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4  Ergebnisse

4.1 Die Histaminfreisetzung in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis

Die Mastzellstimulation kann durch zahlreiche Substanzen und auf unterschiedlichste Art und Weise erfolgen. Bei der anti-IgE Stimulation spielt der tetramerische hochaffine IgE Rezeptor FcεRI eine Schlüsselrolle. Auch Neuropeptide wie Substance P sind in der Lage Mastzellen zu aktivieren. Bei den durchgeführten Untersuchungen wurde eine Substance P (SP) Konzentration von 30µM eingesetzt. Bei der Stimulation mit anti-IgE ergab sich eine durchschnittliche Netto-Histaminfreisetzung von 30,1% des Gesamthistamingehaltes beziehungsweise von 8,9% bei Substance P Stimulation.

Die dermalen Mastzellen wurden mit verschiedene Dosen von UVB (Abb. 6), UVA-1 (Abb. 7) und PUVA-1 (Abb. 8) bestrahlt, um die Auswirkungen von UV Licht unterschiedlicher Intensität zu testen.

Es zeigte sich bei allen drei Bestrahlungsarten 24 Stunden nach Bestrahlung eine signifikante, dosisabhängige Inhibierung der anti-IgE induzierten Histaminfreisetzung. In stetiger Weise verringerten die bestrahlten Mastzellen ihre Fähigkeit nach anti-IgE Stimulation Histamin freizusetzen, so dass eine maximale Hemmung bei maximaler Bestrahlungsdosis erzielt wurde. Bei der UVA-1 Bestrahlung wurde die Hemmung am deutlichsten. Setzten die unbestrahlten Mastzellen noch 31,6% ihres Gesamthistamingehaltes frei, so wurden nach einer Bestrahlungsdosis von 25 J/cm² nur noch 1,5% ausgeschüttet. Die Mastzellen reduzierten folglich ihre Histaminfreisetzung um 95,3%. Bei der UVB(100mJ/cm²) und PUVA-1(5J/cm²) Bestrahlung ist die Inhibierung mit 81,1% (von 30,2% bei unbestrahlten MC auf 5,7% bei 100mJ bestrahlten MC) und 71,5% (von 28,4% auf 8,1%)zwar ebenfalls deutlich, aber weniger potent.

Ferner konnten Bestrahlungsdosen aller drei Bestrahlungsarten ermittelt werden, die eine ähnlich inhibitorische Wirkung auf die anti-IgE induzierte Histaminausschüttung aufwiesen. So wurde nach 75 mJ/cm² UVB Bestrahlung nur noch 24,3% (Inhibierung: 75,7%), nach 15 J/cm² UVA-1 Bestrahlung 25,6% (Inhibierung: 74,38%) und nach 5 [Seite 33↓]J/cm² PUVA-1 Behandlung 28,9% (Inhibierung: 71,0%) Histamin freigesetzt. In den nachfolgenden Versuchen (s. Kapitel 4.2, 4.3 und 4.4) wurden zur besseren Vergleichbarkeit der Ergebnisse diese Äquivlenzdosen eingesetzt.

Für die Substance P stimulierten Mastzellen ergab sich ein anderer Zusammenhang. Bei der UVB und PUVA-1 Bestrahlung konnte keine signifikante Veränderung der Histaminausschüttung festgestellt werden (s. Abb. 6 und 8). Durch die UVA-1 Bestrahlung hingegen wurden die SP induzierte Histaminfreisetzung der Mastzellen in stetiger und dosisabhängiger Weise inhibiert (s. Abb. 7). Wurde durch Substanz P Stimulation bei unbestrahlten Mastzellen noch 7,9% des Gesamthistamingehaltes freigesetzt, so waren es nach maximaler Bestrahlungsdosis nur noch 1,4%. Dies entspricht einer 82,3 prozentigen Inhibierung.

Es zeigte sich also, dass die UVA-1 Strahlung im Gegensatz zu UVB und PUVA-1 sowohl die anti-IgE wie auch die SP stimulierte Histaminausschüttung hemmen konnte.

Bestrahlung mit UVB – Stimulierte Histaminfreisetzung

Abb. 6 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei UVB Bestrahlung.
Die Mastzellen wurden mit UVB bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 11 Versuchen. **p = 0,003
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)

[Seite 34↓]Bestrahlung mit UVA-1 – Stimulierte Histaminfreisetzung

Abb. 7 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung
Die Mastzellen wurden mit UVA-1 bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 10 Versuchen. *p = 0,022; **p ≤ 0,007.
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)

Bestrahlung mit PUVA-1 – Stimulierte Histaminfreisetzung

Abb. 8 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.
Die Mastzellen wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml 8-MOP) und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 9-8 Versuchen. *p = 0,028; **p = 0,008.
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)


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Zusätzlich zur stimulierten Histaminfreisetzung wurde die basale, also die nicht stimulierte Histaminfreisetzung aller drei Bestrahlungsarten bestimmt (s. Abb. 9).

Im Gegensatz zu der reduzierten stimulierten Mediatorausschüttung verursachte das UV Licht im untersuchten Dosisbereich eine hochsignifikante Zunahme der spontanen Histaminfreisetzung. So stieg innerhalb der ersten 24 Stunden nach UVB Bestrahlung die Mediatorfreisetzung um 56,15%, nach UVA-1 um 52,75% und nach PUVA-1 um 60,90%.

Die nicht stimulierte Histaminfreisetzung

Abb. 9 : Die nicht stimulierte Histaminfreisetzung humaner dermaler MC.
Die MC wurden mit UVB (0 und 75mJ/cm²), UVA-1 (0 und 15J/cm²) und PUVA-1 (0 und 5 J/cm², 500 ng/ml) bestrahlt und die Histaminfreisetzung in Bezug zum Gesamthistamingehalt wurde 24 Stunden später ermittelt. Darstellung von MW und SEM. Zahl der Versuche: UVB: 11, UVA-1: 10 und PUVA-1: 9; **p < 0,01


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4.2  Die Tryptasefreisetzung nach UVB, UVA-1 und PUVA-1 Bestrahlung

Im vorherigen Versuch wurde die Inhibierung der anti-IgE induzierten Histaminfreisetzung durch UV Licht festgestellt. Zum Vergleich dieser Daten wurde im Folgenden untersucht, ob 24 Stunden nach UV Bestrahlung eine ähnlich inhibitorische Wirkung auf die anti-IgE provozierte Tryptasefreisetzung eintritt. Die Tryptase wurde aus folgendem Grund gewählt. Sie ist, wie auch Histamin zum einen in sekretorischer Granula gespeichert und zum anderen ein spezifischer Marker für die Mastzellstimulation.

Für die UVB Bestrahlung wurde eine Dosis von 75 mJ/cm², für UVA-1 von 15 J/cm² und für PUVA-1 von 5 J/cm² gewählt, weil sie näherungsweise ein äquivalentes Potential hinsichtlich der Reduktion der stimulierbaren Histaminfreisetzung gezeigt hatten.

Unbestrahlte, anti-IgE stimulierte Mastzellen setzten bei Präinkubation mit 8-Methoxypsoralen 17,2 beziehungsweise ohne Vorbehandlung 18,6% Tryptase frei. Die alleinige Behandlung der Zellen mit dem Photosensibilisator 8-MOP scheint keinen Einfluss auf die Tryptasefreisetzung zu haben, denn zwischen 17,2 und 18,5 besteht kein signifikanter Unterschied.

Nach UVB Bestrahlung reduzierte sich die anti-IgE induzierte Tryptasefreisetzung signifikant, auf 11,4%. Dies entspricht einer Inhibierung um 38,7% und ist damit ähnlich deutlich, wie die nach UVA-1 Bestrahlung. Sie belief sich in diesem Ansatz auf 39,2%, denn verglichen mit den freigesetzten 18,6% aus der Kontrollpopulation, wurden hier lediglich 11,3% Tryptase auf den anti-IgE Stimulus hin ausgeschüttet. Etwas deutlicher reagierten die mit PUVA-1 bestrahlten Mastzellen, denn sie konnten nur noch 8,9% der Serinprotease freisetzen. Verglichen mit den 8-Methoxypsoralen vorbehandelten Mastzellen, die auf den gleichen Stimulus mit anti-IgE noch 17,2% abgaben, entspricht dies einer Inhibierung um 48,1% (s. Abb. 10).

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass sich für die drei Bestrahlungsarten eine signifikante Inhibierung der anti-IgE induzierten Tryptasefreisetzung zeigen ließ.

[Seite 37↓]Tryptasefreisetzung von bestrahlten dermalen Mastzellen

Abb. 10 : Die anti-IgE induzierte Tryptasefreisetzung von humanen dermalen Mastzellen nach UVB, UVA-1 und PUVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit 75 mJ/cm² UVB, 15 J/cm² UVA-1 und 5 J/cm² PUVA-1 bestrahlt und die Tryptasefreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. Für PUVA-1 und 8-MOP gilt + 500ng/ml 8-Methoxypsoralen. Sham und 8-MOP sind unbestrahlte Kontrollen. MW und SEM aus 7-9 Versuchen. *p = 0,018; **p=0,008.


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4.3  Die basale Freisetzung von Interleukin-6, Interleukin-8 und Tumornekrosefaktor-α nach Bestrahlung mit UV Licht

Es wurden humane dermale Mastzellen (1 x 106 MC pro ml) mit UV Licht bestrahlt, um 24 Stunden später die basale Freisetzung der Interleukine-6 und –8 sowie des Tumornekrosefaktors-α bestimmen zu können. Auch bei diesem Versuch wurden für die drei Bestrahlungsarten Dosen ausgewählt, mit annähernd gleichen inhibitorischen Effekten bezüglich der Histaminausschüttung ( s. Kapitel 3.2.6).

Die unbestrahlten Mastzellkontrollen gaben durchschnittlich 220,7 pg/ml beziehungsweise bei Präinkubation mit 8-MOP 219,1 pg/ml Interleukin-6 ab. Wurden die Zellen mit UVB Licht bestrahlt, so setzten sie im Laufe der 24 Stunden 86,6 pg/ml des Zytokins frei, was verglichen mit der Kontrolle nur noch 39,2% sind und einer Inhibierung um 60,8% entspricht. Um 66,9% inhibiert wurden die Zellen nach Behandlung mit PUVA-1 Licht, denn sie schütteten lediglich 72,6 pg/ml des hier untersuchten Interleukins aus. Am deutlichsten jedoch war das Resultat bei der UVA-1 Bestrahlung, da die Zellen um 82,3% ihre Fähigkeit der basalen Freisetzung von IL-6 einbüßten und nur 39,2 pg/ml abgaben (s. Abb. 11).

Verglichen mit den Interleukin-6 Daten ergab sich bei der Untersuchung des Interleukins-8 ein recht ähnliches Bild. Denn auch hier zeigten sich die inhibitorischen Auswirkungen des UV Lichtes. So setzten die Mastzellen in den 24 Stunden nach der UVB Bestrahlung nur 1244,7 pg/ml des Zytokins frei, was verglichen mit den 2953,2 pg/ml aus der unbestrahlten Kontrolle einer Inhibierung um 57,9% gleichkommt. Am deutlichsten wurden die Auswirkungen wieder bei der UVA-1 Bestrahlung, denn die Zellen waren nicht in der Lage mehr als 21,4%, dies entspricht absolut 632,3 pg/ml, des Interleukins 8 abzugeben. Durch die PUVA-1 Bestrahlung verminderte sich die basale Ausschüttung um 73,3% und zeigte so einen ebenfalls signifikanten Unterschied verglichen mit den 8-MOP vorbehandelten und unbestrahlten Mastzellen (s. Abb. 12).

Bei der Untersuchung der 24-stündigen basalen Freisetzung des Tumornekrosefaktors-α fielen zweierlei Dinge auf. Zum einen bewegte sich die Ausschüttung dieses Zytokins, verglichen mit den untersuchten Interleukinen auf einem sehr niedrigen Niveau um 6 pg/ml. Zum anderen unterlag diese geringe Menge an sezerniertem TNF-α nur gering-[Seite 39↓]fügigen nicht signifikanten Schwankungen bei der Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1. Das UV Licht hatte also auf die basale TNF-α Freisetzung keinerlei Einfluss (s. Abb. 13).

Basale Interleukin – 6 Freisetzung

Abb. 11 : Die basale Interleukin – 6 Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028.

[Seite 40↓]Basale Interleukin – 8 Freisetzung

Abb. 12 : Die basale Interleukin – 8 Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028

Basale Tumornekrosefaktor - α Freisetzung

Abb. 13 : Die basale Tumornekrosefaktor - α Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte TNF-α Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen.


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4.4  Die Expression der Moleküle CD107a und CD63 nach Bestrahlung mit UV Licht

Die Rezeptoren CD107a und CD 63 gehören zu der Gruppe der LAMPs (lysosome - associated membrane proteins) und befinden sich auf Lysosomen und Mastzellgranula. Sie sind bei der Degranulation, also während der Verschmelzung von Mastzell- und Vesikelmembran auf der Mastzelloberfläche verstärkt nachweisbar.

An dieser Stelle wurde untersucht, inwiefern UV Licht einen Einfluss auf die anti-IgE induzierte vermehrte Expression der Moleküle CD 107a und CD63 hat. Die Versuche wurden fünfmal wiederholt und zeigten jeweils nahezu gleiche Resultate. Exemplarisch seien die folgenden Abbildungen aufgelistet.

Auf der Abb. 16 erkennt man das nur wenige, im Mittel 10±1,1% der unbestrahlten und unstimulierten Mastzellen den Rezeptor CD 107a (LAMP-1) auf ihrer Oberflächenmembran exprimieren (graue Kurve). Nach Stimulation mit anti-IgE entstehen zwei Populationen, von denen eine nach wie vor nur in geringer Weise CD 107a zeigt und eine zweite größere Gruppe von durchschnittlich 53±7,3%, die vermehrt das Oberflächenmolekül aufweist (schwarze Kurve). Gleiches Phänomen, also das nach Stimulation mit anti-IgE die Oberfläche der MC intensiver mit CD 107a besetzt ist, lässt sich auch bei den mit 8-MOP präinkubierten Zellen feststellen (s. Abb. 14). So wurden bei durchschnittlich 39±1,7% der MC (anti-IgE stimuliert versus nicht stimuliert) der anti-IgE induzierte Anstieg von CD 107a deutlich.

Diese beiden Kontrollen werden nun mit den bestrahlten Zellen verglichen. Zunächst ist darauf hinzuweisen, dass eine leicht erhöhte basale Expression von LAMP-1 bei UVB und PUVA-1 und eine stark erhöhte basale Expression bei UVA-1 demonstriert werden konnte. Im Einzelnen waren dies für UVB 16±2,5%, für PUVA-1 24±2,1% und für UVA-1 50±6,2% (s. graue Kurven der Abbildungen 17, 15, 18).

Nach Stimulation mit anti-IgE lässt sich für 11±2,8% (anti-IgE stimuliert versus nicht stimuliert) bei UVB, für 10±3,1% bei UVA-1 und für 13±2,6% bei PUVA-1 die Nachweisbarkeit von CD107a zwar noch zusätzlich zur basalen Expression steigern (s. schwarze Kurven der Abbildungen 17, 18, 15), bei weitem jedoch nicht in dem Ausmaße wie bei den unbestrahlten Zellen (sham: 43±6,2% und 8-MOP: 39±1,7%). [Seite 42↓]Durch die UV Bestrahlung ließ sich die ansonsten durch anti-IgE induzierbare Mehrexpression von CD 107a auf humanen dermalen MC supprimieren.

Die Oberflächenexpression von CD107a auf humanen dermalen MC

Abb. 14 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD107a auf humanen dermalen Mastzellen bei Behandlung mit 8-Methoxypsoralen.
Die MC wurden mit 8-MOP (500ng/ml) präinkubiert und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 15 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit PUVA-1 (500ng/ml) bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.


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Abb. 16 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf unbestrahlten, humanen dermalen Mastzellen.
Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 17 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei UVB Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 18 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.


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Bei dem Molekül CD63 zeigt sich ein ganz ähnliches Bild wie bei CD 107a. Die beiden unbestrahlten Kontrollen sham und 8-MOP belegen, dass unstimulierte Mastzellen in nur geringer Intensität LAMP-3 auf ihrer Oberfläche tragen (s. graue Kurven der Abbildungen 21 und 19). Werden sie mit anti-IgE stimuliert, so kommt es im Zuge der Degranulation zu einem deutlichen Anstieg der Intensität (s. schwarze Kurven der Abbildungen 21 und 19).

Bedingt durch die Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 steigt die basale Expression von CD63 auf der Mastzelloberfläche. Die auf den anti-IgE Stimulus folgende Hochregulation des Moleküls wird durch die UV Bestrahlung inhibiert, was sich graphisch durch das Angleichen der beiden Kurven zeigt. (s. Abb. 22, 23 und 20)

Abb. 19 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei Behandlung mit 8-Methoxypsoralen.
Die MC wurden mit 8-MOP präinkubiert (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 20 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.


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Abb. 21 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf unbestrahlten humanen dermalen Mastzellen.
Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 22 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei UVB Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 23 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.


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4.5  Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Histaminfreisetzung

Die Tryptasefreisetzung

Die Modulation der IL-6, IL-8 und TNF- α Freisetzung

Die Expression von CD107a und CD63


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31.01.2005