Die menschliche Mastzelle wurde erstmals 1878 von Paul Ehrlich beschrieben. Im Rahmen seiner Dissertation entdeckte er diese polymorph, häufig jedoch oval bis spindelförmig, geformten Zellen, indem er sie mit Anilin behandelte und dabei einen Farbumschlag von blau nach violett feststellte. Diese als Metachromasie bezeichnete Färbeeigenschaft beruht auf der zahlreich im Zytoplasma vorliegenden basophilen Granula, die aufgrund ihres sulfatierten Glykosaminoglykangehaltes reagiert. Eben diese Granula, die bei der Entdeckung eine so wesentliche Rolle spielte, war nun auch ausschlaggebend für die Namensgebung. Denn sie liegt so dicht gedrängt um den zentralen meist rundlichen Zellkern, dass die Zelle wie gemästet erscheint und seitdem Mastzelle genannt wird.
Mastzellen haben einen Anteil von 2-8% an den dermalen Zellen. Außer in der Haut, wo sie ihre höchste Besiedlungsdichte von durchschnittlich 7000 Zellen/mm³ aufweisen, kommen sie im Gehirn, in den Alveolarwänden der Lunge, der Adventitia kleinerer Blutgefäße und den Schleimhäuten von Auge, Nase und Gastrointestinaltrakt vor. Auch eine enge Lagebeziehung zu Nervenzellen ist beschrieben worden[ 1, 2].
Die Vorläuferzellen der Mastzellen, pluripotente hämatopoetische Stammzellen (CD34+, c-kit+ und CD13-) des Knochenmarks[ 3], wandern über Blutgefäße in peripheres Gewebe, wo sie transmembranäre SCF-Rezeptoren (c-kit, CD 117) exprimieren. Der Stammzellfaktor SCF (c-kit-Ligand) kann nun an die Vorläuferzellen binden, was letztendlich die Differenzierung zur reifen Mastzellen bewirkt. Auch Interaktionen mit lokal produzierten Zytokinen, sowie weitere unerforschte Mechanismen scheinen bei dem Entwicklungsprozess eine tragende Rolle zu spielen.
Schon im Jahre 1960 stellte Enerback anhand von Rattenmastzellen fest, dass diese sich in ihrer Struktur, Funktion und histochemischen Eigenschaft beachtlich unterscheiden. Auch die Reaktion auf bestimmte Stimuli, hinsichtlich der Mediatorproduktion und –freisetzung, unterliegt erheblichen Schwankungen.
Angesichts einer solchen Fülle an Unterscheidungsmerkmalen verwundert es nicht, dass es mehrere Klassifikationsmodelle gibt. Bei Rattenmastzellen unterscheidet man hinsichtlich der Lokalisationsorte in CTMC (connective tissue-type mast cells) und MMC (mucosal mast cells). Für die menschlichen Mastzellen gilt als wesentliches Kriterium der unterschiedliche intrazelluläre Gehalt von Tryptase (T) und Chymase (C). So gliedert man die Mastzellen in zwei Subpopulationen, von denen die eine (MCTC) hauptsächlich Tryptase und Chymase beinhaltet. Sie sind überwiegend in der Haut, den Konjunktiven, dem subkutanen Gewebe und der Schleimhaut des Gastrointestinaltraktes anzutreffen. Der andere Subtyp (MCT) weist in erster Linie nur Tryptase auf und findet sich in der Mukosa von Darm und Lunge. Ferner ist bei den MCT Mastzellen die enge Lagebeziehung zu T2-Helferzellen (TH2-Lymphozyten) auffällig, die sich mit dem gemeinsamen Abwehrmechanismus gegen parasitäre Erkrankungen, erklären lässt[ 4-7].
Der für dieses Klassifikationsmodell so ausschlaggebende unterschiedliche Gehalt zweier Serinproteasen lässt sich interessanterweise durch Umsetzen der Mastzellen in eine andere Umgebung modifizieren. Darüber hinaus gibt es Krankheiten, die durch eine Veränderung des Verhältnisses der beiden Subpopulationen zustande kommen[ 8].
Die Aktivierung der Mastzelle kann durch immunologische und nicht-immunologische Stimuli (Trigger) erfolgen. Diese Trigger sind: Immunglobuline (zum Beispiel: IgE), Neuropeptide (z.B.: Substanz P), Zytokine, Peptide beziehungsweise Proteine (z.B.: Komplementsystem-Proteine), Antibiotika (z.B.: Calcium-Ionophor) aber auch Infektionen. Zu dem Aktivierungsprozess gehört per definitionem die auf die Stimulation folgende Degranulation mit der Freisetzung in Granula gespeicherter Mediatoren.
Eine Schlüsselposition bei dem Aktivierungsprozess spielt der tetramerische hochaffine IgE Rezeptor FcεRI[ 9], der aus einer IgE bindenden α-Kette, einer signalamplifizierenden β-Kette und zwei homologen signalübermittelnden γ-Ketten besteht[ 10, 11]. Letztere werden bisweilen auch als homodimere Untereinheit beschrieben. Über ITAMs (Immunotyrosine Based Activation Motifs) sind in Abhängigkeit vom Phosphorylierungszustand die Tyrosinkinasen Lyn und Syk an die β- beziehungsweise γ-Kette gebunden[ 12, 13]. Gehen nun die während der spezifischen Sensibilisierungsphase bei der Typ-I-Sofortreaktion von Plasmazellen produzierten Immunglobuline der Klasse E eine Bindung mit der α-Kette ein, so wird eine Signalkaskade ausgelöst[ 14]. Notwendige Voraussetzung hierfür ist die Quervernetzung der an Antigene gebundenen Moleküle auf der Mastzelloberfläche. Auch eine direkte Stimulation des Rezeptors, durch bivalente Antikörper kann eine Mastzellaktivierung bewirken.
Zu Beginn der Signalweiterleitung steht die Phosphorylierung der Tyrosinkinase Lyn, die nun ihrerseits Syk und Btk (Bruton’s tyrosine kinase) aktiviert[
15-17]. Letztere sind in der Lage die Phospholipase Cγ (PLCγ) zu phosphorylieren, die so aus dem membranständigen Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2), Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) abspalten kann. IP3 bewirkt eine Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern, was eine Konzentrationserhöhung des Elektrolyts nach sich zieht[
18]. Zusätzlich bindet Calcium an sogenannte CRAC-Kanäle (Calcium Release Activated Calcium), so dass diese geöffnet werden und Calcium entlang des Konzentrationsgefälles aus dem Extrazellulärraum einströmen kann[
19]. Calcium aktiviert das frei im Zytoplasma vorliegende Calcineurin, welches so den phosphorylierten
Die durch das DAG aktivierte Proteinkinase C kann, wie auch die Tyrosinkinase Btk, die MAPK-Kaskade (Mitogen Activated Protein Kinase) aktivieren. Bestehend aus gestaffelt angeordneten Kinasen ist diese Kaskade in der Lage Transkriptionsfaktoren wie AP1 (Activator Protein 1) so zu modifizieren, dass eine Translokation in den Nucleus möglich ist. Dort wird dann zusammen mit dem Transkriptionsfaktor NF-AT die Zytokinproduktion, beispielsweise von TNF-α, induziert.
Wie die Sekretion der präformierten in Granula gespeicherten Mediatoren im Einzelnen funktioniert, ist noch ungeklärt. Man geht heute jedoch davon aus, dass ein Calcium bindendes Protein CE, GTP bindende Proteine, wie Rac 1 und 2 und Cdc 42 aktiviert und so letztendlich die Fusion von Vesikel- und Zellmembran bewirkt. Eine Schlüsselrolle scheint dabei das Zusammenspiel von SNARE-Proteinen (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachement protein receptor) zu haben, die sich auf beiden Zellstrukturen befinden (vesicle SNARE und target SNARE). Durch die Fusion beider Membranen werden nicht nur die gespeicherten Mediatoren ausgeschüttet, sondern auch die auf der Vesikelmembran befindlichen LAMPs (Lysosome Associated Membrane Proteins), zu denen CD107a, CD107b und CD63 gehören, vermehrt auf der Zelloberfläche exprimiert[ 21-24]. Über die Funktion dieser erst kürzlich im Rahmen der Mastzelldegranulation entdeckten Membranproteine ist man sich noch im Unklaren.
Neuere Forschungsergebnisse belegen, dass besonders Nervenendigungen die das Neuropeptid Substanz P freisetzen, Gewebe mit einer sehr hohen Mastzelldichte in ihrer Umgebung aufweisen[
25-29]. Die direkte Wirkung auf Mastzellen mit der folgenden Degranulation und Histaminfreisetzung konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Es ließ sich zeigen, dass niedrige Dosen des Neuropeptids (im picomolaren Bereich) über Neurokininrezeptoren (NK-Rezeptoren; bei Substanz P besonders der Nk1-Rezeptor) G-Proteine aktivieren und somit die Mastzelle stimulieren[
30-33]. Bei Gabe höherer Dosen (im mikromolaren Bereich) erfolgt zusätzlich eine direkte Aktivierung des Pertussistoxin sensitiven G-Proteins an der Innenseite der Plasmamembran[
34, 35]. Dieser Vorgang wird wahrscheinlich durch die spezielle Strukturformel von Substanz P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2) verursacht. In Untersuchungen mit modifizierten
PKC
(Abkürzungen: AP1 = Activator Protein 1; Btk = Bruton’s tyrosine kinase; DAG = Diacylglyzerin; IP3 = Inositoltrisphosphat; MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase; NF-AT = Nuclear Factor of Activated T-cells; PIP2 = Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat; PKC = Proteinkinase C; PLCγ = Phospholipase Cγ).
Neben der direkten Interaktion mit Effektorzellen vermag die Mastzelle über die Ausschüttung ihrer Mediatoren mit der näheren Umgebung zu kommunizieren. Diese Freisetzung gliedert sich in drei zeitlich aufeinander folgende Schübe, von denen der erste innerhalb von Minuten und der letzte innerhalb von Stunden stattfindet. Histamin, Proteoglykane und neutrale Proteasen liegen präformiert in der Mastzellgranula vor und können so direkt nach der Aktivierung sezerniert werden (erster Schub). Der sich anschließende zweite Schub zeichnet sich durch Lipidmediatoren aus, wobei aus membranständiger Arachidonsäure über die Cyclooxygenase Prostaglandine und über die Lipoxygenase Leukotriene synthetisiert werden. Die durch DNA Transkription gebildeten Zytokine entstehen in der Spätphase.
Gemeinsam ist den meisten Mediatoren, dass sich ihr Wirkort auf die Umgebung ihres Freisetzungsortes beschränkt, da sie im Blut relativ schnell abgebaut werden.
Die Granula der Mastzelle enthält Histamin, Tryptase, Chymase, Carboxypeptidase A, Cathepsin G, Heparin, Chondroitinsulfat E, Exoglykosidasen und TNF-α.
Das durch Decarboxylierung von Histidin entstehende Histaminliegt mit durchschnittlich 3-8 pg pro Mastzelle gebunden an Proteine oder Proteoglykane vor und kann nach Exozytose an spezifische Rezeptoren binden[ 7]. Dabei bewirkt die Aktivierung des sogenannten H1- Rezeptors eine Senkung des Blutdrucks, Erweiterung und Erhöhung der Durchlässigkeit der Blutgefäße, Erregung der glatten Darmmuskulatur, Kontraktion der Bronchien und die von H2-Rezeptoren eine Verstärkung der Magensaftsekretion und Herzfrequenzsteigerung[ 39]. Über die Interaktion von Histamin mit Nervenendigungen werden unerwünschte Wirkungen des biogenen Amins, wie Pruritus oder Schmerz ausgelöst.
Zu dem wichtigsten Vertreter der granulagebundenen Proteoglykane gehört Heparin, welches neben der antikoagulierenden Wirkung, Proteasen der MC stabilisiert und die biologische Aktivität vieler Enzyme beeinflusst.
Die Tryptase greift auf unterschiedlichste Art und Weise in den Entzündungsmechanismus ein. Sie steigert die Permeabilität der dermalen Kapillaren, fördert die Adhäsion beziehungsweise die Migration von Leukozyten, inaktiviert neurogene Peptide und erleichtert über eine gerinnungshemmende Wirkung den Plasmaeinstrom ins Gewebe. Auch ein Einfluss auf den Auf- und Umbau von Gewebe wird diskutiert. So hat die Serinprotease einen stimulierenden Effekt auf die Synthese und Sekretion von Typ I Kollagen und gilt als potenter Wachstumsfaktor für Fibroblasten, Epithel- und glatte Muskelzellen. Darüber hinaus kann sie Mitglieder der Familie der Matrix-Metalloproteasen aktivieren, die praktisch alle Bestandteile der extrazellulären Matrix degradieren können und in der Haut durch UV Strahlung und Zytokine reguliert werden. Im klinischen Alltag ist die Tryptase als Indikator für Mastzellaktivierung in Blut und Körperflüssigkeiten von Bedeutung, da sie eine längere Halbwertszeit als Histamin besitzt[ 42-46]. So kann beispielsweise bei einer anaphylaktischen Reaktion schon nach 15 Minuten ein erhöhter Tryptasespiegel nachgewiesen werden; Gipfel treten nach ein bis zwei Stunden auf und im Falle einer verzögerten Anaphylaxie sogar noch später.
Auch der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) wird in nicht unerheblicher Weise in dieser ersten Phase freigesetzt und nimmt so eine Sonderstellung unter den Mediatoren ein, weil sein Hauptanteil in der Spätphase sezerniert wird. Seine Synthese erfolgt vorrangig in aktivierten Makrophagen, aber auch in T- und B- Lymphozyten, NK-Zellen, Endothelzellen, Mastzellen und Astrozyten[ 47]. Die biologisch aktive Form von TNF-α ist ein trimer strukturiertes, aus 157 Aminosäuren bestehendes Polypeptid, dass durch seine pleiotropen Funktionen imponiert. Es stimuliert die Immunantwort, sowie die Synthese von Zytokinen und Lymphokinen; es aktiviert katabolische Prozesse und Endothelzellen und Fibroblasten; es führt mit Interleukin-1 zu einer Gerinnungsaktivierung und hat eine direkte toxische Wirkung für einige Tumorzellen[ 48-53].
Die durch die Lipoxygenase aus Arachidonsäure entstehenden Leukotriene (zum Beispiel LTC4, LTD4, LTE4) vermögen ebenso wie Histamin die Bronchien zu kontrahieren, allerdings mit einer 10-1000 fach potenteren Wirkung[ 58]. Sie fördern die bronchiale Sekretion, steigern die Gefäßpermeabilität und induzieren Kontraktionen der glatten Muskulatur in Gefäßen und im Gastrointestinaltrakt. Zusammen mit den Prostaglandinen (zum Beispiel PGD2), die ebenfalls bei der Bronchokonstriktion und der vermehrten Schleimsekretion mitwirken, sind sie an der Chemotaxis beteiligt und können Neutrophile und Eosinophile Granulozyten aktivieren.
In dieser Spätphase werden neben dem Fibroblast growth factor, dem Vascular endothelial growth factor und TNF-α auch Interleukine sezerniert, von denen IL-6 und IL-8 im Folgenden näher beschrieben werden.
Interleukin-6, auch B cell stimulatory factor -2 genannt, ist ein multifunktionales Protein, welches in seiner aktiven Form aus 184 Aminosäuren besteht und in seiner Tertiärstruktur ein Vier-Helix-Bündel zeigt. Die Synthese erfolgt beispielsweise durch Makrophagen, Monozyten, T- und B-Lymphozten, Keratinozyten und Mastzellen. Es spielt eine wichtige Rolle bei der Immunantwort, bei der es die B-Zell Differenzierung und Antikörperproduktion stimuliert. T-Lymphozyten werden zu ihrer Produktion von Interleukin-2 und Interferon-γ angeregt und die Differenzierung zu zytotoxischen T-Zellen wird ebenfalls gefördert. Interleukin-6 induziert die Synthese und die Sekretion der Akute-Phase-Proteine in den Hepatozyten und auch in der Hämatopoese spielt es eine nicht unwichtige Rolle. So verkürzt es gemeinsam mit IL-3 die G0 Periode der hämatopoetischen Stammzellen und stimuliert das Wachstum von Blastenzellen[ 52, 59-61].
Physiologischerweise kann die Mastzelle phagozytieren, also Antigene aufnehmen, und diese auf ihrer Oberfläche präsentieren. Hierbei spielt insbesondere der MHC II (Major Histocompatibility Complex) Rezeptor eine wichtige Rolle, der neben dem MHC I
In der Pathophysiologie findet man die Mastzellen als Vermittler der anaphylaktischen Reaktion, die durch Hypersensitivität im Rahmen der allergischen Reaktion vom Typ I auftreten. Neben der anaphylaktischen Reaktion sind auch die allergische Rhinitis, das allergische Asthma und die Urtikaria mastzellassoziierte Erkrankungen, denen gemeinsam der IgE und FcεRI vermittelte Auslösemechanismus ist.
Aber auch bei einer Reihe von weiteren Entzündungsreaktionen, seien sie chronischer oder proliferativer Art, kann man die Zunahme von Mastzellen am Ort des Geschehens feststellen. Die mit einer Mutation am SCF Rezeptor assoziierten systemische Mastozytose gehört zu diesen Erkrankungen, genauso wie rheumatische Erkrankungen (die chronischen Polyarthritis und die Arthritis psoriatica) und einige fibrotische Erkrankungen (Lungenfibrose und zystische Fibrose).[ 63]
Die typische Mastzellvermehrung am Ort der Entzündung lässt sich mit einer gesteigerten Rekrutierung von Vorläuferzellen und deren Differenzierung, sowie mit einer verstärkten Migration aus benachbartem Gewebe erklären. Außerdem sollen auch reife Mastzellen über ein gewisses Proliferationspotenial verfügen.
Bei leichten Verläufen mastzellassoziierter Erkrankungen werden zunächst Antihistaminika verabreicht, um symptombezogen zu therapieren. In schwereren Fällen (quälender Juckreiz, Atemnot, Übelkeit, Hypotonie) sind Kortikosteroide hoher Dosierung und gegebenenfalls Adrenalin angezeigt. Jedoch ist bei länger andauernder systemischer Gabe von Kortikosteroiden der Umfang von möglichen Nebenwirkungen beachtlich. So können beispielsweise Osteoporose, Diabetes mellitus, Hypertonie,
Unter diesem Gesichtspunkt erscheinen alternative Möglichkeiten, unter denen eine Kortikosteroiddosierung reduziert werden kann um so interessanter. Neben allgemeinunterstützender Maßnahmen, wie Diät, Klima, Kleidung, Wohnhygiene und Berufsberatung hat nicht selten die UV Therapie eine Besserung des Hautbefundes erzielt. Hierbei sollte neben Stadium und Schweregrad der Erkrankung auch die Art der Bestrahlung berücksichtigt werden. So zeigt sich beispielsweise, dass bei der akut exazerbierten atopischen Dermatitis[ 64-67] und auch bei der Sklerodermie[ 68] das längerwellige UVA-1 Licht (340-400 nm) seine Anwendung findet. Bei der chronischen moderatenen Verlaufsform der atopischen Dermatitis erzielt die UVB Bestrahlung (280-315 nm) die besten Ergebnisse und die PUVA-1 Therapie zeigt sich besonders wirkungsvoll bei der Bekämpfung von psoriatischen Erkrankungen. Auch polymorphe Lichtdermatosen, der Lichen ruber planus, die Mastozytose, die Urticaria pigmentosa, die Mycosis fungoides und andere niedrig maligne T-Zell-Lymphome der Haut können mit PUVA-1 behandelt werden. Man hat hierbei die Möglichkeit, den für die PUVA-1 Bestrahlung notwendigen Photosensibilisator 8-Methoxypsoralen (8-MOP) lokal und somit sehr gezielt anzuwenden oder aber systemisch zu verabreichen.
Die Wirkmechanismen der Phototherapie haben sich als äußerst vielfältig erwiesen. So können Schäden an der Zellmembran, der DNA und von einigen Transkriptionsfaktoren beobachtet werden. Des weiteren findet sich im bestrahlten Gewebe eine veränderte Zytokinzusammensetzung, die die Interaktion verschiedenster Zelltypen beeinflusst.
Die einzelnen Bestrahlungsarten verfügen über unterschiedliche Angriffspunkte. UVB mit einer Wellenlänge zwischen 290 und 315 nm erreicht vorrangig Zellverbände der
Betrachtet man die durch unterschiedliches UV Licht bestrahlten Zellverbände genauer, so sind die strukturellen Veränderungen ähnlich. Die DNA wird in Form von Pyrimidindimeren geschädigt[ 70], da diese Photoprodukte RNA- und DNA-Polymerasen blockieren und potentiell mutagen sind[ 71]. Auf diesen durch UV Belastung entstandenen Schaden kann die Zelle mit Schutzmechanismen reagieren[ 72-76]. Einer ist die Produktion des Tumor-Suppressor-Proteins p53, dessen Funktion darin besteht, den weiteren Verlauf der Zelle inklusive der Einleitung der Apoptose zu bestimmen.
Ein weiterer Abwehrmechanismus ist folgender: die blockierte Polymerase kann das Ausschneiden des entsprechenden Nukleotids einleiten, so dass bei rechtzeitiger Elimination der fehlerhaften DNA-Sequenz der Entstehung eines Tumors vorgebeugt werden kann (NER = Nucleotide Excision Repair)[ 77].
Wegen seiner Wellenlänge kann UVB direkt von der DNA absorbiert werden und sie daher unmittelbar schädigen. UVA-1 hingegen wird nur zu einem geringen Teil absorbiert und führt eher indirekt zu einer Störung des Erbgutes. Es werden reaktive Sauerstoffmoleküle wie Hydroxylradikale und Singulett-Sauerstoff gebildet[ 78], die bei unzureichend vorhandener Schutzmechanismen, wie Antioxidantien, die Zelle in einen Zustand des oxidativen Stresses befördern[ 79]. Hierdurch kann es zur Oxidation von Membranlipiden kommen, was wiederum den Verlust der Membranintegrität und -funk-tion nach sich zieht. Als Nachweis dieser Störung kann die Laktatdehydrogenase (LDH) herangezogen werden, die als stabiles zytoplasmatisches Enzym in nahezu allen Zellen vorhanden ist und wegen der nicht mehr intakten Membran extrazellulär nachweisbar wird.
Der oxidative Stress kann Schäden der DNA hervorrufen, die Transkription und Replikation unterbrechen und so Mutationen induzieren[ 80]. Auch kann auf den oxidativen Stress eine Proteolyse des Eisenspeicherproteins Ferritin folgen[ 81]. Daraus resultiert eine ansteigende intrazelluläre Konzentration von freiem Eisen mit negativen Folgen für die Zelle. So kann Eisen als Katalysator in Reaktionen zwischen reaktiven Sauerstoffspezies und Biomolekülen fungieren, wodurch es beispielsweise zu Lipidperoxidationen kommen kann[ 82-84].
Die aufgeführten Veränderungen, die durch die drei Bestrahlungsarten entstehen können, zeigen sich bei einer Vielzahl unterschiedlichster Zellarten. So werden nicht nur Mastzellen, sondern auch andere immunologisch kompetente Zellen, wie Monozyten, Keratinozyten, Natürliche Killerzellen(NK-Zellen), Langerhanszellen und T-Zellen in ihrer gegenseitigen Interaktion beeinflusst[ 89].
Aus diesen komplexen Zusammenhängen, die einerseits die vielfältigen Wirkmechanismen und andererseits die Wechselwirkungen unterschiedlichster Zellarten umfassen, resultiert letztendlich der Erfolg der Bestrahlungstherapie.
Zurzeit findet die UV Therapie in der Dermatologie, insbesondere bei mastzellassoziierten Erkrankungen und psoriatischen Leiden eine vielfältige und umfangreiche Anwendung. Gemessen an dem breiten Spektrum der klinischen Einsatzmöglichkeiten, ist verhältnismäßig wenig über die Wirkmechanismen der einzelnen Bestrahlungsformen bei menschlichen Mastzellen bekannt.
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen von UVB, UVA-1 und PUVA-1 auf die Mediatorfreisetzung humaner, dermaler Mastzellen genauer beleuchtet. So wurde im Besonderen die sowohl durch verschiedene Stimulantien provozierte, als auch die basale Ausschüttung von Histamin, Tryptase und der Zytokine IL-6, IL-8 und TNF-α untersucht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit war die Betrachtung der Moleküle CD 107a und CD63 (diese tragen auch die Namen LAMP 1 und LAMP 3). Hier interessierte inwiefern das UV Licht bei unstimulierten und stimulierten MC die Präsentation dieser Proteine auf Membranen beeinflusst.
Letztendlich sollen die Forschungsergebnisse dazu beitragen, die Mechanismen der Phototherapie besser verstehen zu können, um so ein sinnvolles und gezieltes Einsetzen im klinischen Alltag zu ermöglichen.
Alle benötigten Standardchemikalien wurden in analytischer Reinheit von den Firmen Merck, Sigma und Biochrom KG bezogen. Besondere Chemikalien werden in Tabelle 2 gesondert aufgelistet.
Für die Isolierung der Mastzellen wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Enzyme eingesetzt.
Die in Tabelle 4 dargestellten Enzyme wurden für die Aufreinigung und Stimulierung der Mastzellen sowie für die Durchflusszytometrie benötigt.
Verbrauchsmaterialien wie Reaktionsgefäße, Pipettenspitzen, Handschuhe und ähnliches wurden von den Firmen Eppendorf, Falcon, Greiner und Sarstedt bezogen. Im Rahmen der Doktorarbeit eingesetzte Laborgeräte sind in Tabelle 5 aufgelistet.
Bei dieser Tabelle fällt die recht hohe UVA und UVA- 1 Strahlenabsonderung der UVB Lichtquelle auf. Auswirkungen auf die Versuche hat diese Eigenschaft der UVB- Lampe jedoch nicht, da meßbare Effekte bei UVA- Bestrahlung erst im Joule Bereich auftreten, und die UVB- Bestrahlung im Millijoule Bereich stattfindet.
Für die höchste UVB Bestrahlungsdosis von 100mJ wurden die Zellen für 132 s bestrahlt (0,758 mJ/cm² s x 132 s = 100,01 mJ/cm²). Hierbei ergibt sich eine UVA und UVA-1 Strahlendosis von 91,32 mJ/cm² (0,6918 mJ/cm² s x 132 s) beziehungsweise von 22,89 mJ/cm² (0,1734 mJ/cm² s x 132 s).
Pipes- Stock- Puffer (10x)
Piperazine- N, N‘- bis (2- ethanesulfonic acid)
69,3g NaCl (1,19M), 76g Pipes(Na-Salz)(250 mM) und 3,85g KCl (49,98 mM) mit Aqua dest. ad 1000ml
pH- Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen
Pipes- Albumin- Glucose + Calcium + Magnesium (PAG- CM)
Pipes- Stock- Puffer (10x) mit Aqua dest. 1:10 verdünnt
0,003 % Humanes Serum Albumin
0,1 % Glukose
3mM CaCl2
3mM MgCl2
MACS- Puffer
PBS w/o Ca²+/Mg²+
0,5 % Bovine Serum Albumine
2mM EDTA
FACS- Puffer
0,05 % Na- Azid
2 % Fetal Calf Serum (FCS)
Tryptase- Meßpuffer
20 ml Trispuffer (0,15M Trsi, 0,3 M KCl = pH 7,6)
2,3 mg Heparin
4 mg α-1-Antitrypsin
Mastzellmedium
Basal- Iscove- Medium
10 % Fetal Calf Serum,
2 % L- Glutamin
1 % Penicillin/Streptomycin,
0,05 % Amphotericin B
α -Monothioglycerol
3 mM Ca²+ und 3 mM Mg2+
Stimulationsmedium
Basal- Iscove- Medium
2 % L-Glutamin
0,1% BSA
1 % Penicillin/Streptomycin
0,05 % Amphotericin B
α -Monothioglycerol
2,8 mM Ca²+ und 1,3 mM Mg2+
Dispergiermedium
PBS w/o
10 % Fetal Calf Serum
2 % L-Glutamin
1 % Penicillin/Streptomycin
0,05 % Amphotericin B
Dnase 1 (10 µg/ml)
5mM MgSO4
Für die Versuche wurden ausschließlich dermale Mastzellen verwendet, die aus Mammareduktionsplastiken gesunder Patientinnen stammen. Ein großer Vorteil gegenüber Mastzelllinien oder peritonealen Rattenmastzellen ist die hierbei wesentlich höhere Aussagekraft in Bezug auf Auswirkungen von UV Bestrahlung auf menschliche Mastzellen.
Für einen Teil der Versuche wurden aufgereinigte MC benötigt. Bei diesem Prozess spielt der monoklonale Maus- Antikörper YB5.B8 eine wichtige Rolle, weil er spezifisch an das Oberflächenmolekül CD117 bindet. Dieser Rezeptor befindet sich nicht nur auf den Mastzellen, sondern auch auf den epidermlen Melanozyten, so dass zu Beginn der Hautbearbeitung die Epidermis von der Dermis getrennt werden muss.
Die Trennung von Epidermis und Dermis
Die Hautpräparate wurden in wenige Millimeter breite Streifen geschnitten, dann in Dispase Typ I (0,5mg/ml) eingelegt und für 24 Stunden bei 4°C verwahrt. Während dieser Zeit kann das Enzym die Bindung zwischen Epidermis und Dermis spalten, so dass die beiden Hautschichten mechanisch voneinander getrennt werden konnten.
Dispergierung der Dermis
Mit einer Schere wurde die Dermis zerkleinert, um sie dann in Dispergiermedium eingelegt, in ein Schüttelwasserbad zu geben. Hier verweilte sie für ungefähr eine Stunde bei 37°C und 200 Schütteleinheiten pro Minute und es folgte eine Filtration der dispergierten Dermis (Porengröße: 300µm, 70 µm und 40µm). Anschließend wurde das
Mit der für eine weiteren Stunde dispergierten Dermis wurde auf gleiche Art und Weise verfahren.
Für einige Versuche war eine besonders hohe Konzentration an Mastzellen erforderlich, um eventuelle Störfaktoren, bzw. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften auszusortieren. Zu Beginn der Mastzellaufreinigung erfolgte ein zweimaliger Waschvorgang mit 4°C kaltem und entgasten MACS- Puffer. Eine zehnminütige Inkubation der Zellen mit AB- Serum (Verdünnung 1 : 5 ) und Sandoglobin (25µl für 1 108 Zellen) schloss sich an, um unspezifische Bindungen, wie zum Beispiel Protein-Protein-Wechselwirkungen, zu minimieren. Monoklonalen Maus- Anti- Human CD117- Antikörper (YB5.B8, Endkonzentration 0,1µg/ml) wurden hinzugegeben, um die an der Mastzelloberfläche befindlichen Rezeptoren CD117 zu binden. Es folgten zwei weitere Waschvorgänge mit MACS- Puffer, bevor die paramagnetischen Sekundärantikörper (Ziege- Anti- Maus- IgG, Micro- Beads in einer 1 : 5 Verdünnung der gebrauchsfertigen Lösung) an die Primärantikörper binden konnten. Um diese spezifische Kopplung zu ermöglichen, wurden die Mastzellen für zwanzig Minuten bei 4°C mit dem Antikörper inkubiert. Die Zellsuspension wurde abschließend auf eine MACS- Trennsäule gegeben, in der die Mastzellen mit ihrem Antikörperkomplex magnetisch binden konnten. Aufschluss über die Reinheit, die im Mittel bei 90% lag, gab eine Zellzählung, bei der die Mastzellen mit saurem Toluidinblau angefärbt wurden.
Die Bestrahlung wurde durchgeführt mit entsprechender UV- Lichtquelle (s. S. 18) und je 1,8 105 Mastzellen in einer offenen Petrischale. In diesen betrug die Füllhöhe einheitlich 1,5 mm. Für die PUVA-1 Bestrahlung wurden die Zellen dreißig Minuten vor Beginn mit 500 ng/ml 8- Methoxypsoralen (8- MOP) bei 37°C präinkubiert.
Bis zum Zeitpunkt der Messung wurden die Zellen bei 37°C und fünfprozentiger CO2 Atmosphäre verwahrt.
Nicht aufgereinigte Mastzellen wurden folgenden Bestrahlungsdosen ausgesetzt:
Nach 24 Stunden wurde die anti- IgE, die Substanz P, die nicht stimulierte und die maximale Histaminfreisetzung bestimmt.
Die Mastzellen wurden mit anti- IgE und Substanz P stimuliert und das hierbei freigesetzte Histamin wurde in Bezug zum Gesamthistamingehalt gesetzt. Dieser auch als Complete bezeichneter Gesamthistamingehalt wurde ermittelt, indem die Zellen mit einprozentiger Perchlorsäure lysiert wurden. Zusätzlich wurde der Blank also die spontane Histaminfreisetzung bestimmt, indem die Zellen nur mit dem Puffer PAG- CM inkubiert wurden.
Zu Beginn der Bestimmung wurden die in Petrischalen bestrahlten Zellen aus diesen in Falcons umgefüllt, um sie dann mit 50 ml PAG-CM zu waschen. Anschließend wurden sie mit 1800µl PAG-CM resuspendiert und zu je 200µl in Einzelansätze aufgeteilt. Für jede einzelne Bestrahlungsart und -dosis ergab sich folgender Versuchsaufbau:
Die Einzelansätze wurden nun für dreißig Minuten in einem 37°C warmen Schüttelwasserbad inkubiert, indem die Zellen auf die hinzugefügten Substanzen reagieren konnten. Dann wurde die Stimulation mit 600 µl 4°C kaltem PAG-CM beendet. Durch anschließendes zehnminütiges Zentrifugieren bei 250g konnten die Überstände mit dem freigesetztem Histamin gewonnen werden. Bis zur Messung wurden sie bei –20°C verwahrt.
Der Histamingehalt wurde mit der automatisierten fluorometrischen Methode nach Siraganian[
90] bestimmt. In der Probe wird das Histamin durch organische und anorganische Lösungsmittel extrahiert, um dann mit o- Phthaldialdehyd (OPDA) versetzt zu werden. Die Reaktion zwischen dem OPDA und dem Histamin findet bei stark basischem pH statt und das eigentlich fluoresziernde Reaktionsprodukt wird erst bei einem pH von kleiner als zwei gebildet. Es folgt eine Anregung mit Wellenlängen zwischen 355 und 360 nm, worauf die Fluoreszenz bei 450 – 460 nm gemessen werden
Durch den vorherigen Histaminversuch konnten für die drei Bestrahlungsarten Dosen ermittelt werden, die einen gleichermaßen inhibitorischer Effekt der anti-IgE Stimulation erzielten. Die Mastzellen wurden also für die anschließenden Versuche folgendermaßen bestrahlt:
Die unbestrahlte Kontrollpopulation für die UVB und UVA-1 behandelten Zellen wird als Sham (engl.:Täuschung, Betrug) bezeichnet. Für eine zweite Kontrolle wurden unbestrahlte Mastzellen mit 8-Methoxypsoralen inkubiert, um sie mit PUVA-1 bestrahlten Zellen vergleichen zu können.
Zunächst ist auf die Randbedingung hinzuweisen, dass mit Zellkonzentrationen von 8 x 105 bis 1 x 106 Mastzellen pro ml gearbeitet wurde.
Pro Ansatz wurde ein Drittel der Mastzellsuspension im Verhältnis von 1:1 mit anti-IgE (1:10 000) stimuliert; zu den restlichen zwei Dritteln wurde ebenfalls im Verhältnis von 1:1 der Puffer PAG-CM hinzugefügt. Anschließend fand eine Aufteilung der mit PAG-CM behandelten Zellen in zwei gleich große Fraktionen statt. Von diesen wurde eine für den Complete im dreimaligen Wechsel langsam eingefroren und wieder aufgetaut.
Ebenfalls in 3 x 50µl Portionen wurde der Complete in je einer 1:10 er Verdünnung (entspricht in diesem Versuchsaufbau der Mediatormenge, die von 5 x 103 MC freigesetzt wird) und einer 1:20 er Verdünnung (2,5 x 103 MC) auf die Platte aufgetragen (s. Abb. 4).
Zu den 50µl Proben wurden 150µl Tryptasemeßpuffer und 20µl Tryptase Substrat hinzugefügt. Die sich nun im 90 Sekunden Takt anschließenden Messungen im Dynex MRX 96 well-Platten-Photometer wurden bei 37°C durchgeführt. Bei dieser Zeitkinetik korreliert die Tryptasekonzentration in den Proben mit der Umsetzungsgeschwindigkeit des Substrates.
Das der hier verwendeten Absorptionsphotometrie zugrundeliegende liegende Prinzip basiert im wesentlichen auf zwei Punkten. Zum einen können schon kleinste Mengen
(E = Extinktion, I = Lichtintensität des austretenden geschwächten Lichtes, I° = eingesetzte Lichtintensität, ε = Absorbtionskoeffizient, c = Konzentration des absorbierenden Stoffes, d = Schichtdicke)
Um mögliche Störfaktoren im höheren Maße zu vermeiden, wurden für die Bestimmung der Zytokine mittels ELISA (enzyme–linked immuno sorbent assay) ausschließlich hoch aufgereinigte Mastzellen verwendet.
Nach der Bestrahlung wurden die Mastzellen für 24 Stunden bei 37°C und fünfprozentiger Kohlendioxidatmosphäre verwahrt, um dann die basale Freisetzung von IL.6, IL-8 und TNF-α in dieser Zeit untersuchen zu können. Das anschließende Zentrifugieren bei 250g und 4°C ermöglichte, dass die hierbei gewonnenen Überstände unter Berücksichtigung der Zellzahlen auf die 96- well- Mikrotiterplatte des jeweiligen Immunoassays pipettiert werden konnten. Jedes Well dieser Platte ist vorbeschichtet mit einem monoklonalen Antikörper, spezifisch gegen das zu bestimmende Zytokin.
Um potentielle Fehler durch Einzelmessungen ausschließen zu können, bestand in diesem Versuchsaufbau jede Messung aus einer Doppelbestimmung. Der hieraus gebildete Mittelwert wurde schließlich als eigentlicher Messwert protokolliert.
Die für diesen Versuch benötigten aufgereinigten Mastzellen wurden 24 Stunden nach der Bestrahlung mit anti- IgE (1 :10 000) stimuliert oder mit PAG- CM inkubiert. So konnten zum einen bestrahlte und unbestrahlte und zum anderen stimulierte und unstimulierte Mastzellen in Bezug auf ihre CD 63 und CD107a Oberflächenexpression untersucht werden. Nach der Stimulation wurden die 1 105 Zellen pro Ansatz gewaschen, um anschließend mit 100µg/ml mouse gamma globulin in PBS und 20prozentigem AB Serum bei 4°C für 15 min inkubiert werden zu können. So wurden unspezifische Bindungen blockiert und auf ein erneutes Waschen der Mastzellen konnte die Inkubation mit FITC-konjugierten monoklonalen Antikörpern für 30 min bei 4°C erfolgen. Außer dieser monoklonalen Antikörper: CD 63 (cloneCLBGran/12) und CD107a (clone H4A3) wurde zur Kontrolle ein IgG1 Antikörper eingesetzt. Die Analyse
Die Durchflusszytometrie auch Fluorescence-activated-cell-sorting (FACS-Analyse) genannt, ist ein fluoreszenzoptisches Verfahren zur Epitopdetektion von Rezeptormolekülen auf Einzelzellniveau[ 91]. Dieses wird ermöglicht durch Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe gekoppelt sind. Es folgt eine Anregung durch Laserlicht und die emittierten Fluoreszenzsignale werden von Photonenverstärkern empfangen. Sie werden von einem angeschlossenen Rechner verarbeitet und als event auf dem Monitor dargestellt. Dadurch ist eine Zellanalyse, um phänotypische Befunde zu liefern, in sicherer und schneller Weise möglich.
Um die untersuchten Ergebnisse auf statistische Signifikanz zu untersuchen, wurde der verteilungsfreie Rangsummen-Test für zwei verbundene Variablen nach Wilcoxon eingesetzt. Dieser nicht parametrische Test überprüft die Hypothese, dass beide Stichproben dieselbe Verteilung haben, und beruht auf der Rangordnung der Absolutwerte der Differenzen zwischen den beiden Stichproben, ohne eine Aussage über die Form der Verteilung zu machen. Es wurde definiert, dass ein p-Wert ≤ 0,05 als signifikant und ein p-Wert ≤ 0,01 als hoch signifikant bezeichnet werden kann. Der Wilcoxon-Test fand bei der Untersuchung der stimulierten und nicht stimulierten Histaminfreisetzung, der Tryptaseausschüttung, sowie bei der basalen Freisetzung von IL-6, IL-8 und TNF-α Verwendung.
Die Mastzellstimulation kann durch zahlreiche Substanzen und auf unterschiedlichste Art und Weise erfolgen. Bei der anti-IgE Stimulation spielt der tetramerische hochaffine IgE Rezeptor FcεRI eine Schlüsselrolle. Auch Neuropeptide wie Substance P sind in der Lage Mastzellen zu aktivieren. Bei den durchgeführten Untersuchungen wurde eine Substance P (SP) Konzentration von 30µM eingesetzt. Bei der Stimulation mit anti-IgE ergab sich eine durchschnittliche Netto-Histaminfreisetzung von 30,1% des Gesamthistamingehaltes beziehungsweise von 8,9% bei Substance P Stimulation.
Die dermalen Mastzellen wurden mit verschiedene Dosen von UVB (Abb. 6), UVA-1 (Abb. 7) und PUVA-1 (Abb. 8) bestrahlt, um die Auswirkungen von UV Licht unterschiedlicher Intensität zu testen.
Es zeigte sich bei allen drei Bestrahlungsarten 24 Stunden nach Bestrahlung eine signifikante, dosisabhängige Inhibierung der anti-IgE induzierten Histaminfreisetzung. In stetiger Weise verringerten die bestrahlten Mastzellen ihre Fähigkeit nach anti-IgE Stimulation Histamin freizusetzen, so dass eine maximale Hemmung bei maximaler Bestrahlungsdosis erzielt wurde. Bei der UVA-1 Bestrahlung wurde die Hemmung am deutlichsten. Setzten die unbestrahlten Mastzellen noch 31,6% ihres Gesamthistamingehaltes frei, so wurden nach einer Bestrahlungsdosis von 25 J/cm² nur noch 1,5% ausgeschüttet. Die Mastzellen reduzierten folglich ihre Histaminfreisetzung um 95,3%. Bei der UVB(100mJ/cm²) und PUVA-1(5J/cm²) Bestrahlung ist die Inhibierung mit 81,1% (von 30,2% bei unbestrahlten MC auf 5,7% bei 100mJ bestrahlten MC) und 71,5% (von 28,4% auf 8,1%)zwar ebenfalls deutlich, aber weniger potent.
Ferner konnten Bestrahlungsdosen aller drei Bestrahlungsarten ermittelt werden, die eine ähnlich inhibitorische Wirkung auf die anti-IgE induzierte Histaminausschüttung aufwiesen. So wurde nach 75 mJ/cm² UVB Bestrahlung nur noch 24,3% (Inhibierung: 75,7%), nach 15 J/cm² UVA-1 Bestrahlung 25,6% (Inhibierung: 74,38%) und nach 5
Für die Substance P stimulierten Mastzellen ergab sich ein anderer Zusammenhang. Bei der UVB und PUVA-1 Bestrahlung konnte keine signifikante Veränderung der Histaminausschüttung festgestellt werden (s. Abb. 6 und 8). Durch die UVA-1 Bestrahlung hingegen wurden die SP induzierte Histaminfreisetzung der Mastzellen in stetiger und dosisabhängiger Weise inhibiert (s. Abb. 7). Wurde durch Substanz P Stimulation bei unbestrahlten Mastzellen noch 7,9% des Gesamthistamingehaltes freigesetzt, so waren es nach maximaler Bestrahlungsdosis nur noch 1,4%. Dies entspricht einer 82,3 prozentigen Inhibierung.
Es zeigte sich also, dass die UVA-1 Strahlung im Gegensatz zu UVB und PUVA-1 sowohl die anti-IgE wie auch die SP stimulierte Histaminausschüttung hemmen konnte.
Bestrahlung mit UVB – Stimulierte Histaminfreisetzung
Die Mastzellen wurden mit UVB bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 11 Versuchen. **p = 0,003
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)
Die Mastzellen wurden mit UVA-1 bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 10 Versuchen. *p = 0,022; **p ≤ 0,007.
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)
Bestrahlung mit PUVA-1 – Stimulierte Histaminfreisetzung
Die Mastzellen wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml 8-MOP) und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 9-8 Versuchen. *p = 0,028; **p = 0,008.
(die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)
Im Gegensatz zu der reduzierten stimulierten Mediatorausschüttung verursachte das UV Licht im untersuchten Dosisbereich eine hochsignifikante Zunahme der spontanen Histaminfreisetzung. So stieg innerhalb der ersten 24 Stunden nach UVB Bestrahlung die Mediatorfreisetzung um 56,15%, nach UVA-1 um 52,75% und nach PUVA-1 um 60,90%.
Die nicht stimulierte Histaminfreisetzung
Die MC wurden mit UVB (0 und 75mJ/cm²), UVA-1 (0 und 15J/cm²) und PUVA-1 (0 und 5 J/cm², 500 ng/ml) bestrahlt und die Histaminfreisetzung in Bezug zum Gesamthistamingehalt wurde 24 Stunden später ermittelt. Darstellung von MW und SEM. Zahl der Versuche: UVB: 11, UVA-1: 10 und PUVA-1: 9; **p < 0,01
Im vorherigen Versuch wurde die Inhibierung der anti-IgE induzierten Histaminfreisetzung durch UV Licht festgestellt. Zum Vergleich dieser Daten wurde im Folgenden untersucht, ob 24 Stunden nach UV Bestrahlung eine ähnlich inhibitorische Wirkung auf die anti-IgE provozierte Tryptasefreisetzung eintritt. Die Tryptase wurde aus folgendem Grund gewählt. Sie ist, wie auch Histamin zum einen in sekretorischer Granula gespeichert und zum anderen ein spezifischer Marker für die Mastzellstimulation.
Für die UVB Bestrahlung wurde eine Dosis von 75 mJ/cm², für UVA-1 von 15 J/cm² und für PUVA-1 von 5 J/cm² gewählt, weil sie näherungsweise ein äquivalentes Potential hinsichtlich der Reduktion der stimulierbaren Histaminfreisetzung gezeigt hatten.
Unbestrahlte, anti-IgE stimulierte Mastzellen setzten bei Präinkubation mit 8-Methoxypsoralen 17,2 beziehungsweise ohne Vorbehandlung 18,6% Tryptase frei. Die alleinige Behandlung der Zellen mit dem Photosensibilisator 8-MOP scheint keinen Einfluss auf die Tryptasefreisetzung zu haben, denn zwischen 17,2 und 18,5 besteht kein signifikanter Unterschied.
Nach UVB Bestrahlung reduzierte sich die anti-IgE induzierte Tryptasefreisetzung signifikant, auf 11,4%. Dies entspricht einer Inhibierung um 38,7% und ist damit ähnlich deutlich, wie die nach UVA-1 Bestrahlung. Sie belief sich in diesem Ansatz auf 39,2%, denn verglichen mit den freigesetzten 18,6% aus der Kontrollpopulation, wurden hier lediglich 11,3% Tryptase auf den anti-IgE Stimulus hin ausgeschüttet. Etwas deutlicher reagierten die mit PUVA-1 bestrahlten Mastzellen, denn sie konnten nur noch 8,9% der Serinprotease freisetzen. Verglichen mit den 8-Methoxypsoralen vorbehandelten Mastzellen, die auf den gleichen Stimulus mit anti-IgE noch 17,2% abgaben, entspricht dies einer Inhibierung um 48,1% (s. Abb. 10).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass sich für die drei Bestrahlungsarten eine signifikante Inhibierung der anti-IgE induzierten Tryptasefreisetzung zeigen ließ.
Die MC wurden mit 75 mJ/cm² UVB, 15 J/cm² UVA-1 und 5 J/cm² PUVA-1 bestrahlt und die Tryptasefreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. Für PUVA-1 und 8-MOP gilt + 500ng/ml 8-Methoxypsoralen. Sham und 8-MOP sind unbestrahlte Kontrollen. MW und SEM aus 7-9 Versuchen. *p = 0,018; **p=0,008.
Es wurden humane dermale Mastzellen (1 x 106 MC pro ml) mit UV Licht bestrahlt, um 24 Stunden später die basale Freisetzung der Interleukine-6 und –8 sowie des Tumornekrosefaktors-α bestimmen zu können. Auch bei diesem Versuch wurden für die drei Bestrahlungsarten Dosen ausgewählt, mit annähernd gleichen inhibitorischen Effekten bezüglich der Histaminausschüttung ( s. Kapitel 3.2.6).
Die unbestrahlten Mastzellkontrollen gaben durchschnittlich 220,7 pg/ml beziehungsweise bei Präinkubation mit 8-MOP 219,1 pg/ml Interleukin-6 ab. Wurden die Zellen mit UVB Licht bestrahlt, so setzten sie im Laufe der 24 Stunden 86,6 pg/ml des Zytokins frei, was verglichen mit der Kontrolle nur noch 39,2% sind und einer Inhibierung um 60,8% entspricht. Um 66,9% inhibiert wurden die Zellen nach Behandlung mit PUVA-1 Licht, denn sie schütteten lediglich 72,6 pg/ml des hier untersuchten Interleukins aus. Am deutlichsten jedoch war das Resultat bei der UVA-1 Bestrahlung, da die Zellen um 82,3% ihre Fähigkeit der basalen Freisetzung von IL-6 einbüßten und nur 39,2 pg/ml abgaben (s. Abb. 11).
Verglichen mit den Interleukin-6 Daten ergab sich bei der Untersuchung des Interleukins-8 ein recht ähnliches Bild. Denn auch hier zeigten sich die inhibitorischen Auswirkungen des UV Lichtes. So setzten die Mastzellen in den 24 Stunden nach der UVB Bestrahlung nur 1244,7 pg/ml des Zytokins frei, was verglichen mit den 2953,2 pg/ml aus der unbestrahlten Kontrolle einer Inhibierung um 57,9% gleichkommt. Am deutlichsten wurden die Auswirkungen wieder bei der UVA-1 Bestrahlung, denn die Zellen waren nicht in der Lage mehr als 21,4%, dies entspricht absolut 632,3 pg/ml, des Interleukins 8 abzugeben. Durch die PUVA-1 Bestrahlung verminderte sich die basale Ausschüttung um 73,3% und zeigte so einen ebenfalls signifikanten Unterschied verglichen mit den 8-MOP vorbehandelten und unbestrahlten Mastzellen (s. Abb. 12).
Bei der Untersuchung der 24-stündigen basalen Freisetzung des Tumornekrosefaktors-α fielen zweierlei Dinge auf. Zum einen bewegte sich die Ausschüttung dieses Zytokins, verglichen mit den untersuchten Interleukinen auf einem sehr niedrigen Niveau um 6 pg/ml. Zum anderen unterlag diese geringe Menge an sezerniertem TNF-α nur gering-
Basale Interleukin – 6 Freisetzung
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028.
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028
Basale Tumornekrosefaktor - α Freisetzung
Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte TNF-α Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen.
Die Rezeptoren CD107a und CD 63 gehören zu der Gruppe der LAMPs (lysosome - associated membrane proteins) und befinden sich auf Lysosomen und Mastzellgranula. Sie sind bei der Degranulation, also während der Verschmelzung von Mastzell- und Vesikelmembran auf der Mastzelloberfläche verstärkt nachweisbar.
An dieser Stelle wurde untersucht, inwiefern UV Licht einen Einfluss auf die anti-IgE induzierte vermehrte Expression der Moleküle CD 107a und CD63 hat. Die Versuche wurden fünfmal wiederholt und zeigten jeweils nahezu gleiche Resultate. Exemplarisch seien die folgenden Abbildungen aufgelistet.
Auf der Abb. 16 erkennt man das nur wenige, im Mittel 10±1,1% der unbestrahlten und unstimulierten Mastzellen den Rezeptor CD 107a (LAMP-1) auf ihrer Oberflächenmembran exprimieren (graue Kurve). Nach Stimulation mit anti-IgE entstehen zwei Populationen, von denen eine nach wie vor nur in geringer Weise CD 107a zeigt und eine zweite größere Gruppe von durchschnittlich 53±7,3%, die vermehrt das Oberflächenmolekül aufweist (schwarze Kurve). Gleiches Phänomen, also das nach Stimulation mit anti-IgE die Oberfläche der MC intensiver mit CD 107a besetzt ist, lässt sich auch bei den mit 8-MOP präinkubierten Zellen feststellen (s. Abb. 14). So wurden bei durchschnittlich 39±1,7% der MC (anti-IgE stimuliert versus nicht stimuliert) der anti-IgE induzierte Anstieg von CD 107a deutlich.
Diese beiden Kontrollen werden nun mit den bestrahlten Zellen verglichen. Zunächst ist darauf hinzuweisen, dass eine leicht erhöhte basale Expression von LAMP-1 bei UVB und PUVA-1 und eine stark erhöhte basale Expression bei UVA-1 demonstriert werden konnte. Im Einzelnen waren dies für UVB 16±2,5%, für PUVA-1 24±2,1% und für UVA-1 50±6,2% (s. graue Kurven der Abbildungen 17, 15, 18).
Nach Stimulation mit anti-IgE lässt sich für 11±2,8% (anti-IgE stimuliert versus nicht stimuliert) bei UVB, für 10±3,1% bei UVA-1 und für 13±2,6% bei PUVA-1 die Nachweisbarkeit von CD107a zwar noch zusätzlich zur basalen Expression steigern (s. schwarze Kurven der Abbildungen 17, 18, 15), bei weitem jedoch nicht in dem Ausmaße wie bei den unbestrahlten Zellen (sham: 43±6,2% und 8-MOP: 39±1,7%).
Die Oberflächenexpression von CD107a auf humanen dermalen MC
Die MC wurden mit 8-MOP (500ng/ml) präinkubiert und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit PUVA-1 (500ng/ml) bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Bedingt durch die Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 steigt die basale Expression von CD63 auf der Mastzelloberfläche. Die auf den anti-IgE Stimulus folgende Hochregulation des Moleküls wird durch die UV Bestrahlung inhibiert, was sich graphisch durch das Angleichen der beiden Kurven zeigt. (s. Abb. 22, 23 und 20)
Die MC wurden mit 8-MOP präinkubiert (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.
Die Histaminfreisetzung
Die Untersuchung der anti-IgE induzierten Histaminfreisetzung bei humanen dermalen Mastzellen ergab nach Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 eine dosisabhängige und hochsignifikante Inhibition.
Es wurde zusätzlich die dosisabhängige und signifikante Inhibition der Substanz P stimulierten Histaminfreisetzung nach UVA-1 Bestrahlung aufgezeigt.
Des weiteren wurde festgestellt das nach Bestrahlung mit UVB und PUVA-1 keine signifikante Abweichung der Substanz P induzierten Histaminausschüttung verglichen mit den unbestrahlten Kontrollen stattfindet.
Die nicht stimulierte Histaminfreisetzung stieg bei jeweils äquivalenter Bestrahlungsdosis (UVB: 75 mJ/cm², UVA-1: 15 J/cm², PUVA-1: 5 J/cm²) in hochsignifikanter Weise an.
Die Tryptasefreisetzung
Analog zu der Histaminfreisetzung wurde der ebenfalls präformiert vorliegende Mediator Tryptase in seiner anti-IgE induzierten Ausschüttung signifikant sowohl nach UVB und UVA-1 als auch nach PUVA-1 Bestrahlung inhibiert.
Die Modulation der IL-6, IL-8 und TNF- α Freisetzung
Eine signifikante Abnahme der basalen Freisetzung von Interleukin-6 konnte durch die Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 erzielt werden.
Gleiches Resultat, also ebenfalls eine signifikante Inhibierung ergab sich für das Interleukin-8.
Zudem erwiesen sich die gemessenen Werte der basalen Freisetzung als äußerst gering.
Die Expression von CD107a und CD63
●Die Stimulation der humanen dermalen Mastzellen mit anti-IgE führt zu einer vermehrten Oberflächenpräsenz von CD63 und CD107a verglichen mit der basalen Expression.
Ferner ließ sich zeigen, dass die basale Expression der Oberflächenrezeptoren CD107a und CD63 nachweisbar bei UVB, PUVA-1 und besonders deutlich bei UVA-1 Bestrahlung ansteigt.
●Durch Bestrahlung mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 konnte die anti-IgE induzierte Mehrexpression von CD 107a und CD 63 deutlich reduziert werden.
Es sind unterschiedlichste Effekte von UV Licht auf menschliche Zellen bekannt. So wurde in bisherigen Studien berichtet, dass UV Bestrahlung pro- oder antiinflammatorische Effekte im Bereich der Haut, insbesondere durch die Beeinflussung von Keratinozyten, Melanozyten, Fibroblasten und Leukozyten, bewirken kann. Beispielsweise wird von UV Licht induzierter IL-10[ 92] und IL-6[ 93, 94] Freisetzung bei Keratinozyten und von UVA-1 verursachten oxidativen Schäden an Lipiden und Proteinen bei Fibroblasten[ 82] berichtet. Auch eine UVA-1 induzierte Apoptose von dermalen Fibroblasten ist bekannt[ 95].
Die Einsatzmöglichkeiten von UV Licht bei Hauterkrankungen haben sich als äußerst vielfältig erwiesen. So findet allein die PUVA-1 Therapie bei Psoriasis vulgaris, Psoriasis pustulosa, Lichen ruber planus, Mycosis fungoides und Urticaria pigmentosa seine Anwendung. Die einzelnen Wirkmechanismen des UV Lichtes, die genauen Ursachen für den therapeutischen Nutzen beziehungsweise die Unterschiede zwischen den einzelnen Bestrahlungsarten sind verglichen mit der routinemäßigen und täglichen Anwendung der Phototherapie überraschend wenig für humane dermale Mastzellen erforscht.
Bisherige Studien befassten sich größtenteils mit der Untersuchung von Ratten abstammender Mastzellen oder mit den zur Verfügung stehenden Mastzelllinien. Solche Zellen, wie beispielsweise die der HMC-1 Mastzelllinie (leukämische Mastzellen) weisen hinsichtlich ihrer Stimulierbarkeit und ihres Zytokinprofils Parallelen im Verhalten mit den menschlichen Mastzellen auf. Allerdings zeigen sie auch gravierende Unterschiede. So verfügen sie über ein hohes proliferatives Potential, mit der daraus resultierenden permanenten Zellteilung. Eine Eigenschaft die bei den reifen humanen Mastzellen in dem Ausmaße nicht zu finden ist. Aus diesem Sachverhalt ergeben sich Unterschiede in dem Apoptoseverhalten bei UV Bestrahlung. Denn anders als die apoptosefreudigen, unreifen, leukämischen Mastzellen (HMC-1), gelten die ausdifferenzierten, menschlichen Mastzellen als äußerst langlebig und strahlenresistent, so dass ihr Zelluntergang während der Phototherapie unwahrscheinlich ist. Das dieses Verhalten der HMC-1 Zellen von der Teilungsrate und nicht von dem leukämischen Status
Ist die Apoptose bei den reifen Mastzellen eher vernachlässigbar, so wird die Inaktivierung, das heißt die verminderte Mediatorfreisetzung um so bedeutender, für die Erklärung therapeutischer Erfolge mit UV Licht. Ein ähnliches Angriffsmuster findet sich bei weiteren Therapiemaßnahmen. Antiallergika (wie zum Beispiel Cromoglycinsäure und Oxatomid) auch Mastzellstabilisatoren genannt, hemmen die Freisetzung von Entzündungsmediatoren aus Mastzellen. Sie werden wegen ihrer begrenzten Wirksamkeit allerdings nur in der topischen Therapie bei Erkrankungen aus dem allergischen Formenkreis eingesetzt. Antihistaminika wie beispielsweise Dimetinden (Fenistil), Fexofenadin (Telfast) und Cetericin (Zyrtec) hemmen die Wirkung des Histamins durch reversible Blockade der H1- Rezeptoren. Damit können sie sinnvoll gegen Urtikaria, allergische Rhinitis, atopische Dermatitis, Pruritus und Prurigo eingesetzt werden. Auch die in der Dermatologie häufig verwendeten Glukokortikoide wirken antientzündlich, allgemein immunsupprimierend sowie antiproliferativ und induzieren ebenfalls keine Apoptose.
Die Erforschung der Einwirkungen des UV Lichtes auf die Mediatorfreisetzung der dermalen Mastzellen macht unter dem Gesichtspunkt der therapeutischen Relevanz für die Fülle an Erkrankungen durchaus Sinn.
Das Histamin gilt als der wohl prominentester Vertreter aus der Gruppe der Mastzellmediatoren. Es liegt bereits präformiert in der Granula gespeichert vor und kann nach Exozytose an H1- und H2- Rezeptoren sowie an sensible Nervenendigungen binden, um so zu einer Senkung des Blutdruckes, einer Erweiterung und Erhöhung der Durchlässigkeit der Blutgefäße, einer Erregung der glatten Darmmuskulatur, einer Kontraktion der Bronchien, einer Herzfrequenzsteigerung und einer Steigerung der Magensekretion führen[ 39].
Diese Freisetzung von Histamin kann auf unterschiedlichste Art und Weise getriggert werden. Typische Stimuli der Mastzelle sind Immunglobuline (Immunglobulin E), Neuropeptide (Substanz P, Neuropeptid Y), Zytokine (Stem cell factor) und
Bei der Stimulation mit Immunglobulinen, die beispielsweise bei der spezifischen Sensibilisierungsphase der Typ-1-Sofortreaktion gebildet werden, spielen die Fc-Rezeptoren eine herausragende Rolle. IgE bindet an FcεR und durch multivalente Antigene oder Antikörper gegen dieses Immunglobulin findet eine Quervernetzung auf der Oberfläche der Mastzelle statt. Es folgt eine Signalkaskade an deren Ende eine intrazelluläre Calciumkonzentrationserhöhung und damit eng verbunden eine Sezernierung der Mediatoren steht[ 37].
Bei der nicht-immunologischen Stimulation der Mastzelle durch Substanz P ist der genaue molekulare Mechanismus noch Gegenstand der aktuellen Forschung. Außer Frage steht, dass Substanz P prinzipiell eine Degranulation der Mastzelle provozieren kann[ 99]. Studien haben gezeigt, dass das Neuropeptid eine maximale histaminfreisetzende Wirkung bei einer Konzentration von 30µmol/l hat. Aber schon ab einer Konzentration von 5 pmol/l ist eine elektrophysiologische Erregung der Mastzelle feststellbar, so dass nach mehrmaliger Wiederholung dieser Stimulation eine Freisetzung von Mediatoren stattfindet[ 100]. Bei Nagetier-Mastzellen und auch bei der Rattenmastzelllinie RBL-2H3 konnte ein pertussistoxin-sensitiver G-Protein gekoppelter Neurokininrezeptor (NK-Rezeptor) festgestellt werden[ 101]. Insbesondere der NK-1-Rezeptor ließ sich durch Substanz P Dosen im mikromolaren Bereich aktivieren, so dass eine Mastzellaktivierung resultierte[ 102-104]. Da sich ein vergleichbarer Rezeptor auf humanen Mastzellen noch nicht nachweisen ließ, wird derzeit beim Menschen eine rezeptorunabhängige direkte G-Protein Aktivierung diskutiert[ 105-108]. Es liegt die Vermutung nahe, dass die Strukturformel von Substanz P mit der speziellen Anordnung einer basischen NH2-Gruppe direkt neben der hydrophoben COOH-Gruppe hierbei eine Schlüsselposition einnimmt[ 36]. So konnte mit einer synthetisch hergestellten Hybridtetrapeptidvariante eine fünfzigfach potentere Histaminfreisetzung erzielt werden, verglichen mit dem natürlich vorkommendem Substanz P.
Hier ergab sich, dass unbestrahlte anti-IgE stimulierte Mastzellen eine durchschnittliche Netto-Histaminfreisetzung von 30,1% zeigten, die nach Bestrahlung dosisabhängig und signifikant verringert wurde. So konnte, nach jeweils maximaler Bestrahlungsdosis, durch UVB Licht eine Inhibierung der Histaminausschüttung um 81,1% durch PUVA-1 um 71,5% und durch UVA-1 sogar um 95,3% erzielt werden. Zeigte sich für die anti-IgE induzierte Mediatorfreisetzung nach Bestrahlung ein zumindest tendenziell einheitlich inhibitorisches Bild, so ergab sich für die Substanz P Untersuchungen ein differenzierterer Zusammenhang. Unbestrahlte dermale Mastzellen gaben netto, auf den Substanz P Stimulus hin, 8,9% vom Gesamthistamingehalt frei. Nach Behandlung mit UVB und PUVA-1 büßten die MC nicht ihre Fähigkeit ein auf den Substanz P Reiz adäquat zu reagieren und schütteten ähnlich viel Histamin aus, wie die unbestrahlten Zellen. Anders bei der UVA-1 Bestrahlung; hier konnte nach maximaler Dosis eine signifikante Inhibierung der Histaminfreisetzung um 82,3% beobachtet werden.
Das unterschiedliche Verhalten der Mastzellen bezüglich der Stimulation ist wahrscheinlich auf die unterschiedlichen Wirkmechanismen der verwendeten Strahlungsarten zurückzuführen.
Durch UVB und PUVA-1 Behandlung werden bei humanen Mastzellen in erster Linie Störungen auf DNA-Ebene induziert. So kann UVB Licht aufgrund seiner Wellenlänge von der DNA absorbiert werden und sie daher direkt und unmittelbar schädigen[
109, 110]. Durch die PUVA-1 Therapie kommt es zur Ausbildung sogenannter Photoaddukte zwischen den Pyrimidinbasen der DNA und aktiviertem 8-Methoxypsoralen[
85, 86]. Daraus resultiert eine verzögerte und fehlerhafte Ablesung des Doppelstranges, was in einer Änderung von Quantität und Qualität der Transkripte münden kann. Zusammenfassend sind dieses Störungen der Zellhomöostase auf DNA-Ebene von
Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies wie Singulett-Sauerstoffe und Hydroxylradikale wird durch das längerwellige UVA-1-Licht angeregt. Sie können an zahlreichen Punkten im Stoffwechsel der Zelle Störungen hervorrufen. So können Auswirkungen auf die verschiedenen Membranen durch Oxidation von ungesättigten Fettsäuren genauso beobachtet werden, wie Strukturveränderungen diverser Proteine[ 82-84]. Es werden wichtige Enzyme durch oxidative Modifikationen in ihrer Funktion beeinträchtigt und verstärkt dem Abbau durch Proteasomen-Komplexe zugeführt. Zwar sind Läsionen der DNA auch bei dieser Bestrahlungsform nicht gänzlich auszuschließen, sie sind aber definitiv nicht vordergründig.
Die Sauerstoffradikale sind extrem reaktionsfreudig und beginnen innerhalb von Sekunden bis Minuten die oxidativen Veränderungen an Proteinen und Membranen zu provozieren. Nun sind die meisten menschlichen Zellen diesen schädigenden Einflüssen nicht völlig schutzlos ausgeliefert. So besitzen sie Verteidigungsmechanismen wie beispielsweise Hitzeschockptroteine und Radikalfänger. Man kann davon ausgehen, dass auch humane Mastzellen aus diesem Arsenal einiges zur Verfügung steht[
73, 111, 112]. Jedoch können die hohen Bestrahlungsdosen von bis zu 25J/cm2 zu einer Überbelastung der Schutzmechansimen führen, was einen zumindest temporären Totalausfall der Zelle zu Folge hat. Für die Funktionslosigkeit der Zelle sprechen die drastische Inhibierung der anti-IgE und SP induzierten Histaminausschüttung nach maximaler UVA-1 Bestrahlung. Das es sich hierbei um einen reversiblen Effekt handelt, die Mastzellen sich also zu einem gewissen Teil von der Belastung wieder erholen können zeigen Untersuchungen aus unserer Arbeitsgruppe, in denen nach 48 beziehungsweise nach 72 Stunden wieder vermehrt Histamin ausgeschüttet wurde. An dieser Stelle ist es lohnenswert, auf die im Rahmen der PUVA-1 Behandlung entstehenden Sauerstoffspezies einzugehen. Denn auch bei dieser Bestrahlungsform wird das UVA-1 Licht eingesetzt. Allerdings in einer wesentlich geringeren Dosis (maximal 5J/cm2), so dass die Exposition der Zellen weitaus kürzer ist und die Bildung der Radikale nur auf niedrigem Niveau vollzogen wird. Die Schutzmechanismen werden bei weitem nicht in dem Maße überfordert, wie
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass eine Beeinflussung der verschiedenen Funktionen der bestrahlten Zellen wahrscheinlich auf eine Fülle unterschiedlicher kleinerer und größerer Modifikationen im komplexen Zusammenspiel der einzelnen Stoffwechselprozesse zurückzuführen ist.
Die Serinprotease Tryptase wird fast ausschließlich in Mastzellen exprimiert. Sie liegt in enzymatisch aktiver Form in der sekretorischen Granula bereit, wobei ihre Aktivität durch die Kombination von saurem pH, hoher Histaminkonzentration und hoher Konzentration von divalenten Kationen reguliert wird. Gemeinsam mit anderen Mediatoren wie Histamin wird sie während der Mastzelldegranulation in den Extrazellulärraum freigesetzt.
Bisherige in vitro Studien konnten belegen, dass Tryptase neben einer Bedeutung für die klassischen mastzellassoziierten Erkrankungen eine Funktion als Mediator bei weiteren Entzündungsreaktionen sowie bei dem Auf- und Umbau von Gewebe hat. Tryptase gilt außerdem als spezifischer Marker für die Aktivierung von Mastzellen. So ist die Konzentration der beim Gesunden kontinuierlich, in geringen Mengen ins Blut sezernierten Tryptase offensichtlich proportional zu der Anzahl im Körper zirkulierender Mastzellen. Die Konzentration der Protease steigt bei Krankheiten wie dem allergischen Asthma, der allergischen Rhinitis, dem Atopischen Ekzem, der Urtikaria, der Psoriasis, dem Lichen ruber planus, dem nummulären Ekzem, den Mastozytosen, den interstitiellen Lungenerkrankungen, der Multiplen Sklerose und bei Autoimmunerkrankungen, wie dem Bullösen Pemphigoid und dem Pemphigus vulgaris. Nicht nur unter diesem Aspekt schien es sinnvoll die anti-IgE induzierte Tryptasefreisetzung in Abhängigkeit von den drei Bestrahlungsarten zu erforschen.
Es wurde nun nach den vorangegangenen Versuchen, bei denen sich eine signifikante und dosisabhängige Inhibierung der anti-IgE induzierten Histaminausschüttung darstellen ließ mit ähnlichen Ergebnissen bezüglich der Tryptasefreisetzung gerechnet. Schließlich weisen beide Mediatoren prinzipiell viele Gemeinsamkeiten auf (siehe unten).
Aber auch sonst harmonieren die ermittelten Tryptasewerte gut mit den Histamindaten. Während beider Versuchabläufe hat sich gezeigt, dass eine UV Licht induzierte Inhibierung der stimulierten Mediatorausschüttung stattfindet. Aufgrund der prinzipiellen Gemeinsamkeiten von Histamin und Tryptase, beide liegen präformiert in der Mastzellgranula vor, beide werden in der ersten Phase der Mediatorfreisetzung ausgeschüttet und beide unterliegen dem Einfluss der anti-IgE Stimulation, ist das ähnliche Freisetzungsverhalten der bestrahlten MC bezogen auf Histamin und Tryptase gut nachzuvollziehen.
Neben den bereits präformiert in Sekretgranula vorliegenden Mediatoren gehören auch Zytokine zu den Botenstoffen der Mastzelle. Diese in der Spätphase also innerhalb von Stunden freigesetzten Mediatoren umfassen die Interleukine 4, 5, 6 und 8, den Fibroblast growth factor, den Vascular endothelial growth factor und teilweise den Tumornekrosefaktor-α.
Das proinflammatorische Interleukin-6 ist ein Polypeptid mit pleiotropen Funktionen. Es beeinflusst die Immunantwort, greift in den Prozess der Hämatopoese ein, fungiert als Wachstumsfaktor für verschiedene Zelllinien und als Wachstumshemmer einiger Tumorzellen.
Trotz seiner Bedeutung gibt es wenige Arbeiten, die sich mit der Freisetzung von IL-6 aus humanen dermalen Mastzellen befassen. Derzeit veröffentlichte Studien konnten zeigen, dass durch Neuropeptiden stimulierte periphere Blutmonozyten und dermale Fibroblasten mit einer gesteigerten Synthese des Mediators reagierten. Andererseits ließ sich in einer Arbeit feststellen, dass Substance P einen eher inhibitorischen Effekt auf Keratinozyten ausübte, was ihre Produktion von IL-6 betraf[ 113].
Das zu den neutrophil-spezifischen Chemokinen gehörende Interleukin-8 ist vor allem ein hochpotenter Mediator für die neutrophile Chemotaxis und spielt bei der Aktivierung entzündlicher Prozesse eine wichtige Rolle.
In bisherigen Studien ist man sich dahingehend einig, dass einer Stimulation von Mastzellen innerhalb von Stunden eine messbare Sekretion von IL-8 folgt[ 62]. Eine weitere Arbeitsgruppe, die zur Überprüfung der These, ob das Zytokin nicht bereits präformiert in der Mastzellgranula vorliegt, untersuchte den m-RNA Gehalt für Interleukin-8 in unstimulierten Mastzellen. Hier kam man zu dem Resultat, dass die entsprechende m-RNA und somit auch IL-8 kontinuierlich von den humanen dermalen Zellen gebildet wird[ 51].
TNF-α ist ein äußerst pleiotropes Zytokin. So stimuliert es die Immunantwort, moduliert Entzündungsprozesse, aktiviert katabolische Prozesse, führt zu einer Gerinnungsaktivierung und hat eine direkte zytotoxische Wirkung für einige Tumorzellen.
Zurzeit unumstritten ist, dass der Tumornekrosefaktor-α von menschlichen Mastzellen durch Stimulation innerhalb von Stunden vermehrt sezerniert wird[ 114]. Es konnte auch eine Freisetzung von TNF-α innerhalb der ersten dreißig Minuten nach der Stimulation beobachtet werden. Dieses spricht für eine zumindest teilweise Präformierung des Zytokins mit nachfolgender Speicherung in der Mastzellgranula[ 51].
In der vorliegenden Arbeit interessierte inwiefern UV Licht einen Einfluss auf die basale also unstimulierte Freisetzung dieser drei Zytokine hat.
Gaben die unbestrahlten Mastzellen innerhalb von 24 Stunden durchschnittlich 220,7 pg/ml (8-MOP: 219,1 pg/ml) IL-6 an ihre Umgebung ab, so wurde diese Freisetzung nach UVB und PUVA-1 Bestrahlung um 60,8% beziehungsweise um 66,9% inhibiert und nach UVA-1 Bestrahlung gar um 82,3%. Eine ebenso signifikante Inhibierung ergab sich bei den Versuchen zu Interleukin-8. Die von unbestrahlten Mastzellen ausgeschüttete Menge des Mediators (sham: 2953,2 pg/ml und 8-MOP: 3318,3 pg/ml) konnte nach UVB und PUVA-1 Behandlung um 57,9% beziehungsweise um 73,3% reduziert werden und nach UVA-1 sogar um 78,6%.
Wie ist dieses unterschiedliche Verhalten der Mastzelle, bezüglich der Sekretion dieser drei Zytokine zu erklären? Eine Interpretationsmöglichkeit ist, dass wie oben schon erwähnt Interleukin-8 kontinuierlich in der menschlichen Mastzelle gebildet und ebenso kontinuierlich in die Umgebung freigesetzt wird. Eine Freisetzung die ähnlich intensiv auch Interleukin-6 betrifft und dafür spricht, dass die Zytokine nicht oder nur in geringem Umfang in der Sekretgranula der Mastzelle gespeichert werden. Deswegen ist die Inhibierung der Sekretion, wenn auch von unstimulierten Mastzellen gut in Einklang zu bringen mit der verminderten anti-IgE induzierten Mehrsekretion von Histamin und Tryptase nach UV Bestrahlung. Dafür sprechen auch nachfolgende Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe. Für die beiden Interleukine konnte bezüglich ihrer innerhalb von 24 Stunden ausgeschütteten Menge demonstriert werden, dass unabhängig vom Aktivierungsgrad dermalen Mastzellen eine Suppression der Freisetzung stattfindet [ 115].
Der Tumornekrosefaktor-α wird wie in der Studie von Gibbs et al. berichtet zwar auch kontinuierlich also ohne besonderen Stimulus von der Zelle produziert, aber dann in der Mastzellgranula gespeichert. Ein wesentlicher Unterschied verglichen mit den Interleukinen-6 und -8 der erklärt, dass TNF-α in nur so geringer Weise von den unstimulierten Mastzellen an die Umgebung abgegeben wird. Denn dieser Zusammenhang deutet auf eine enge Kopplung zwischen TNF-α Ausschüttung und Stimulation der Mastzelle hin.
In weitergehenden Studien unserer Arbeitsgruppe ließ sich zeigen, dass anti-IgE induziert eine signifikant größere Menge des Zytokins freigsetzt wird. Diese beachtliche Mehrsekretion konnte wie auch schon für Histamin und Tryptase nachgewiesen durch UV Licht inhibiert werden[ 115].
CD 107a, CD 107b und CD 63 lassen sich auf Membranen von Lysosomen und lysosomenähnlicher Strukturen nachweisen, was zu der Namensgebung Lysosomen-
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Mastzellen nach anti-IgE Stimulation also nach Fusion der Granula- und Zellmembran die LAMPs eins und drei in einer höheren Dichte auf ihrer Oberfläche präsentieren. Desweiteren konnte nach Bestrahlung mit UVB, PUVA-1 und besonders nach UVA-1 ein Anstieg der basalen Expression verzeichnet werden. Im eigentlichen Mittelpunkt des Interesses ist jedoch der Zusammenhang, dass nach Einwirkung von UV Licht die der Stimulation folgende deutlichere Ausprägung von CD 63 und CD 107a auf der Mastzelloberfläche geringer ausfällt als bei den unbestrahlten Zellen. Die bei anti-IgE Stimulation vermehrt auftretende Fusion von Granula- und Zellmembran wird folglich durch UV Licht inhibiert.
Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe können sehr gut in Einklang mit den übrigen Untersuchungen gebracht werden. So kommt es durch UV Licht zu einer erhöhten spontanen Histaminfreisetzung, was sich in der vermehrten basalen Expression der LAMPs wiederspiegelt. Die verminderte Histamin- und Tryptasefreisetzung bei anti-IgE stimulierten und bestrahlten Mastzellen spricht für eine geringere Bereitschaft der Zellen zur Degranulation. Eben dieses Verhalten bestätigt sich bei denen als Marker für die Mastzelldegranulation dienenden LAMPs[ 21], da sie bei gleichfalls behandelten Zellen (stimuliert und bestrahlt) in geringerer Weise auf der Oberfläche exprimiert werden.
Aufgrund der in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse ist der Schluss zulässig, dass sowohl Produktion als auch Freisetzung der Mediatoren menschlicher Mastzellen bis zu einem gewissen Grad gehemmt werden können. Da viele mastzellassoziierten Erkrankungen mit einer verstärkten Produktion und Ausschüttung von Transmittern einhergehen, kann davon ausgegangen werden, dass durch Bestrahlung der Patienten eine positive Beeinflussung des Krankheitsverlaufes ermöglicht wird. Allerdings sollten
Die in dieser Arbeit isolierten und hochaufgereinigten, humanen dermalen Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 bestrahlt und anschließend entweder mit Substanz P oder anti-IgE stimuliert. Dadurch sollten Einblicke in die unterschiedlichen Wirkmechanismen der bei zahlreichen mastzellassoziierten Erkrankungen eingesetzten UV Licht Therapie gewonnen werden.
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Erforschung der Histamin-, Tryptase- und Zytokinfreisetzung von menschlichen Mastzellen. Zusätzlich wurde die Expression von Lysosomen-assoziierten Membran Proteinen (LAMPs) auf der Oberfläche dieser Zellen untersucht.
Im Gegensatz zu der durch UV Licht induzierbaren spontanen Histaminfreisetzung zeigte sich die anti-IgE stimulierte Histaminausschüttung durch UVB, UVA-1 und PUVA-1 signifikant und dosisabhängig inhibierbar. Auch die durch Substanz P stimulierten Mastzellen gaben nach UVA-1 Bestrahlung deutlich weniger Histamin ab. Demgegenüber blieb die sezernierte Menge des Mediators nach UVB und PUVA-1 konstant. Analog zu den erhobenen Histaminergebnissen konnte eine signifikante Inhibition der anti-IgE induzierten Tryptasefreisetzung nachgewiesen werden. Ebenso zeigte sich eine signifikante Verringerung, der innerhalb von vierundzwanzig Stunden basal freigesetzten Menge an Interleukin-6 und Interleukin-8, nach UV Bestrahlung. Die spontane Ausschüttung vom Tumornekrosefaktor-α verblieb in dem Untersuchungszeitraum auf sehr geringem Niveau, so dass eine relevante Beeinflussung durch UV Licht nicht stattfand. Des weiteren konnte eine vermehrte basale Expression von CD107a und CD63 auf der Mastzellmembran durch UV Bestrahlung demonstriert werden. Auch die anti-IgE induzierte Mehrexpression der LAMPs konnte bei den drei Bestrahlungsarten nachweisbar supprimiert werden.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass die Auswirkungen der UV Licht Therapie auf Mastzellen sehr komplex sind. Zu beachten ist, dass unter physiologischen Bedingungen nicht nur isolierte Mastzellen, sondern auch weitere bestrahlte Zellverbände eine Veränderung erfahren. Erst durch das Zusammenspiel aller Zellen lassen sich Rückschlüsse auf Krankheitsbilder und die anzuwendende
Hiermit erkläre ich an Eides Statt, dass die vorliegende Arbeit von mir selbst und ohne Hilfe Dritter verfasst wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.
Mein erster Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. Torsten Zuberbier für die immer vorhandene Gesprächsbereitschaft, die Überlassung des Themas und die vielen wertvollen Anregungen und Hinweise.
Ein besonderer Dank geht an Herrn Dipl.-Ing. Sven Guhl für seine hilfsbereite Unterstützung und seine konstruktive Kritik, die sowohl zur Klärung von Teilproblemen als auch zu interessanten Erweiterungen der Arbeit führte.
Ich danke auch den zahlreichen Patienten für die Bereitstellung der Hautproben. Ohne ihr freundliches Entgegenkommen wäre die Durchführung des experimentellen Teiles dieser Arbeit in der Form nicht möglich gewesen.
Dank auch den gesamten Mitarbeitern der Abteilung für Dermatologie, Venerologie und Allergologie und insbesondere den Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Zuberbier für ihr hilfreiches Interesse, dass sie meiner Arbeit entgegengebracht haben.