Aus der Klinik für Innere Medizin m. S. Kardiologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Messung von Phospholipase D Metaboliten bei Notfall- und Intensivpatienten mit akutem Koronarsyndrom unter besonderer Berücksichtigung der Therapie mit GPIIb/IIIa-Antagonisten

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Christian Storm
aus Groß Vollstedt

Dekan:
Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. PD Dr. med. M. Möckel
2. Prof. Dr. med. T. Störk
3. PD Dr. G. Hafner

Datum der Promotion:29.10.2004

Abstrakt

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss des GPIIb/IIIa- Antagonisten Tirofiban auf die Vollblut-Konzentration des Phospholipase D Metaboliten Cholin (2- hydroxyethyltrimethylammonium, „whole blood cholin“, WBCHO) bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom untersucht. Die Phospholipase D hat eine Schlüsselfunktion bei der Destabilisierung atherosklerostischer Plaques, Aktivierung von Thrombozyten und Sekretion von Matrixmetalloproteinasen durch Makrophagen. Als Analyseverfahren für Cholin wurde die Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) in Verbindung mit der Massenspektrometrie (MS) eingesetzt. Die Klassifikation der Patienten erfolgte nach den aktuellen Richtlinien der European Society of Cardiology (ESC) und des American College of Cardiology (ACC) für das akute Koronarsyndrom. Aus einem Kollektiv von 342 Patienten wurden 32 Patienten mit akutem Koronarsyndrom in diese Studie aufgenommen, in zwei Gruppen mit jeweils 16 Patienten mittels matched pairs Technik unterteilt und analysiert. Eine Gruppe erhielt zusätzlich zur Standard- Therapie Tirofiban. Es wurden Blutabnahmen bei Aufnahme, nach 3-6 Stunden und nach 12-24 Stunden gewonnen. Hieraus wurden Troponin I und T, Myoglobin, Kreatinkinase Isoenzym MB, sowie Vollblut-Cholin bestimmt. Es gab einen signifikanten Verlauf der WBCHO- Konzentration (p = 0,006) in der mit Tirofiban behandelten Gruppe im Gegensatz zur Gruppe die nur die Standardtherapie erhielt (p = 0,174). Für den Verlauf der Standardmarker (Myoglobin, Kreatinkinase, Troponin I und T), wurde keine signifikante Beeinflussung durch die Therapie mit Tirofiban nachgewiesen. Im Vergleich zu Troponin I und T, Myoglobin und Kreatinkinase hatte WBCHO das zeitlich früheste Maximum. WBCHO könnte als Markersubstanz der Phospholipase D Aktivität zusätzliche Informationen über die Möglichkeit einer Destabilisierung einer atherosklerotischen Plaque bei Patienten mit akutem Koronarsyndrom geben. Dies könnte in Kombination mit anderen Markern eine verbesserte Risikostratifizierung in der Frühphase des akuten Koronarsyndroms ermöglichen. Zusätzlich scheint ein Monitoring der Tirofiban Therapie durch die WBCHO Konzentration möglich zu sein.

Eigene Schlagworte: Akutes Koronarsyndrom, GPIIb/IIIa-Antagonist, Phospholipase D, Cholin, HPLC-MS

Abstract

This research work deals with the measurement of the phospholipase D metabolite choline in patients with acute coronary syndrome (ACS) undergoing GPIIb/IIIa antagonist therapy. The influence of GPIIb/IIIa antagonists on concentration levels of the PLD metabolite 2- hydroxyethyltrimethylammonium in blood (whole blood choline, WBCHO) was studied. The activation of phospholipase D (PLD) has a key function in plaque destabilisation, activation of platelets and secretion of matrixmetalloproteinases by macrophages. For the detection of the PLD metabolite WBCHO high pressure liquid chromatography (HPLC) with a mass spectrometer (MS) was used. The classification of patients was performed according to the current guidelines of the European Society of Cardiology (ESC) and the American College of Cardiology (ACC). 32 patients with ACS out of a 342 patient study were included and analysed by matched pairs technique as two groups with 16 patients. One group was treated with Tirofiban (aggrastrat) in addition to standard therapy. Blood samples were taken at admission, after 3-6 hours and after 12-24 hours and in addition to the troponines, myoglobin and creatinkinase Isoenzyme MB, whole blood choline was analyzed. There was a significant (p = 0,006) decrease of WBCHO level in the group treated with Tirofiban in contrast to the reference group with no significant decrease (p = 0,174). The levels of conventional markers as troponin I and T, CK-MB mass and myoglobin had no significant changes in relationship to the Tirofiban therapy. WBCHO had the earliest maximum in contrast to all other markers. We concluded that WBCHO can be used as an additional early risk marker in ACS. Since GPIIb/IIIa- antagonist- therapy may influence WBCHO level, WBCHO has potential to be used for monitoring of therapy.

Keywords: Acute coronary Syndrome, GPIIb/IIIa-antagonist, phospholipase D, choline, HPLC-MS

Widmung:

Diese Arbeit ist Wiebke Naefe gewidmet

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Das akute Koronarsyndrom
  • 1.2  Diagnostik und Risikostratifizierung des akuten Koronarsyndroms
    • 1.2.1  Notfalldiagnostik und frühe Risikostratifizierung
    • 1.2.2  Weiterführende biochemische Diagnostik
      • 1.2.2.1 Konventionelle Marker
      • 1.2.2.2  Troponin
      • 1.2.2.3 C-reaktives Protein und B-Typ natriuretisches Peptid
      • 1.2.2.4  Andere biochemische Marker
      • 1.2.2.5 Kombination von Marker-Substanzen
  • 1.3 Medikamentöse Therapie des akuten Koronarsyndroms mit GPIIb/IIIa-Antagonisten
  • 1.4 Pathophysiologie der atherosklerotischen Plaques
    • 1.4.1  Stabile Plaque
    • 1.4.2  Instabile Plaque
  • 1.5 Der GPIIb/IIIa-Rezeptor
  • 1.6  Phospholipase D
    • 1.6.1 Phospholipase D Isoformen
    • 1.6.2  Phospholipase D in Makrophagen und Plättchen
  • 1.7 Vollblut-Cholin
    • 1.7.1  Messung der Phospholipase D Aktivität
    • 1.7.2 Prognostische Aussagekraft von Cholin
• 2  Fragestellung
• 3  Methodik
  • 3.1 Studienprotokoll
    • 3.1.1  Studienpopulation
    • 3.1.2  Einschluss der Studienpatienten
    • 3.1.3 Selektion der Gruppen
    • 3.1.4 Probengewinnung
    • 3.1.5  Probenbearbeitung
  • 3.2 Analyse- und Trennverfahren
    • 3.2.1  HPLC
    • 3.2.2  Massenspektrometrie mittels Elektrospray-Ionisation
    • 3.2.3  Messung und Interpretation
  • 3.3  Untersuchte Laborwerte
  • 3.4 Statistische Auswertung
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Charakteristika der Patienten
  • 4.2 Verlauf der Marker-Substanzen
    • 4.2.1  Verlauf der Troponine
    • 4.2.2  Verlauf von Myoglobin
    • 4.2.3  Verlauf der Kreatinkinase
  • 4.3 WBCHO-Verlauf
• 5  Diskussion
  • 5.1 Diskussion der Methode
  • 5.2 Diskussion der Ergebnisse
• 6  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1: Darstellung weitere Marker-Substanzen, welche im Rahmen der Diagnostik des akuten Koronarsyndroms in verschiedenen Untersuchungen evaluiert wurden.
• Tabelle 2: Basis Merkmale der Gruppen: *Median, ** absolute Zahlen;( ) Perzentile (25/75)
• Tabelle 3: Darstellung der Risikofaktoren, Medikation und Therapie innerhalb der beiden Patientengruppen.
• Tabelle 4: Routine Laborparameter, Darstellung des Median und der Perzentilen (25/75). Signifikante Unterschiede werde mit dem p-Wert angegeben, bei nicht signifikanten (n.s.) Differenzen erfolgt keine Angabe des p-Wertes.
• Tabelle 5: Zusammenfassung der Marker.* Zentrallabor, ** Stratus. *** HPLC-MS, M (Median), P25 und P75 (Perzentile), ^a Darstellung der p-Werte der Gruppen 1 und 0 im zeitlichen Verlauf von t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h).

Bilder

• Abbildung 1: Nomenklatur des akuten Koronarsyndroms der ACC/AHA Richtlinie 2002 zum Therapiemanagement von Patienten mit akutem Koronarsyndrom und nicht ST-Hebungs Infarkt übersetzt aus dem Englischen [1]. Das Diagramm verdeutlicht, dass Patienten mit Brustschmerz unterteilt werden müssen, in die Gruppen mit ST-Hebungen und ohne ST-Hebungen. Die meisten Patienten mit ST-Hebung im EKG entwickeln einen Q-Zacken Infarkt und nur ein kleiner Anteil imponiert mit einem nicht-Q-Zacken Infarkt. Patienten, die keine diagnostischen Veränderungen im EKG aufweisen, haben entweder eine instabile Angina Pectoris oder einen Infarkt ohne ST-Hebung im EKG (NSTAMI), wobei die Differenzierung durch den Nachweis oder das Ausbleiben eines Anstiegs kardialer Marker geführt wird.
• Abbildung 2: Darstellung der Strukturformel von Tirofiban
• Abbildung 3: Mechanismen der Signalübertragung bei der Thrombozythenaktivierung.  PLD: Phospholipase D, PLC: Phospholipase C, PIP2: Phosphoinositol-4,5-biphosphonat, IP3: Inositol-1,4,5-triphosphonat, PKC: Proteinkinase C, DAG: Diacylglycerol, PLA2: Phospholipase A2, TXA2: Thromboxan A2, oxLDL: oxidiertes „low densitiy“ Lipoprotein, PA: Phosphatidat, lyso PC: Lysophosphatidylcholin.
• Abbildung 4: Stark vereinfachte schematische Darstellung des Aufbaus der gekoppelten Analyse- und Trennsysteme der HPLC-ESI-MS. Die Probe wird im Autosampler automatisch in den von einer binären Hochdruckpumpe erzeugten HPLC-Fluss injiziert und auf der thermostatisierten LC-Säule getrennt. Danach durchlaufen die Substanzen einen Dioden-Array-Detektor (DAD) und gelangen über das ESI-Interface ionisiert in das Massenspektrometer.
• Abbildung 5: Schematische Darstellung der HPLC-ESI MS. Im Spray-Raum wird das HPLC-Eluat zu einem feinen Aerosol versprüht. Die ionisierten Analyte werden elektrostatisch orthogonal über die Transferkapillare und den Octopol in den Analysatorraum überführt und dort massenselektiv detektiert. [1] Nebulizer-Nadel, [2] Aerosol, orthogonal abgelenkte Ionen, [3] Transferkapillare, [4] Skimmer 1 und 2, [5] Octopol, [6] Quadrupol, [7] Multiplier (nähere Erläuterungen siehe laufenden Text unter 3.2.2).
• Abbildung 6: ESI-positiv Massenspektrum von Cholin (original Abbildung LC/MSD Chemstation). Das Spektrum wird vom positiv geladenen Cholin-Molekül (m/z 104) dominiert. Das Fragment mit m/z 60 entspricht dem protonierten Trimethylammoniumion.
• Abbildung 7: Reportausdruck LC/MSD Chemstation. Dargestellt sind ein massenselektives Chromatogramm (1), sowie der Cholingehalt der Probe (2) und die Kalibrationskurve (3).
• Abbildung 8: Verlauf TnI innerhalb der Gruppen (1= ■ (Gruppe mit zusätzlicher GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie); 0= □ (Gruppe ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie)). Die Blutabnahme Zeitpunkte sind durch t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h) angegeben. Dargestellt sind Median mit Perzentilen (25;75), Ausreißer-Werte sind nicht dargestellt;* Verlauf über die Zeit innerhalb Gruppe 0 (p=0,002) und Gruppe 1 (p<0,01).
• Abbildung 9: Verlauf Myoglobin innerhalb der Gruppen (1= ■ (Gruppe mit zusätzlicher GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie); 0= □ (Gruppe ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie)). Die Blutabnahme Zeitpunkte sind durch t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h) angegeben. Dargestellt sind Median mit Perzentilen (25;75), Ausreißer-Werte sind nicht dargestellt;* Verlauf über die Zeit in Gruppe 0 (p=0,016) und Gruppe 1 (p nicht signifikant).
• Abbildung 10: Verlauf CK-MB Masse innerhalb der Gruppen (1= ■ (Gruppe mit zusätzlicher GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie); 0= □ (Gruppe ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie)). Die Blutabnahme Zeitpunkte sind durch t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h) angegeben. Dargestellt sind Median mit Perzentilen (25;75), Ausreißer-Werte sind nicht dargestellt; * Verlauf über die Zeit in Gruppe 0 (p=0,047) und Gruppe 1 (p=0,002).
• Abbildung 11: Verlauf WBCHO innerhalb der Gruppen (1= ■ (Gruppe mit zusätzlicher GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie); 0= □ (Gruppe ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie)). Die Blutabnahme Zeitpunkte sind durch t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h) angegeben. Dargestellt sind Median mit Perzentilen (25;75), Ausreißer-Werte sind nicht dargestellt; * Verlauf über die Zeit in Gruppe 0 (p=0,174) und Gruppe 1 (p=0,006).
• Abbildung 12: Verlauf WBCHO innerhalb der Gruppen (1= ■ (Gruppe mit zusätzlicher GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie); 0= □ (Gruppe ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Therapie)). Die Blutabnahme Zeitpunkte sind durch t1 (Aufnahme), t2 (4-6h) und t3 (12-24h) angegeben. Dargestellt sind Mittelwerte.