten (Abb. 11B). Tracer-Studien mit DiI, die in fixierten Gehirnen von Sema3C-/- Mäusen durchgeführt wurden, zeigten jedoch, daß die Abwesenheit von Sema3C keinen Einfluß auf die Terminierung von septalen Fasern in der inneren und äußeren Molelekularschicht des Gyrus dentatus hatte (T. Skutella, unpublizierte Beobachtungen). Zusätzlich zu den Effekten auf septale Fasern besitzt Sema3C repulsive Eigenschaften auf Explantate aus der CA1-Region, in der dieser Faktor auch exprimiert wird (Abb. 11B). Sema3C könnte als repulsiver Faktor auf CA1-Neurone wirken und deren Axone in Richtung auf das Subiculum leiten.
Sema3F wirkt in diesem System zusätzlich als repulsiver Faktor auf Axone aus der CA1- und der CA3-Region sowie auf Axone aus dem Gyrus dentatus . Es kann daher davon ausgegangen werden, daß mehrere Semaphorine ihre repulsiven Effekte auf die Fasern ausüben oder diese Semaphorine redundante Funktionen ausüben, um den Ausfall eines Faktors zu kompensieren .


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4.2 Netrin-1 wirkt als attraktiver Faktor für Fasern der hippokampalen Kommissur

Die hippokampale Kommissur entspringt ipsilateral in zwei Regionen und projiziert auf die kontralaterale Seite. Die Mooszellen im Hilus des Gyrus dentatus projizieren über die hippokampale Kommissur in die innere Molekularschicht des kontralateralen Gyrus dentatus, während Neurone aus der CA3-Region in die CA1- und CA3-Regionen des kontralateralen Hippokampus projizieren . Die ontogenetische Verteilung der mRNAs des attraktiven Leitmoleküls Netrin-1 und seines Rezeptors, DCC läßt sich mit der Ausbildung der hippokampalen Kommissur in Übereinstimmung bringen und entspricht der Expression dieser mRNAs im adulten Hippokampus . In der Fimbria des Hippokampus wurde die Expression von Netrin-1 früh in der Ontogenese beschrieben . In der vorliegenden Untersuchung war es möglich, Netrin-1 mRNA zwischen E19 und P8 auch in den Zielgebieten der hippokampalen kommissuralen Fasern in CA1, CA3 und dem DG zu detektieren. DCC wird im DG/Hilus sowie in den Pyramidelzellen der CA3-Region exprimiert (Abb. 8). In den funktionellen Kokulturstudien konnte ein attraktiver Effekt von Netrin-1 auf Explantate aus DG und CA3 (Abb. 9), deren Fasern der Ursprung der hippokampalen Kommissur sind, nachgewiesen werden. Studien an Netrin-1- und DCC-defizienten Mäusen zeigen zudem selektive, aber schwere Defekte in der Ausbilung verschiedener kommissuraler Fasern . Sowohl das Corpus callosum als auch die hippokampale Kommissur fehlen vollständig in den homozygoten Mutanten. Die Fimbria und die anteriore Kommissur sind ebenfalls in ihrer Entwicklung gestört . Zusammengenommen unterstützen diese


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Daten die Hypothese, das Netrin-1 und DCC an der Attraktion von kommmissuralen Gyrus dentatus-/ Hilus- und CA3-Fasern in ihre Terminationszone im kontralateralen Hippokampus beteiligt sind.

4.3 Ein komplexes Netzwerk von neuronalen Leitmolekülen ist für die Entwicklung hippokampaler Projektionen verantwortlich

Während der Entwicklung der hippokampalen Projektionen sowie der intrahippokampalen Verschaltungen wird eine Vielzahl von Genen verschiedener Familien exprimert, die als neuronale Leitmoleküle wirken. Die Resultate der vorliegenden Arbeit unterstützen die Vorstellung, daß sezernierte Klasse 3 Semaphorine sowie Netrin-1 als neuronale Leitmoleküle während der Entwicklung des zentralen Nervensystems wirken. In dieser Arbeit wurde der Einfluß dieser Moleküle auf die Entwicklung von afferenten Systemen in den Hippokampus der Ratte sowie auf intrahippokampale Projektionen nachgewiesen. Die sezernierten Klasse 3 Semaphorine Sema3A und Sema3C wirken als repulsive Moleküle und bilden repulsive Barrieren für verschiedene afferente Projektionen in den Hippokampus . Die Entwicklung des Tractus perforans und des Moosfasersystems wird durch Sema3A und dessen Rezeptor Neuropilin-1 beeinflußt, während Sema3C und Neuropilin-2 das Einwachsen der septo-hippokampalen Axone kontrollieren (Abb. 11).


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Abb. 11: Die Entwicklung von Projektionen in der hippokampalen Formation wird durch neuronale Leitmoleküle reguliert.

(A) Entorhinale Fasern der Schichten II und III projizieren durch den Tractus perforans in die äußere Molekularschicht des Gyrus dentatus und durch den Alveus in das Stratum lacunosum moleculare in


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die CA1-Region. Durch die repulsive Wirkung von Sema3A werden die Fasern des Tractus perforans in ihrem weiteren Auswachsen gehindert und etablieren synaptische Kontakte in der Zielregion. Sema3A wird zusätzlich an der Grenze zwischen Subiculum und CA1 exprimiert, wo es möglicherweise die entorhinalen Fasern, die durch den Alveus wachsen, in die Richtung des Stratum pyramidale ablenkt. Die Projektion der Moosfasern ensteht in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus und wächst nach CA3. Die Fasern dieser Projektion können durch Sema3A, das in der Körnerzellschicht exprimiert wird, kollabiert werden. Damit stellt diese Schicht eine repulsive Barriere für die Moosfasern dar. Expression des Sema3A-Rezeptors Neuropilin-1 findet sich in den Regionen, in denen der Tractus perforans sowie die Moosfaserprojektionen entstehen (linke Seite: Schema des Tractus perforans und der Alveus-Projektion [rot] sowie der Moosfasern [blau]; rechte Seite: Expression von Sema3A [in rot] und Neuropilin-1 [in blau]).
(B) Fasern aus dem medialen Septum projizieren entlang der Fimbria, der weißen Substanz und des Stratum radiatum des Hippokampus. Sema3C wird in der Cornu ammonis-Region exprimiert und produziert eine repulsive Barriere, um diese Fasern entlang der CA-Region zu leiten. Die Expression von Sema3C findet sich ebenfalls in der Terminationszone der septalen Fasern, dem Gyrus dentatus. Der Sema3C-Rezeptor Neuropilin-2 wird im medialen Septum exprimiert. Zusätzlich findet sich die Expression des Rezeptors in den Terminationszonen der septalen Fasern im Hippokampus, der CA-Region und dem Gyrus dentatus (linke Seite: Schema der septo-hippokampalen Projektionen [rot]; rechte Seite: Expression von Sema3C [in rot] und Neuropilin-2 [in blau]).
(C) Die kommissuralen Fasern projizieren über die Fimbria in das Stratum oriens und das Stratum radiatum der Cornu ammonis-Region, sowie in die innere Molekularschicht des Gyrus dentatus. Netrin-1 wird in der Cornu ammonis-Region und im Gyrus dentatus exprimiert und könnte daher als attraktiver Faktor für diese Projektionen dienen. Der Netrin-1-Rezeptor DCC wird sowohl in den Ursprungsgebieten der kommissuralen Projektionen als auch in den Zielregionen, der Cornu ammonis-Region und dem Gyrus dentatus, exprimiert. (linke Seite: Schema der kommissuralen Projektionen [rot]; rechte Seite: Expression von Netrin-1 [in rot] und DCC [in blau]).
ap = Alveus-Projektion; CA1/3 = Cornu ammonis; DCC = deleted in colorectal cancer; DG = Gyrus dentatus; EC II/III= entorhinaler Kortex, Schichten II/III; fi = Fimbria; mf = Moosfasern; ms = Molekularschichten; medS = mediales Septum; np1/-2 = neuropilin-1/2; pp = Tractus perforans; slm = Stratum lacunosum moleculare; so = Stratum oriens; sp = Stratum pyramidale; sr = Stratum radiatum; ws = weiße Substanz.


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Netrin-1 besitzt, im Gegensatz zu den Semaphorinen, attraktive Eigenschaften und wirkt als Leitmolekül für die kommissuralen Fasern (Abb. 11). Daten aus Sema3A-, Sema3C- und Netrin-1-defizienten Tieren zeigten, daß, zusätzlich zu den hier untersuchten Molekülen, noch weitere Faktoren an der Ausbildung der hippokampalen Formation beteiligt sein müssen . Die wird durch Befunde unterstützt, die zeigen, daß außer den sezernierten Semaphorinen noch weitere membranständige Vertreter dieser Familie während der Ontogenese im Hippokampus exprimiert werden (Sema4B, Sema5A und Sema5B). Diese sind alle früh im Neuroepithelium vorhanden. Sie zeigen im Laufe der Entwicklung, während der Hippokampus seine charakteristische Morphologie annimmt, distinkte, z.T. überlappenden Expressionsdomänen . Semaphorin Sema4A wird postnatal ab P2 sowohl in CA1 wie auch CA3 exprimiert. Sema5A wird dagegen schon um E19 im Gyrus dentatus exprimiert, ab P0 auch in CA1 sowie der Grenze zwischen CA1 und dem Subikulum . Einen weitereren wichtigen Faktor in der hippokampalen Entwicklung und seiner Laminierung stellen die Cajal-Retzius-Zellen dar, die Reelin exprimieren . Reelin wird ebenfalls in den Cajal-Retzius-Zellen des Kortex exprimiert. In Reeler-Mutanten, denen Reelin fehlt, ist die Anordnung neokortikaler Zellen gestört, was darauf hindeutet, daß Reelin für die normale Entwicklung der kortikalen Laminierung eine wichtige Rolle spielt. Die Kortex-Laminierung entsteht durch die Wanderung von neu gebildeten Neuronen durch ältere Schichten hindurch nach außen (inside-out). Dort befinden sich Cajal-Retzius-Zellen, deren Reelin als Stopsignal für früh während der Laminierung gebildetete Neuronen dient. Dies verhindert, daß diese Neurone die Pia erreichen. In der weiteren Entwicklung wandern weitere Neurone durch diese

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Schicht hindurch, erhalten durch Reelin ein Stopsignal und beginnen synaptische Kontakte auszubilden. In der Reeler-Mutanten, denen Reelin fehlt, erreichen die frühen Neurone jedoch die Pia und differenzieren sich dort. Später gebildete Neurone können sich nun ausschließlich weiter innen differenzieren, wodurch eine umgekehrte Laminierung des Kortex (outside-in) zustande kommt . Während der Entwicklung der hippokampalen Formation wird Reelin in den Cajal-Retzius-Zellen des Gyrus dentatus sowie in den Schichten I und II des entorhinalen Kortex exprimiert . Die entorhinal-hippokampale Projektion wird auch in Abwesenheit von Reelin ausgebildet, wobei die Fasern auch in den korrekten Schichten des Hippokampus terminieren. Als Vorlage für die entorhinalen Fasern dient hierbei möglicherweise die frühe hippokampal-entorhinale Projektion, die um E17 herum von den Cajal-Retzius-Zellen gebildet wird . Dennoch werden einige Abnormalitäten in diesem System beobachtet, z.B. die Ausbildung einer Projektion des medialen entorhinalen Kortex in das Stratum radiatum und Stratum oriens von CA2 oder die Abwesenheit der lateralen entorhinalen Projektion in das Stratum lacunosum moleculare von CA3 . Außerdem sind die Kollateralen, die entorhinale Fasern im Gyrus dentatus ausbilden, nach der Blockierung von Reelin durch funktionelle Antikörper in Anzahl und Dichte reduziert . Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Entwicklung des Hippokampus, seiner Struktur sowie seiner Projektionen durch das Zusammenspiel verschiedener attraktiver, repulsiver und adhesiver Moleküle kontrolliert wird .

Fußnoten:

<3>

Diese Experimente wurden von Fr. Marion Lohrum, Frankfurt/Main, durchgeführt (Steup et al., 2000).

<4>

Diese Experimente wurden von Fr. Marion Lohrum, Frankfurt/Main, durchgeführt (Steup et al., 2000).


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