1  Einleitung

• 1.1 Die Entdeckung der Mastzelle

• 1.2 Das Vorkommen und die Differenzierung der Mastzelle

• 1.3 Die Heterogenität der Mastzellen

• 1.4  Die Stimulation der Mastzelle durch anti-IgE und Substanz P

• 1.5  Die Mediatoren der Mastzelle

  • 1.5.1 Die erste Phase der Mediatorfreisetzung

  • 1.5.2 Die zweite Phase der Mediatorfreisetzung

  • 1.5.3 Die dritte Phase der Mediatorfreisetzung

• 1.6 Die Physiologie und Pathophysiologie der Mastzelle

• 1.7 Die Phototherapie

• 1.8 Die Wirkmechanismen der UVB-, UVA-1- und PUVA-1-Therapie

2  Zielsetzung

3  Material und Methoden

• 3.1 Materialien

  • 3.1.1  Puffer

  • 3.1.2  Medien

• 3.2  Methoden

  • 3.2.1 Die Isolierung der Mastzellen

  • 3.2.2 Die Aufreinigung der Mastzellen

  • 3.2.3 Die Bestrahlung der Mastzellen mit UVB, UVA- 1 und PUVA-1

  • 3.2.4 Die Untersuchung der Histaminfreisetzung in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis (Dosisabhängigkeit)

  • 3.2.5  Die Bestimmung der Histaminfreisetzung

  • 3.2.6 Die Bestrahlung dermaler Mastzellen für die Tryptase-, die Zytokin- und die LAMP- Bestimmung

  • 3.2.7 Die Tryptaseaktivitätsbestimmung

  • 3.2.8 Die Untersuchung der basalen Freisetzung von Interleukin-6, Interleukin-8 und Tumornekrosefaktor-α bei bestrahlten dermalen Mastzellen

  • 3.2.9 Die Bestimmung der Moleküle CD63 und CD107a auf bestrahlten und unbestrahlten dermalen Mastzellen

• 3.3  Statistik

4  Ergebnisse

• 4.1 Die Histaminfreisetzung in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis

• 4.2  Die Tryptasefreisetzung nach UVB, UVA-1 und PUVA-1 Bestrahlung

• 4.3  Die basale Freisetzung von Interleukin-6, Interleukin-8 und Tumornekrosefaktor-α nach Bestrahlung mit UV Licht

• 4.4  Die Expression der Moleküle CD107a und CD63 nach Bestrahlung mit UV Licht

• 4.5  Zusammenfassung der Ergebnisse

5  Diskussion

6  Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Erklärung an Eides Statt

Danksagung

Lebenslauf

Tabelle 1 : Übersicht über die Mediatorenfreisetzung von dermalen Mastzellen, geordnet nach zeitlichem Verlauf
Kursiv: die in der Studie untersuchten Mediatoren

Tabelle 2 : Reagenzien

Tabelle 3 : Enzyme

Tabelle 4 : Antikörper

Tabelle 5 : Laborgeräte

Tabelle 6 : Leistungsspektrum der UVB- und der UVA- 1- Lichtquelle

Tabelle 7 : Versuchsaufbau zur Bestimmung der Histaminfreisetzung

Abb. 1 : Schematische Darstellung zur Aktivierung der Mastzelle[37, 38]  (Abkürzungen: AP1 = Activator Protein 1; Btk = Bruton’s tyrosine kinase; DAG = Diacylglyzerin; IP3 = Inositoltrisphosphat; MAPK = Mitogen Activated Protein Kinase; NF-AT = Nuclear Factor of Activated T-cells; PIP2 = Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat; PKC = Proteinkinase C; PLCγ = Phospholipase Cγ).

Abb. 2 : Zusammenfassung der verwendeten Methoden

Abb. 3 : Übersicht über die bei der Mastzellaufreinigung eingesetzten Antikörper

Abb. 4 : Pipettierschema zur Bestimmung der Tryptaseaktivität

Abb. 5 : Lambert-Beersches-Gesetz  (E = Extinktion, I = Lichtintensität des austretenden geschwächten Lichtes, I° = eingesetzte Lichtintensität, ε = Absorbtionskoeffizient, c = Konzentration des absorbierenden Stoffes, d = Schichtdicke)

Abb. 6 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei UVB Bestrahlung.  Die Mastzellen wurden mit UVB bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 11 Versuchen. **p = 0,003  (die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)

Abb. 7 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung  Die Mastzellen wurden mit UVA-1 bestrahlt und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 10 Versuchen. *p = 0,022; **p ≤ 0,007.  (die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)

Abb. 8 : Dosisabhängigkeit der anti – IgE und Substance P induzierten Histaminfreisetzung humaner dermaler Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.  Die Mastzellen wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml 8-MOP) und die Histaminfreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. MW und SEM aus 9-8 Versuchen. *p = 0,028; **p = 0,008.  (die für jede Bestrahlungsdosis maximale Histaminausschüttung entspricht 100%)

Abb. 9 : Die nicht stimulierte Histaminfreisetzung humaner dermaler MC.  Die MC wurden mit UVB (0 und 75mJ/cm²), UVA-1 (0 und 15J/cm²) und PUVA-1 (0 und 5 J/cm², 500 ng/ml) bestrahlt und die Histaminfreisetzung in Bezug zum Gesamthistamingehalt wurde 24 Stunden später ermittelt. Darstellung von MW und SEM. Zahl der Versuche: UVB: 11, UVA-1: 10 und PUVA-1: 9; **p < 0,01

Abb. 10 : Die anti-IgE induzierte Tryptasefreisetzung von humanen dermalen Mastzellen nach UVB, UVA-1 und PUVA-1 Bestrahlung.  Die MC wurden mit 75 mJ/cm² UVB, 15 J/cm² UVA-1 und 5 J/cm² PUVA-1 bestrahlt und die Tryptasefreisetzung wurde 24 Stunden später ermittelt. Für PUVA-1 und 8-MOP gilt + 500ng/ml 8-Methoxypsoralen. Sham und 8-MOP sind unbestrahlte Kontrollen. MW und SEM aus 7-9 Versuchen. *p = 0,018; **p=0,008.

Abb. 11 : Die basale Interleukin – 6 Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.  Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028.

Abb. 12 : Die basale Interleukin – 8 Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.  Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte IL-6 Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen. *p = 0,028

Abb. 13 : Die basale Tumornekrosefaktor - α Freisetzung von humanen dermalen Mastzellen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsart.  Die Mastzellen wurden mit UVB, UVA-1 und PUVA-1 (500ng/ml 8 – MOP) bestrahlt und ihre unstimulierte TNF-α Ausschüttung wurde 24Stunden später ermittelt. Unbestrahlte Kontrollen sind sham und 8 – MOP (500ng/ml). MW und SEM aus 6 Versuchen.

Abb. 14 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD107a auf humanen dermalen Mastzellen bei Behandlung mit 8-Methoxypsoralen.  Die MC wurden mit 8-MOP (500ng/ml) präinkubiert und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 15 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.  Die MC wurden mit PUVA-1 (500ng/ml) bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 16 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf unbestrahlten, humanen dermalen Mastzellen.  Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 17 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei UVB Bestrahlung.  Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 18 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 107a auf humanen dermalen Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung.  Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 107a bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 19 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei Behandlung mit 8-Methoxypsoralen.  Die MC wurden mit 8-MOP präinkubiert (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 20 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei PUVA-1 Bestrahlung.  Die MC wurden mit PUVA-1 bestrahlt (500ng/ml) und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 21 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf unbestrahlten humanen dermalen Mastzellen.  Bei unbestrahlten MC wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 22 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei UVB Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVB bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.

Abb. 23 : Die anti-IgE induzierte Expression von CD 63 auf humanen dermalen Mastzellen bei UVA-1 Bestrahlung.
Die MC wurden mit UVA-1 bestrahlt und anschließend wurde die Oberflächenexpression von CD 63 bestimmt. Die graue Kurve zeigt die Expression unstimulierter und die schwarze Kurve die anti-IgE stimulierter MC.