2 Material und Methoden

↓15

2.1  Material

2.1.1  Reagenzien und Chemikalien

AAF-CMK

Sigma

Acetonitril (für HPLC)

Baker

Acrylamid 30%, 29:1

AppliChem

Agarose

Serva

Ammoniumchlorid

Serva

Ammoniumsulfat

AppliChem

AmpholineTM

Amersham

Ampicillin

AppliChem

Amplify

Amersham

Aprotinin

AppliChem

Ammoniumpersulfat (APS)

Serva

Bacto-Agar

AppliChem

Bacto-Trypton

AppliChem

Bestatin

Sigma

beta-Mercaptoethanol

Serva

bovines Serum Albumin Fraktion V (BSA)

Serva

Bromphenolblau

AppliChem

Coomassie Brilliant Blue R250

Serva

Coumarinsäure

Sigma

DEAE Sephacel

Amersham

DEPC

Roth

Dinatriumhydrogenphosphat

AppliChem

DMEM-Glc--Medium

Biochrom

DMF

Sigma

DMSO

Fluka

DTT

Roth

Essigsäure

Merck

Ethanol

Baker

Ethidiumbromid

AppliChem

fötales Kälberserum (FCS)

Biochrom

fluorogene Peptidsubstrate

Bachem Biochemica, Calbiochem

Formaldehyd

Baker

D-1[-14C]Glucosamin

Amersham

Glycerol

Roth

H2O (für HPLC)

Baker

Hefeextrakt

Difco

HEPES

Roth

Isopropanol

Baker

Kaliumchlorid

Roth

Kaliumdihydrogenphosphat

AppliChem

Kalziumchlorid

Sigma

Kanamycin

Serva

L-Glutamin

Biochrom

Leupeptin

AppliChem

Luminol (3-Aminophthalhydrazid)

Fluka

Magnesiumacetat

Merck

Magnesiumchlorid

AppliChem

Magermilchpulver

Difco

Manganchlorid

Fluka

Methanol

Baker

35S-Methionin

ICN

MG132

Calbiochem

Molekulargewichtstandard: Protein prestained blue

Biolabs

Molekulargewichtstandard: Protein Rainbow

Amersham

Na-Doc (Desoxycholatsäure Natriumsalz)

Roth

Natriumazid

Merck

Natriumcarbonat

Sigma

Natriumchlorid

AppliChem

Natriumfluorid

Roth

Natriumhydroxid

AppliChem

Natriumthiosulfat

Sigma

Nonidet P40 (NP40)

AppliChem

Okadainsäure

Sigma

Orthovanadat

Sigma

Penicillin/Streptomycin

Seromed

PepstatinA

Sigma

Peptidsubstrate

Dr. Peter Henklein, Institut für Biochemie

PIC Complete (Proteinasen-Inhibitoren-Cocktail)

Roche

PharmalyteTM

Amersham

PMSF

Sigma

ProteinA-Sepharose

Amersham

RPMI-Medium

Biochrom

RMPI-Met--Medium

Biochrom

Saccharose

Roth

SDS

AppliChem

Servalyte®

Serva

Silbernitrat

Roth

TEMED

Serva

Trifluoressigsäure (TFA)

Fluka

Tris

AppliChem

Trypanblau-Stammlösung

Sigma

Tween20

Serva

WGA-Lectin, Peroxidase-gekoppelt

Sigma

Wasserstoffperoxid

Roth

Xylencyanol

Serva

2.1.2 Antikörper

↓16

anti-Delta (K43/7)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-LMP2 (K864/A)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-LMP7 (K63/5)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-MC14 (K53)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-MB1 (FB774)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-Mecl1 (K65/4)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-20S (K08)

Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel

anti-ClpC

Prof . P. Berche

anti-F4/80

Arbeitsgruppe PD Dr. U. Steinhoff, MPIIB

anti-O-GlcNAc (CTD110.6)

Covance

anti-O-GlcNAc (MA1-076)

Affinity Bioreagents

anti-KaninchenIgG, Peroxidase-gekoppelt (GAR)

Dianova

anti-MausIg, Peroxidase-gekoppelt (RAM)

Dako

2.1.3 Nukleinsäuren

dNTPs

Invitrogen

DNA-Längenstandard: 1 kb DNA-Marker

GibcoBRL

DNA-Längenstandard: 100 bp DNA-Marker

Fermentas

Vektor: pCR®2.1-TOPO

Invitrogen

Vektor: pCMV-Tag 3C

Stratagene

Oligo-dT-Pimer

BioTeZ Berlin-Buch GmbH

Primer ( Tab. 1 )

BioTeZ Berlin-Buch GmbH

siRNAs ( Tab. 2 )

eurogentec

Für die Klonierungen wurde der Escherichia coli Stamm DH5α (Arbeitsgruppe Prof. Dr. P.-M. Kloetzel) verwendet.

↓17

Tab. 1 : Verwendete spezifische Primer. Alle Primer wurden nach Reinigung durch Gelfiltration geliefert. Die Konzentration der Arbeitslösungen betrug 10 µM.

Name

Sequenz

NAG1_fwd

5´-GGATCCATGGTGCAGAAGGAGAGCCAGG-3´

NAG2_rev

5´-CCAGGTAGAAGCTTCTCACCC-3´

NAG2_fwd

5´-GGGTGAGAAGCTTCTACCTGG-3´

NAG3_rev

5´-GGTGAACATCCCCATCACTAGTGC-3´

NAG3_fwd

5´-GCACTAGTGATGGGGATGTTCACC-3´

NAG4_rev

5´-GTCGACTCACAGGCTTCGACCAAGTATAACC-3´

816-385-G2

5´-CACATGCACAAGTTTCCATC-3´

OGT1_fwd

5´-GGATCCATGGCGTCTTCCGTGGGCAACG-3´

OGT2_rev

5´-GGATGGCACGAGTATAACACTGC-3´

OGT2_fwd

5´-GCAGTGTTATACTCGTGCCATCC-3´

OGT3_rev

5´-CCATGAACAGTGCACCACTAGTCC-3´

OGT3_fwd

5´-GGACTAGTGGTGCACTGTTCATGG-3´

OGT4_rev

5´-GTCGACTCAGGCTGACTCGGTGACTTCAACAGGC-3´

Tab. 2 : Verwendete siRNAs. Die siRNAs waren HPLC-gereinigt und wurden in DEPC-H2O zu einer Konzentration von 100 µM aufgenommen.

Name

Sequenz

siNAG_1_s

5´-ACGCAAAUUGGACCAGGUCdTdT-3´

siNAG_1_as

5´-GACCUGGUCCAAUUUGCGU dTdT-3´

siOGT_2_s

5´-TGGCATCGATCTCAAAGCAdTdT-3´

siOGT_2_as

5´-TGCTTTGAGATCGATGCCAdTdT-3´

siKontrolle_s

5´-GCAGAAUCCGUAUCGCAAGdTdT-3´

siKontrolle_as

5´-CUUGCGAUACGGAUUCUGC dTdT-3´

2.1.4 Enzyme

DNA Polymerase: High Fidelitiy

Roche

DNA Polymerase: Pfu

Promega

DNA Polymerase: Taq

Invitrogen

Restriktionsenzyme

New England Biolabs

Reverse Transkriptase M-LV

Promega

RNAsin

Promega

Shrimp Alkalische Phosphatase

Roche

T4 Ligase

New England Biolabs

2.1.5 Kits

↓18

GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kits

Amersham

HighPure RNA Isolation Kit

Roche

QIAGEN Plasmid Midi Kit

QIAGEN

QIAprep Spin Miniprep Kit

QIAGEN

TOPO TA Cloning TM Kit

Invitrogen

2.1.6 Verbrauchsmaterialien

Centricon® Plus-20

Millipore

Combitips

Eppendorf

Einmalspritzen

Braun

Elektroporations-Küvetten

EquiBio

Kryoröhrchen

Nunc

Mikrotiter-Platten, schwarz

Greiner

Petrischalen

Greiner

PhastGel 4-15; native Pufferstreifen

Amersham

PVDF-Membran Immobilon-P

Millipore

Röntgenfilme: Xomat-UV/AR/Biomax-MR

Kodak

Sterilfilter 4,5; 0,2 µm

Schleicher & Schuell

Ultrazentrifugenröhrchen

Beckman Coulter

Whatman-Papier

Schleicher & Schuell

Zellkultur-Plastikwaren, steril

Falcon, Greiner

2.1.7 Geräte

ÄktaFPLC

Amersham

Dounce-Homogenator

Kontes Glass

Easyject Optima Elektroporator

EquiBio

Fluorimeter Fluostar Reader mit Easy Software

SLT / Tecan

Gradientenmischer

Werkstatt, Institut für Biochemie

Gradientenzapfanlage

Werkstatt, Institut für Biochemie

HPLC HP1100

Hewlett Packard

HPLC System Gold, Detektor 166

Beckman Coulter

HPLC-Säule Micra NPS ODS-I 1,5 ktm Säule

Bischoff chromatography

HPLC-Säule µRPC C2/C18 SC 2.1/10

Amersham

Kühlzentrifuge: Avanti J-25

Beckman Coulter

Kühlzentrifuge: GS-6R

Beckman Coulter

Kühlzentrifuge: GS-15R

Beckman Coulter

Kühlzentrifuge: RC24

Sorvall

Massenspektrometer, TSQ7000

Finnigan Mat

Massenspektrometer MALDI

Applied Biosystems

Mastercycler gradient

Eppoendorf

Mikroskop Leitz DMRD

Leica

MonoQ-Säule 5/5

Amersham

Phastsystem®

Pharmacia

Photometer: GeneQuant

Pharmacia

Photometer: UltrospecIII

Pharmacia

Rotor SS34

Sorvall

Rotor SW40

Beckman Coulter

Steril gard Hood classll A1 B3

Baker

Ultra-Turrax® T8

IKA®-Werke

Ultrazenrifuge: L-70

Beckman Coulter

Ultrazenrifuge: Ultra Pro 80

Sorvall

2D-Gelsystem

LabTech

2.1.8 Software

↓19

AIDA

Fuji

Extraktor-B5

Dr. Björn Peters

LCquan

ThermoFinnigan

OligonucleotideProtpertiesCalculator

www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html

SEQUEST 2.0

ThermoFinnigan

Visual Basics

Microsoft

Xcalibur

ThermoFinnigan

YinOYang

www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang

2.2 Methoden

2.2.1  Mäuse

2.2.1.1  Mausstämme und Listeria monocytogenes Infektion

In der vorliegenden Arbeit wurden ausschließlich Mäuse des H-2b Haplotyps verwendet. Es handelte sich um den Laborstamm C57Black/6 (Wildtypmäuse) sowie die vor diesem genetischen Hintergrund generiertem Stämme mit Deletion des IFNγ-Rezeptor (I-Tiere), beziehungsweise mit Deletionen von p55 und p75, den Rezeptoren für TNFα (T-Tiere). Die Tierhaltung erfolgte im Tierstall des Max-Planck-Institutes für Infektionsbiologie (MPIIB), und die Mäuse wurden freundlicherweise von PD Dr. Ulrich Steinhoff, MPIIB, mit 5x103 cfu Listeria monocytogenes intravenös in die Schwanzvene infiziert. Die Wildtypmäuse erholten sich vollständig von der Listeriose, während die I-Tiere am 4./5. Tag post Infektion (p.i.) und die T-Tiere am 3. Tag p.i. der Listeriose erlagen. Somit wurden Tötung und Organentnahme bei den Wildtypmäusen am Tag 0, 2, 6 und 27 p.i., bei den I-Tieren am Tag 0, 2 sowie 4 p.i. und bei den T-Tieren am Tag 0 und 2 nach der Infektion durchgeführt. Dünndarm und Colon wurden mit 1x PBS gespült, während Milz und Leber nicht weiter behandelt wurden. Die Organe wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und gelagert. Die Infektion wurde dreimal wiederholt.

↓20

2.2.1.2 Bestimmung der Bakterientiter in Organen

Die Bakterientiter in den Organen wurden im Rahmen eines gemeinsamen Projektes von Thorsten Joeris, MPIIB, bestimmt. Hierfür wurden die Organe in RMPI-Medium mit dem Ultra-Turrax® zerkleinert, 10fach in PBS verdünnt und auf Tryptic-Soy-Agar ausgestrichen. Die Colon- und Dünndarm-Homogenate wurden auf Palcam-Listeria-Selektiv-Agar (VWR International) ausplattiert, damit gegen die intestinale Mikroflora selektioniert werden konnte. Nach 16 h bei 37°C wurden am nächsten Tag die gewachsenen Kolonien gezählt.

2.2.1.3 Herstellung der Organhomogenate für die Präparation von 20S Proteasomen

Für die Präparation von 20S Proteasomen ( 2.2.2.1 ) aus den verschiedenen Organen wurden die Gewebe von bis zu fünf Tieren im halb-gefrorenen Zustand in 10-30 ml gekühlten Lysepuffer gegeben und mit dem Ultra-Turrax® auf Eis zerkleinert. Anschließend wurden die Gewebezellen in einem Douncer durch 20maliges Stampfen aufgeschlossen und das Homogenat bei 45000 xg, 30 min, 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Mullbinden gefiltert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Bei der Lyse der Organe aus dem dritten Infektionsansatz wurden zusätzlich Phosphataseinhibitoren eingesetzt.

↓21

2.2.1.4 Herstellung der Organhomogenate für Cytokinbestimmung

Nach dem Austesten verschiedener Lysetechniken und Lysepuffer wurde für die Cytokinbestimmung ( 2.2.4.4 ) folgende Methode angewandt: Frische Organe wurden im Cytokin-Lysepuffer mit dem Ultra-Turrax® homogenisiert und bei 45000 xg, 30 min mehrfach zentrifugiert. Das Homogenat wurde für die Cytokinbestimmung verwendet.

2.2.2 Biochemische Methoden

2.2.2.1  Präparation von 20S Proteasomen

↓22

Die zügig aufgetauten Gewebehomogenate ( 2.2.1.3 ) oder frischen Zell-Lysate ( 2.2.6.3 ) wurden mit äquilibriertem DEAE Sephacel bei 4°C auf einem Rad inkubiert. Nach 1 h wurde das DEAE Sephacel in eine Säule überführt und mit 70-150 ml eiskaltem TEAD-50 gewaschen, bis der Proteingehalt des Durchlaufs bei der A280-Messung einen Wert unter 0,08 aufwies (siehe auch 2.2.2.2 ). Der Waschschritt wurde mit eiskaltem TEAD-150 wiederholt und die gebundenen Proteine durch gekühltes TEAD-350 in zwanzig 2 ml Fraktionen auf Eis eluiert. Die proteolytisch aktiven Fraktionen ( 2.2.2.13 ) wurden vereinigt und einer fraktionierten Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen. Um zu einer 35%igen Sättigung zu gelangen, wurden pro 10 ml DEAE-Pool 1,94 g Ammoniumsulfat unter ständigem Rühren auf Eis hinzugegeben. Nach weiteren 30 min Rühren wurde der Ansatz bei 25000 xg, 10 min, 4°C abzentrifugiert. Der Überstand wurde mit 2,91 g pro 10 ml auf 80% Sättigung gebracht, 30 min auf Eis gerührt und dann bei 19000 xg, 4°C, 20 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 600 µl TEAD-50 auf Eis langsam gelöst, noch einmal bei 19000 xg, 10 min, 4°C geklärt und anschließend auf einen 10-40%ige Saccharosegradienten geladen. Die Zentrifugation erfolgte bei 2,8x105 xg, 4°C, 16 h. Das Fraktionieren der Gradienten von unten wurde durch eine Gradientenzapfanlage ermöglicht. Die erhaltenen Fraktionen wurden entsprechend ihrer Aktivitäten gepoolt, 1:10 mit PufferA verdünnt, filtriert und dann in der ÄktaFPLC mit 1 ml/min auf eine MonoQ-Säule geladen. Der Stufengradient verlief von 0% zu 20% PufferB in 3 ml, darauf folgte die flachere Elutionsstufe zu 35% PufferB in 20 ml und zum Schluss ein Reinigungsschritt auf 100% PufferB in 3 ml. Die 1 ml Fraktionen wurden unter dem Aspekt der proteolytischen Aktivität und des Proteingehaltes nach A280 Messung ( 2.2.2.2 ) vereinigt. Es folgte ein Umpuffern und Konzentrieren in TEAD-50 mittels der Centricons® Plus-20 laut Herstellerangaben.

2.2.2.2 Bestimmung der Proteinkonzentration

Der Proteingehalt wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm ermittelt (A280). In der vorliegenden Arbeit wurden die Konzentration von isolierten Proteasomen oder die Gesamtproteinkonzentration in Homogenaten bestimmt. Für A280 = 1 wurde eine Konzentration von 1 µg/µl angenommen und der spezifische Extinktionskoeffizient vernachlässigt. Somit konnten zwar keine korrekten absoluten Konzentrationsangaben gemacht werden, aber die Verhältnisse der eingesetzten Proteasomen- oder Proteinmengen waren identisch.

2.2.2.3 Proteinfällung

↓23

Zur Proteinfällung wurde die Proteinlösung mit dem 2,5fachen Volumen an 100% EtOH versetzt, gemischt und mindestens 1 h bei -80°C inkubiert. Es schloss sich eine Zentrifugation bei 19000 xg, 4°C, 30 min an sowie das Waschen des Pellets mit 70% EtOH. Die luftgetrockneten Pellets wurden bei 4°C aufbewahrt.

2.2.2.4 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Aktivitätstest im Gel

In der native Gelelektrophorese wurden 0,7 µg Proteasom eingesetzt. Die Trennung erfolgte im Phast-System mit einem 4-15% Gradientengel bei 15°C und 110 Vh. Das Gel wurde mit Overlay-Puffer bedeckt und 15 min bei 37°C inkubiert. Die Aktivität der Proteasomen und eventuell kontaminierender kleinerer Proteasen konnte nach Anregung mit UV-Licht detektiert werden.

2.2.2.5 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli

↓24

Für die Auftrennung in der denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (Laemmli, 1970) wurden die Proben mit 4x SDS-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C denaturiert, 1 min bei 19000 xg zentrifugiert und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit 80 V für 20 min begonnen und dann mit 130 V für 1-2 h weitergeführt, entsprechend der Acrylamidkonzentrationen im Trenngel.

2.2.2.6 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow

Für die Auftrennung in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow (Schagger und von Jagow, 1987) wurden die Proben mit 4x Schagger-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95°C denaturiert, 1 min bei 19000 xg zentrifugiert und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde mit 30 V für 60 min begonnen und dann mit 85 V für 16 h weitergeführt.

↓25

2.2.2.7 Mini-2D-Gelelektrophorese

Die Separierung der Proteine nach ihrem isolektrischen Punkt in der 1. Dimension erfolgte mittels der „Non-equilibrium pH gradient elektrophoresis“ (NEPHGE). Die Gele der 1. Dimension wurden mithilfe von Kanülen 6,5 cm hoch in Glasröhrchen mit 1 mm Durchmesser gegossen. Die Röhrchen wurden mit einem Wassertropfen verschlossen und für mindestens 16 h zum Auspolymerisieren senkrecht stehen gelassen. 10 µg Proteasom wurden wie in 2.2.2.3 beschrieben gefällt, das Pellet in 10 µl 2D-Probenpuffer aufgenommen und durch mindestens 3 h Schütteln sowie intensives Pipettieren gelöst. Die Probe wurde auf die anodischen Seite des 1.Dimensions-Geles geladen und mit ca. 10 µl Überschichtungspuffer bedeckt. Die isoelektrische Fokussierung verlief 4 h bei 400 V. Unter Zuhilfenahme von Glycerol und Druckluft wurde das 1.Dimensions-Gel aus dem Röhrchen gedrückt und anschließend in 3 ml Äquilibrierungspuffer entweder 15 min inkubiert oder bei -20°C eingefroren. Eingefrorene Gele wurden nach dem Auftauen nicht zusätzlich in Äquilibrierungspuffer inkubiert. In der 2. Dimension erfolgte die Proteintrennung nach dem Prinzip der SDS-PAGE mittels einem 15%igen Trenngel ( 2.2.2.5 ). Hierfür wurde das 1.Dimensions-Gel nach der Äquilibrierung oder dem Auftauen luftblasenfrei auf das Sammelgel gelegt und die Elektrophorese wie in 2.2.2.5 beschrieben durchgeführt.

50-80 µg Proteasom wurden mittels der hochauflösenden 2D-Großgeltechnik durch Dr. Ursula Zimny-Arndt, MPIIB, separiert.

↓26

2.2.2.8 Elektrotransfer von Proteinen auf PVDF-Membran

Die in der Gelelektrophorese aufgetrennten Proteine ( 2.2.2.5 , 2.2.2.6 , 2.2.2.7 ) wurden elektrophoretisch auf eine PVDF-Membran überführt. Hierbei wurde das diskontinuierliche Puffer-System in der Semidry-Blotkammer angewandt. Drei in Kathodenpuffer getränkte Lagen Whatman-Papier wurden auf die Kathode der Blotkammer gelegt. Es folgten das Gel, die in 100% Methanol aktivierte PVDF-Membran sowie je zwei in Anodenpuffer II bzw. I getränkte Lagen Whatman-Papier. Der Transfer erfolgte bei 400 mA für 60 min. Anschließend wurde die Membran mit Bleistift markiert und beschriftet.

2.2.2.9 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen und PVDF-Membranen

Für den unspezifischen Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membranen sowie in Polyacrylamidgelen eignete sich die Coomassie-Färbung. Hierfür wurden Membranen bis zu 5 min, Gele bis zu 30 min in der Coomassie-Lösung geschwenkt. Die Gele wurden mit Coomassie-Entfärber entfärbt, während für Membranen 50% Methanol zur Entfärbung verwendet wurde.

↓27

2.2.2.10 Densitometrische Auswertung Coomassie-gefärbter 2D-Gele

Die mit der Großgeltechnik von Dr. Ursula Zimny-Arndt, MPIIB, erstellten Coomassie-gefärbten 2D-Gele wurden eingescannt und ohne weitere Bearbeitung der Helligkeit oder Kontraste mit der AIDA-Software ausgewertet. Für jeden einzelnen Spot wurde den Färbeverhältnissen an dieser Stelle im Gel entsprechend der Hintergrund neu definiert und subtrahiert. Die Färbeintensität einer proteolytisch aktiven Untereinheit und ihrer korrespondierenden Immuno-Untereinheit wurde auf 100% gesetzt. Aus drei Experimenten wurden die prozentualen Anteile aller Immuno-Untereinheiten an den Gesamtintensitäten der jeweiligen Paare gemittelt. Der Mittelwert stellte somit den durchschnittlichen prozentualen Anteil der Immunoproteasomen in einem Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Infektion dar. Der einseitige heteroskedastische t-Test (Welch-Test) mit p < 0,05 wurde angewandt, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion zu ermitteln.

2.2.2.11 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen

Durch Silberfärbung lassen sich in Polyacrylamidgelen geringere Proteinmengen nachweisen als mit der Coomassie-Färbung ( 2.2.2.9 ). Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel dreimal à 20 min in Methanol-Fixierer geschwenkt. Dieser Schritt entfiel, wenn das Gel schon Coomassie-gefärbt war. Nach dreimaligem Schütteln in 50% EtOH wurde das Gel für 1 min in 1x Reduzierer inkubiert und daraufhin dreimal für je 20 sec in MilliQ-H2O gewaschen. Es folgten die Färbung für 20 min in Silberlösung und ein zweimaliges Waschen je 20 sec in MilliQ-H2O. Das Gel wurde so lange in Entwickler geschwenkt, bis die Proteinspots gut sichtbar waren, und dann sofort kurz in MilliQ-H2O gewaschen. Methanol-Fixierer stoppte die Reaktion und diente auch zur Aufbewahrung des Gels.

↓28

2.2.2.12 Zuckeridentifizierung mittels Lektinen

Lektine sind Zucker-bindene Glycoproteine. „Wheat Germ Agglutinin“ (WGA) bindet GlcNAc und Tritrichomonas mobilensis Lektin (TML) erkennt Sialinsäure auf geblotteten Proteinen ( 2.2.2.8 ). Zur Detektion von GlcNAc wurde die Membran über Nacht bei 4°C mit PBST1 geblockt und dann in mit PBST 1:700 verdünntem, Peroxidase-gekoppeltem WGA für 2h, RT geschwenkt. Es folgten zweimaliges Spülen sowie 4x 20 min Waschen in PBST und Spülen in 1x PBS mit anschließender ECL-Reaktion ( 2.2.4.1 ). Zum Nachweis von Sialinsäure wurde die Membran über Nacht, RT mit hS-TBST2 blockiert, 2x 5 min in hS-TBST0.05 gewaschen, kurz mit Lektinpuffer gespült und dann in TML-Lektionlösung über Nacht, RT inkubiert. Nach 3x 5min Waschen mit hS-TBST0.05 wurde zur Bindung des Biotin-gekoppelten TMLs die Membran 1 h, RT mit Extravidin-Peroxidase geschüttelt, welche in hS-TBST0.05 1:2000 verdünnt war. Die ECL-Reaktion wurde nach erneutem Waschen mit 2x 5 min hS-TBST0.05 und 1x 5 min hS-TBS durchgeführt.

2.2.2.13 Aktivitätstest mit fluorogenen Substraten

↓29

Der Aktivitätstest mit fluorogenen Substraten erfolgte mit 1 ng/µl Proteasom in Mikrotiterplatten. Die Substrate Suc-LLVY-AMC und Z-GGL-AMC wurden in 1x TEAD ( 2.2.2.1 ) in den finalen Konzentrationen 0 – 15,6 – 31,3 – 62,5 – 125 µM eingesetzt; die Substrate Boc-VGR-AMC sowie Z-LLE-βNA in den finalen Konzentrationen 0 – 37,5 –75 – 150 – 300 µM. Die Ansätze wurden für 0 – ½ – 1 – 1½ – 2 – 3 – 4 – 5 h bei 37°C inkubiert und dann im Fluorimeter vermessen. Folgende Messparameter wurden gewählt: „Anzahl der Blitze“ 10, „Gain“ 30, „Extinction“ 390 nm, „Emission“ 460 nm. Die fluorogene Gruppe -βNA wurde mit „Extinction“ 355 nm, „Emission“ 405 nm gemessen.

2.2.2.14 Proteolytische Prozessierung von Modellpeptiden

Die in vitro Prozessierung von Modellpeptiden wurde mit drei unterschiedlichen Substraten durchgeführt. Das Peptidsubstrat „pp89“ (RLMYDMYPHFMPTNLGPSEKRVWMS) stammt aus dem gleichnamigen Protein des murinen Cytomegalovirus (Aminosäuren 162-186), „Hsp60“ (VATISANGDKDIGNIISDAMKKVGRKGVIT) stammt aus HSP60 der Maus (Aminosäuren 171-200) und „LLO“ (AYISSVAYGRQVYLKLSTNSHS TKVKA) beinhaltet eine Sequenz des ListeriolysinO (Aminosäuren 291-317). In den Verdaus wurden 10 ng/µl Proteasom eingesetzt sowie 100 ng/µl pp89-Substrat, 25 ng/µl Hsp60-Substrat oder 30 ng/µl LLO-Substrat. Die Inkubation erfolgte bei 37°C für 0 – 4 – 20 h bei Verwendung von pp89 und Hsp60 bzw. für 0 – 2 – 4 – 8 h im Fall von LLO und wurde durch Zugabe von TFA auf eine Endkonzentration von 0,1% TFA und Einfrieren bei -20°C gestoppt. Als Inhibitoren wurden MG132 und AAF-CMK in der finalen Konzentration von 2 µM verwendet.

2.2.2.15 Analytische Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)

↓30

10 µl der Prozessierungsansätze ( 2.2.2.14 ) wurden mittels Reverse-Phase-HPLC über eine NPS RP18 1,5 µm Säule getrennt. Der Gradient begann bei 0% HPLC-LaufmittelB für 5 min, stieg auf 40% in 20 min, dann auf 100% in 2 min. Die Flussrate betrug 500 µl/min. Die Detektion erfolgte bei 220 nm.

2.2.3 Massenspektrometrie

2.2.3.1  Massenspektrometrische Analyse der Prozessierungsprodukte

Zur Identifizierung und Quantifizierung wurden die Prozessierungsprodukte massenspektrometrisch untersucht. Hierfür wurden 30 µl des Verdauansatzes ( 2.2.2.14 ) mit 20 µl des frisch angesetzten internen Peptidstandards „9GPS“ (YPHFMPTNLGPS) vermischt und bei 4°C bis zu 30 h gelagert. Die Probenauftragung in das HPLC-System HP1100 erfolgte automatisch und die eluierten Fragmente wurden durch Elektrospray-Ionisierung (ESI) direkt in das angeschlossene Tandemquadrupol Massenspektrometer mit Ionenfalle TSQ7000 injiziert (HPLC-ESI-Ionenfalle). Die Geräte wurden mit der Xcalibur-Software gesteuert. Bei der Standardmethode wurde die chromatografische Trennung in der HPLC mit 0,2 ml/min für 4 min bei 25% LaufmittelB begonnen, gefolgt vom Anstieg auf 85% LaufmittelB in 15 min. Zur Reäquilibrierung wurde innerhalb von 1 min auf 100% LaufmittelB erhöht, 3 min gewaschen, zum Schluss LaufmittelB innerhalb von 2 min auf die Ausgangskonzentration gesenkt und weitere 11 min gewaschen. Dieser Gradient wurde für die Verdauanalysen mit pp89- und Hsp60-Substrat verwendet. Für die Trennung des LLO-Degradationsansatzes verlief der Gradient in den obengenannten Zeitparametern allerdings von 15% bis 95% LaufmittelB. Die Flussrate wurde nach der HPLC auf 0,07 ml/min reduziert. Das Eluat der ersten 8 min des Gradientenlaufes wurde verworfen; das folgende Eluat wurde über ESI in die auf 200°C geheizte Kapillare gespritzt und im Positivmodus analysiert. Ein Scan umfasste das m/z von 300 bis 14000 in 1,8 sec („Full Scan“), demnach wurden pro Probe während der 28-minütigen Messzeit über 900 Scans durchgeführt.

↓31

2.2.3.2 Identifizierung der Prozessierungsprodukte: Erstellung von Schnittkarten

Um einen Überblick über die von den Proteasomen generierten Peptide zu bekommen, wurde die Schnittkarte für das LLO-Substrat neu angelegt bzw. die Schnittkarten des pp89- und Hsp60-Substrates überarbeitet. Der Probenansatz hierfür sowie die HPLC-Methode entsprachen den Angaben in 2.2.3.1 , während für diese Sequenzierungsläufe die Einstellungen des Quadrupols modifiziert wurden: Nach jedem Full Scan wurde ein isotopenauflösender Scan +/- 5 m/z um das im Full Scan dominanteste m/z durchgeführt, der sogenannte „Zoom Scan“. Im sich anschließenden „MS/MS Scan“ wurde das Peptid mit diesem m/z durch Kollision mit Heliumgas fragmentiert und die entstandenen Fragmente im Scan analysiert. Der Zoom Scan lieferte die Information über die Ladungsstufe des m/z, so dass die molekulare Masse des Peptides ermittelt werden konnte. Der folgende MS/MS Scan wurde zur Sequenzierung des Peptides mit dieser Masse genutzt und diente damit der eindeutigen Identifizierung dieses Verdauproduktes: In der Kollision mit Helium brechen bevorzugt die Peptidbindungen, so dass sich viele der entstehenden Fragmente um die Masse einer Aminosäure unterscheiden. Die Differenzen zwischen den Fragmentmassen entsprechen also den einzelnen Aminosäuren und damit zusammengenommen der Sequenz des analysierten Peptides. Das Programm SEQUEST (Version 2.0) führte diese Berechnungen durch und lieferte mehrere Vorschläge, die manuell verifiziert werden mussten. Neben der Quadrupoleinstellung, immer das dominanteste m/z zu untersuchen, konnte die Einstellung auch so vorgenommen werden, dass entweder bestimmte m/z bevorzugt analysiert oder aber vollständig ausgeschlossen wurden. Die Aktivierung der „dynamic exclusion“ resultierte darin, dass ein m/z nicht mehr als z.B. dreimal hintereinander durch Zoom Scan und MS/MS Scan vermessen wurde und stattdessen die zweit- und drittintensivsten m/z untersucht wurden.

2.2.3.3 Auswertung und Kinetik der Prozessierungsprodukte

In den Quantifizierungsläufen identifizierte die LCquan-Software ausgewählte Prozessierungsprodukte durch eine Kombination aus Retentionszeit in der HPLC und m/z der massenspektrometrischen Messung. Das Programm integrierte den so gefundenen Peak,und die erhaltenen Intensitäten wurden als Maß für die Menge des Prozessierungsproduktes in jeder Probe verwendet. Aus diesen Daten wurde in einer Zwischenauswertung mit dem Extraktor-B5-Programm eine Kinetik über die Inkubationszeit für jedes Prozessierungsprodukt erstellt.

2.2.3.4 Excel-Programm zur statistischen Analyse der Produktgenerierung

↓32

Mit den Proteasomen aus zwei unterschiedlichen Infektionsansätzen erfolgten je zwei Prozessierungsexperimente. Alle Proben eines Verdauexperimentes, die mit dem gleichen Peptidsubstrat durchgeführt wurden ( 2.2.2.14 ), wurden in demselben Lauf vermessen. Da aber aus gerätetechnischen Gründen die Detektionssensitivität und somit die Intensitäten zwischen den verschiedenen Läufen stark schwankten, wurden alle Peptide auf den jeder Probe zugesetzten internen Standard 9GPS ( 2.2.3.1 ) normiert. Aus diesen korrigierten Daten wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen gebildet. Der einseitige heteroskedastische T-Test (Welch-Test) mit p < 0,05 wurde angewandt, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten zu erkennen. Zur Berechnung und einfacheren Handhabung der großen Datenmenge wurde mit Unterstützung von Dr. Björn Peters ein Excel-Programm in Visual Basic geschrieben.

2.2.3.5 Erstellung der Eichreihen für ausgewählte Prozessierungsprodukte

Zur Erstellung der Eichreihen für ausgewählte Prozessierungsprodukte des LLO-Substrates wurden das LLO-Substrat, der Precursor 4-14, das Epitop 6-14, das Epitop 7-14 und das Antitop 4-12 in verschiedenen Konzentrations-Zusammensetzungen gemischt und mit der HPLC-ESI-Ionenfalle nach dem in 2.2.3.1 beschriebenen Vorgehen für das LLO-Substrat analysiert. Die unterschiedlichen Zusammensetzungen enthielten die in Tab. 3 angegeben Fragmentmenge je 40 µl Probe.

Tab. 3 : Konzentrations-Zusammensetzung der ausgewählten LLO-Prozessierungsprodukte für die Eichreihen. Es sind die pmol der jeweiligen synthetisierten Peptide in 40 µl Probe angegeben. Pre – Epitopprecursor; Epi – Epitope; Anti – Antitop.

Probe

LLO-Substrat

Precursor
4-14

Epitop
6-14

Epitop
7-14

Antitop
4-12

Pre=Epi=Anti

Ia

50

1

1

1

1

Ib

50

5

5

5

5

Ic

50

10

10

10

10

Id

50

20

20

20

20

Pre=Epi<Anti

IIa

50

1

1

1

5

IIb

50

1

1

1

10

IIc

50

5

5

5

10

IId

50

5

5

5

20

Pre=Epi>Anti

IIIa

50

5

5

5

1

IIIb

50

10

10

10

1

IIIc

50

10

10

10

5

IIId

50

20

20

20

5

2.2.3.6 Epitop-Antitop Auswertung durch Verhältnisbildung

↓33

Um eine Änderung in der Schnittpräferenz der Proteasomen festzustellen, wurde die Generierung der immunologisch relevanten Verdauprodukte wie MHC-Klasse-I Epitop und Epitopprecursor mit der Generierung von sogenannten Antitopen verglichen. Als Antitope werden im Folgenden Peptide bezeichnet, deren Produktion eine mögliche Weiterprozessierung zu immunologisch relevanten Peptiden ausschließt, weil das Antitop durch einen Schnitt innerhalb der Epitopsequenz generiert wird. Die normierten Intensitäten von Epitop und Epitopprecursor wurden ins Verhältnis zu den normierten Intensitäten der in derselben Probe vorhandenen Antitope gesetzt. Hierdurch konnte eine Änderung im Verhältnis dieser Peptide zueinander nach der Infektion dargestellt werden.

2.2.3.7 Proteinidentifizierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie

Durch die „Peptide Mass Fingerprint“ Analyse in der MALDI-TOF Massenspektrometrie kann die Identität eines Proteins je nach der Aminosäuresequenzabdeckung eindeutig festgestellt werden. Aus Coomassie-gefärbten Gelen ( 2.2.2.9 ) wurden Banden und Spots unter keratinfreien Bedingungen ausgeschnitten. Der folgende Trypsinverdau, die Elution der Peptide aus dem Gel sowie die MALDI-TOF Messung und Auswertung wurden freundlicherweise von Dr. Katharina Janek und Dr. Sabine Baumgart durchgeführt.

2.2.4 Immunologische Methoden

2.2.4.1  Spezifische Protein- und Zuckeridentifizierung mittels Westernblotanalyse

Auf PVDF-Membran geblottete Proteine ( 2.2.2.8 ) sowie ihre posttranslationalen Modifikationen können mittels Immunodetektion durch Antikörper (Westernblot) spezifisch nachgewiesen werden. Die Membranen wurden über Nacht bei 4°C mit Blockpuffer blockiert und anschließend mit dem primären Antikörper 2 h, RT inkubiert. Es folgten vier Waschschritte à 15 min mit Waschpuffer und die Inkubation 1 h, RT mit Peroxidase-gekoppeltem sekundärem Antikörper GAR. Nach erneutem Waschen 4x 15 min und Spülen in 1x PBS wurde zur Detektion ECL-Reagenz auf die Membran gegeben und die Chemilumineszenzsignale auf einem Röntgenfilm visualisiert. Dieses Standardprotokoll wurde für die Immunodetektion von Zuckereinheiten optimiert und die entsprechenden Verdünnungen und Puffer in Tab. 4 zusammengefasst. Bei Verwendung des Antikörpers CTD110.6 gegen O-GlcNAc wurde nach der Inkubation mit dem 1.Ak nur 3x, jedoch nach dem 2.Ak 5x für je 15 min gewaschen. Membranen, die mit dem anderen Antikörper gegen O-GlcNAc, MA-I, inkubiert werden sollten, wurden vor dem Blocken 1 h in 1x PBS auf 70°C erhitzt. Die Waschschritte wurden zudem auf 5x und 8x 10 min erhöht.

↓34

Tab. 4 : Übersicht zu den verwendeten Antikörper-Verdünnungen und Puffern bei Protein- und Zucker identifizierung mittels Westernblot. Die Spalte „Verd.“ enthält die Verdünnung des 1. Antikörpers (1.Ak) im Verhältnis von 1 zu der angegebenen Zahl. Der 2. Antikörper (2.Ak) GAR wurde immer in der Verdünnung 1:10000, der 2. Antikörper RAM immer in der Verdünnung 1:1000 eingesetzt. Für alle Verdünnungen wurde der in der Spalte „Ak-Puffer“ genannte Puffer verwendet. Bei Benutzung von MA-I wurde die Verdünnung des 1.Ak und das anschließende Waschen mit hS-PBST durchgeführt, während beim 2.Ak PBST genutzt wurde.

1.Ak

Verd.

2.Ak

Ak-Puffer

Blockpuffer

Waschpuffer

anti-Delta

20000

GAR

PBST-M2

PBST-M5

PBST

anti-LMP2

1000

anti-LMP7

30000

anti-MC14

5000

anti-MB1

7000

anti-MECL1

2000

anti-ClpC

1000

CTD110.6

5000

RAM

TBST-BSA2

TBST-BSA4

TBST

MA-I

5000

hS-PBST, PBST

hS-PBST-BSA

hS-PBST, PBST

2.2.4.2 Immunopräzipitation von radioaktiv markierten 20S Proteasomen

Aus den in 2.2.6.5 und 2.2.6.6 hergestellten radioaktiv markierten Zell-Lysaten wurden 20S Proteasomen mittels Immunopräzipitation isoliert. Dazu wurden 10 µl Lysat aus der 14C-Markierung und 5 µl Lysat der 35S-Markierung im Scintillationszähler vermessen. Der 700 µl Präzipitationsansatz bestand aus 5x106 cpm 14C-Lysat, bzw. 1x107 cpm 35S-Lysat, 143 µg/ml BSA, 5 µl anti-K08 Antikörper sowie 1x PIC Complete und wurde mit IP-Lysepuffer ( 2.2.6.5 ) aufgefüllt. Die Proteasom-Antikörper-Bindung erfolgte über Nacht bei 4°C auf einem Rollator. Am nächsten Tag wurde 1/10 Volumen ProteinA/G-Sepharose50% zugegeben und die Antikörper-ProteinA/G-Bindung in weiteren 2 h auf dem Rollator bei 4°C vollzogen. Die Sepharose wurde durch Zentrifugation bei 4°C, 2 min, 2000 xg pelletiert und der Überstand verworfen. Es folgten dreimaliges Waschen mit 200 µl RIPA-Puffer und je 5 min Inkubationen auf dem Rollator bei 4°C; anschließend wurde die Prozedur mit PBS und zuletzt mit MilliQ-H2O wiederholt. Die Sepharose wurde in 20 µl 2x SDS-Probenpuffer 5 min aufgekocht und die im Probenpuffer denaturierten Proteine auf ein SDS-Gel ( 2.2.2.5 ) geladen. Das Gel wurde zur Fixierung der Proteine 15 min in Coomassie-Entfärber ( 2.2.2.9 ) geschwenkt, dann zur Verstärkung des radioaktiven Signals 30 min in Amplify inkubiert und hinterher auf Whatman-Papier getrocknet. Die radioaktiven Signale wurden auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht.

↓35

2.2.4.3 Immunofluoreszenz

Die Immunofluoreszenzen wurden freundlicherweise im Rahmen eines gemeinsamen Projektes von Dagmar Oberbeck-Müller, MPIIB, erstellt. Die 5 µm dicken Gefrierschnitte der Gewebe wurden 10 min in 4% Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C gelagert. Zur Vorbereitung der Färbung wurden die Gewebeschnitte dreimal 5 min mit 50 mM NH4Cl in 1x PBS inkubiert und anschließend durch 30 min 0,1% NP40 in 1x PBS permeabilisiert. Die Blockierung erfolgte durch 15 min Inkubation mit 15% FCS. Die primären Antikörper anti-LMP2, anti-LMP7 oder anti-Mecl1 wurden für 1 h in einer 1:75 Verdünnung auf die Schnitte gegeben. Der sekundäre Antikörper war Cy2-gekoppelt und wurde 45 min in einer 1:200 Verdünnung eingesetzt. Es folgte die Inkubation mit dem Antikörper anti-F4/80 für 45 min in der Verdünnung 1:50 und dann die Inkubation mit dem sekundären Cy3-gekoppelten Antikörper für 45 min in einer Verdünnung von 1:200.

2.2.4.4 Bio-Plex Immunoassay zur Cytokinbestimmung aus Serum und den Organhomogenaten

↓36

Die Bestimmung der Cytokine im Serum und in den Organenhomogenaten wurde im Rahmen einer Kooperation von Thorsten Joeris, MPIIB, ausgeführt. Blut wurde in Serum-Separationsgefäßen gesammelt, 30 min zur Gerinnung stehen gelassen und dann bei 10000 xg für 5 min zentrifugiert. Das so erhaltene Serum wurde in Serum Dilutent verdünnt, während die Organhomogenate ( 2.2.1.4 ) mit PBS auf 0,9 mg/ml gebracht wurden. Die Cytokinbestimmung erfolgte im Bioplex Bead Array System nach den Angaben des Herstellerprotokolls.

2.2.5 Molekularbiologische Methoden

2.2.5.1  RNA-Isolation aus RMA-Zellen

Für die Isolation von RNA wurden 2x106 Zellen bei 4°C, 3 min, 250 xg pelletiert und in dem „HighPureRNA Isolation Kit“ eingesetzt. Die Vorgehensweise entsprach dem Protokoll des Herstellers. Die isolierte Gesamt-RNA wurde bei -80°C gelagert.

2.2.5.2 Reverse Transkription der RNA in cDNA

5 µg der isolierten Gesamt-RNA wurden mit 50 µM Oligo-dT-Primern in einem 17 µl Ansatz mit DEPC-H2O 10 min bei 30°C denaturiert und danach sofort auf Eis gestellt. Der Ansatz wurde mit final 1 mM dNTPs, 1,6 U/µl RNAsin, 12 U/µl Reverse Transkriptase und dem dazugehörigen Puffer auf 25 µl gebracht. Die reverse Transkription erfolgte bei 42°C, 1 h mit anschließender Kühlung auf 4°C, 2 min und einer Inaktivierung der Transkriptase bei 95°C, 2 min. Die cDNA-Proben wurden bei -20°C aufbewahrt.

2.2.5.3 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Ketten-Reaktion

↓37

Ein Standard-Ansatz der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) beinhaltete je 0,5 µM des Vorwärts- und Rückwärtsprimers, 200 µM dNTPs, 10% DMSO und den der Polymerase entsprechenden Puffer in einfacher Konzentration. Je nach Aufgabenstellung wurden 1 U Taq-Polymerase, 3 U Pfu-Polymerase oder 2,6 U HighFidelity-Polymerase eingesetzt. 0,5 ng Plasmid-DNA ( 2.2.5.10 ) oder mindestens 4 µl cDNA ( 2.2.5.2 ) wurden als Matrize verwendet. Das PCR-Programm begann mit einem einmaligen 5minütigen Denaturierungsschritt bei 95°C, an den sich 30 Zyklen von Denaturierung bei 95°C für 1 min, Annealing 1 min und Synthese bei 72°C anschlossen. Für die Dauer des Syntheseschrittes wurde 1 min pro 1 kb Produkt kalkuliert; bei der Pfu-Polymerase jedoch 1 min pro 0,5 kb Produkt. Vor der Kühlung bei 4°C erfolgte noch ein zusätzlicher Syntheseschritt von 10 min. Bei Verwendung der Pfu-Polymerase wurden in diesen letzten Syntheseschritt noch 0,1 U Taq-Polymerase zugegeben, um A-Überhänge zu generieren.

2.2.5.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen

Die Spaltung von DNA mittels sequenzspezifischer Restriktionsenzyme wurde in einem Volumen von 15 µl bei 37°C für 1 h durchgeführt. Pro 1 µg DNA wurde 1 U des Enzyms, der dazugehörige Puffer in einfacher Konzentration sowie 0,1 µg/µl BSA eingesetzt. Die Reaktion wurde entweder durch Hitzeinaktivierung für 15 min bei 65°C oder durch Gelextraktion der elektrophoretisch getrennten DNA ( 2.2.5.5 , 2.2.5.6 ) gestoppt.

2.2.5.5 DNA-Gelelektrophorese

Die DNA-Probe wurde mit DNA-Probenpuffer versetzt und in einem Agarosegel bei einer Spannung von 120 V in 1x DNA-Laufpuffer aufgetrennt. Die DNA wurde auf einem UV-Tisch visualisiert.

↓38

2.2.5.6 Aufreinigung von DNA aus Reaktionsansätzen und Agarosegelen

Zum Aufreinigen der DNA aus einer PCR ( 2.2.5.3 ) oder Spaltung ( 2.2.5.4 ) wurde das „GFXTMPCR DNA and Gel Band Purification Kit“ nach Anleitung des Herstellers verwendet. Entstanden bei einer Spaltung mehrere Fragmente, wurde die DNA in einem Agarosegel aufgetrennt ( 2.2.5.5 ), die interessierende Bande unter reduzierter UV-Lichtintensität aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung des oben genannten Kits extrahiert.

2.2.5.7 Dephosphorylierung der Vektor-DNA

Um eine Religation der Vektor-DNA bei ungerichteter Klonierung zu vermeiden, wurde die Vektor-DNA dephosphoryliert. 16 µl des geschnittenen und isolierten Vektors ( 2.2.5.6 ) wurden in zwei sequentiellen Zyklen mit je 1 U der Shrimp Alkalischen Phosphatase für je 30 min, 37°C inkubiert. Durch Hitzeinaktivierung der Phosphatase bei 65°C für 15 min wurde die Reaktion gestoppt.

2.2.5.8 Ligation von DNA-Fragmenten in Vektor-DNA

↓39

Für die Ligation wurden Vektor ( 2.2.5.7 ) und Fragment ( 2.2.5.6 ) im Verhältnis 1:3 nach Mengenabschätzung im Agarosegel eingesetzt. Der Ligationsansatz enthielt außerdem 400 U T4 DNA Ligase und den dazugehörigen Puffer in einfacher Konzentration in einem Volumen von 20 µl. Bei der Ligation von PCR-Produkten wurde das „TOPO TA Cloning®“ Kit entsprechend der Herstellerangaben verwendet. Die Reaktion beider Ligationsprotokolle erfolgte bei 16°C für mindestens 16 h.

2.2.5.9 Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA

Chemisch kompetente Escherichia coli DH5α Zellen wurden auf Eis aufgetaut mit 1µg Plasmid-DNA ( 2.2.5.10 ), dem gesamten TA-Cloning-Ansatz oder 10µl Ligationsansatz ( 2.2.5.8 ) versetzt, vorsichtig gemischt und dann 30 min auf Eis inkubiert. Nach dem Hitzeschock bei 42°C für 30 sec und einer zweiminütigen Abkühlung auf Eis wurden 250 µl SOC-Medium zugegeben und die Bakterien 1 h bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden 50 µl sowie der pelletierte Rest auf Antibiotika-haltigem LB-Agar, für die Blau/Weiß-Selektion auf b/w-LB-Agar, ausplattiert und bei 37°C 16 h inkubiert.

2.2.5.10 Präparation von Plasmid-DNA

↓40

Nach der Transformation wurden 8-12 gewachsene Klone, bei der Blau/Weiß-Selektion 12 der weißen und hellblauen Klone über Nacht in 3 ml Antibiotika haltigem LB-Medium angezogen. Aus 2 ml der Vorkulturen wurde die transformierte DNA mithilfe des „QIAGEN Plasmid Mini Kits“ unter Verwendung eines verkürzten Protokolls isoliert. Hierbei wurde nach der Zugabe der Puffer P1, P2 und N3 und anschließender zehnminütiger Zentrifugation bei 19000 xg die DNA direkt aus dem Überstand mit 1 Vol Isopropanol gefällt. Mit dem Rest der Vorkultur wurden 200 ml des Antibiotika-haltigen LB-Medium angeimpft. Die DNA-Präparation aus der Hauptkultur wurde anhand des vollständigen Protokolls des „QIAGEN Plasmid Midi Kits“ durchgeführt. Die DNA wurde in sterilem MilliQ-H2O aufgenommen.

2.2.5.11 Bestimmung der RNA- und DNA-Konzentration

Die Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren erfolgte im Photometer durch Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 260 nm (A260). Die Konzentration der DNA errechnete sich aus dem A260-Wert multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor sowie dem Faktor 0,05 µg/µl, da dieser Faktor der DNA-Konzentration bei A280 = 1 entspricht. Der Faktor für die Berechung der RNA-Konzentration betrug 0,04 µg/µl.

2.2.5.12 Zusammenlagerung einzelsträngiger siRNA

↓41

Die einzelsträngigen siRNAs wurde mit DPEC-H2O auf 50 µM gebracht. Je 30 µl der komplementären siRNAs wurden mit 15 µl Annealing Puffer für 2 min bei 95°C erhitzt. Die Abkühlung erfolgte für 60 min bei Raumtemperatur und die nun doppelsträngige siRNA wurde bei -20°C gelagert

2.2.6 Zellkultur

2.2.6.1  Kultur von RMA-Zellen

Die RMA-Zelllinie stammte von einem T-Zellen Lymphom aus C57Black/6 Mäusen des H-2b Haplotyps. RMA-Zellen wuchsen in Suspension mit einer ungefähren Teilungsrate von dreimal in 24 h. Sie wurden in RPMI-Medium unter Zusatz von beta-Mercaptoethanol in Flaschen mit leicht aufgedrehtem Verschluss kultiviert. Das Umsetzen erfolgte bei einer Dichte von ca. 1x106 Zellen/ml an jedem zweiten bis dritten Tag durch direktes Überführen der Zellen in frisches Medium. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde durch Trypanblau-Färbung ermittelt.

2.2.6.2 Einfrieren und Auftauen von RMA-Zellen

↓42

Zum Einfrieren wurden 2x106 Zellen für 3 min, 4°C, 250 xg pelletiert, in 1 ml Einfriermedium aufgenommen und in Kryogefäße überführt. Der Gefrierprozess wurde bei -80°C in Einfrierboxen verlangsamt. Über längere Zeiträume wurden die Zellen in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Zellen wurde durch Schütteln und Erwärmen in der Hand zügig aufgetaut, sofort in 10 ml vorgelegtem RMA-Medium verdünnt, bei 4°C, 250 xg, 5 min zentrifugiert und in 3 ml RMA-Medium ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen entsprechend ihres Wachstums gesplittet.

2.2.6.3 Lyse der RMA-Zellen für Präparation von 20S Proteasomen

Die RMA-Zellen wurden für 3 min, 4°C, 250 xg pelletiert, zweimal mit PBS gewaschen und dann bei -80°C eingefroren. Die Pellets wurden unter Zugabe von Lysepuffer ( 2.2.1.3 ) aufgetaut, gepoolt und durch mehrmaliges Douncen aufgeschlossen. Das Lysat wurde bei 45000 xg, 30 min, 4°C zentrifugiert und der Überstand direkt für die 20S Proteasomenpräparation ( 2.2.2.1 ) verwendet.

2.2.6.4 Elektroporation mit siRNA

↓43

Pro Transfektionsansatz wurden 5x106 Zellen pelletiert, in 300µl RMA-Medium ( 2.2.6.1 ) aufgenommen und in die Elektroporationsküvette überführt. Nach der Zugabe der doppelsträngigen siRNA ( 2.2.5.12 ) wurde der Ansatz vorsichtig gemischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Die Elektroporation wurde mit 350 V bei 0,975 F durchgeführt und die Zellen danach sofort in 10 ml vorgelegtes RMA-Medium gegeben. Nach 24 h wurde die Lebend-Zellzahl bestimmt, 2x106 Zellen für 3 min, 4°C, 250 xg abzentrifugiert, mit kaltem PBS gewaschen und das Zellpellet bei -80°C eingefroren.

2.2.6.5 Markierung von Proteinen in RMA-Zellen mit 14C

Die RMA-Zellen wurden gezählt, zweimal mit PBS bei 4°C, 3 min, 250 xg gewaschen und dann in Glc--Medium aufgenommen, so dass die Konzentration 5x106 Zellen/ml betrug. Zu 2 ml Zellen wurden 100 µl 14C-Glucosamin gegeben; dies entsprach einer finalen Konzentration von 10 µCi/ml. Nach unterschiedlich langen Inkubationszeiten bei 37°C wurden die Zellen bei 250 xg geerntet, zweimal mit PBS gewaschen, dann in IP-Lysepuffer aufgenommen und durch mehrmaliges Pipettieren und nach 5minütiger Inkubation bei RT lysiert. Im Anschluss daran wurden die lysierten Zellen bei 500 xg zentrifugiert, der Überstand mit final 1x PIC Complete versetzt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

2.2.6.6 Markierung von Proteinen in RMA-Zellen mit 35S

↓44

Die RMA-Zellen wurden gezählt, zweimal mit PBS bei 4°C, 3 min, 250 xg gewaschen und dann in Met--Medium aufgenommen, so dass die Konzentration 2,5x106 Zellen/ml betrug. Die Zellen wurden 1 h in dem Mangelmedium inkubiert, bevor 40 µl 35S-Methionin zu einer finalen Konzentration von 0,4 mCi hinzugegeben wurden. Nach einer Markierungszeit von 1 h wurde das radioaktive Medium entfernt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in demselben Volumen RMA-Medium ( 2.2.6.1 ) aufgenommen. Nach weiteren 4 h Inkubation wurden die Zellen wie in 2.2.6.5 beschrieben geerntet und lysiert.


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24.05.2007