1 Einleitung

1.1  Struktur und Funktion des Proteasomensystems

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Das Proteasomensystem ist ubiquitär in Archea sowie Eukaryoten verbreitet, und zudem werden sogar in den Prokaryonten Rhodococcus und Mycobacterium einige Komponenten des Proteasomensystems exprimiert (Dahlmann et al., 1989; De Mot et al., 1999). Die Hauptaufgabe des Systems ist die Degradation nicht benötigter Proteine. Aus diesem Grund ist das Proteasomensystem eng mit lebenswichtigen Prozessen wie Zellteilung, Differenzierung, Transkription, Stressantwort und Apoptose verknüpft (Coux et al., 1996; Schwartz und Ciechanover, 1999). Eine weitere wichtige Funktion ist der Abbau neusynthetisierter, aber fehlgefalteter Proteine (Schubert et al., 2000). Zusätzliche immunologische Bedeutung erlangt das Proteasomensystem in Vertebraten, da einige der Degradationsprodukte als Liganden, nachfolgend als Epitope bezeichnet, auf dem „Major Histocompatibility Complex“ der Klasse I (MHC-Klasse-I) fungieren (Kloetzel und Ossendorp, 2004). Durch die spezifische Interaktion des T-Zell-Rezeptors mit diesem Komplex aus Epitop und MHC-Klasse-I Molekül werden die cytotoxischen T-Lymphocyten (CTLs) angeregt, infizierte oder entartete Zellen zu lysieren.

Das Proteasomensystem ist im Cytosol und Kern der Zelle lokalisiert. Dies setzt voraus, dass der Proteinabbau streng reguliert ist, um eine unspezifische Degradation sämtlicher Proteine des Cytosols und des Kerns zu vermeiden. Eine wichtige Rolle hierbei spielt die Markierung von Proteinen mit Polyubiquitin, welches sie als proteasomale Substrate kennzeichnet. Die Enzyme der dreistufigen Ubiquitinierungskaskade binden das 76 Aminosäuren lange, globuläre Ubiquitin kovalent an die ε-Aminogruppe eines Lysinrestes des zu degradierenden Proteins. Ist die N-terminale Aminosäure für die Erkennung des zu degradierenden Proteins durch die Enzyme der Ubiquitinierungskaskade verantwortlich, wird von der N-Terminus-Regel gesprochen(Bachmair et al., 1986; Varshavsky, 1997). In den darauf folgenden enzymatischen Schritten werden weitere Ubiquitinmoleküle an das erste Ubiquitin angeheftet, wodurch eine Polyubiquitininkette entsteht (Pickart, 2004; Weissman, 2001).

1.1.1  Strukturelle Komponenten des Proteasomensystems

Das 26S Proteasom stellt die vorherrschende katalytisch aktive Form des Proteasomensystems in der Zelle dar. Es setzt sich aus dem 20S Proteasom und zwei 19S Regulatoren zusammen, die sich ATP-abhängig an zwei Seiten des 20S Proteasoms anlagern (Peters et al., 1993; Yoshimura et al., 1993). Die Funktion des 19S Regulators besteht in der Erkennung der ubiquitinierten proteasomalen Substrate (Deveraux et al., 1994; Young et al., 1998), ihrer Deubiquitinierung, Entfaltung sowie schließlich ihrer Translokation in das 20S Proteasom (Glickman und Ciechanover, 2002). Der 19S Regulator hat ein Molekulargewicht von 700 kDa und wird aus 17 Untereinheiten gebildet, die in den zwei Subkomplexen „Lid“ und „Base“ angeordnet sind (Ferrell et al., 2000) ( Abb. 1 A). Während den Lid-Untereinheiten noch keine spezifischen Funktionen zugeordnet werden konnten, zeigen die ATPase-Untereinheiten des Base Chaperon-ähnliche Aktivität und unterstützen damit die energieabhängige Entfaltung und Translokation des Substrates (Braun et al., 1999).

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Abb. 1 : Komplexe des Proteasomensystems. (A) 19S Regulator: orange – Lid-Untereinheiten; violett – Base-Untereinheiten. (B) 20S Proteasom: grün – α-Untereinheiten; rot – proteolytisch aktive β-Untereinheiten; blau – inaktive β-Untereinheiten. (C) PA28. Die einzelnen Komplexe ergeben in der dargestellten Kombination das Hybrid-Proteasom 19S-20S-PA28. Das 26S Proteasom hat die Anordnung 19S-20S-19S. Daneben existiert das Proteasom als PA28-20S-PA28 Komplex in der Zelle. (Die Abbildung ist eine Kombination aus (Kloetzel, 2001; Kloetzel, 2004; Tanahashi et al., 2000))

Das 20S Proteasom, der proteolytisch aktive Kern des 26S Proteasoms, besteht aus zweimal 14 verschiedenen Untereinheiten, von denen die kleinste Untereinheit, iβ2, ein Molekulargewicht von 21 kDa und die größte Untereinheit, β6, eines von 30 kDa aufweist. Auf Grund von Sequenzhomologien werden sie zu sieben α-Untereinheiten und sieben β-Untereinheiten zusammengefasst und durchnummeriert (Tanaka et al., 1992). Vier heptamere Ringe, die entweder jede der α-Untereinheiten oder jede der β-Untereinheiten enthalten, ergeben mit α7β7β7α7-Stöchiometrie die zylinderförmige Struktur des 20S Proteasoms ( Abb. 1 B). Die aktiven Zentren der proteolytisch aktiven Untereinheiten β1, β2 und β5 sind zu den Zentren der β-Ringe hin ausgerichtet (Groll et al., 1997; Lowe et al., 1995). Sie enthalten als Nukleophil die Hydroxylgruppe des N-terminalen Threoninrestes (Lowe et al., 1995)und gehören daher zu den aminoterminalen nukleophilen Proteasen (Groll und Huber, 2003). Die katalytischen Untereinheiten werden als inaktive Vorläufer mit N-terminalen Propeptiden exprimiert, welche nach abgeschlossener Assemblierung des 20S Proteasoms autokatalytisch abgespalten werden. Die reaktiven Threoninreste sind also erst dann zugänglich, wenn sie vom Cytosol durch die proteasomale Zylinderstruktur getrennt sind. Neben der Substratubiquitinierung vermeiden also auch die Propeptide sowie die Struktur des 20S Proteasoms eine unspezifische Degradation der cytosolischen Proteine (Chen und Hochstrasser, 1996; Schmidtke et al., 1996).

Die N-Termini der α-Untereinheiten verschließen die Eingänge des 20S Proteasoms (Groll et al., 1997). Eine einzige Punktmutation im N-terminalen Bereich von α3 führt jedoch dazu, dass die N-Termini nicht mehr über den Eingängen angeordnet sind und sich daher ein Kanal in das Innere des 20S Proteasoms öffnet (Groll et al., 2000). Ein vergleichbarer Effekt ist in der Röntgenkristallstrukturanalyse zu beobachten, wenn das 20S Proteasom mit einem dem Proteasomen-Aktivator 28 (PA28) homologen Komplex aus Trypanosoma inkubiert wird (Whitby et al., 2000). Der ca. 200 kDa große PA28-Komplex wird wahrscheinlich durch drei PA28α- und vier PA28β-Untereinheiten gebildet, die sich in einer Ringstruktur an die α-Heptamere des 20S Proteasoms anlagern (Rechsteiner et al., 2000) ( Abb. 1 C). Neben den 26S Proteasomen existieren demnach ebenfalls 20S Proteasomen, die über die α-Ringe mit zwei PA28-Komplexen verbunden sind. Zusätzlich liegen in den Zellen bis zu 20% aller 20S Proteasomen als Hybrid-Komplex mit PA28 auf der einen und 19S Regulator auf der anderen Seite vor (Cascio et al., 2002; Hendil et al., 1998; Noda et al., 2000; Tanahashi et al., 2000).

1.1.2 Strukturvariabilität durch posttranslationale Modifikationen

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Aus Geweben oder Zellen gewonnene 20S Proteasomenpräparationen sind nicht in sich homogen, sondern enthalten jeweils eine Mischung von 20S Proteasomen. Das zeigt sich im proteasomalen Elutionsverhalten bei der Anionenaustausch-Chromatographie, in der aktive 20S Proteasomen in bis zu sechs separaten Fraktionen eluieren. Wahrscheinlich durch andere Oberflächenladungen können daher sogenannte proteasomale Subtypen unterschieden werden.(Dahlmann et al., 2001; Dahlmann et al., 2000). Die Auftrennung in der zweidimensionalen (2D-) Gelelektrophorese lässt zudem erkennen, dass eine Untereinheit mit mehreren unterschiedlichen Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten vorliegen kann wie in Abb. 2 dargestellt (Kuckelkorn et al., 2002). Eine Erklärung dafür können posttranslationale Modifikationen bieten.

Abb. 2 : Unterschiedliche Molekulargewichte und isoelektrische Punkte der gleichen proteasomalen Untereinheiten. Gezeigt sind aus murinem Dünndarm isolierte und in der 2D-Gelelektrophorese separierte 20S Proteasomen. Die erste Dimension trennt nach isolelektrischem Punkt (NEPHGE – „Nonequilibrium pH Gradient Electrophoresis“); die zweite Dimension trennt nach Molekulargewicht (SDS-PAGE – denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese). Die Pfeile geben die Trennrichtungen der Elektrophoresen an. Durch Massenspektrometrie identifizierte gleiche Untereinheiten sind in den gleichen Farben markiert. (Abb. nach (Kuckelkorn et al., 2002))

Reversible posttranslationale Modifikationen führen zu strukturellen Änderungen und regulieren dadurch die Eigenschaften und Funktionen der Proteine (Seo und Lee, 2004). Auch für das Proteasomensystem sind posttranslationale Modifikationen beschrieben worden, die allerdings noch nicht mit den oben gezeigten multiplen Spots oder Subtypen in Zusammenhang gebracht werden konnten. Hierzu gehören die N-terminale Acetylierung von β3, β4, sämtlicher α-Untereinheiten und von zwölf Untereinheiten des 19S Regulators sowie eine für die 19S Regulator-Untereinheit Rpt2a nachgewiesene N-terminale Myristoylisierung (Kimura et al., 2003; Kimura et al., 2000). Oxidativer Stress kann weitere Modifikationen hervorrufen: So wurde für die aus verschiedenen Rattenorganen isolierten proteasomalen Untereinheiten α1, α2 und α4 gezeigt, dass diese nach oxidativem Stress zusätzliche Carbonylgruppen enthalten wie das ungesättigte Aldehyd HNE (4-Hydroxy-2-Nonenal) (Bulteau et al., 2001; Okada et al., 1999). Andere Untersuchungen ergaben, dass bei mildem oxidativen Stress Cysteinreste der Proteasomen eine reversible S-Glutathionylierung eingehen (Demasi et al., 2001; Demasi et al., 2003). Phosphorylierungen wurden an β6 (Wehren et al., 1996), an den α-Untereinheiten, mit Ausnahme von α1, (Fernandez Murray et al., 2002; Iwafune et al., 2002; Mason et al., 1996) sowie an den Untereinheiten des 19S Regulators S4, S6, S7 und S12 (Mason et al., 1998) detektiert.

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Über die Funktionen dieser Modifikationen kann bislang nur spekuliert werden: Für die N-Acetylierung lässt sich ein Schutz der N-Termini vor cytosolischen Aminopeptidasen postulieren, und die N-Myristoylisierung könnte über Interaktion mit Membranen oder Proteinen an der Lokalisation der 26S Proteasomen beteiligt sein. N-Acetylierungen, oxidative Modifikationen und Phosphorylierungen werden auch mit Änderungen der proteasomalen Aktivität in Verbindung gebracht; die Ergebnisse stammen jedoch aus weitgehend unphysiologischen Versuchen mit fluorogenen Substraten und sind außerdem sehr widersprüchlich (Bulteau et al., 2001; Demasi et al., 2001; Demasi et al., 2003; Iwafune et al., 2002; Mason et al., 1996). Funktionelle Hinweise gibt es indes für die Phosphorylierung der α3 und α7 Untereinheiten basierend auf dem Einsatz von Interferon-γ (IFNγ) in der Zellkultur. IFNγ-Behandlung resultiert in der Reduktion der proteasomalen Phosphorylierung, was zur Abnahme der Menge an 26S Proteasomen und zur gleichzeitigen Zunahme von PA28-20S-PA28 führt (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Dies kann als erster Hinweis auf eine physiologisch relevante Regulation der Proteasomen durch posttranslationale Modifikationen verstanden werden, über die die Zelle auf komplexe Situationen wie z.B. eine Infektion reagieren könnte.

Eine posttranslationale Modifikation, der bislang wenig Aufmerksamkeit geschenkt wurde, ist die nukleo-cytosolische Glycosylierung. Im Gegensatz zu der im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und Golgi-Apparat stattfindenden Anheftung von komplexen Kohlenhydratverbindungen, die an Proteinfaltung, Qualitätskontrolle und Translokation zur Zelloberflächen beteiligt sind (Helenius und Aebi, 2004), besteht die nukleo-cytosolische Glycosylierung aus der Übertragung nur eines einzigen Monosaccharids: des β-N-Acetylglucosamins (GlcNAc), welches über die Hydroxylgruppe von Serin- und Threoninresten an native Proteine gebunden wird (O-GlcNAc) (Holt und Hart, 1986; Torres und Hart, 1984). Diese Modifikation ist reversibel und wird durch zwei spezifische nukleo-cytosolische Enzyme reguliert, die in Metazoa konserviert sind. Die N-Acetylglucosaminidase (NAG) ist für die hydrolytische Abspaltung des O-GlcNAc zuständig, während die O-GlcNAc-Transferase (OGT) das Monosaccharid von UDP-GlcNAc auf die Proteine überträgt (Gao et al., 2001; Wells et al., 2002). Im Gegensatz zu der im ER lokalisierten Glycosylierung ist für diesen Vorgang bislang keine Konsensussequenz bekannt(Kreppel et al., 1997; Kreppel und Hart, 1999; Lubas et al., 1997). Interessanterweise konnte jedoch für einige Proteine nachgewiesen werden, dass O-GlcNAc an Serin- und Threoninreste bindet, die selbst oder deren Nachbaraminosäuren mit Phosphatgruppen modifiziert werden können. Zu diesen Proteinen gehören der Östrogenrezeptor-β (Cheng et al., 2000), die RNA-PolymeraseII (Comer und Hart, 2001), der Transkriptionsfaktor c-Myc (Kamemura et al., 2002) und die CaseinkinaseII (Matsuoka et al., in prep). Generell scheint der Phosphorylierungsgrad zuzunehmen, wenn der Glycosylierungsgrad in der Zelle reduziert wird (Boehmelt et al., 2000; Lefebvre et al., 1999; Lefebvre et al., 2003). Diese Beobachtung und die Entdeckungen, dass die OGT mit Phosphatasen assoziiert ist (Wells et al., 2004), sowie dass O-GlcNAc in die Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse involviert ist (Zachara und Hart, 2004), unterstützen das sogenannte Yin-Yang-Modell, welches eine reziproke Regulation von Glycosylierung und Phosphorylierung vorschlägt (Hart et al., 1995; Slawson und Hart, 2003).

Die Herausforderung bei der Untersuchung posttranslationaler Modifikationen liegt darin, diese in einen physiologisch relevanten Kontext zu setzen. Unter experimentellen artifiziellen Bedingungen, wie sie bei Deletionsmutanten oder in in vitro Experimenten gegeben sind, ist der Nachweis einer Modifikation oft möglich, da der Anteil der modifizierten Proteine künstlich erhöht ist. Wird aber von einer in vivo Situation ausgegangen, erschweren mehrere Aspekte die Identifizierung und Charakterisierung: Wegen der regulatorischen Funktion von posttranslationalen Modifikationen liegt innerhalb der Zelle meist nur ein geringer Anteil eines Proteins entsprechend verändert vor. Es sind also hochsensitive Nachweismethoden erforderlich, oder es muss ein genaues Wissen über die Regulationsmechanismen vorliegen, um die Zellen synchron in den Status eines hohen endogenen Modifikationsgrades zu versetzen. Hinzu kommt, dass Modifikationen an den Seitenketten der Aminosäuren oft sehr instabil sind, was während der Proteinanreicherung zu Verlusten der Modifikationen führen kann (Seo und Lee, 2004). Trotz der aufgeführten Schwierigkeiten sind posttranslationale Modifikationen ein überaus interessantes und wichtiges Forschungsgebiet in der Zellbiologie, weil sie im Vergleich zur Proteinregulation über Transkription, Translation und Komplexassemblierung für die Zelle schneller, flexibler und energetisch günstiger einzusetzen sind.

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1.1.3 Generierung der MHC-Klasse-I Epitope und ihrer Precursor durch das Proteasomensystem

Das Proteasomensystem spaltet zum Abbau markierte Proteine in Peptide. Mithilfe fluorogener Peptidsubstrate können den einzelnen katalytischen Untereinheiten des Proteasoms charakteristische proteolytische Aktivitäten zugeordnet werden. Diese Substrate bestehen aus Tri- oder Tetrapeptiden mit einer C-terminal gebundenen chemischen Gruppe, die bei Abspaltung fluorogen wird. Die Untereinheit β1 spaltet bevorzugt fluorogene Substrate mit sauren Aminosäuren vor der fluorogenen Gruppe und zeigt damit eine Caspase-ähnliche Aktivität. Der Untereinheit β2 wird eine Trypsin-ähnliche Aktivität zugeschrieben, da die sie C-terminal nach basischen Aminosäuren schneidet, und die β5-Aktivität wird auf Grund der Hydrolyse nach hydrophoben Aminosäuren als Chymotrypsin-ähnlich bezeichnet (Orlowski und Wilk, 2000).

Werden hingegen den in vivo Bedingungen eher entsprechende Peptidsubstrate mit mehr als 20 Aminosäuren durch das Proteasom degradiert, lässt sich diese strikte Zuteilung von Schnittpräferenzen auf einzelne katalytische β-Untereinheiten nicht mehr aufrecht erhalten (Kisselev et al., 1999; Kuckelkorn et al., 1995; Schmidtke et al., 1998). Des Weiteren entscheidet beim Abbau längerer Substrate nicht nur die C-terminale Aminosäure über die Schnitteffizienz, sondern auch Aminosäurereste innerhalb des Epitopes sowie in den flankierenden Sequenzen (Beekman et al., 2000; Eggers et al., 1995; Nussbaum et al., 1998; Peters et al., submitted). Als generelles Charakteristikum der proteasomalen Schnittpräferenz gilt jedoch, dass Proteasomen die Spaltung nach basischen und hydrophoben Aminosäuren favorisieren (Boes et al., 1994; Niedermann et al., 1995; Ossendorp et al., 1996). Der C-Terminus der an MHC-Klasse-I bindenden Epitope wird – mit einer bekannten Ausnahme – durch das Proteasomensystem generiert (Kloetzel, 2004; Seifert et al., 2003). Der N-Terminus hingegen ist weniger strikt durch das Proteasom definiert (Cascio et al., 2001). Dies wird verständlich, wenn man berücksichtigt, dass cytosolische Aminopeptidasen im Zuge der Proteindegradation Peptide vom N-Terminus aus verkürzen und vollständig in einzelne Aminosäuren zerlegen können. Die N-terminal elongierten MHC-Klasse-I Epitope, im Folgenden als „Precursor“ bezeichnet, vergrößern demnach die Wahrscheinlichkeit, dass die Epitope nicht im Cytosol degradiert werden (Reits et al., 2004).

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In Zellkultur eingesetzt stimuliert IFNγ die Expression von PA28α und PA28β (Realini et al., 1994) sowie von drei alternativen proteolytischen β-Untereinheiten (Groettrup et al., 1996; Ortiz-Navarrete et al., 1991). Sind diese alternativen β-Untereinheiten im Cytosol vorhanden, werden sie bevorzugt in neugebildete Proteasomen integriert und ersetzen ihre konstitutiven Homologe (Frentzel et al., 1994; Groettrup et al., 1997). Entsprechend ihrer Austauschpartner werden sie als induzierbares β1 (iβ1), iβ2 und iβ5 oder zusammen als Immuno-Untereinheiten bezeichnet und bilden mit den nicht-aktiven α- und β-Untereinheiten das Immunoproteasom(Aki et al., 1994; Akiyama et al., 1994). Untersuchungen der proteasomalen Aktivität mithilfe fluorogener Substrate in Abhängigkeit vom Vorhandensein der konstitutiven und der Immuno-Untereinheiten zeigen ein sehr uneinheitliches Bild. Während einige Ergebnisse für eine reduzierte Caspase-ähnliche Aktivität der Immunoproteasomen sprechen (Gaczynska et al., 1993; Kuckelkorn et al., 1995), ist in anderen Experimenten kein Unterschied zu erkennen (Driscoll et al., 1993; Ustrell et al., 1995). Die Trypsin-ähnliche Aktivität wird einerseites als unverändert (Boes et al., 1994; Kuckelkorn et al., 1995), andererseits als in Immunoproteasomen erhöht (Driscoll et al., 1993; Gaczynska et al., 1993; Gaczynska et al., 1994)beschrieben, wohingegen für die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität sowohl ein Anstieg (Driscoll et al., 1993; Gaczynska et al., 1993; Gaczynska et al., 1994)als auch eine Reduktion (Boes et al., 1994; Eleuteri et al., 1997; Kuckelkorn et al., 1995) infolge der Inkorporation der Immuno-Untereinheiten gefunden wurde. Wie schon oben erwähnt, sind den aktiven β-Untereinheiten und ihren induzierbaren Homologen allgemeingültig offenbar keine spezifischen Aktivitäten zuzuordnen.

Physiologisch relevantere Prozessierungsexperimente mit Peptidsubstraten, die sich von viralen und zelleigenen Proteinen ableiten, zeigen, dass die Immuno-Untereinheiten einen positiven Effekt auf die Epitop- und Precursorgenerierung ausüben (Kloetzel, 2001; Sijts et al., 2001). Dies gilt für die Epitope und Precursor von körpereigenen Proteinen wie MAGE3 (Schultz et al., 2002), Hsp60 (Kuckelkorn et al., 2002), HY (Fehling et al., 1994) und Enolase-1 (Toes et al., 2001) ebenso wie für die immunrelevanten Fragmente aus viralen Proteinen wie dem HBV Core Protein (Sijts et al., 2000), HCV NS3 (Seifert et al., 2004), EBV LMP-2 (Lautscham et al., 2003), adenoviralem E1B (Sijts et al., 2000), Nukleoproteinen des Influenza A Virus (Van Kaer et al., 1994) und von LCMV (Schwarz et al., 2000) sowie dem Gag Protein von MuLV (van Hall et al., 2000). Neben dieser Vielzahl an Berichten über eine gesteigerte Epitopgenerierung gibt es zwei Epitope, deren Produktion nicht durch Immunoproteasomen beeinflusst wird (van Hall et al., 2000; Van Kaer et al., 1994). Bislang konnte eine Arbeitsgruppe nur für die körpereigenen Proteine RU1, Melan-A, gp100 und Tyrosinase zeigen, dass konstitutive Proteasomen Epitope freisetzen, die von Immunoproteasomen nicht gebildet werden (Morel et al., 2000; Van den Eynde und Morel, 2001).

Wie das Vorhandensein der Immuno-Untereinheiten führt auch die Induktion des PA28-Komplexes zu einer verbesserten Produktion vieler Epitope und Precursor (Dick et al., 1996; Groettrup et al., 1996; Sun et al., 2002; van Hall et al., 2000). Ein negativer Einfluss von PA28 wurde bisher nicht veröffentlicht, allerdings gibt es Beispiele für Epitope, deren Produktion nicht durch PA28 zu verstärken ist (Schwarz et al., 2000; van Hall et al., 2000). Der positive Effekt von PA28 ist möglicherweise mit der Öffnung der α-Ringe und einem daraus folgenden schnelleren Substratdurchsatz zu begründen (Groll et al., 2000; Stohwasser et al., 2000). Zudem verursacht die Bindung von PA28 an 20S Proteasomen wahrscheinlich eine Konformationsänderung innerhalb des 20S Proteasoms, die in der verstärkten Nutzung bestimmter Schnittstellen resultiert (Dick et al., 1996; Li et al., 2001; Sun et al., 2002).

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Aussagen über die Schnittpräferenzen des konstitutiven und des Immunoproteasoms entstehen durch Analyse von in vitro durchgeführten Prozessierungsexperimenten. Hierbei werden gereinigte 20S Proteasomen mit einem Peptidsubstrat inkubiert, die Prozessierungsprodukte über Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) getrennt und in der Massenspektrometrie identifiziert. Die so erlangten in vitro Resultate reflektieren überzeugend in vivo Beobachtungen, in denen die Epitopgenerierung aus nativen Proteinen durch das endogene Proteasomensystem mittels CTL-Experimenten analysiert wird (Eggers et al., 1995; Schultz et al., 2002; Schwarz et al., 2000; Sijts et al., 2000; Sijts et al., 2000; Sun et al., 2002). Der in vitro auf die 20S Proteasomen und das Peptidsubstrat minimierte Ansatz kann deshalb als Modell der komplexeren in vivo Prozessierung in der Zelle betrachtet und verwendet werden.

Die Stimulation von Zellen mit Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα) führt zu einer erhöhten Expression von MHC-Klasse-I Molekülen auf der Zelloberfläche und ergibt einen Anstieg der Transkripte für die Immuno-Untereinheiten iβ1 und iβ5 (Loukissa et al., 2000; Raasi et al., 1999). In einer weiteren Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die Behandlung verschiedener Zellen mit TNFα die Proteine des MHC-Klasse-I Präsentationsweges einschließlich der Immuno-Untereinheiten induziert und MHC-Klasse-I Moleküle stabilisiert werden. Die beobachtete Stimulation fiel geringer aus als ein mit IFNγ erzielter Effekt auf dieselben Proteine. Da die Ergebnisse nicht auf eine basale Wirkung von IFNγ zurückzuführen waren, legen sie die Vermutung nahe, dass TNFα in der Lage ist, einen Verlust von IFNγ auszugleichen, und als stellvertretendes Cytokin wirken kann (Hallermalm et al., 2001). Der direkte Einfluss von TNFα auf die proteasomale Generierung immunrelevanter Peptide wurde in diesen Publikationen allerdings nicht untersucht.

1.2 Präsentation von Epitopen auf MHC-Klasse-I Molekülen

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Durch das Proteasomensystem generierte Peptide und Epitope können von dem Heterodimer TAP („Transporter associated with Antigen Processing“) ATP-abhängig aus dem Cytosol in das ER befördert werden. TAP favorisiert Peptide mit acht und mehr Aminosäuren sowie einer hydrophoben oder basischen Aminosäure am C-Terminus (Peters et al., 2003; Shepherd et al., 1993). N-terminal elongierte Epitope, im Weiteren Precursor genannt, können vor und nach dem Transport durch Aminopeptidasen auf Epitoplänge „getrimmt“ werden. Im Cytosol stehen dafür unter anderem die Bleomycinhydrolase, Leucinaminopeptidase, Puromycin-sensitive Aminopeptidase sowie Tripeptidylpeptidase-II (TPPII) und Thimet-Oligopeptidase zur Verfügung, während im ER beispielsweise die Enzyme ERAP1 und ERAP2 mit gleicher Funktion lokalisiert sind (Rock et al., 2004). TAP ist im ER-Lumen mit einem partiell gefalteten MHC-Klasse-I Molekül und Chaperonen assoziiert (Ortmann et al., 1997). Die Chaperone unterstützen die Bindung des Epitopes an das MHC-Klasse-I Molekül, was in dessen Stabilisierung und seinem Transport über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche resultiert. Dort kann die Interaktion des Epitop-MHC-Klasse-I Komplexes mit spezifischen T-Zell-Rezeptoren der CTLs erfolgen ( Abb. 3 ).

Abb. 3 : Epitopgenerierung und MHC-Klasse-I Präsentation. Ubiquitinierte Proteine werden durch das 26S Proteasom zu Peptiden prozessiert, die durch cytosolische Aminopeptidasen getrimmt oder vollständig abgebaut werden können. TAP transportiert die Epitope und Precursor in das ER, wo nach eventuell weiterem Trimming die Epitope an MHC-Klasse-I Moleküle gebunden werden. Die beladenen MHC-Klasse-I Moleküle werden über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert, an der sie die Epitope den CTLs präsentieren. (Abbildung nach (Kloetzel, 2004; Pamer, 2004))

Das auf allen kernhaltigen Zellen vorhandeneMHC-Klasse-I Molekül setzt sich aus dem β2-Mikroglobulin und der transmembranen α-Kette zusammen. In der Maus existieren bis zu drei verschiedene MHC-Klasse-I Typen, die Histokompatibilität-2 (H-2) Moleküle, mit jeweils mehreren Allelen der α-Kette. Jede murine Zelle kann daher maximal sechs unterschiedliche MHC-Klasse-I Haplotypen exprimieren. Die Epitope besitzen eine Länge von acht bis zehn Aminosäuren und interagieren über ihre terminalen Amino- und Carboxylgruppen mit der durch die α1- und α2-Domänen gebildeten Peptidbindungsfurche ( Abb. 4 ). Zwei bis drei Aminosäuren des Epitopes sorgen als Ankerreste ebenfalls für eine Stabilisierung der Bindung. Die hochpolymorphen MHC-Klasse-I Haplotypen unterscheiden sich darin, welche Aminosäuren sie an welcher Position des Peptides hierfür bevorzugen. Da die restliche Peptidsequenz keinen weiteren Einfluss auf die Bindung ausübt, kann jeder Haplotyp eine Vielzahl von Epitopen präsentieren (Rammensee et al., 1995). Eine Gemeinsamkeit der meisten MHC-Klasse-I Haplotypen besteht darin, dass sie Epitope mit einer hydrophoben oder basischen Aminosäure am C-Terminus präferieren.

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Abb. 4 : Bindung des T-Zell-Rezeptors an ein Peptid-beladenes MHC-Klasse-I Molekül. Es werden die extrazelluläreren Bereiche des T-Zell-Rezeptors (hell- und dunkelgrün) und des MHC-Klasse-I Moleküls (blau – α-Kette; violett – β2Microglobulin) mit Epitop (rosa) gezeigt. Im Text erwähnte Domänen sind beschriftet. Der dimere T-Zell-Rezeptor bindet mit den hochvariablen Regionen an das Epitop, welches in der Furche zwischen der α1- und α2-Domäne des MHC-Klasse-I Moleküls präsentiert wird. (Erweiterte Abbildung nach http://allele5.biol.berkeley.edu)

Die durch das Proteasomensystem gebildeten C-Termini entsprechen also den Bindungsrestriktionen der MHC-Klasse-I Moleküle und des TAP.Diese Tatsache unterstreicht die Verknüpfung von Proteasomen- und Immunsystem und ist als Hinweis auf die Anpassung des evolutionär jüngeren Immunsystems an das ältere Proteasomensystem zu werten. Doch auch das Proteasomensystem hat sich mit der Entstehung des Immunsystems in den Vertebraten weiterentwickelt: Die katalytisch aktiven Immuno-Untereinheiten und PA28 ebenso wie die Untereinheiten des MHC-Klasse-I Moleküls, die TAP-Proteine (Schroder et al., 2004) und einige Aminopeptidasen (Beninga et al., 1998; Saric et al., 2002; Tanioka et al., 2003) sind durch das proinflammatorischen Cytokin IFNγ induzierbar und können die MHC-Klasse-I Präsentation der Epitope verstärken.

Der T-Zell-Rezeptor besteht aus zwei Ketten, die in der Erkennungsregion hochvariabel sind. Ähnlich den Antikörpern werden diese durch Rearrangements der chromosomalen DNA gebildet. Kann ein T-Zell-Rezeptor den Komplex aus Epitop und MHC-Klasse-I Molekül binden ( Abb. 4 ), wird der CTL angeregt, die Zelle anzugreifen. Hierfür scheint die Interaktion eines einzigen T-Zell-Rezeptors mit einem Epitop-MHC-Klasse-I Komplex auszureichen (Stevanovic und Schild, 1999; Sykulev et al., 1996). CTLs, deren Rezeptoren Epitope aus körpereigenen Proteinen erkennen, werden nach ihrer Entstehung sofort weitgehend negativ selektioniert. Aus diesem Grund besteht das T-Zell-Repertoire eines Organismus vor allem aus solchen CTLs, die ausschließlich mit Komplexen aus MHC-Klasse-I Molekülen und Fremdepitopen interagieren.

1.3 Das murine Infektionsmodell mit Listeria monocytogenes

1.3.1  Verlauf der Listeriose

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Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) ist ein Gram positives, fakultativ anaerobes Stäbchen, das keine Sporen bildet und sich im Cytosol von Mammaliazellen vermehren kann. Werden Mäuse oral oder intravenös mit L. monocytogenes infiziert, gelangt ein Großteil der Bakterien sehr schnell in die Leber (Gregory et al., 1996; Huleatt et al., 2001; Kursar et al., 2002). Hier erzwingen sie sich über die Bindung von InternalinB an den Rezeptor des Hepatocyten-Wachstumsfaktors den Eintritt in die Hepatocyten (Rogers et al., 1996; Shen et al., 2000). Ein anderer Teil der Bakterien wird von den Makrophagen der Milz phagocytiert (Aichele et al., 2003). L. monocytogenes entkommt aus den Vesikeln und Phagosomen durch Sekretion von ListeriolysinO (LLO), einem die Membran zerstörenden Cytolysin (Bielecki et al., 1990). Im Cytosol der Wirtszelle erfolgt dann die Vermehrung, die von der sekretierten Mureinhydrolase p60 abhängig ist (Bubert et al., 1992). Indem L. monocytogenes durch Expression von ActA das zelleigene Aktin zur Polymerisierung anregt und sich so durch das Wirtscytosol bis in die Nachbarzelle schieben lässt, breitet sich der Erreger weiter aus (Kocks et al., 1992; Portnoy et al., 2002). Wie in Abb. 5 gezeigt, beginnt dann erneut der parasitäre intrazelluläre Zyklus mit der Auflösung der Vesikel und dem Eintritt in das Cytosol der neuen Wirtszelle.

Abb. 5 : Intrazellulärer Lebenszyklus von Listeria monocytogenes . (A) Internalin-vermittelte oder phagocytotische Aufnahme in die Zelle; (B) Lyse der Vesikelmembran durch LLO; (C) Vermehrung im Cytosol; (D) Fortbewegung mittels Aktinschweif; (E) Befall der Nachbarzelle; (F) Lyse der Vesikelmembranen. (Abbildung nach (Tilney und Portnoy, 1989))

Wenige Minuten nach der Primärinfektion eines Organismus wird die unspezifische Immunantwort aktiviert mit dem Ziel, die Verbreitung von L. monocytogenes einzudämmen. Nach einigen erfolgreichen Replikationszyklen der Pathogene treten die infizierten Hepatocyten in die Apoptose. Die dabei freigesetzten Signalstoffe rekrutieren phagocytierende Zellen zum Infektionsherd (Rogers et al., 1996). Parallel dazu werden natürliche Killerzellen durch TNFα und Interleukin-12 zur Ausschüttung von IFNγ angeregt. Die Kombination aus TNFα und IFNγ aktiviert die eingewanderten Monocyten und Granulocyten, welche nun mit reaktivem Sauerstoff und Stickstoffmonoxid die Bakterien abtöten (Edelson und Unanue, 2000). Als Folge der Zelleinwanderung entstehen in der Leber und Milz um die infizierten Bereiche Granuloma, welche die angrenzenden Zellen vor der weiteren Verbreitung von L. monocytogenes schützen (Vazquez-Boland et al., 2001).

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Während die unspezifische Immunantwort sehr schnell reagiert, dauert es bei einer Primärinfektion mehrere Tage, bis die spezifische oder adaptive Immunantwort ihre Wirkung entfalten kann. Ihre Aufgabe ist es, die restlichen infizierten Zellen zu entdecken und zu eliminieren, so dass der sterile Zustand in den Geweben wieder hergestellt wird. Die wichtigste Komponente der adaptiven Immunantwort gegen L. mono cytogenes sind die CTLs (Ladel et al., 1994; McGregor et al., 1970). Die adaptive Immunantwort bildet auch die Grundlage für die protektive Immunität. Dies bedeutet, dass bei einer Sekundärinfektion die auf den Erreger schon abgestimmte adaptive Immunantwort ohne Verzögerung einsetzt und somit eine Erkrankung verhindert wird. Bei der Etablierung der CTL-basierten protektiven Immunität werden für einen kurzen Zeitraum T-Helferzellen Typ I gebraucht (Shedlock und Shen, 2003; Sun und Bevan, 2003), die nur im Zusammenhang mit IFNγ eine eigene protektive Immunität bieten können (Harty et al., 1992; Ladel et al., 1994).

IFNγ und TNFα sind mit ihren pleiotropen Effekten für die Bekämpfung der Listeriose unbedingt notwendig (Harty und Bevan, 1995; Huang et al., 1993; Pfeffer et al., 1993; Rothe et al., 1993). Beide Cytokine werden von Zellen der unspezifischen sowie der adaptiven Immunantwort sezerniert und wirken auf sämtliche kernhaltigen Zellen. TNFα wird als Homotrimer und Homodimer gebildet, kann sowohl membrangebunden als auch gelöst vorliegen und bindet an die Rezeptoren p55 und p75. Der Effekt von TNFα beruht auf der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB. Dieser induziert die Produktion weiterer proinflammatorischer Cytokine, besonders von IFNγ, und die Expression der costimulatorischen Moleküle, welche für die Einleitung der adaptiven Immunantwort wichtig sind. Wenn NFκB inhibiert ist, induziert TNFα jedoch die Apoptose der Zelle (Varfolomeev und Ashkenazi, 2004). IFNγ ist ein lösliches Homodimer, dessen Interaktion mit seinem heterodimeren Rezeptor in der Aktivierung des Jak/Stat-Signalweges resultiert. Dies führt zur Expression von Genen, deren Produkte an der Aktivierung der T-Zellen und der spezifischen Erkennung infizierter Zellen beteiligt sind ( 1.1.3 und 1.2 ). In Makrophagen werden außerdem die antimikrobiellen Enzyme für die Produktion der reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffmonoxid-Moleküle induziert (Schroder et al., 2004). TNFα und IFNγ werden über Mechanismen reguliert, welche die für die Bekämpfung intrazellulärer Pathogene nötigen cytotoxischen Effekte begrenzen und somit weitere Zell- oder Gewebeschäden minimieren. Zu den Mechanismen zählen die negative Rückkopplung über die Induktion eines Inhibitors des Signalweges sowie die Reduktion des IFNγ-Rezeptors auf der Zelloberfläche und eine Destabilisierung der mRNA für IFNγ, wodurch die Cytokinproduktion vermindert wird. Die Bedeutung von TNFα und IFNγ für die Immunabwehr wird offensichtlich, wenn Mäuse, denen die Gene für die Rezeptoren dieser Cytokine fehlen, mit L. monocytogenes infiziert werden: Im Gegensatz zu Wildtyptmäusen überleben sie die Listeriose nicht (Huang et al., 1993; Pfeffer et al., 1993; Rothe et al., 1993).

1.3.2 Die MHC-Klasse-I Epitope von Listeria monocytogenes

Die Bekämpfung der L. monocytogenes Infektion ist dann erfolgreich gewesen, wenn sämtliche infizierten Zellen eliminiert und die Gewebe, wie z.B. die Leber, wieder steril sind. Es wurde nachgewiesen, dass L. monocytogenes in Mäusen die Hepatocyten infiziert (Rogers et al., 1996), und dass in Zellkultur infizierte Hepatocyten durch CTLs lysiert werden (Jiang et al., 1997). Ferner können CTLs in das Leberparenchym einwandern und dort die Hepatocyten angreifen (Ando et al., 1994; Knolle und Gerken, 2000). Dies deutet darauf hin, dass in L. monocytogenes infizierten Mäusen die CTLs die Leber infiltrieren und dort gegen die Hepatocyten aktiv werden können. Eine Voraussetzung für die Lyse der infizierten Zellen ist, dass diese von den spezifischen CTLs erkannt werden, was wiederum die Präsentation von L. monocytogenes Epitopen auf MHC-Klasse-I Molekülen erfordert. Durch Elution der Epitope von MHC-Klasse-I Molekülen wurden insgesamt vier listerielle Epitope identifiziert, die aus der Mureinhydrolase p60, dem Cytolysin LLO und der Metalloprotease mpl stammen (Busch et al., 1999). Diese Proteine werden von L. monocytogenes in das Wirtscytosol sekretiert und sind infolgedessen dem Proteasomensystem zugänglich. Für eine Protasomen-abhängige Degradation der bakteriellen Proteine spricht, dass die Sekretion in das Cytosol essentiell für eine protektive, CTL-basierte Immunantwort ist (Shen et al., 1998) und die Inhibierung der Proteasomen eine Abnahme der präsentierten p60-Epitope bewirkt (Sijts et al., 1996). Darüber hinaus werden p60 und ActA in Abhängigkeit von der N-Terminus-Regel degradiert (Moors et al., 1999; Sijts et al., 1997). LLO enthält eine PEST-Sequenz, die ebenfalls als Hinweis auf Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau gilt (Decatur und Portnoy, 2000; Rechsteiner und Rogers, 1996). Bis jetzt allerdings existiert kein direkter Nachweis für die Epitopgenerierung aus bakteriellen Proteinen durch das Proteasomensystem.

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Die bislang untersuchten MHC-Klasse-I Epitope binden ausschließlich den MHC-Klasse-I Haplotyp H-2Kd (Busch et al., 1999). Eine neue Methode zur Epitopidentifizierung basiert auf dem Screening einer Peptidbibliothek, die sich aus überlappenden Dodecameren zusammensetzt. T-Zellen einer infizierten Maus werden mit dieser Peptidbibliothek inkubiert und die Erkennung eines Peptides durch Freisetzung von IFNγ gemessen. Angewandt auf p60- und LLO-Peptidbibliotheken konnten weitere Epitope identifiziert werden, unter anderem ein LLO-Epitop, welches an MHC-Klasse-I Moleküle vom Typ H-2Kb bindet (Geginat et al., 2001). Dieser Haplotyp wird auch von den Mausstämmen exprimiert, in denen die Gene für die TNFα- und IFNγ-Rezeptoren deletiert sind. Somit eignet sich das H-2Kb Epitop aus LLO, um die Immunreaktion auf L. monocytogenes in den beiden Deletionsstämmen zu untersuchen.

1.4 Massenspektrometrische Analyse der in vitro Prozessierungsexperimente

Bei der in vitro Prozessierung von Peptidsubstraten durch 20S Proteasomen entstehen komplexe Produktgemische. Die HPLC führt zu einer Auftrennung des Gemisches, dessen Peptide in einem direkt angeschlossenen Massenspektrometer identifiziert und quantifiziert werden können. Das Prinzip der Massenspektrometrie beruht auf 1. der Ionisierung von Molekülen, 2. der Auftrennung der Ionen entsprechend ihres Masse/Ladungs-Verhältnisses (m/z), 3. ihrer anschließenden Detektion und 4. ihrer Identifizierung durch ihre typischen molekularen Massen.

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Für die Analyse der Prozessierungsexperimente eignet sich die Elektrospray-Ionisierung (ESI), da hierbei die Probe in gelöster Form eingesetzt wird. Das Eluat der HPLC wird in ein elektrisches Feld gesprüht, in dem sich die positiv geladenen Probentröpfchen zur gegenüberliegenden Kathode bewegen. Die Verdampfung des Lösungsmittels erhöht in den Tröpfchen die Ladungsdichte und führt durch Coulomb-Explosion zum Zerfall in immer kleinere Tröpfchen und letztendlich zu einzelnen, desolvatisierten und positiv geladenen Molekülen. Diese werden über ein elektromagnetisches Fokussierungssystem in den Massenanalysator, die Ionenfalle, geleitet, wo sie für wenige Millisekunden akkumulieren. Durch Spannungsänderungen an den Elektroden werden die ionisierten Moleküle nach ansteigendem m/z aus der Ionenfalle entlassen. Die Detektion erfolgt mit einem Sekundärelektronenvervielfacher, der kleine Ionenströme durch Umwandlung in eine Elektronenkaskade nachweist. Eine Darstellungsform der Messergebnisse ist das dreidimensionale Chromatogramm, in welchem auf der x-Achse die Retentionszeiten aus der HPLC, auf der y-Achse die gemessenen Ionenströme und auf der z-Achse die m/z angegeben werden. Der Aufbau der HPLC-ESI-Ionenfalle ist in Abb. 6 gezeigt (Lottspeich und Zorbas, 1998; Schrattenholz, 2001).

Abb. 6 : Schematische Darstellung der HPLC-ESI-Ionenfalle und eines Chromatogramms. Durch eine Kapillare werden die Moleküle des HPLC-Eluats (rot) zwischen die Elektroden der ESI-Einheit (grün) gesprüht, deren Anode von der Kapillare gebildet wird. Hierbei erfolgt die Ionisierung der Moleküle. Nach der Fokussierung werden die ionisierten Moleküle in der Ionenfalle durch die Ringelektrode (hellblau) auf kreisförmige Bahnen gezwungen. Durch Zuschalten der Endkappenelektroden (dunkelblau) und daraus folgender Spannungsänderungen werden die Moleküle aus der Ionenfalle geworfen. Die Retentionszeit, der Ionenstrom und das m/z der detektierten Moleküle werden im Chromatogramm dargestellt. (Abbildung nach Dr. Katharina Janek)

Die Quantifizierung der Peptide erfolgt im Chromatogramm über die Integration der Fläche unterhalb des für ein Peptid spezifischen m/z-Peaks. Je mehr Peptid detektiert wird, desto größer ist die Fläche des Peaks. Die Peakfläche ist also ein Maß für die Peptidmenge und wird als Intensität ohne Einheiten angegeben. Da verschiedene Moleküle unterschiedlich gut ionisierbar und folglich auch unterschiedlich gut detektierbar sind (Cech und Enke, 2001), können nur relative Intensitäten miteinander verglichen werden: Die Intensitätszunahme eines Produktes kann der Intensitätsabnahme eines weiteren Produktes gegenübergestellt werden; die Aussage, dass das eine Peptid mengenmäßig häufiger vorhanden ist als das andere, ist allerdings nicht möglich.

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Im Prozess der Ionisierung können mehrere Ladungen auf ein Molekül übergehen. Ein Ion mit zweifacher Ladung bewegt sich im elektrischen Feld doppelt so schnell wie das gleiche, einfach geladene Molekül. Aus diesem Grund ist jenes zweifach geladene Molekül nicht von einem anderen Teilchen zu unterscheiden, das zwar doppelt so groß aber nur einfach geladen ist: Beide Moleküle werden gleichzeitig aus der Ionenfalle geworfen. Dies bedeutet, dass in der Massenspektrometrie nicht direkt die molekulare Masse sondern das schon erwähnte Masse/Ladungs-Verhältnis, m/z, detektiert wird. Um die Masse und damit die Identität eines Moleküls zu ermitteln, muss daher seine Ladungsstufe bekannt sein, die aus isotopenaufgelösten Massenspektren („Zoom Scans“) abgelesen wird. Je nach Aminosäuresequenz können verschiedene Peptide die gleichen molekularen Massen besitzen. Um trotzdem eine exakte Identifizierung zu gewährleisten, ist die zusätzliche Information über die Aminosäuresequenz erforderlich. Diese Möglichkeit bietet die Ionenfalle, da – im Gegensatz zu anderen Masseanalysatoren, wie z.B. dem einfachen TOF („Time of Flight“) – die fraglichen Moleküle im MS/MS-Experiment gezielt sequenziert werden können. Wurde ein Produkt der Prozessierungsexperimente einmal auf diese Weise in einem Sequenzierungslauf identifiziert, reicht die Kenntnis seines m/z sowie der definierten Retentionszeit aus, um es in den sich anschließenden Quantifizierungsläufen ebenfalls zu identifizieren.

1.5 Zielstellung

Das Proteasom degradiert defekte und nicht benötigte Proteine im Cytosol der Zelle. Ein Teil der dabei entstehenden Peptide fungiert als MHC-Klasse-I Epitope und stellt so eine Verbindung des Proteasomensystems mit der Immunabwehr her. Der Einfluss der proinflammatorischen Cytokine IFNγ und TNFα auf die Struktur und Funktion der Proteasomen wurde bislang nur in der Zellkultur analysiert. Diese stellt ein überschaubares System dar, welches aber von der komplexen Situation im Organismus sehr verschieden ist. Die vorliegende Arbeit sollte diese Lücke schließen. Hierfür wurde das immunphysiologisch gut charakterisierte murine Infektionsmodell mit Listeria monocytogenes gewählt in Kombination mit der Infektion von Mausstämmen, deren Gene für die Rezeptoren von IFNγ und TNFα deletiert wurden. Folgende Aspekte sollten bearbeitet werden:

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Die vorliegende Arbeit sollte die Beziehung zwischen Struktur und Funktion der isolierten 20S Proteasomen in Abhängigkeit von den Cytokinen IFNγ und TNFα aufzeigen und dies erstmalig auf der Basis eines infizierten Organismus untersuchen.


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24.05.2007