Studienprotokoll

Das Studienprotokoll beinhaltet die Festlegung der möglichen Patientenpopulation, Ein- und Ausschluss-Kriterien sowie Vorstellung der Studie bei der Ethik Kommission. Zusätzlich wurde im Protokoll die Therapie und Gruppenauswahl der Studienpatienten, sowie die Probengewinnung und Probenvorbereitung festgelegt.

Studienpopulation

In der Rettungsstelle und der Intensivstation der Charité, Campus Virchow Klinikum, wurden 342 Patienten im Zeitraum von August 1999 bis Oktober 2000 in die Studie eingeschlossen. In der Anamnese wurden besonders die aktuellen Beschwerden, Vorerkrankungen einschließlich Familienanamnese, die kardialen Risikofaktoren und die aktuelle Medikation erfragt. Im Anschluss erfolgte die klinische Untersuchung der Patienten. Als letztes wurde die Blutabnahme durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vor der Studie durch die Ethik Kommission der Charité genehmigt. Das Einschlusskriterium für alle Patienten war das Symptom Brustschmerz. Als Ausschlusskriterium wurde ein Hb < 7 g/dL, aktive Blutung, Symptome nicht kardialen Ursprungs und stabile Angina ohne aktuelle Symptome definiert. Die Aufnahme in die Studiengruppe erfolgte dann nach Aufklärung und Einwilligung des Patienten. Um einen möglichst reibungslosen Einschluss der Patienten in die Studie zu gewährleisten, war es erforderlich, eine 24-Stunden-Rufbereitschaft einzurichten. Es wurde jeweils nach 30 Tagen und 12 Monaten ein Follow-up in der Studiengruppe durchgeführt.

Einschluss der Studienpatienten

Bei den Patienten wurde entsprechend des Studienprotokolls eine Anamnese und klinische Untersuchung durchgeführt. Zusätzlich zur Blutentnahme für die Routineparameter wurde eine Vollblutprobe für die WBCHO-Bestimmung abgenommen. Die Therapie erfolgte dann durch den Aufnahmearzt nach denen im Jahr 1999/2000 aktuellen Guidelines, insbesondere auch der Einsatz eines GPIIb/IIIa-Antagonisten. Die Therapie Entscheidungen wurden ohne Kenntnis der WBCHO Konzentration getroffen.

Selektion der Gruppen

Die Patienten wurden retrospektiv in zwei Gruppen unterteilt. Eine Gruppe erhielt wie unter 3.1.2 beschrieben das Medikament Aggrastat® (GPIIb/IIIa-Antagonist) zusätzlich zur Standardtherapie (im Folgenden Gruppe 1). Die andere Gruppe wurde ohne zusätzliche GPIIb/IIIa-Antagonisten Medikation therapiert (Gruppe 0). Alle Patienten waren nach der ACC/AHA Definition ACS Patienten. Weiterhin sollte die WBCHO-Konzentration bei Aufnahme > 20 μmol/L sein, da speziell der Effekt der Therapie auf Patienten mit aktivierter Phospholipase D untersucht werden sollte. Zur Paar-Bildung wurden Patienten aus Gruppe 1 entsprechenden Patienten aus Gruppe 0 zugeordnet. Hierbei wurden Diagnose, Geschlecht, Alter und Anzahl der Risikofaktoren berücksichtigt (Tabelle 2). Nach diesem Auswahlverfahren lagen 16 Paare zur Analyse vor. Die Analyse entspricht einer retrospektiven „Matched Pairs“ Analyse.

Probengewinnung

Die Bestimmung des WBCHO im zeitlichen Verlauf machte eine zusätzliche Blutabnahme zu der jeweiligen Routineabnahme an drei verschiedenen Zeitpunkten erforderlich. Die erste Probe wurde bei Aufnahme des Patienten, die zweite nach 4-6 Stunden und die dritte nach 12-24 Stunden abgenommen. Zur Blutentnahme wurden Lithium-Heparin/ Kalium-Fluorid Monovetten der Fa. Sarstedt (Deutschland, 9ml Volumen) verwendet. Die Vollblutproben wurden bei -80°C eingefroren und gelagert. Der Transport der Proben bis zum Einfrieren erfolgte auf Eis mit einer maximalen Dauer von 30 Minuten.

Probenbearbeitung

Um die Blutproben für eine weiterführende Cholin-Analytik zugänglich zu machen, wurden alle Bestandteile mit einem Gewicht größer 10000 Dalton mit Ultrafiltern abgetrennt.

Dazu wurden Ultrafilter (Fa. Millipore, UFV4BGC00, Cut-off 10 kD) durch Zentrifugation (3 min bei 3645 x g) mit 2 mL Wasser (Aqua Braun) gewaschen; das Auffanggefäß mit filtriertem Wasser wurde verworfen. Die Filter wurden in ein neues Auffanggefäß (14 mL Falkon Tube) gesteckt. Filter und Falcon Tubes wurden mit der entsprechenden Probennummer beschriftet. Die bei –80°C gelagerten Proben wurden im Wasserbad bei 37°C für 20 min unter Rütteln (60 u/min) kontrolliert aufgetaut. Hiernach wurden die Proben bis zur endgültigen Abfüllung zur Vermeidung ungewollter Enzymreaktionen auf Eis gelagert. Jede Probe von ca. 6-8 mL Vollblut wurde durch Schütteln homogenisiert und aufgeteilt. 2 mL Vollblut wurden als Rückstellprobe bei –80°C wieder eingefroren. Das restliche Vollblut wurde auf 2 Ultrafilter aufgeteilt.

Es erfolgte nun die Zentrifugation in einer Kühlzentrifuge bei 15°C und 3645 x g für 120 min zur Abtrennung der Ultrafiltrate. Diese wurden anschließend homogenisiert und 300µl zur Analyse in ein Glas-Vial (Supelco, Nr. 27087, 1 ml; mit PTFE-Silikon Septum) abgefüllt. Bis zur Analyse wurde das Vial bei –20°C eingefroren. Das verbleibende Ultrafiltrat wurde als Rückstellprobe bei -80°C eingefroren. Der Prozess der Ultrafiltration wurde validiert. Die Wiederfindungsrate von Cholin nach der Ultrafiltration beträgt 100% (siehe Kapitel 3.2.2).

Analyse- und Trennverfahren

Die Messung von Cholin in der komplexen Matrix Blut stellt besondere Anforderungen an moderne Detektions- und Trennverfahren. In dieser Arbeit wurde die analytische Hochleistungskopplungstechnik HPLC-MS (High Performance Liquid Chromatographie- Massenspektrometrie) eingesetzt.

Mit diesem Verfahren werden komplexe Substanzgemische mittels HPLC analytisch getrennt und online selektiv und spezifisch mit einem Massenspektrometer analaysiert. Die Kopplung der beiden Methoden erfolgte mit einem Electrospray Ionization (ESI-) - Interface (HPLC-ESI-MS).

Für die maßgebliche Weiterentwicklung der ESI als Bindeglied zwischen Trenn- und Detektionstechniken wurde 2002 der Chemie-Nobelpreis an Professor John B. Fenn der Universität Yale verliehen.

HPLC

Als mögliches Trennverfahren zur Untersuchung polarer Substanzen, wie z.B. Cholin in Biomatrices, wird die Chromatographie, insbesondere die Ionentauscher- und die Umkehrphasen- („Reversed Phase“, RP) Chromatographie, in Verbindung mit geeigneten Detektionssystemen eingesetzt. Die Trennung erfolgt durch unterschiedliche Wechselwirkungen der einzelnen Bestandteile des Stoffgemisches mit einer flüssigen mobilen und einer festen stationären Phase. Die Wechselwirkungen sind im Wesentlichen abhängig vom Verteilungskoeffizienten der einzelnen Komponenten des Gemisches. Die stationäre Phase befindet sich bei der HPLC in dicht gepackten, hochdruckstabilen Säulen.

Bei der HPLC bestimmt die Partikelgröße der stationären Phase den Strömungswiderstand. Abhängig davon ist auch der benötigte Druck um die mobile Phase durch die Säule zu pumpen. Die Selektivität der Trennung mittels HPLC erfolgt unter Anderem in Abhängigkeit von Polarität und Partikelgröße der stationären Phase, sowie den pH-Werten von Analyt und mobiler Phase.

Bei der Flüssigkeitschromatographie wird grundsätzlich je nach Eigenschaft der stationären Phase zwischen Normalphasen (NP)- und Umkehrphasen (RP)- Chromatographie unterschieden. Als stationäre Phase der NP-Chromatographie wird überwiegend Kieselgel oder Aluminiumoxid verwendet. Bei der RP-Chromatographie wird die Polarität der stationären Phase durch chemische Anbindung einer hydrophoben Verbindung (meist eine apolare Alkylgruppe unterschiedlicher Länge) an die Trägersubstanz umgekehrt. So erfolgt eine Modifizierung der Trenneigenschaften durch Einbringen funktioneller Gruppen in die stationäre Phase.

Die Trennung der Analyte erfolgt dann aufgrund unterschiedlich starker Wechselwirkungen zu den Alkylgruppen der stationären Phase. In der RP-Chromatographie wird besonders häufig mit Octadecylsilylresten modifiziertes Kieselgel als stationäre Phase eingesetzt (ODS-Säulen, RP-C-18 Material). Die für die Cholin-Trennung eingesetzten ODS-Säulen werden zur Verbesserung der Trenneigenschaften mit EDTA behandelt, um Reste an Schwermetallionen zu entfernen, die besonders bei Substanzen wie Cholin zu Peakverbreiterungen durch Tailing (Interaktion der Analysesubstanz mit Schwermetallionen der Säule führt häufig zu Peakverbreiterung und erschwert somit die Analyse der einzelnen Peaks) führen. In dieser Arbeit wurde als analytische Säule eine vorbehandelte Inertsil ODS-3 Säule (250x 3.0 mm, Teilchengröße 5 μm; VDS Optilab, Deutschland) verwendet. Die Flussrate betrug 650 μL/min, die analytische Säule wurde im Säulenofen auf 45°C temperiert. Der Druck über der Säule betrug zwischen 105 und 120 bar. Es wurden 5 μL Probenvolumen injiziert.

Bei der RP-Chromatographie besteht die mobile Phase meist aus polaren Lösungsmitteln wie Methanol, Wasser, aquatischen Pufferlösungen oder Acetonitril. Die Wechselwirkungen der Analyte zwischen mobiler und stationärer Phase - bedingt durch unterschiedliche pH-Werte, Polaritäten, Verteilungsgleichgewichte und Hydrophobizitäten - führt zu unterschiedlichen Retentionszeiten der Substanzen und somit zur Trennung.

Wegen der Polarität des Analyt-Ions (Cholin) wird ein spezielles Puffergemisch als mobile Phase eingesetzt. Dieses Puffergemisch wurde speziell für die WBCHO-Analytik entwickelt und setzt sich aus einer wässrigen Lösung von 10 mmol/L monobasischem Natriumphosphat (NaH₂HPO₄), 10 mmol/L dibasischem Natriumphosphat (Na₂HPO₄), 5% (v/v) Acetonitril und 50 mg/L N-Octylsulfat zusammen. Da Vollblut-Proben ohne Probenvorbereitung das Injektionssystem und die Trennsäule schädigen und verstopfen würden, werden Vollblut-Ultrafiltrate analysiert (3.1.5). Sämtliche LC-Parameter wurden für die WBCHO-Analytik hinsichtlich eines hohen Probendurchsatzes und hoher Stabilität optimiert. Die Optimierung erfolgte anhand der Phosphatzusammensetzung (Na₂HPO₄, NaH₂PO₄) und Additivkonzentrationen wie Acetonitril sowie Zusatz verschiedener Modifier (N-Octylsulfat, Natriumdodecylsulfat und Natrium-Pentasulfat). Weiterhin wurden verschiedene analytische Chromatographie Säulen (C-18 polymer Säulen, Spheisorb ODS-2 und Inertsil ODS-3) zur WBCHO-Analytik evaluiert. Ergebnis der Optimierung ist die oben angegebene Eluent-Zusammensetzung, welche die besten Trenneigenschaften in Verbindung mit der ODS-3-Säule für Cholin aufweist.

Massenspektrometrie mittels Elektrospray-Ionisation

Nach Trennung des Stoffgemisches mittels HPLC erfolgt die Detektion der Substanzen. Zur Detektion wird in der Cholin-Analytik wegen seiner Selektivität häufig ein Enzymreaktor eingesetzt, der unter Ausnutzung der Cholinoxidase- Reaktion arbeitet. Da Enzymsysteme bei der Analyse komplexer Matrices anfällig für Kreuzreaktionen sind, ist diese Technik jedoch oft problematisch. Da Cholin kein Absorptions-Spektrum im UV-visuellen Bereich hat, kann auch nicht der in der Chromatographie weit verbreitete Dioden-Array-Detector (DAD) verwendet werden (Messung der Absorptionsspektren von UV-Licht mittels Diodenfeld).

In den letzten Jahren hat sich mit der fortschreitenden Entwicklung von Atmosphärendruck Ionisationstechniken (z.B. Electrospray Ionization, ESI) die Massenspektrometrie (MS) als leistungsfähiges Detektionssystem für die Flüssigchromatographie etabliert. Für viele analytische Fragestellungen ist die Selektivität und Spezifität eines Massenspektrometers sogar so hoch, dass auf eine chromatographische Trennung komplett verzichtet werden kann und so Probleme einer HPLC-MS-Kopplung vermieden werden können. Bei der Analytik komplexer Matrices ist eine chromatographische Vortrennung des Analysats jedoch meistens erforderlich, da es zu Querstörungen mit anderen Matrixbestandteilen kommen kann. Die Kopplung zwischen HPLC und MS ist in diesen Fällen unverzichtbar.

Die ESI-Kopplungstechnik ermöglicht es, die hohe Trennleistung der Chromatographie mit den selektiven und spezifischen Eigenschaften der Massenspektrometrie zu kombinieren und dabei die Probleme dieser Kopplungstechnik (z.B. die Überführung und Ionisierung einer im HPLC-Eluat gelösten Substanz ins Hochvakuum des Massenspektrometers unter Abtrennung der Lösungsmittelmatrix) zu minimieren. Diese Technik wurde daher auch in dieser Arbeit für die Cholin-Analytik eingesetzt.

Die Ionisierungstechnik der ESI ist vergleichsweise schonend, so dass die Analyte vorwiegend als geladene Molekül-Ionen neben wenigen Fragment-Ionen detektiert werden können. Wegen ihrer schonenden Ionisierungseigenschaften ist die ESI auch gut für die Analytik thermolabiler Substanzen geeignet, die sonst schwer zerstörungsfrei ionisiert und in die Gasphase überführt werden können. Die bei herkömmlichen Massenspektren üblichen komplexen Fragmentierungsmuster (bekannt vor allem aus der Elektronenstoß-Ionisation) treten unter Normalbedingungen der ESI nicht auf. Daher können Fragmentierungsmuster auch nicht zur Identifikation unbekannter Analyte herangezogen werden. Die Identifikation erfolgt meist mit Hilfe von Standards über das Molekül-Ion und die Retentionszeit einer definierten Chromatographie.

Bei der Kopplung eines Massenspektrometers an die HPLC werden die Analyte aus der flüssigen, mobilen Phase abgetrennt und in die Gasphase überführt. Anschließend gelangen die ionisierten Substanzen zur Detektion in den Vakuumbereich des Massenspektrometers. Dieser Prozess wird bei dem in dieser Arbeit eingesetzten Gerät durch eine Orthogonalspray Ionenquelle erreicht, welche besonders robust und stabil bei der Kopplung der HPLC an Massenspektrometer arbeitet. Durch die Robustheit der Orthogonalspray Ionenquelle können sogar massenspektrometrische Analysen mit hochkonzentrierten salzhaltigen Puffersystemen durchgeführt werden. Diese sind mit herkömmlichen linearen Spraysystemen nahezu unmöglich, da das Massenspektrometer durch Bildung von Salzkristallen aus der mobilen Phase verklebt und unbrauchbar wird. Diese Eigenschaft ist besonders bei der Chromatographie polarer und geladener Teilchen wie Cholin wichtig, da diese Substanzen meist nur mit komplexen Puffersystemen getrennt werden können. In Abbildung 4 ist der Aufbau der HPLC-ESI-MS schematisch dargestellt. Es wird die Kopplung der HPLC mit der MS mittels ESI gezeigt, sowie die parallele Detektion mittels DAD zur Kontrolle der Messungen (Qualitätskontrolle der Analyse).

Die mobile Phase der HPLC wird im Sprayraum des ESI-Interface durch die Nebulizer Nadel mit Stickstoff-Gas zu einem Aerosol versprüht, das durch Anlegen einer Hochspannung zwischen Nadel und Transferkapillare ionisiert wird. Durch die Verdampfung des Trennpuffers im Gegenstrom mit Trockengas (ebenfalls Stickstoff) wird die Tröpfchengröße immer weiter reduziert und dabei die Ladungsdichte auf dem Tropfen gleichzeitig erhöht. Der Analyt geht nach vollständiger Verdampfung des Lösungsmittels ionisiert in die Gasphase über.

Abbildung 4: Stark vereinfachte schematische Darstellung des Aufbaus der gekoppelten Analyse- und Trennsysteme der HPLC-ESI-MS. Die Probe wird im Autosampler automatisch in den von einer binären Hochdruckpumpe erzeugten HPLC-Fluss injiziert und auf der thermostatisierten LC-Säule getrennt. Danach durchlaufen die Substanzen einen Dioden-Array-Detektor (DAD) und gelangen über das ESI-Interface ionisiert in das Massenspektrometer.

In Abbildung 5 ist das Prinzip der Elektrospray Ionisation dargestellt.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der HPLC-ESI MS. Im Spray-Raum wird das HPLC-Eluat zu einem feinen Aerosol versprüht. Die ionisierten Analyte werden elektrostatisch orthogonal über die Transferkapillare und den Octopol in den Analysatorraum überführt und dort massenselektiv detektiert. [1] Nebulizer-Nadel, [2] Aerosol, orthogonal abgelenkte Ionen, [3] Transferkapillare, [4] Skimmer 1 und 2, [5] Octopol, [6] Quadrupol, [7] Multiplier (nähere Erläuterungen siehe laufenden Text unter 3.2.2).

Es wird der Ionenfluss nach Ionisation in den Analysatorraum verdeutlicht. Die geladenen Analyte werden nun durch elektrostatische Anziehung orthogonal aus der Flussrichtung heraus abgelenkt und in die Transferkapillare überführt, durch welche sie in den Vorvakuumsbereich des Massenspektrometers gelangen. Die Lösungsmittelfracht und sich bildende Salzkristalle fließen in HPLC-Sprayrichtung ab, ohne den weiteren Weg der geladenen Analyte ins Massenspektrometer zu beeinträchtigen (Abbildung 5). An den Skimmerblenden werden letzte Flüssigkeits- und Salzrückstände abgeschieden (Die Skimmer sind Blenden, welche den Ionenstrom der schweren Moleküle durch elektromagnetische Fokussierung optimieren und die leichteren Partikel, wie Helium und Lösungsmittelreste abscheiden). Die Analyte gelangen darauf durch den Qctopol (stabförmige Metallelektrode zur weiteren Flussoptimierung) in den unter Hochvakuum stehenden Analysatorraum. Das im Analysatorraum anliegende Vakuum muss besonders hoch sein, um das Grundrauschen des Gerätes zu minimieren und Entladungen der Analyte durch Kollisionen mit Restluftmolekülen zu verhindern. Die ionisierten Moleküle werden im Quadrupol (vier parallele, stabförmige Metallelektroden, die durch ein Wechsel- und Gleichspannungsfeld beeinflusst werden) des Massenspektrometers entsprechend ihres Masse/ Ladung (m/z) Verhältnisses selektiv getrennt und abschließend mit einem Multiplier (Verstärker, der Ionenkontakt in ein elektronisches Signal umsetzt) detektiert.

Die massenspektrometrische Detektion kann im Full-Scan-Modus und im SIM („Single-Ion-Monitoring“)-Modus erfolgen. Im Full-Scan-Modus wird für jeden Datenpunkt des Chromatogramms ein komplettes Spektrum eines definierten Massenbereiches aufgenommen (z.B. 50 bis 1000 Dalton). Diese Technik ist sinnvoll, wenn man eine Übersicht über ein unbekanntes Substanzgemisch benötigt, um dann die Unbekannten an Hand der Spektreninformationen zu identifizieren. Die Aufnahme eines Full-Scan Spektrums benötigt jedoch vergleichsweise viel Zeit, so dass in einem definierten Abschnitt eines Chromatogramms nur wenige Datenpunkte sind, wodurch die Nachweisempfindlichkeit beeinträchtigt wird. Durch „Single Ion Monitoring“ kann die Nachweisempfindlichkeit ca. um Faktor 10 verbessert werden. Sind die zu analysierenden Ionen bekannt, kann der Scan auf nur wenige, oder gar eine Einzelmassen beschränkt werden. Dadurch lassen sich in der gleichen Zeiteinheit eines Full-Scans ein Vielfaches an Datenpunkten gewinnen, was in der Summe zur wesentlich verbesserten Empfindlichkeit führt. Für die Cholin-Analytik wird daher der selektive SIM-Modus eingesetzt (siehe Kapitel 3.2.3).

Die Massenspektrometrie (MS) mittels Elektrospray Ionisation (ESI) wurde in dieser Arbeit im positiv Modus (Parameter: Fragmentorspannung 100 Volt, Trockengas-Temperatur 350 °C, Nebulizer Gasdruck 20 psi, Vcap 3000 Volt) mit selektivem Ionen Monitoring von positiv geladenen Cholin-Ionen (m/z = 104, Retentionszeit 4,96 min) eingesetzt. Die MS-Parameter wurden für die Cholin-Analytik optimiert. Als Trocken-und Nebulizer Gas wurde 99%-iger, über einen Filter gereinigter, Stickstoff_{verwendet_.Das HPLC-MS Verfahren wurde für einen Konzentrationsbereich des WBCHO von 0,5-1000 μmol/L gemäß laborinterner Standardarbeitsanweisung (StAA Nr.2, 1999 1. Fassung, „Bestimmung von Cholin in Blutproben mit HPLC/MS“, Abteilung für Innere Medizin mit Schwerpunkt Nephrologie und Intensivmedizin, MS-Labor, CVK, Charite Berlin) und Validierungsprotokoll optimiert.}

Zur Kontrolle des Detektionsvorgangs wurde online ein Dioden-Array-Detektor (DAD, Wellenlängen: 200 und 360 nm) eingesetzt. Die genaue technische Herstellerbezeichnung der in dieser Arbeit verwendeten Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Apparatur lautet: Agilent Technologies HPLC 1100 Series/ Hewlett Packard, bestehend aus einem G1322A Degasser, einer G1322A binären Pumpe, einem G1313A Autosampler, einem G1316A Säulenthermostat und einem G1315A Dioden-Array-Detektor. Das System ist über ein Electrospray-Interface an ein G1946B Massenspektrometer gekoppelt.
Messung und Interpretation
Für die WBCHO-Analyse wurden in verschiedenen Konzentrationen (5, 50, 500 μmol/L) Kalibrierlösungen hergestellt. Die Kalibrationsstandards wurden zur Quantifizierung der Ergebnisse verwendet. Als Lösungsmittel für die Verdünnungsreihe wurde Kochsalzlösung (0,9 %ige NaCl-Lösung) zur Matrix-Nachstellung der Ultrafiltrate verwendet. Eine weitere Absicherung und Kontrolle der Ergebnisse erfolgte durch unabhängig hergestellte Proben zur Qualitätskontrolle (QC) in verschiedenen Verdünnungen (12,5, 125, 200 μmol/L). Nach vier Realproben wurde eine QC-Messung zur Kontrolle durchgeführt und eine neue Kalibrierkurve erstellt. Ein HP Kajak XA PC mit der LC/MSD ChemStation Software (Version 8.03) wurde zur Geräte-Steuerung und Auswertung eingesetzt. Die computer-gestützte Auswertung der Ergebnisse umfasste Peakerkennung, Integration, Kalibrierung und Quantifizierung. Der Reportausdruck liefert neben dem Cholingehalt der Analyseprobe auch die aktuelle Kalibration.

In Abbildung 6 ist das Massenspektrum von Cholin dargestellt. Das ESI-positiv Fullscan Massenspektrum wird durch das positiv geladene Cholin-Molekül-Ion (m/z 104) dominiert. Das Fragment mit m/z 60 entspricht dem protonierten Trimethylammoniumion. In einer WBCHO-Analyse wird selektiv das Molekül-Ion im SIM-Modus (Single-Ion-Monitoring) vermessen.

Abbildung 6: ESI-positiv Massenspektrum von Cholin (original Abbildung LC/MSD Chemstation). Das Spektrum wird vom positiv geladenen Cholin-Molekül (m/z 104) dominiert. Das Fragment mit m/z 60 entspricht dem protonierten Trimethylammoniumion.

In Abbildung 7 ist ein Reportausdruck der LC/MSD Chemstation dargestellt. Der Reportausdruck liefert ein massenselektives Chromatogramm der „Selective Ion Monitoring“-Analyse (m/z = 104, ESI positiv, SIM-Modus) (1), den Cholingehalt der Probe (2) in μmol/L und die Kalibrationskurve (3), aus der der Cholingehalt berechnet wird.

Abbildung 7: Reportausdruck LC/MSD Chemstation. Dargestellt sind ein massenselektives Chromatogramm (1), sowie der Cholingehalt der Probe (2) und die Kalibrationskurve (3).