3  Material und Methoden

Alle benötigten Standardchemikalien wurden in analytischer Reinheit von den Firmen Merck, Sigma und Biochrom KG bezogen. Besondere Chemikalien werden in Tabelle 2 gesondert aufgelistet.

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Tabelle 2 : Reagenzien

Für die Isolierung der Mastzellen wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Enzyme eingesetzt.

Tabelle 3 : Enzyme

Die in Tabelle 4 dargestellten Enzyme wurden für die Aufreinigung und Stimulierung der Mastzellen sowie für die Durchflusszytometrie benötigt.

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Tabelle 4 : Antikörper

Verbrauchsmaterialien wie Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, Handschuhe und ähnliches wurden von den Firmen Eppendorf, Falcon, Greiner und Sarstedt bezogen. Im Rahmen der Doktorarbeit eingesetzte Laborgeräte sind in Tabelle 5 aufgelistet.

Tabelle 5 : Laborgeräte

Die Tabelle 6 dient zur näheren Information über die UVB- (UV 800, Waldmann) und die UVA- 1- Lichtquelle.

Tabelle 6 : Leistungsspektrum der UVB- und der UVA- 1- Lichtquelle

Bei dieser Tabelle fällt die recht hohe UVA und UVA- 1 Strahlenabsonderung der UVB Lichtquelle auf. Auswirkungen auf die Versuche hat diese Eigenschaft der UVB- Lampe jedoch nicht, da meßbare Effekte bei UVA- Bestrahlung erst im Joule Bereich auftreten, und die UVB- Bestrahlung im Millijoule Bereich stattfindet.

Für die höchste UVB Bestrahlungsdosis von 100mJ wurden die Zellen für 132 s bestrahlt (0,758 mJ/cm² s x 132 s = 100,01 mJ/cm²). Hierbei ergibt sich eine UVA und UVA-1 Strahlendosis von 91,32 mJ/cm² (0,6918 mJ/cm² s x 132 s) beziehungsweise von 22,89 mJ/cm² (0,1734 mJ/cm² s x 132 s).

Pipes- Stock- Puffer (10x)

• Piperazine- N, N‘- bis (2- ethanesulfonic acid)
• 69,3g NaCl (1,19M), 76g Pipes_(Na-Salz)(250 mM) und 3,85g KCl (49,98 mM) mit Aqua dest. ad 1000ml
• pH- Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen

Pipes- Albumin- Glucose + Calcium + Magnesium (PAG- CM)

• Pipes- Stock- Puffer (10x) mit Aqua dest. 1:10 verdünnt
• 0,003 % Humanes Serum Albumin
• 0,1 % Glukose
• 3mM CaCl₂
• 3mM MgCl₂

MACS- Puffer

• PBS w/o Ca²⁺/Mg²⁺
• 0,5 % Bovine Serum Albumine
• 2mM EDTA

FACS- Puffer

• 0,05 % Na- Azid
• 2 % Fetal Calf Serum (FCS)

Tryptase- Meßpuffer

• 20 ml Trispuffer (0,15M Trsi, 0,3 M KCl = pH 7,6)
• 2,3 mg Heparin
• 4 mg α-1-Antitrypsin

Mastzellmedium

• Basal- Iscove- Medium
• 10 % Fetal Calf Serum,
• 2 % L- Glutamin
• 1 % Penicillin/Streptomycin,
• 0,05 % Amphotericin B
• α -Monothioglycerol
• 3 mM Ca²⁺ und 3 mM Mg²⁺

Stimulationsmedium

• Basal- Iscove- Medium
• 2 % L-Glutamin
• 0,1% BSA
• 1 % Penicillin/Streptomycin
• 0,05 % Amphotericin B
• α -Monothioglycerol
• 2,8 mM Ca²⁺ und 1,3 mM Mg²⁺

Dispergiermedium

• PBS w/o
• 10 % Fetal Calf Serum
• 2 % L-Glutamin
• 1 % Penicillin/Streptomycin
• 0,05 % Amphotericin B
• Dnase 1 (10 µg/ml)
• 5mM MgSO4

	Abb. 2 : Zusammenfassung der verwendeten Methoden

Für die Versuche wurden ausschließlich dermale Mastzellen verwendet, die aus Mammareduktionsplastiken gesunder Patientinnen stammen. Ein großer Vorteil gegenüber Mastzelllinien oder peritonealen Rattenmastzellen ist die hierbei wesentlich höhere Aussagekraft in Bezug auf Auswirkungen von UV Bestrahlung auf menschliche Mastzellen.

Für einen Teil der Versuche wurden aufgereinigte MC benötigt. Bei diesem Prozess spielt der monoklonale Maus- Antikörper YB5.B8 eine wichtige Rolle, weil er spezifisch an das Oberflächenmolekül CD117 bindet. Dieser Rezeptor befindet sich nicht nur auf den Mastzellen, sondern auch auf den epidermlen Melanozyten, so dass zu Beginn der Hautbearbeitung die Epidermis von der Dermis getrennt werden muss.

Die Trennung von Epidermis und Dermis

Die Hautpräparate wurden in wenige Millimeter breite Streifen geschnitten, dann in Dispase Typ I (0,5mg/ml) eingelegt und für 24 Stunden bei 4°C verwahrt. Während dieser Zeit kann das Enzym die Bindung zwischen Epidermis und Dermis spalten, so dass die beiden Hautschichten mechanisch voneinander getrennt werden konnten.

Dispergierung der Dermis

Mit einer Schere wurde die Dermis zerkleinert, um sie dann in Dispergiermedium eingelegt, in ein Schüttelwasserbad zu geben. Hier verweilte sie für ungefähr eine Stunde bei 37°C und 200 Schütteleinheiten pro Minute und es folgte eine Filtration der dispergierten Dermis (Porengröße: 300µm, 70 µm und 40µm). Anschließend wurde das [Seite 23↓]Filtrat bei 4°C und 250g für 10 Minuten zentrifugiert, um dann den Überstand ein wiederholtes Mal, zusammen mit der restlichen Dermis, in das Schüttelwasserbad zu geben. Die durch das Zentrifugieren gewonnenen Zellen wurden mit PBS w/o Ca²⁺/Mg²⁺ gewaschen und dann einer Erythrozytenlyse mittels 0,2%iger NaCl-Lösung unterzogen. Zum Wiedererlangen der Isotonie wurde unmittelbar danach 1,6%ige NaCl-Lösung hinzupipettiert. Nach erneutem Zentrifugieren wurden die Mastzellen mit saurem Toluidinblau und Trypanblau gefärbt, um Auskunft über die Zellzahl beziehungsweise über die Vialibilität zu erlangen. Schließlich wurden die Zellen in Mastzellmedium bei 37°C und 5%iger CO₂-Atmosphäre für zwölf Stunden im Brutschrank inkubiert.

Mit der für eine weiteren Stunde dispergierten Dermis wurde auf gleiche Art und Weise verfahren.

Für einige Versuche war eine besonders hohe Konzentration an Mastzellen erforderlich, um eventuelle Störfaktoren, bzw. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften auszusortieren. Zu Beginn der Mastzellaufreinigung erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang mit 4°C kaltem und entgasten MACS- Puffer. Eine zehnminütige Inkubation der Zellen mit AB- Serum (Verdünnung 1 : 5 ) und Sandoglobin (25µl für 1 10⁸ Zellen) schloss sich an, um unspezifische Bindungen, wie zum Beispiel Protein-Protein-Wechselwirkungen, zu minimieren. Monoklonalen Maus- Anti- Human CD117- Antikörper (YB5.B8, Endkonzentration 0,1µg/ml) wurden hinzugegeben, um die an der Mastzelloberfläche befindlichen Rezeptoren CD117 zu binden. Es folgten zwei weitere Waschvorgänge mit MACS- Puffer, bevor die paramagnetischen Sekundärantikörper (Ziege- Anti- Maus- IgG, Micro- Beads in einer 1 : 5 Verdünnung der gebrauchsfertigen Lösung) an die Primärantikörper binden konnten. Um diese spezifische Kopplung zu ermöglichen, wurden die Mastzellen für zwanzig Minuten bei 4°C mit dem Antikörper inkubiert. Die Zellsuspension wurde abschließend auf eine MACS- Trennsäule gegeben, in der die Mastzellen mit ihrem Antikörperkomplex magnetisch binden konnten. Aufschluss über die Reinheit, die im Mittel bei 90% lag, gab eine Zellzählung, bei der die Mastzellen mit saurem Toluidinblau angefärbt wurden.

	Abb. 3 : Übersicht über die bei der Mastzellaufreinigung eingesetzten Antikörper

Die Bestrahlung wurde durchgeführt mit entsprechender UV- Lichtquelle (s. S. 18) und je 1,8 10⁵ Mastzellen in einer offenen Petrischale. In diesen betrug die Füllhöhe einheitlich 1,5 mm. Für die PUVA-1 Bestrahlung wurden die Zellen dreißig Minuten vor Beginn mit 500 ng/ml 8- Methoxypsoralen (8- MOP) bei 37°C präinkubiert.

Bis zum Zeitpunkt der Messung wurden die Zellen bei 37°C und fünfprozentiger CO₂ Atmosphäre verwahrt.

Nicht aufgereinigte Mastzellen wurden folgenden Bestrahlungsdosen ausgesetzt:

Nach 24 Stunden wurde die anti- IgE, die Substanz P, die nicht stimulierte und die maximale Histaminfreisetzung bestimmt.

Die Mastzellen wurden mit anti- IgE und Substanz P stimuliert und das hierbei freigesetzte Histamin wurde in Bezug zum Gesamthistamingehalt gesetzt. Dieser auch als Complete bezeichneter Gesamthistamingehalt wurde ermittelt, indem die Zellen mit einprozentiger Perchlorsäure lysiert wurden. Zusätzlich wurde der Blank also die spontane Histaminfreisetzung bestimmt, indem die Zellen nur mit dem Puffer PAG- CM inkubiert wurden.

Zu Beginn der Bestimmung wurden die in Petrischalen bestrahlten Zellen aus diesen in Falcons umgefüllt, um sie dann mit 50 ml PAG-CM zu waschen. Anschließend wurden sie mit 1800µl PAG-CM resuspendiert und zu je 200µl in Einzelansätze aufgeteilt. Für jede einzelne Bestrahlungsart und -dosis ergab sich folgender Versuchsaufbau:

Tabelle 7 : Versuchsaufbau zur Bestimmung der Histaminfreisetzung

Die Einzelansätze wurden nun für dreißig Minuten in einem 37°C warmen Schüttelwasserbad inkubiert, indem die Zellen auf die hinzugefügten Substanzen reagieren konnten. Dann wurde die Stimulation mit 600 µl 4°C kaltem PAG-CM beendet. Durch anschließendes zehnminütiges Zentrifugieren bei 250g konnten die Überstände mit dem freigesetztem Histamin gewonnen werden. Bis zur Messung wurden sie bei –20°C verwahrt.

Der Histamingehalt wurde mit der automatisierten fluorometrischen Methode nach Siraganian^{[ 90]} bestimmt. In der Probe wird das Histamin durch organische und anorganische Lösungsmittel extrahiert, um dann mit o- Phthaldialdehyd (OPDA) versetzt zu werden. Die Reaktion zwischen dem OPDA und dem Histamin findet bei stark basischem pH statt und das eigentlich fluoresziernde Reaktionsprodukt wird erst bei einem pH von kleiner als zwei gebildet. Es folgt eine Anregung mit Wellenlängen zwischen 355 und 360 nm, worauf die Fluoreszenz bei 450 – 460 nm gemessen werden [Seite 26↓]kann. Die Fluoreszenz ist hierbei proportional zur Histaminkonzentration in den Proben. Die erwünschte Netto- Histaminfreisetzung ergibt sich, indem von der stimulierten die spontane Histaminfreisetzung abgezogen und in Relation zum Gesamthistamingehalt gesetzt wird.

Durch den vorherigen Histaminversuch konnten für die drei Bestrahlungsarten Dosen ermittelt werden, die einen gleichermaßen inhibitorischer Effekt der anti-IgE Stimulation erzielten. Die Mastzellen wurden also für die anschließenden Versuche folgendermaßen bestrahlt:

Die unbestrahlte Kontrollpopulation für die UVB und UVA-1 behandelten Zellen wird als Sham (engl.:Täuschung, Betrug) bezeichnet. Für eine zweite Kontrolle wurden unbestrahlte Mastzellen mit 8-Methoxypsoralen inkubiert, um sie mit PUVA-1 bestrahlten Zellen vergleichen zu können.

Zunächst ist auf die Randbedingung hinzuweisen, dass mit Zellkonzentrationen von 8 x 10⁵ bis 1 x 10⁶ Mastzellen pro ml gearbeitet wurde.

Pro Ansatz wurde ein Drittel der Mastzellsuspension im Verhältnis von 1:1 mit anti-IgE (1:10 000) stimuliert; zu den restlichen zwei Dritteln wurde ebenfalls im Verhältnis von 1:1 der Puffer PAG-CM hinzugefügt. Anschließend fand eine Aufteilung der mit PAG-CM behandelten Zellen in zwei gleich große Fraktionen statt. Von diesen wurde eine für den Complete im dreimaligen Wechsel langsam eingefroren und wieder aufgetaut. [Seite 27↓]Dadurch konnten kleine Eiskristalle die Zellmembranen der MC zerstören, so dass die gesamten Botenstoffe, inklusive der Tryptase in den Extrzellulärraum gelangten. Die zweite Fraktion PAG-CM behandelter Zellen, sowie die mit anti-IgE stimulierten Mastzellen wurden für dreißig Minuten in das 37°C warme Schüttelwasserbad gegeben. Anschließendes zehnminütiges Zentrifugieren bei 250g ermöglichte, dass die Überstände in je 3 x 50µl Portionen auf eine 96 well Platte pipettiert werden konnten. In jeder dieser 50µl Portion ist nun die Mediatormenge, die von 4 bis 5 x 10⁴ MC freigesetzt wurde.

Ebenfalls in 3 x 50µl Portionen wurde der Complete in je einer 1:10 er Verdünnung (entspricht in diesem Versuchsaufbau der Mediatormenge, die von 5 x 10³ MC freigesetzt wird) und einer 1:20 er Verdünnung (2,5 x 10³ MC) auf die Platte aufgetragen (s. Abb. 4).

Zu den 50µl Proben wurden 150µl Tryptasemeßpuffer und 20µl Tryptase Substrat hinzugefügt. Die sich nun im 90 Sekunden Takt anschließenden Messungen im Dynex MRX 96 well-Platten-Photometer wurden bei 37°C durchgeführt. Bei dieser Zeitkinetik korreliert die Tryptasekonzentration in den Proben mit der Umsetzungsgeschwindigkeit des Substrates.

	Abb. 4 : Pipettierschema zur Bestimmung der Tryptaseaktivität

Das der hier verwendeten Absorptionsphotometrie zugrundeliegende liegende Prinzip basiert im wesentlichen auf zwei Punkten. Zum einen können schon kleinste Mengen [Seite 28↓]eines Enzyms durch Messung seiner enzymatischen Aktivität nachgewiesen werden. Der Tryptase wird unter definierten Bedingungen, wie Temperatur und Konzentration der eingesetzten Substanzen ein Substrat angeboten. Je schneller es umgesetzt wird, desto höher konzentriert ist der Tryptasegehalt der Probe. Zum anderen ist das Lambert – Beersche – Gesetz eine Grundvoraussetzung (s. Abb. 5), denn das enzymatisch gespaltene Substrat verursacht einen Farbumschlag. Diese absorbierende Substanz wird von monochromatischem Licht durchstrahlt und ihre Konzentration, sowie die Schichtdicke des Probengefäßes, ist zu der Extinktion proportional. Die Extinktion einer Lösung ist definiert als der negative dekadische Logarithmus des Quotienten von austretendem geschwächten und eintretendem Licht.

	Abb. 5 : Lambert-Beersches-Gesetz (E = Extinktion, I = Lichtintensität des austretenden geschwächten Lichtes, I° = eingesetzte Lichtintensität, ε = Absorbtionskoeffizient, c = Konzentration des absorbierenden Stoffes, d = Schichtdicke)

Um mögliche Störfaktoren im höheren Maße zu vermeiden, wurden für die Bestimmung der Zytokine mittels ELISA (enzyme–linked immuno sorbent assay) ausschließlich hoch aufgereinigte Mastzellen verwendet.

Nach der Bestrahlung wurden die Mastzellen für 24 Stunden bei 37°C und fünfprozentiger Kohlendioxidatmosphäre verwahrt, um dann die basale Freisetzung von IL.6, IL-8 und TNF-α in dieser Zeit untersuchen zu können. Das anschließende Zentrifugieren bei 250g und 4°C ermöglichte, dass die hierbei gewonnenen Überstände unter Berücksichtigung der Zellzahlen auf die 96- well- Mikrotiterplatte des jeweiligen Immunoassays pipettiert werden konnten. Jedes Well dieser Platte ist vorbeschichtet mit einem monoklonalen Antikörper, spezifisch gegen das zu bestimmende Zytokin. [Seite 29↓]Das in der Probe beziehungsweise im Standard befindliche Antigen bindet nun an den immobilisierten Antikörper. Es folgt ein Waschvorgang durch den ungebundene Substanzen entfernt werden und ein enzymgebundener polyklonaler Antikörper, der an einer anderen Antikörperbindungsstelle des Antigens bindet, wird hinzupipettiert. Das zu bestimmende Zytokin ist nun an zwei unterschiedliche Antikörper gebunden und aus dieser Konstellation ergibt sich die weitläufige Bezeichnung des two-site sandwich assays für die hier verwendete Methode. Nachdem den Bindungen ausreichend Zeit gegeben wurde, werden die restlichen ungebundenen Antikörper weggewaschen. Eine Substratlösung wird in jedes Well hinzugegeben und nach einer Inkubationszeit wird eine Verstärkerlösung verabreicht, die einen Farbumschlag sichtbar werden lässt. Dieser zu der Zytokinkonzentration in den Wells proportionaler Farbumschlag wird durch eine Stoplösung beendet und anschließend wird die Intensität der Farbe mit einem Microplate reader gemessen.

Um potentielle Fehler durch Einzelmessungen ausschließen zu können, bestand in diesem Versuchsaufbau jede Messung aus einer Doppelbestimmung. Der hieraus gebildete Mittelwert wurde schließlich als eigentlicher Messwert protokolliert.

Die für diesen Versuch benötigten aufgereinigten Mastzellen wurden 24 Stunden nach der Bestrahlung mit anti- IgE (1 :10 000) stimuliert oder mit PAG- CM inkubiert. So konnten zum einen bestrahlte und unbestrahlte und zum anderen stimulierte und unstimulierte Mastzellen in Bezug auf ihre CD 63 und CD107a Oberflächenexpression untersucht werden. Nach der Stimulation wurden die 1 10⁵ Zellen pro Ansatz gewaschen, um anschließend mit 100µg/ml mouse gamma globulin in PBS und 20prozentigem AB Serum bei 4°C für 15 min inkubiert werden zu können. So wurden unspezifische Bindungen blockiert und auf ein erneutes Waschen der Mastzellen konnte die Inkubation mit FITC-konjugierten monoklonalen Antikörpern für 30 min bei 4°C erfolgen. Außer dieser monoklonalen Antikörper: CD 63 (cloneCLBGran/12) und CD107a (clone H4A3) wurde zur Kontrolle ein IgG₁ Antikörper eingesetzt. Die Analyse [Seite 30↓]der Zellen mit dem Epics XL flow cytometer (Coulter) schloss sich an und dieses Prinzip der Messung sei im Folgenden kurz geschildert.

Die Durchflusszytometrie auch Fluorescence-activated-cell-sorting (FACS-Analyse) genannt, ist ein fluoreszenzoptisches Verfahren zur Epitopdetektion von Rezeptormolekülen auf Einzelzellniveau^{[ 91]}. Dieses wird ermöglicht durch Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind. Es folgt eine Anregung durch Laserlicht und die emittierten Fluoreszenzsignale werden von Photonenverstärkern empfangen. Sie werden von einem angeschlossenen Rechner verarbeitet und als event auf dem Monitor dargestellt. Dadurch ist eine Zellanalyse, um phänotypische Befunde zu liefern, in sicherer und schneller Weise möglich.

Um die untersuchten Ergebnisse auf statistische Signifikanz zu untersuchen, wurde der verteilungsfreie Rangsummen-Test für zwei verbundene Variablen nach Wilcoxon eingesetzt. Dieser nicht parametrische Test überprüft die Hypothese, dass beide Stichproben dieselbe Verteilung haben, und beruht auf der Rangordnung der Absolutwerte der Differenzen zwischen den beiden Stichproben, ohne eine Aussage über die Form der Verteilung zu machen. Es wurde definiert, dass ein p-Wert ≤ 0,05 als signifikant und ein p-Wert ≤ 0,01 als hoch signifikant bezeichnet werden kann. Der Wilcoxon-Test fand bei der Untersuchung der stimulierten und nicht stimulierten Histaminfreisetzung, der Tryptaseausschüttung, sowie bei der basalen Freisetzung von IL-6, IL-8 und TNF-α Verwendung.