Steup, Andreas : Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Expression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Diplom-Biologe Andreas Steup,
geb. am 21.12.1970 in Berlin

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I:
Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Gutachter:
Prof. Dr. Robert Nitsch
Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
Priv. Doz. Dr. Bernd Heimrich

Datum der Promotion: 18.10.2001

Zusammenfassung

Die Semaphorine Sema3A und Sema3C sowie Netrin-1 und deren Rezeptoren, die Neuropiline und DCC wurden in der vorliegenden Arbeit hinsichtlich ihrer Expression und auf ihre funktionellen Eigenschaften bezüglich des Auswachsens von Axonen, die die intrinsischen und afferenten hippokampalen Projektionen bilden, untersucht.
Während die Expressionsmuster von Sema3A schon gut bekannt waren, wurde in der hier vorliegenden Arbeit die Expression des Rezeptors von Sema3A, Neuropilin-1 (NP-1), untersucht. NP-1 wird von Embryonaltag E17 an im entorhinalen Kortex, dem Subiculum und der hippokampalen Anlage exprimiert. Es konnte eine starke postnatale Expression von NP-1 in der CA3-Region und eine schwächere Expression in der CA1-Region, dem Gyrus dentatus und dem entorhinalen Kortex gezeigt werden. Außerdem wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Sema3C und Neuropilin-2 (NP-2) genauer analysiert. Etwa zum Zeitpunkt der Geburt (P0) wurde Sema3C im Gyrus dentatus und in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Sema3C-Rezeptor Neuropilin-2 wurde zu diesem Zeitpunkt ebenso im Gyrus dentatus und CA3-Region, schwächer auch in der CA1-Region exprimiert. Es wurde keine Expression dieser beiden Faktoren im entorhinalen Kortex detektiert. In Kokulturstudien zwischen mit Sema3A bzw. Sema3C transfizierten Zellaggregaten und Explantaten aus den hippokampalen Subregionen wurden für spezifische Explantate ein funktioneller Zusammenhang zwischen der Sekretion der Semaphorine und dem Auswachsen der jeweiligen Explantate in einer drei-dimensionalen Kollagenmatrix deutlich. Sema3A besitzt repulsive Eigenschaften auf Explantate vom Gyrus dentatus, der CA1- und der CA3-Region sowie dem entorhinalen Kortex. Die Interaktion zwischen Sema3A und NP1 beeinflußt das Einwachsen bzw. die Terminierung entorhinaler Fasern in der Molekularschicht des Gyrus dentatus, indem Sema3A eine repulsive Barriere für einwachsende Fasern und Moosfasern, die in Richtung der CA3-Region auswachsen, darstellt. Sema3C besitzt repulsive Eigenschaften auf Fasern des medialen Septums und beeinflußt dadurch das Einwachsen dieser Fasern entlang der Cornu ammonis Region in den Hippokampus.
Weiterhin wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster von Netrin-1 und DCC im Hippokampus sowie die funktionellen Eigenschaften von Netrin-1 untersucht. Netrin-1 wird bereits zum Zeitpunkt E17 im Neokortex exprimiert, konnte im Hippokampus jedoch erst ab dem postnatalen Entwicklungsstadium P1 detektiert werden. Während im Gyrus dentatus nur ein schwaches und im entorhinalen Kortex kein Signal gefunden werden konnte, wird Netrin-1 stark in der Cornu ammonis Region exprimiert. Der Rezeptor DCC wird dagegen schon früher in der Embryonalentwicklung, ab E15, diffus in der hippokampalen Anlage exprimiert. Ab P1 lassen sich diese Signale im Gyrus dentatus und in den CA1-CA3-Regionen unterscheiden. Von den untersuchten Explantaten der hippokampalen Region zeigte Netrin-1 nur auf die Fasern von Gyrus dentatus und CA3, welche die hippokampale Kommissur bilden, einen attraktiven Wachstumseffekt. Dies bestätigt Befunde aus Netrin-1- und DCC-defizienten Tieren, in denen die hippokampale Kommissur aufgrund des fehlenden axonalen Leitmoleküls bzw. seines Rezeptors nicht ausgebildet wird.

Schlagwörter:
Semaphorin, Netrin, Entwicklung, Kokultur, Hippokampus, axonale Leitmoleküle

Abstract

In this work, the semaphorins Sema3A and Sema3C as well as Netrin-1 and their receptors, the neuropilins and DCC, were investigated regarding their expression and functional properties on outgrowing axons, which are forming the intrinsic and afferent hippocampal projections.
Because of the already well known expression patterns of Sema3A, this work focused on the expression of the receptor of Sema3A, NP-1. From embryonic stage E17 on, NP-1 is expressed in the entorhinal cortex, the subiculum and the hippocampal Anlage. A strong postnatal expression of NP-1 in the CA3-region could be detected, while the expression pattern in the CA1-region, the dentate gyrus and the entorhinal cortex was weaker. Additionally, the expression patterns of Sema3C and NP-2 were investigated in greater detail. At birth (P0), Sema3C was expressed in the dentate gyrus and the cornu ammonis region. The expression of its receptor NP-2 could be detected at the same timepoint P0 in the dentate gyrus and the CA3-region and, less pronounced, in the CA1-region.There could not be detected any expression of Sema3C or NP-2 in the entorhinal cortex. In functional coculture studies between with Sema3A or Sema3C transfected cell clusters and neuronal explants from subregions of the hippocampal formation, these factors were investigated for their influence on axonal outgrowth within a three-dimensional collagen gel matrix. Sema3A has repulsive properties on explants from the dentate gyrus, the CA1- and CA3- regions and the entorhinal cortex. I the resulting model, the interaction between Sema3A and NP-1 influences the ingrowth and/or the termination of entorhinal fibers into the molecular layer of the dentate gyrus by a repulsive barrier formed by Sema3A. The same barrier also acts on mossy fibers to allow them to grow only in direction of the CA3-region. Sema3C has repulsive properties on fibers from the medial septum and shapes the ingrowth of these fibers along the cornu ammonis region into the hippocampus.
Additionally, the expression patterns of Netrin-1 and DCC and their functional properties in the hippocampus were investigated. Netrin-1 is already expressed in the cortex at E17, although the onset of expression in the hippocampus is at P1. In the dentate gyrus, a weak signal could be detected, but no signal was found in the entorhinal cortex. In the cornu ammonis region, however, Netrin-1 showed a strong expression signal. The Netrin-1 receptor DCC could be detected as early as E15 with a diffuse distribution in the hippocampal Anlage. From P1 on, these signals could be distinguished in the dentate gyrus and the CA1-CA3-regions. Netrin-1 showed attractive properties only on fibers from explants of the dentate gyrus and the CA3-region, which form the hippocampal commissure. These results confirm previous findings from Netrin-1 and DCC deficient animals in which the absence of the hippocampal commissure was described.

Keywords:
Semaphorin, Netrin, development, co-culture, hippocampus, axon guidance molecules


Seiten: [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [49] [48] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteExpression und Funktion neuronaler Leitmoleküle im Hippokampus
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung
1.1Die Zielfindung von auswachsenden Neuronen
1.2Leitmoleküle axonalen Wachstums
1.2.1Semaphorine und Neuropiline
1.2.2Netrine und seine Rezeptoren
1.3Die hippokampale Formation der Ratte als Modell
1.3.1Der Gyrus dentatus
1.3.2Cornu ammonis
1.3.3Der entorhinale Kortex
1.4Fragestellung
2 Material und Methoden
2.1In situ Hybridisierungen
2.1.1Gewebepräparation
2.1.2Vorbereitung der Kryostatschnitte für die in situ Hybridisierungen
2.1.3Verwendung von Oligonukleotiden für die radioaktive in-situ-Hybridisierungen:
2.1.4Verwendung von Riboproben
2.2Zell- und Gewebekulturexperimente
2.2.1Präparation von Gewebeexplantaten aus embroynalen Gehirnen:
2.2.2Kokulturexperimente
3 Ergebnisse
3.1Semaphorine
3.1.1Semaphorine und ihre Rezeptoren werden während der Entwicklung in der hippokampalen Formation der Ratte exprimiert
3.1.2Semaphorine und ihre Rezeptoren sind an der Entwicklung der hippokampalen Projektionen der Ratte als neuronale Leitmoleküle beteiligt
3.2Netrin
3.2.1Netrin-1 und sein Rezeptor DCC werden während der Entwicklung der hippokampalen Formation der Ratte exprimiert
3.2.2Netrin-1 und sein Rezeptor DCC sind an der Entwicklung der hippokampalen Projektionen der Ratte als neuronale Leitmoleküle beteiligt
4 Diskussion
4.1Die Semaphorine Sema 3A und 3C besitzen repulsive Eigenschaften auf verschiedene afferente hippokampale Projektionen
4.2Netrin-1 wirkt als attraktiver Faktor für Fasern der hippokampalen Kommissur
4.3Ein komplexes Netzwerk von neuronalen Leitmolekülen ist für die Entwicklung hippokampaler Projektionen verantwortlich
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1 (nächste Seite): Differentielle Auswachsmuster neuronaler Explantate der hippokamplaen Formation in der Kokultur. Semiquantitive Auswertung der differentiellen Auswachsmuster von Explantaten aus dem entorhinalen Kortex, dem Gyrus dentatus, dem Cornu ammonis und dem medialen Septum, die mit Sema3A-, Sema3C- oder Netrin-1 sekretierenden Zellaggregaten oder mit Kontrollzellaggregaten (mock) kokultiviert wurden. Die Zahlen repräsentieren die Anzahl der individuellen Explantate, die das jeweilige Auswachsmuster unter den untersuchten Kulturbedingungen zeigten. Die fett gedruckten Zahlen zeigen das bevorzugte Auswachsmuster unter den jeweiligen Kulturbedingungen an. Die Daten stammen jeweils aus drei voneinander unabhängig durchgeführten Ko-Kulturexperimenten. Das Gebiet, in dem das Auswachsen von Neuriten beobachtet wurde, wurde in eine proximale (dem Zellaggregat zugewandte) und eine distale (dem Zellaggregat abgewandte) Hälfte unterteilt. Radiales Auswachsen bedeutet gleiche Faserdichte in beiden Hälften des Explantates. Repulsion bedeutet eine höhere Faserdichte in der distalen Hälfte des Explantates als in der proximalen Hälfte. Attraktion bedeutet eine höhere Faserdichte in der proximalen Hälfte des Explantates als in der distalen Hälfte. CA1, CA3 Cornu ammonis Regionen, DG Gyrus dentatus, EC entorhinaler Kortex

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Die Semaphorin-Familie neuronaler Leitmoleküle. Die Semaphorine definieren sich über eine 500 Aminosäuren lange homologe Region, die Semaphorindomäne, die in Invertebraten und Vertebraten konserviert ist.
Abb. 2: Modell der Interaktion der sezernierten Klasse 3 Semaphorine mit ihren Rezeptoren, den Neuropilinen.
Abb. 3: Schematische Darstellung der Struktur des neuronalen Leitmoleküles Netrin-1 (A) und seines Rezeptors deleted in colorectal cancer (B; DCC).
Abb. 4: Schematische Darstellung der hippokampalen Formation einer adulten Ratte in einem horizontalen Schnitt durch den temporalen Pol des Hippokampus mit anliegendem entorhinalen Kortex.
Abb. 5: Schematische Darstellung der wichtigsten Projektionen zwischen entorhinalem Kortex und Hippokampus sowie innerhalb des Hippokampus.
Abb. 6 (vorherige Seite): Expression von Neuropilin-1 im entorhinalen Kortex und Hippokampus (A, B Autoradiogramm; E-H gedippte Schnitte), Diagramm der Expression von Sema3A im Hippokampus (C), schematische Darstellung der Anatomie des Tractus perforans und der Moosfaserprojektion (D).
Abb. 7: Expression von Sema3C (A-C) und seinem Rezeptor Neuropilin-2 (D-F) im Rattengehirn während der Entwicklung, durch radioaktive in-situ-Hybridisierung visualisiert.
Abb. 8: Expression von Netrin-1 (A-C) und seinem Rezeptor DCC (D-F) im Rattengehirn während der Entwicklung, durch radioaktive in-situ-Hybridisierung visualisiert.
Abb. 9: Die neuronalen Leitmoleküle Sema3A, Sema3C und Netrin-1 beeinflussen differentiell das Auswachsen von Neuriten aus Hippokampus-Explantaten.
Abb. 10 (vorherige Seite): Die neuronalen Leitmoleküle Sema3A, Sema3C und Netrin-1 beeinflussen differentiell das Auswachsen von Neuriten aus Explantaten des EC und dem medialen Septum.
Abb. 11: Die Entwicklung von Projektionen in der hippokampalen Formation wird durch neuronale Leitmoleküle reguliert.

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