3 Ergebnisse

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3.1  Charakteristika der Listeria monocytogenes Infektion in Mäusen

Proteasomen erfüllen die für Zellen lebensnotwendige Funktion des Proteinabbaus und sind deshalb in allen Körperzellen zu finden. Es konnten jedoch organspezifische Unterschiede in Struktur und Funktionsweise der 20S Proteasomen nachgewiesen werden (Kuckelkorn et al., 2002). In einem murinen Listeria monocytogenes Infektionsmodell wurde deshalb untersucht, ob diese Unterschiede statischer Natur sind oder ob sich die Struktur und die Funktion der Proteasomen in den entsprechenden Organen ändern können. Wildtypmäuse des Stammes C57Black/6 entwickelten eine Listeriose, welche zwischen den Tagen 6 und 8 nach der intravenösen Injektion von 5x103 cfu L. monocytogenes ihren Höhepunkt erreichte. Am Tag 27 p.i. (post Infektion) waren die Wildtypmäuse wieder symptomfrei. Mäuse des C57Black/6 Stammes mit Deletionen des IFNγ-Rezeptorgenes (I-Tiere) hingegen verstarben am Tag 4 oder 5 p.i., und C57Black/6 Mäuse mit Defizienzen der TNF-Rezeptoren (T-Tiere) erlagen der Listeriose bereits am Tag 3 p.i..

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Gelangen Listeria nach einer oralen Infektion über den Darm oder nach einer intravenösen Infektion direkt in das Blut, befallen sie primär Makrophagen. Diese transportieren die Krankheitserreger in Leber und Milz, die beiden durch die L. monocytogenes Infektion am schwersten betroffenen Organe. In allen Mäusen war ab Tag 2 p.i. die Milz vergrößert und wie die Leber mit weißen Listeria-Granuloma übersät ( Abb. 7 ).

Abb. 7 : Milz. (A) Gesunde Milz einer Maus. (B) Milz einer L. monocytogenes infizierten Maus mit den typischen weißen Granuloma.

Um den Verlauf der Listeriose nach der Infektion zu charakterisieren, wurden die Bakterientiter in den Organen bestimmt. Am Tag 2 p.i. konnten in Leber und Milz der Wildtyptiere hohe L. monocytogenes Titer nachgewiesen werden, die am Tag 6 p.i. wieder rückläufig waren ( Abb. 8 A). In den I-Tieren lagen die L. monocytogenes Titer am Tag 2 p.i. schon um mindestens eine Größenordnung über denen der Wildtypmäuse und reduzierten sich nicht bis zum infektionsbedingten Tod ( Abb. 8 B). Zudem wurden auch Colon und Dünndarm der I-Tiere von Listeria besiedelt, was darauf hindeutete, dass die I-Tiere die sich ausbreitenden Erreger nicht eindämmen konnten.

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Abb. 8 : Listeria monocytogenes Titer in den Organen. (A) Wildtypmäusen und (B) I-Tieren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion Organe entnommen. In diesen Organen wurde die Anzahl der L. monocytogenes Kolonie-bildenden-Einheiten (cfu) bestimmt. Eine Markierung entspricht einem Tier; die waagerechten Striche geben die Mittelwerte auf der logarithmischen Achse an.

Ein wichtiger Infektionsparameter ist die Serumkonzentration des proinflammatorischen Cytokins IFNγ. Am Tag 2 p.i. stieg die Serumkonzentration von IFNγ in den Wildtyptieren auf ca. 1200 pg/ml Serum und in den I-Tieren auf ca. 2000 pg/ml Serum an ( Abb. 9 ). Dieser Unterschied könnte durch die bei den IFNγ-Rezeptor-defizienten Mäuse fehlende negative Rückkopplung erklärt werden, die somit der fortwährenden IFNγ-Produktion nicht entgegen wirkte (Schroder et al., 2004). Am Tag 6 p.i. war bei den Wildtyptieren der Serumspiegel wieder unter das Detektionslimit gefallen, und auch in den I-Tieren war er am Tag 4 p.i. deutlich gesunken.

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Abb. 9 : IFN γ -Spiegel im Serum nach der L. monocytogenes Infektion. Die IFNγ-Konzentration wurde in pg pro ml Serum an verschiedenen Tagen nach der Infektion der Wildtypmäuse (rot) und I-Tiere (grün) bestimmt.

3.2 Funktionsanalyse der aus Gewebe isolierten Proteasomen

Eine wichtige Aufgabe des Proteasomensystems ist die Generierung von Peptiden, welche durch Bindung an MHC-Klasse-I Moleküle immunologische Bedeutung erlangen. Die Funktion der Proteasomen kann somit durch die Analyse der von ihnen generierten Peptide charakterisiert werden. Zu diesem Zweck wurden oligomere Peptidsubstrate in vitro mit den aus Gewebe isolierten Proteasomen inkubiert und die entstandenen Produkte mittels HPLC getrennt und massenspektrometrisch untersucht.

Im Folgenden werden die aus Leber isolierten 20S Proteasomen vereinfacht als „Leberproteasomen“ bezeichnet, die aus Milz isolierten 20S Proteasomen als „Milzproteasomen“ und so fort. Dem Zusammenhang entsprechend werden z.B. 20S Proteasomen, die aus den vor der Infektion entnommenen Geweben präpariert wurden, „Tag 0 Proteasomen“ genannt. Ebenso werden als „Tag 2 p.i. Proteasomen“ diejenigen 20S Proteasomen bezeichnet, die aus Organen isoliert wurden, welche am zweiten Tag nach der Infektion mit L. monocytogenes entnommen worden waren und so fort. Weiterhin werden 20S Proteasomen, die aus den Organen der I-Tiere oder T-Tiere stammen, mit „I-Tier Proteasomen“ bzw. „T-Tier Proteasomen“ abgekürzt.

3.2.1  Reinheit der Proteasomenpräparationen

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Um die Ergebnisse der in vitro Prozessierungsexperimente eindeutig der proteasomalen Funktion zuschreiben zu können, musste ausgeschlossen werden, dass geringe Mengen möglicherweise co-angereicherter Proteasen die Ergebnisse der Funktionsanalyse beeinflussen.

Die Durchführung der nativen Gelelektrophorese in Gradientengelen ermöglichte es, die ca. 700 kDa großen 20S Proteasomen zusammen mit potentiell kontaminierenden kleineren Proteasen nachzuweisen. So könnte z.B. das im Dünndarm sehr abundante und hochaktive Trypsin in Proteasomenisolationen aus diesem Organ in Spuren vorhanden sein und daher ein Problem darstellen. Der Test auf Trypsin-ähnliche Aktivität deutete jedoch niemals – außer im Molekulargewichtsbereich der 20S Proteasomen – proteolytische Aktivitäten an. Die in Abb. 10 dargestellten repräsentativen Dünndarmproteasomen waren funktionell aktiv, nicht mit Trypsin verunreinigt und wurden, wie die densitometrische Auswertung der Coomassie-gefärbten Gele ergab, in gleichen Mengen auf das Gel aufgetragen. Dies gewährleistete außerdem, dass die Proteinquantifizierungen korrekt waren und somit gleiche Proteasomenmengen in den Funktionsanalysen eingesetzt wurden.

Abb. 10 : Dünndarmproteasomen im Nativgel mit Aktivitätstest. 0,7 µg der aus Dünndarm isolierten 20S Proteasomen wurden in nicht-denaturierenden Gelen aufgetrennt, Aktivitätstests auf Trypsin-ähnliche Aktivität unterzogen und anschließend mit Coomassie gefärbt. rot – Wildtypmäuse (Wt); blau – T-Tiere; grün – I-Tiere; / – mit Bromphenolblau beladene Bahn.

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Eine weitere mögliche Kontamination der Proteasomenpräparationen könnte auf Grund ihrer Größe die Aminopeptidase TPPII darstellen. TPPII ist ein großer cytosolischer Enzymkomplex, der in allen Säugerzellen exprimiert wird (Geier et al., 1999). Durch seine in Einzelfällen nachgewiesene endoproteolytische Aktivität (Geier et al., 1999; Seifert et al., 2003) könnte TPPII, wenn es in den Proteasomenisolationen vorhanden sein sollte, die Verdauexperimente beeinflussen. Um eine Kontamination mit TPPII auszuschließen, wurde ein dem Cytolysin LLO entstammendes 27meres Peptidsubstrat (LLO-Substrat) mit isolierten Gewebeproteasomen in Anwesenheit des TPPII Inhibitors AAF-CMK oder des Proteasomeninhibitors MG132 inkubiert. Die in der HPLC analysierten Ansätze ergaben, dass MG132 die Degradation des LLO-Substrates vollständig inhibiert, da keine Abnahme des LLO-Substrates zu verzeichnen war ( Abb. 11 ). Der TPPII Inhibitor hingegen besaß keinen Einfluss auf die Degradation des Substrates, weil nach 8 h kaum noch LLO-Substrat nachweisbar war, was der achtstündigen Degradation in dem Ansatz ohne Inhibitoren entsprach. Dies besagt, dass ausschließlich die Proteasomen in den Präparationen für die Degradation des LLO-Substrates verantwortlich waren und somit keine kontaminierende TPPII-Aktivität vorlag.

Abb. 11 : HPLC-Profile der LLO-Degradation mit Inhibitoren. LLO-Substrat wurde mit Tag 6 p.i. Leberproteasomen der Wildtypmäuse unter Zugabe von MG132 oder AAF-CMK verdaut und anschließend mittels HPLC analysiert. Von unten nach oben: hellblau – LLO-Substrat, Positivkontrolle; rosa – 0 h Verdau ohne Inhibitoren; dunkeltürkis – 8 h Verdau ohne Inhibitoren; violett – 8 h Verdau mit MG132; grün – 8 h Verdau mit AAF-CMK.

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L. monocytogenes besitzt einen dem Proteasom strukturell ähnlichen Proteasekomplex, den Clp-Komplex (De Mot et al., 1999). Um zu zeigen, dass in der Proteasomenisolation aus infizierten Geweben der Clp-Komplex nicht mit angereichert worden war, wurden die isolierten Proteasomen im Westernblot auf das Vorhandensein einer Clp-Untereinheit getestet. Die proteolytisch aktive Untereinheit ClpP ist mit einer Größe von 22 kDa in der SDS-PAGE nicht von proteasomalen Untereinheiten zu unterscheiden und ist deshalb für den Clp-Nachweis nicht geeignet. Da ClpP nur in Verbindung mit der Untereinheit ClpC funktionsfähig und letzteres durch ein größeres Molekulargewicht von den proteasomalen Untereinheiten einfach abzugrenzen ist (Rouquette et al., 1998), wurde ein Antikörper gegen die ClpC Untereinheit gewählt ( Abb. 12 ). In der Positivkontrolle mit L. monocytogenes Lysat wurde eine sehr starke für ClpC spezifische Bande bei 60 kDa sowie eine schwächere Bande bei 33 kDa beobachtet. Keine der beiden Banden wurde in den Proteasomenpräparationen detektiert, so dass davon ausgegangen werden konnte, dass sie keine ClpC-Kontamination enthielten.

Abb. 12 : Nachweis des Clp-Proteasekomplexes von L. monocytogenes . 1µg der aus Leber isolierten 20S Proteasomen der Wildtypmäuse und der I-Tiere sowie Lysat von 107 cfu L. monocytogenes wurden in einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt, geblottet und mit Antikörper gegen ClpC inkubiert. (A) Coomassie-gefärbte Membran. (B) Westernblot. Der Pfeil markiert die für ClpC beschriebene spezifische Bande bei 60 kDa. rot – Wildtypmäuse; grün – I-Tiere; L.m.Listeria monocytogenes Lysat, Positivkontrolle; MW (kDa) – Molekulargewicht in Kilodalton.

Die proteolytischen Aktivitäten der isolierten Proteasomen wurden des Weiteren durch die Hydrolyse von fluorogenen Substraten bestimmt, welche von den verschiedenen aktiven Untereinheiten gespalten werden (Orlowski und Wilk, 2000). Tag 0 Leberproteasomen der Wildtypmäuse zeigten zu den Tag 2 p.i. und 6 p.i. Leberproteasomen keine drastischen Unterschiede hinsichtlich der Trypsin-ähnlichen Aktivitäten ( Abb. 13 ). Die Tag 6 p.i. Proteasomen demonstrierten jedoch eine deutlich geringere Caspase-ähnliche Aktivität als die Tag 0 oder Tag 2 p.i. Proteasomen. Wurde die Chymotrypsin-ähnliche Aktivität durch Spaltung des Z-GGL-AMC Substrates ermittelt, waren keine Unterschiede zwischen den Proteasomen von den verschiedenen Tagen nach der Infektion zu detektieren; bei Einsatz des Suc-LLVY-AMC Substrates hingegen zeigten die Tag 6 p.i. Proteasomen eine reduzierte Aktivität gegenüber den Tag 0 und Tag 2 p.i. Proteasomen. Auch war bei der Spaltung des Suc-LLVY-AMC Substrates eine andere Abhängigkeit von der Substratkonzentration zu erkennen: In dem eingesetzten Konzentrationsbereich beschrieben die Aktivitäten der Tag 0 und Tag 2 p.i. Proteasomen eine sigmoidale Kurve, wohingegen die Aktivität der Tag 6 p.i. Proteasomen eher linear zur Substratkonzentration stieg. Die Hinweise auf Aktivitätsunterschiede zwischen den isolierten Proteasomen wurden nachfolgend durch in vitro Prozessierung von oligomeren Peptidsubstraten näher untersucht, da die Prozessierung von längeren Peptidsubstraten eher der in vivo Situation entspricht als die Abspaltung einer fluorogenen Gruppe von einem mit Schutzgruppe versehenen Tripeptid. Abb. 13 veranschaulicht, dass der Einsatz gleicher Proteinmengen in den Prozessierungsexperimenten geeigneter ist als die Normierung auf die Aktivitäten, da sich hierbei die Frage stellen würde, welches Substrat in welcher Konzentration für den Abgleich herangezogen werden sollte.

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Abb. 13 : Aktivitätsmessung mit fluorogenen Substraten. Leberproteasomen der Wildtyptiere wurden 60 min mit verschiedenen Konzentrationen der fluorogenen Substrate inkubiert, welche von den verschiedenen Aktivitäten der 20S Proteasomen gespalten werden. Gemessen wurde die Emission der freigesetzten fluorogenen Gruppe bei 460 nm nach Anregung bzw. bei 405 nm nach Anregung für die Messung der Caspase-ähnlichen Aktivitäten. gelbe Rauten – Tag 0 Proteasomen; rote Quadrate – Tag 2 p.i. Proteasomen; braune Dreiecke – Tag 6 p.i. Proteasomen.

Die in diesem Kapitel aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die isolierten 20S Proteasomen aktiv waren und keine nachweisbaren Spuren kontaminierender Proteasen enthielten. Somit wurde sichergestellt, dass die folgenden in vitro Prozessierungsexperimente Aufschluss über die Funktionalität der isolierten 20S Proteasomen geben können.

3.2.2 Massenspektrometrische Identifizierung der Produkte aus in vitro Prozessierungsexperimenten

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Zur Charakterisierung der proteasomalen Funktion wurden oligomere Peptidsubstrate mit den isolierten 20S Gewebeproteasomen inkubiert, die entstandenen Prozessierungsprodukte in der HPLC getrennt und anschließend massenspektrometrisch analysiert. Zu Beginn einer massenspektrometrischen Untersuchung stand die eindeutige Identifizierung der aus einem Peptidsubstrat durch die Proteasomen generierten Produkte. Dies erfolgte in Vorversuchen mittels der MS/MS Scans in den Sequenzierungsläufen. Die identifizierten Produkte wurden in einer sogenannten Schnittkarte zusammengefasst, welche die Ladungsstufen, das detektierte m/z und die Retentionszeiten enthielt. Die auf die Sequenzierungsläufe folgenden Funktionsanalysen dienten der Quantifizierung der Prozessierungssprodukte. In diesen Quantifizierungsläufen erfolgte die Identifizierung der proteasomalen Produkte nur über die vorher gesammelten und in der Schnittkarte festgehaltenen Informationen. Außerdem gab eine vollständige Schnittkarte einen Überblick über alle durch das Proteasom generierten und mit der HPLC-ESI-Ionenfalle erfassbaren Prozessierungssprodukte und erleichterte so die Entscheidung darüber, welche dieser Produkte in der Funktionsanalyse ausgewertet werden sollten.

In Abb. 14 ist die vollständige Schnittkarte des LLO-Substrates dargestellt, dessen Sequenz dem von Listeria monocytogenes ins Cytosol der Wirtszellen sekretiertem ListeriolysinO290 317 entstammte. Das LLO-Substrat enthielt das H-2Kb Epitop VAYGRQVYL sowie N- und C-terminal flankierende Sequenzen. In die Funktionsanalyse wurden das Substrat, die Epitope und die Epitopprecursor miteinbezogen sowie Produkte, welche durch einen Epitop- oder Precursorschnitt N- und C-terminal entstanden. Zusätzlich wurden auch zwei sogenannte Antitope ausgewertet. Hierbei handelte es sich um Fragmente, deren Entstehung die weitere Prozessierung zu einem Epitop oder Precursor verhinderte.

Abb. 14 : Vollständige Schnittkarte des LLO-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit aufgelistet. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten; X – Peptide, die in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden.

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Zusätzlich zu der Generierung des bakteriellen Fremdepitopes aus dem LLO-Substrat wurden Prozessierungsexperimente mit zwei weiteren Peptidsubstraten durchgeführt, von denen das eine ein virales Fremdepitop enthielt und das andere ein murines Selbstepitop. Dieser Ansatz sollte Aufschluss darüber geben, ob sich die proteasomale Funktion möglicherweise der Infektionsart anpasst und daher bei der Infektion mit L. monocytogenes nur eine Auswirkung auf die Bildung des bakteriellen Epitopes zu verzeichnen wäre. Als murines Selbstsubstrat wurde das Hsp60-Substrat gewählt, welches aus den Aminosäuren 171-200 des in Mitochondrien vorkommenden Hitzeschockproteins 60 bestand und das H-2Db Epitop KDIGNIISD umfasste (Kuckelkorn et al., 2002). Das virale pp89-Fremdsubstrat leitete sich aus dem Immediate Early Phosphoprotein 89 des murinen Cytomegalovirus ab und beinhaltete die Aminosäuren 162-186 um das H-2Ld Epitop YPHFMPTNL (Boes et al., 1994). Abb. 15 und Abb. 16 zeigen die Schnittkarten mit den durch MS/MS Scan verifizierten Prozessierungsprodukten des Hsp60- bzw. des pp89-Substrates, welche in den Funktionsanalysen ausgewertet wurden.

Abb. 15 : Schnittkarte des Hsp60-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit geordnet. Es wurden nur die Peptide aufgelistet, welche anschließend in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten.

Abb. 16 : Schnittkarte des pp89-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit geordnet. Es wurden nur die Peptide aufgelistet, welche anschließend in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten.

3.2.3 Statistische Bearbeitung und Auswertung der Rohdaten

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Die Auswertung eines Prozessierungsproduktes in den Quantifizierungsläufen erfolgte durch Integration der Fläche unterhalb des massenspektrometrischen Peaks, der diesem Verdauprodukt durch das in den Sequenzierungsläufen bestimmte m/z und die Retentionszeit zugeordnet werden konnte. Die integrierte Fläche wurde als Maß für die Menge des detektierten Produktes verwendet und als „Intensität“ angegeben. Da aus technischen Gründen die Sensitivität der HPLC-ESI-Ionenfalle über den Zeitraum der Datenerfassung stark schwankte, wurde die Normierung auf einen internen Standard eingeführt, um die Daten der verschiedenen Wiederholungsmessungen miteinander vergleichen zu können. Der interne Standard bestand aus einem synthetischen Peptid, dessen Masse – um Verwechslungen auszuschließen – nicht den Massen der möglichen Prozessierungssprodukte entsprach. War die Messung nun zum Beispiel sehr sensitiv, wurden alle in der Probe enthaltenen Produkte sowie der interne Standard mit größeren Intensitäten gemessen. Wie in Abb. 17 gezeigt, brachte eine Normierung auf den internen Standard die Wiederholungsmessungen in den Bereich gleicher Intensitäten. Dieses Vorgehen ermöglichte eine statistische Analyse der Ergebnisse.

Abb. 17 : Gerätebedingte Intensitätsschwankungen in der Messung mit HPLC-ESI-Ionenfalle und Normierung auf den internen Standard. Das Hsp60-Substrat wurde in vitro mit Tag 0 Leberproteasom der Wildtypmäuse für 4 und 20 h verdaut und anschließend mittelsHPLC-ESI-Ionenfalle analysiert. Gezeigt sind die Auswertungen des internen Standards und ausgewählter Degradationsprodukte. (A) Gemessene Produktintensitäten. (B) auf internen Standard normierte Intensitäten. schwarz – 1. Messung; rot – 2. Messung.

Die Prozessierungsexperimente wurden insgesamt viermal durchgeführt, wobei die eingesetzten Proteasomen aus Organen isoliert worden waren, die von in zwei unabhängigen Ansätzen infizierten Mäusen stammten. Um die entstandenen Datenmengen besser bearbeiten zu können, wurde ein Makro-Programm für Excel in Visual Basics entwickelt. Dieses sortierte die Verdauprodukte, normierte sie auf den internen Standard und berechnete die Mittelwerte sowie die Standardabweichungen. Die Wahrscheinlichkeit, dass die erhaltenen Mittelwerte sich unterschieden, wurde durch einen Signifikanztest geprüft. Hierfür wurde der heteroskedastische t-Test (Welch-Test) verwendet und das Kriterium der Einseitigkeit festgelegt.

3.2.4 Auswertung der Prozessierungsexperimente

3.2.4.1  In vitro Prozessierung des LLO-Substrates durch Proteasomen aus den Organen der Wildtypmäuse

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In den in vitro Prozessierungsexperimenten mit LLO-Substrat und den isolierten Proteasomen wurden die zwölf in Abb. 14 mit X gekennzeichneten Fragmente quantifiziert. Es handelte sich hierbei um Verdauprodukte, welche durch Schnitte generiert wurden, die unter anderem die Epitope und/oder die Epitopprecursor sowie die Antitope freisetzten. Hierzu gehörten ebenfalls die an die Epitope und Precursor direkt angrenzenden N- und C-terminalen Produkte. Diese Fragmente werden im Weiteren unter dem Begriff der „immunrelevanten Produkte“ zusammengefasst. Der Übersichtlichkeit halber wird in den folgenden Abbildungen nur jeweils ein repräsentativer Vertreter eines jeden Produkttyps gezeigt ( Abb. 18 A). Für die Darstellung wurde das Epitop 6-14 gewählt, das im Elispot eine bessere T-Zell-Aktivierung zeigte als das kürzere Epitop 7-14 (Geginat et al., 2001), der Precursor 4-14 sowie die flankierenden Fragmente N-Terminus 1-3 und C-Terminus 15-27.

Die aus den Wildtypmäusen isolierten Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. Leberproteasomen generierten nach derselben Verdauzeit signifikant mehr immunrelevante Produkte als die Tag 0 Proteasomen ( Abb. 18 B). Auch die Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. Colonproteasomen produzierten einen auffällig höheren Anteil der immunrelevante Fragmente als die Tag 0 Colonproteasomen ( Abb. 19 ). Der Anstieg der flankierenden Produkte konnte zwar nicht als signifikant ermittelt werden, war jedoch in den vier Wiederholungen jedes Mal als reproduzierbare Tendenz zu beobachten.

Abb. 18 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Leberproteasomen der Wildtypmäuse. (A) Repräsentative Prozessierungsprodukte aus dem LLO-Substrat. (B) Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten der in (A) dargestellten Produkte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) und Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen.

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Abb. 19 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Colonproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) und Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen.

Die Milzproteasomen generierten die zwölf untersuchten Fragmente bereits am Tag 0 mit ungefähr der Effizienz, wie sie die Leber- und Colonproteasomen erst nach der Infektion zeigten ( Abb. 20 ). Eine weitere Steigerung der Fragmentgenerierung durch die Milzproteasomen nach der Infektion konnte jedoch nicht beobachtet werden. Der vermeintliche Anstieg in der Epitopbildung war auf die breite Streuung der Messwerte zurückzuführen und nicht eindeutig reproduzierbar.

Abb. 20 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Milzproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) oder reproduzierbaren Tendenzen festgestellt werden.

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Im Dünndarm befindet sich in Form der Peyerschen Plaques lymphatisches Gewebe. Aus diesem Grund kann der Dünndarm als Ganzes ähnlich der Milz als lymphatisches Organ betrachtet werden. Die verstärkte Generierung der immunrelevanten Produkte durch die Tag 2 p.i. Dünndarmproteasomen im Vergleich zu den Tag 0 oder Tag 6 p.i. Dünndarmproteasomen ließ sich mit den vorliegenden Daten weder als statistisch signifikant noch als reproduzierbare Tendenz bezeichnen ( Abb. 21 ). Somit zeigten auch die Dünndarmproteasomen nach der Infektion keine geänderte Effizienz bei der Bildung der immunrelevanten Peptide. Auffällig war allerdings, dass die durch Dünndarmproteasomen gebildeten Peptidmengen generell viel höher waren als die durch andere Organproteasomen erzeugten Peptidmengen.

Abb. 21 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Dünndarmproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) oder reproduzierbaren Tendenzen festgestellt werden.

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Die Quantifizierungskinetiken der immunrelevanten Fragmente, die durch dieselben Gewebeproteasomen generiert wurden, unterschieden sich nicht voneinander. Wurde z.B. der gezeigte Precursor 4-14 verstärkt gebildet, resultierte dies in einer erhöhten Generation des N-terminalen Fragments 1-3 und des C-terminalen Fragments 15-25. Die Funktionsanalyse ergab, dass nach der L. monocytogenes Infektion verstärkt immunrelevante Produkte durch die Proteasomen aus den nicht-lymphatischen Organen Leber und Colon erzeugt wurden. Die Proteasomen aus den lymphatischen Geweben Milz und Dünndarm hingegen wurden durch die Infektion in ihrer Funktion nicht beeinflusst.

3.2.4.2  In vitro Prozessierung des LLO-Substrates durch Proteasomen aus den Organen der Rezeptor-defizienten Mäuse

Die L. monocytogenes Infektion von Mäusen mit der Gendeletion des IFNγ-Rezeptors (I-Tiere) führte am Tag 4 bis 5 p.i. zum Tod, während Mäuse mit Deletionen der TNF-Rezeptorgene (T-Tiere) am Tag 3 p.i. verstarben. Deshalb war es nicht möglich, wie bei den Wildtypmäusen am Tag 6 p.i. aus den Organen der Rezeptor-defizienten Tiere 20S Proteasomen zu isolieren. Stattdessen wurden aus den Geweben der I-Tiere an den Tagen 0, 2 p.i. sowie 4 p.i. und aus den Organen der T-Tiere lediglich an den Tagen 0 und 2 p.i. die Proteasomen präpariert und in den Prozessierungsexperimenten eingesetzt. Hierbei wurden dieselben Produkte quantifiziert und ausgewertet wie in den oben beschriebenen Versuchen mit den Proteasomen aus den Wildtypmäusen (vergl. Abb. 14 und Abb. 18 A). Da sich auch bei den I- und T-Tieren die immunrelevanten Produkte in ihrer Generierung durch dieselben Gewebeproteasomen nicht wesentlich voneinander unterschieden, wird im Folgenden stellvertretend nur die Bildung des Epitopprecursors dargestellt. Bei den I-Tieren war keine Zunahme der Precursorbildung nach der Infektion zu beobachten: Leber- und Colonproteasomen der I-Tiere produzierten den Precursor auf konstant niedrigem Niveau ( Abb. 22 A). Die Dünndarmproteasomen der I-Tiere generierten dieses Fragment zwar deutlich häufiger, aber immer noch etwas weniger als die Dünndarmproteasomen der Wildtypmäuse (vergl. Abb. 21 ) und der T-Tiere ( Abb. 22 B). Die T-Tier Proteasomen aus den nicht-lymphatischen Organen Leber und Colon zeigten nach der Infektion eine sichtbar vermehrte und reproduzierbare Precursorgenerierung und verhielten sich damit wie die entsprechenden Organproteasomen aus den Wildtyptieren (vergl. Abb. 18 und Abb. 19 ). Interessant war außerdem, dass in beiden Rezeptor-defizienten Tiermodellen die Milzproteasomen nach der Infektion wiederholt geringere Mengen an Precursor bildeten als die Tag 0 Proteasomen.

Abb. 22 : In vitro Generierung des Precursors 4-14 durch die Gewebeproteasomen der Rezeptor-defizienten Mäuse. (A) I-Tiere. (B) T-Tiere. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzu- oder abnahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. Dünnd. – Dünndarmproteasomen.

3.2.4.3  In vitro Prozessierung des Hsp60-Substrates und des pp89-Substrates

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Die Prozessierungsexperimente wurden mit dem murinen Hsp60-Selbstsubstrat und dem viralen pp89-Substrat in demselben Umfang durchgeführt wie mit dem listeriellen LLO-Substrat, um zu untersuchen, ob nur die listeriellen immunrelevanten Fragmente vermehrt produziert werden oder ob dies auch für andere Epitope und Precursor gilt. Stellvertretend für die in den Schnittkarten von Hsp60- und pp89-Substrat aufgeführten und analysierten Produkte wird jeweils nur ein Epitopprecursor besprochen: für die Produkte aus dem Hsp60-Substrat der (Hsp60)Precursor 5-18 und für die Produkte aus dem pp89-Substrat der (pp89)Precursor 5-15 ( Abb. 23 , vergl. Abb. 15 und Abb. 16 ). Als Kontrolle für die Prozessierungsversuche mit Hsp60-Substrat und Tag 0 Wildtypproteasomen konnten die veröffentlichten Daten von Kuckelkorn et al. herangezogen werden, da in dieser Publikation ebenfalls Proteasomen verwendet wurden, die aus den gleichen Geweben gesunder Wildtypmäuse isoliert worden waren (Kuckelkorn et al., 2002). Der Vergleich zwischen den publizierten und den in Abb. 23 A gezeigten Resultaten mit Tag 0 Proteasomen ergab, dass sich die Ergebnisse bezüglich der Fragmentgenerierung aus Hsp60-Substrat entsprachen, und kann somit als Beispiel für die hohe Reproduzierbarkeit dieses Versuchsansatzes gelten. Abb. 23 A veranschaulicht außerdem, dass die Proteasomen, die am Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. aus den nicht-lymphatischen Geweben isoliert wurden, signifikant mehr (Hsp60)Precursor generierten als die Proteasomen der gleichen Organe am Tag 0, was genau so schon bei den Prozessierungsprodukten aus dem LLO-Substrat beobachtet werden konnte. Ebenfalls den Ergebnissen mit dem LLO-Substrat entsprechend wurden die Proteasomen der lymphatischen Organe Milz und Dünndarm durch die Infektion in der Prozessierung des Hsp60-Substrates nicht beeinflusst. Außerdem generierten die Dünndarmproteasomen durchgehend größere Mengen des (Hsp60)Precursors als die Proteasomen der anderen Organe (vergl. 3.2.4.1 ).

Die Entstehung des (pp89)Precursors war – wie bei den Produkten der anderen Peptid-Substrate – durch die Leberproteasomen der Tage 2 p.i. und 6 p.i. gesteigert ( Abb. 23 B). Ähnlich den anderen Substraten tangierte die Infektion nicht die Generierung der Fragmente aus pp89-Substrat durch die Milz- und Dünndarmproteasomen. Es konnten jedoch zwei abweichende Beobachtungen vermerkt werden: Zum einen wurde der (pp89)Precursor durch die nach der Infektion isolierten Colonproteasomen nicht verstärkt gebildet, und zum anderen lagen die durch Dünndarmproteasomen produzierten Fragmentmengen im Bereich der anderen Organproteasomen und nicht darüber.

Abb. 23 : In vitro Generierung eines (Hsp60)Precursors und eines (pp89)Precursors durch Gewebeproteasomen der Wildtypmäuse. (A) (Hsp60)Precursor 5-18. (B) (pp89)Precursor 5-15. In den oberen Teilen der Abbildung sind das Hsp60- und das pp89-Substrates dargestellt; die Epitopsequenzen sind fettgedruckt; die Precursorsequenzen sind durch orange Balken markiert. Darunter werden die normierten und gemittelten Intensitäten nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistische signifikante Unterschiede (p < 0,05) bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. Dünnd. – Dünndarmproteasomen.

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In den I-Tieren kam es durch die Infektion weder bei den Milzproteasomen, noch bei den Dünndarm- oder Colonproteasomen zu signifikanten Unterschieden in der Prozessierung der Hsp60- und pp89-Substrate (nicht gezeigt), was den Resultaten mit LLO-Substrat entsprach. Die Leberproteasomen der I-Tiere hingegen zeigten eine leicht erhöhte Precursorbildung, die aber immer noch deutlich unter der Zunahme blieb, welche bei den Leberproteasomen aus den Wildtypmäusen und den T-Tieren zu verzeichnen war (nicht gezeigt). Sämtliche aus den T-Tieren isolierten Proteasomen verhielten sich bei der Degradation des Hsp60- und des pp89-Substrates ähnlich den Proteasomen aus den Wildtyptieren, und auch dies bestätigte die durch LLO-Substrat gewonnenen Ergebnisse. Es kann also zusammengefasst werden, dass sich die durch die Infektion ausgelöste Funktionsänderung der isolierten Organproteasomen auf die drei verschiedenen Peptidsubstrate weitgehend in gleicher Weise auswirkte.

3.3 Struktur der aus den Geweben isolierten Proteasomen

20S Proteasomen existieren in zwei Grundformen: den konstitutiven 20S Proteasomen und den 20S Immunoproteasomen. Letztere enthalten anstelle der proteolytisch aktiven Untereinheiten β1, β2 und β5 die ebenfalls aktiven Immuno-Untereinheiten iβ1, iβ2 und iβ5, welche in Zellkulturexperimenten durch IFNγ und TNFα induziert werden können. Im folgenden Kapitel wird dargestellt, ob und in welcher Form die L. monocytogenes Infektion einen ähnlichen Einfluss auf die Zusammensetzung der Untereinheiten in Gewebeproteasomen ausübt und ob die Struktur die beobachteten funktionellen Unterschiede begründen kann.

3.3.1  Gewebehomogenate im Westernblot

In Vorversuchen zu der proteasomalen Zusammensetzung wurden die Gewebehomogenate der infizierten Mäuse im Westernblot auf das Vorhandensein der Immuno-Untereinheiten getestet. Abb. 24 A zeigt die Ergebnisse für die Immuno-Untereinheit iβ2 in den Homogenaten der Leber und des Dünndarms aus den Wildtypmäusen. In den Leberhomogenaten nahmen unreifes iβ2 mit Propeptid (pro-iβ2) und maturiertes iβ2 nach der Infektion stark zu und sanken nach der überstandenen Listeriose am Tag 27 p.i. wieder auf das Ausgangsniveau. Im Gegensatz dazu stieg in den Dünndarmhomogenaten der bereits schon erhöhte Level von iβ2 nur geringfügig an und blieb bis zum Tag 27 p.i. konstant. Der Nachweis der Immuno-Untereinheiten iβ1 und iβ5 ergab ebenfalls entsprechende Ergebnisse im Westernblot. Zusammen war dies als ein erster Hinweis auf eine organspezifische Proteasomenregulation nach einer L. monocytogenes Infektion zu werten. Bei den I-Tieren war weder in den Leber- noch in den Dünndarmhomogenaten eine vergleichbar starke iβ2-Zunahme wie in den Leberhomogenaten der Wildtypmäuse zu verzeichnen ( Abb. 24 B). In den T-Tieren stieg iβ2 jedoch in beiden Organen deutlich an ( Abb. 24 C). Auch diese Ergebnisse ließen sich in Westernblots für die anderen Immuno-Untereinheiten bestätigen. Da für die Versuche Gewebehomogenate verwendet wurden, erfassten die Westernblots die Expression der Proteine in den Organen, unterschieden aber nicht zwischen den freien und den in funktionsfähige Proteasomen eingebauten Immuno-Untereinheiten. Zu diesem Zweck mussten die 20S Proteasomen aus den Homogenaten isoliert werden.

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Abb. 24 : Detektion der Immuno-Untereinheit i β 2 in Organhomogenaten. 200µg Gesamtprotein aus Leber- und Dünndarmhomogenaten verschiedener Tage nach der Infektion wurde in der SDS-PAGE getrennt, geblottet und mit dem Antikörper gegen iβ2 inkubiert. (A) Wildtypmäuse. (B) I-Tiere. (C) T-Tiere. Pfeile kennzeichnen reifes iβ2 und unreifes iβ2 (pro-iβ2).

3.3.2 Zusammensetzung der aus Geweben isolierten 20S Proteasomen

3.3.2.1  Die Zusammensetzung der Proteasomen aus den Geweben der Wildtypmäuse

Um verfolgen zu können, welche Untereinheiten in die Proteasomen eingebaut worden waren, wurden die 20S Proteasomen aus den Geweben isoliert, die Untereinheiten in 2D-Gelen aufgetrennt und mittels MALDI-TOF identifiziert. Die Coomassie-gefärbten Gele wurden eingescannt und die Bilder unbearbeitet densitometrisch ausgewertet. Da die Coomassie-Färbung und -Entfärbung auf einem großen Gel nicht vollständig homogen war, wurde die von den Spots abzuziehende Hintergrundfärbung für jeden Spot separat in dessen unmittelbarer Nähe definiert. Für die Quantifizierung der Immunoproteasomen in den jeweiligen Proteasomenpräparationen wurde folgende Methodik eingeführt: Zuerst wurde in jedem Gel für jedes proteolytisch aktive Untereinheiten-Paar, bestehend aus der konstitutiven und der korrespondierenden Immuno-Untereinheit, die Intensität der Färbung beider Spots zusammen auf 100% gesetzt. Dann wurde der prozentuale Anteil der Immuno-Untereinheit an der Gesamtintensität des jeweiligen Paares bestimmt. Die prozentualen Anteile aller drei Immuno-Untereinheiten in den drei Wiederholungsversuchen wurden gemittelt und dieser Mittelwert als der prozentualer Anteil der Immunoproteasomen in der Proteasomenpräparation dargestellt. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Präparationen aus den Organen der verschiedenen Tage nach der Infektion wurden durch Anwendung des einseitigen heteroskedastischen t-Testes (Welch-Test) ermittelt (siehe auch 3.2.3 ).

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Abb. 25 A zeigt die Zusammensetzung der Leberproteasomen aus Wildtypmäusen in repräsentativen 2D-Gelen. Die Immuno-Untereinheit iβ1 stieg nach der Infektion deutlich an, während die entsprechende konstitutive Untereinheit β1 abnahm; ein analoger Austausch konnte bei dem Paar iβ2/β2 beobachtet werden. iβ5 war am Tag 0 schon in geringem Maß in die 20S Proteasomen eingebaut, jedoch reduzierte sich der Anteil der konstitutiven Untereinheit β5 in den isolierten Proteasomen bis zum Tag 6 p.i.. Die densitometrische Auswertung ergab in den Lebern der Wildtyptiere jeweils signifikante Zunahmen der Immunoproteasomen von ca. 20% am Tag 0 bis zu ca. 60% am Tag 6 p.i. ( Abb. 25 B).

Abb. 25 : 2D-Gelelektrophorese der Leberproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Coomassie-gefärbte hochauflösende 2D-Gele der an verschiedenen Tagen nach der Infektion aus Leber isolierten 20S Proteasomen. Kreise markieren Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar. (B) Densitometrische Auswertung der in (A) gezeigten Gele zusammen mit den Wiederholungsgelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) an der Proteasomenisolation angegeben. Klammern und Sterne kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05).

Die aus Dünndarm isolierten Proteasomen der Wildtyptiere wurden ebenfalls einer Auftrennung im 2D-Gel unterzogen. Wie in Abb. 26 A ersichtlich, waren die drei aktiven Immuno-Untereinheiten bereits am Tag 0 in die Proteasomen integriert. Die Infektion hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die proteasomale Zusammensetzung, da der Anteil der Immunoproteasomen in den jeweiligen Isolationen aus dem Dünndarm konstant bei ca. 60% blieb ( Abb. 26 B). Es wurde wiederholt beobachtet, dass das Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt von iβ2 und β2 in Dünndarmproteasomen von denen der übrigen Gewebeproteasomen abwichen (Kuckelkorn et al., 2002); derzeit wird als Ursache hierfür die Möglichkeit des gewebespezifischen Splicing untersucht (Dr. Ulrike Kuckelkorn, persönliche Mitteilung).

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Abb. 26 : 2D-Gelelektrophorese der Dünndarmproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Coomassie-gefärbte hochauflösende 2D-Gele der an verschiedenen Tagen nach der Infektion aus Dünndarm isolierten 20S Proteasomen. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar. (B) Densitometrische Auswertung der in (A) gezeigten Gele zusammen mit den Wiederholungsgelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) an der Proteasomenisolation angegeben. Es waren keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) zu verzeichnen.

Für die Auftrennung im hochauflösenden 2D-Gel mit anschließender Coomassie-Färbung wurden 80 µg Proteasom eingesetzt. Da diese Proteasomenmenge aus kleinen Organen wie der Milz und dem Colon nicht reproduzierbar isoliert werden konnte, wurde bei den genannten Organen auf eine umfassende Analyse mittels 2D-Gelelektrophorese verzichtet. Stattdessen wurden die isolierten Proteasomen mehrfach in der eindimensionalen SDS-PAGE getrennt und Westernblotanalysen durchgeführt. Die Proteasomen aus dem Lymphorgan Milz enthielten in uninfizierten Wildtypmäusen schon einen hohen Anteil an Immuno-Untereinheiten im Vergleich zu den Leberproteasomen ( Abb. 27 A). Analog dazu waren nur sehr geringe Mengen der konstitutiven Untereinheiten in die 20S Proteasomen der Milz integriert ( Abb. 27 B). Dies änderte sich nicht nach der L. monocytogenes Infektion und entsprach somit der Zusammensetzung der Proteasomen aus dem anderen untersuchten lymphatischen Organ, den Dünndarmproteasomen.

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Abb. 27 : Westernblotanalyse und 2D-Gelelektrophorese der Milzproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Westernblots gegen die Immuno-Untereinheiten. Zum Vergleich sind Westernblots gegen Leberproteasomen vom Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtypmäuse dargestellt (LeK). Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden. (B) 2D-Gel der Milzproteasomen, die am Tag 0 aus Wildtypmäusen isoliert wurden. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar.

Der Colon kann als nicht-lymphatisches Organ angesehen werden, da er keine Peyerschen Plaques aufweist. In den Wildtyptieren wurde der Colon im Gegensatz zu Leber und Milz nach der Infektion nicht von L. monocytogenes befallen ( 3.1 ). Ab Tag 2 p.i. war jedoch im Westernblot eine verstärkte Inkorporation von Immuno-Untereinheiten zu erkennen, die mit der in die Leberproteasomen zu vergleichen war ( Abb. 28 , vergl. Abb. 25 ). In Übereinstimmung damit nahmen die konstitutiven Untereinheiten ab. Die Immuno-Untereinheit iβ5 war zwar schon am Tag 0 in die Proteasomen integriert, doch nach Bewältigung der Listeriose am Tag 27 p.i. war der Anteil stark zurückgegangen ( Abb. 28 ). Auffällig war auch die Abnahme der entsprechenden konstitutiven Untereinheit β5 erst am Tag 6 p.i.. Dies entsprach aber der Entwicklung, welche in den 2D-Gelen der Leberproteasomen zu sehen war, da auch dort der deutlichste Rückgang von β5 erst zwischen Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. zu verzeichnen war (vergl. Abb. 25 ). Die Struktur der Proteasomen des nicht-lymphatischen, nicht-infizierten Colons änderte sich nach der Infektion analog der Struktur der Proteasomen aus der nicht-lymphatischen, aber infizierten Leber. Eine Schlussfolgerung könnte daher sein, dass L. monocytogenes keinen direkten Einfluss auf die Induktion der Immuno-Untereinheiten ausübte, sondern dass die Expression und der Einbau der Immuno-Untereinheiten – vielleicht sogar im gesamten Körper – indirekt vermittelt wurden.

Abb. 28 : Westernblotanalyse der Colonproteasomen aus Wildtypmäusen. Es sind repräsentative Westernblots gegen die Immuno- und konstitutiven Untereinheiten isolierter 20S Proteasomen gezeigt. Zum Vergleich sind Westernblots gegen Leberproteasomen von Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtypmäuse dargestellt (LeK). Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden.

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Abschließend kann zusammengefasst werden, dass nach der L. monocytogenes Infektion eine Induktion der Immuno-Untereinheiten in den untersuchten nicht-lymphatischen Organen erfolgte. Eine durch die Infektion verursachte Spotverschiebung der α- oder der anderen β-Untereinheiten in den hochauflösenden 2D-Gelen konnte nicht reproduzierbar festgestellt werden. Die lymphatischen Organe enthielten von Tag 0 an mehr Immunoproteasomen, deren Anteil durch die Infektion aber nicht weiter gesteigert werden konnte. Somit ist die Proteasomenpopulation nicht nur im Körper lokal verschieden, sondern kann sich auch innerhalb eines Organs temporär ändern.

3.3.2.2 Die Zusammensetzung der Proteasomen aus den Geweben der Rezeptor-defizienten Mäuse

TNFα und IFNγ sind proinflammatorische Cytokine, deren Aufgabe es ist, Entzündungsstimuli zu vermitteln. Aus Zellkulturexperimenten gewonnene Daten sprechen diesen beiden Cytokinen eine Rolle bei der Induktion der Immuno-Untereinheiten zu (Hallermalm et al., 2001; Schroder et al., 2004). Ob dies die in vivo Situation widerspiegelt, sollte durch die Analysen von Cytokinrezeptor-defizienten Mäusen geklärt werden. Die densitometrische Auswertung der 2D-Gele von Leberproteasomen ergab, dass nur in den T-Tieren eine signifikante Zunahme der Immunoproteasomen zu beobachten war. Sie betrug wie bei den Wildtypmäusen ca. 20% ( Abb. 29 A), wohingegen der vermeintliche Anstieg zwischen Tag 0 und Tag 4 p.i. bei den I-Tieren mit p ≥ 0,17 als eindeutig nicht signifikant einzustufen war. Es konnte also keine deutliche Zunahme der Immunoproteasomen in den mit L. monocytogenes infizierten I-Tiere beobachtet werden. Bei den Dünndarmproteasomen war ebenfalls eine Übereinstimmung zwischen Wildtyp- und T-Tieren festzustellen, da beide von Tag 0 an schon ca. 60% Immunoproteasomen enthielten ( Abb. 29 B). Die I-Tiere wiesen im Dünndarm zwar mehr Immunoproteasomen auf als zu dem jeweils selben Zeitpunkt in ihrer Leber. Jedoch lag der Anteil der Immunoproteasomen im Dünndarm der I-Tiere mit ca. 40% deutlich unter dem ca. 60%igen Immunoproteasomenanteil im Dünndarm der Wildtypmäuse und T-Tiere. Den drei Tiermodellen gemeinsam war, dass die Infektion keine signifikante Induktion der Immuno-Untereinheiten im Dünndarm bewirken konnte.

Abb. 29 : Übersicht des Anteils der Immuno proteasomen in den Präparationen aus Leber und Dünndarm. Densitometrische Auswertung der drei Immuno-Untereinheiten von je zwei bis drei 2D-Gelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) angegeben. Zum Vergleich ist die Auswertung der Proteasomen aus den Wildtypmäusen noch einmal gezeigt. (A) Leberproteasomen. (B) Dünndarmproteasomen. Klammern und Sterne kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05).

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Ähnlich den Resultaten für Leberproteasomen enthielten die Colonproteasomen der T-Tiere am Tag 2 p.i. in der Westernblotanalyse sichtbar mehr Immuno-Untereinheiten als am Tag 0, wobei in den I-Tieren ein Anstieg dieser Untereinheiten nicht zu verzeichnen war ( Abb. 30 A, B). Die Ergebnisse der Westernblots für Milzproteasomen zeigten, dass sich in diesem bei den I- und T-Tieren sehr stark infizierten Organ der Anteil der Immuno-Untereinheiten nicht weiter erhöhte ( Abb. 30 C).

Abb. 30 : Westernblotanalyse der Colon- und Milzproteasomen aus Cytokinrezeptor-defizienten Mäusen. Es sind repräsentative Westernblots gegen die Immuno-Untereinheiten isolierter 20S Proteasomen der I-Tiere (grüne Schrift) und T-Tiere (blaue Schrift) gezeigt. Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden. (A) Colonproteasomen. (B) Leberproteasomen von Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtyptiere als Kontrolle (LeK). (C) Milzproteasomen.

Obwohl die T-Tiere die Infektion nicht bekämpfen konnten, wiesen sie bei den Immunoproteasomen keinerlei Defizite auf: In Leber und Colon entsprach die Induktion der Immuno-Untereinheiten der in den Wildtypmäusen, und auch Dünndarm und Milz besaßen ähnlich hohe Ausgangsniveaus an Immuno-Untereinheiten. Daraus folgte, dass TNFα keinen dominanten Einfluss auf die proteasomale Expression vor und nach der Infektion ausübte. Im Gegensatz dazu besaßen die I-Tiere in Dünndarm und Milz generell weniger Immunoproteasomen als in den Wildtyp- oder T-Tieren und reagierten nach Besiedlung durch L. monocytogenes weder in der Leber noch im Colon mit der Induktion der Immuno-Untereinheiten. Dies stützt die oben geäußerte Hypothese, dass die Erreger selbst keinen direkten Einfluss auf die Regulation der proteasomalen Untereinheiten ausüben, sondern diese in vivo von einem weiteren Faktor abhängig ist, nämlich INFγ und nicht TNFα.

3.4 Struktur- und Funktionsanalyse der Proteasomen aus ausgewählten Gewebezelltypen

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Organe bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen mit verschiedenen Funktionen. Ist ein Gewebe infiziert, wandern zusätzlich Zellen des Immunsystems in die Gewebe ein. Die Zunahme der Immunoproteasomen und der Peptidgenerierung in den Präparationen aus der Leber der Wildtyp- und T-Tiere könnte demnach auf der Ansammlung von Monocyten am Infektionsherd beruhen. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden Hepatocyten am Tag 0 und Tag 2 p.i. von den restlichen Zellen der Leber aus Wildtypmäusen separiert und zur Isolation von 20S Proteasomen verwendet. Diese isolierten Proteasomen wurden sowohl in den in vitro Prozessierungsexperimenten eingesetzt als auch in der 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Aus Hepatocyten isolierte Proteasomen vom Tag 2 p.i. generierten deutlich mehr Epitop und Precursor als die Hepatocytenproteasomen vom Tag 0 ( Abb. 31 A). Abb. 31 B zeigt, dass die Immuno-Untereinheiten vom Tag 0 zu Tag 2 p.i. ebenfalls zunahmen. Damit entsprachen diese Resultate den zuvor dargestellten Ergebnissen mit Proteasomen, die aus der gesamten Leber isoliert worden waren (vergl. Abb. 18 und Abb. 25 ).

Abb. 31 : Funktionelle und strukturelle Analyse der Hepatocytenproteasomen. (A) Es werden die normierten Intensitäten nach einer repräsentativen Prozessierung des LLO-Substrates mit 4 h Verdauzeit gezeigt. Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. (B) Coomassie-gefärbte 2D-Gele der aus Hepatocyten präparierten Proteasomen. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar.

Anschließend wurde die Expression der Immuno-Untereinheiten in den verschiedenen Gewebezellen und eingewanderten Immunzellen auch mithilfe der Immunofluoreszenz-Mikroskopie analysiert. Gewebeschnitte aus Leber und Colon vor der Infektion und am Tag 2 p.i. wurden mit Antikörpern gegen die Immuno-Untereinheit iβ2 und gegen den Makrophagen-Marker F4/80 gefärbt. Die Auswertung der Übersichtsaufnahmen ergab, dass in den nicht-lymphatischen Zellen die Bildung von Immunoproteasomen durch die L. monocytogenes Infektion induziert wurde: In der Leber stieg die Färbung der Immuno-Untereinheit in den Hepatocyten besonders sichtbar in den Zellkernen an ( Abb. 32 A), und auch die Epithelzellen des Colon entlang der Lieberkühn Krypten reagierten nach der Infektion mit einer starken Expression der Immuno-Untereinheit ( Abb. 32 B). Wie sich aus der Überlagerung der beiden Antikörperfärbungen ergab, wurde iβ2 ebenfalls in den Makrophagen exprimiert, die nach der Infektion im Colon in die unterhalb der Epithelzellen gelegene Lamina Propria eingewandert waren. Die im Gewebe residierenden Makrophagen der Leber, die Kupfferschen Zellen, zeigten keine erhöhte Induktion der Immuno-Untereinheit. Entsprechende Färbungen wurden in denselben Geweben bei Verwendung der Antikörper gegen die anderen beiden Immuno-Untereinheiten iβ1 und iβ5 erzielt (nicht gezeigt).

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Abb. 32 : Expression der Immunoproteasomen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Zellen. Es werden Übersichtssaufnahmen der Immunofluoreszenz-Analysen von (A) Leberschnitten und (B) Colonschnitten vom Tag 0 und Tag 2 nach der L. monocytogenes Infektion gezeigt. Die Immunoproteasomen wurden mit einem Antikörper gegen iβ2 gefärbt (grün). Makrophagen wurden durch Färbung des Markerproteins F4/80 nachgewiesen (rot). Die Überlagerung der beiden Färbungen ist orange dargestellt. Die Schnitte der beiden Organe zeigen am Tag 2 p.i. eine deutlich stärkere Expression der Immunoproteasomen als am Tag 0. (Vergrößerung ca. 100x)

3.5 Funktionelle Unterschiede zwischen konstitutiven und Immunoproteasomen

Die genauere Charakterisierung des Prozessierungsverhaltens von konstitutiven und Immunoproteasomen erforderte eine detaillierte Auswertung der Prozessierungsexperimente. Entsprechend der in 3.3.2.1 gezeigten proteasomalen Zusammensetzungen werden in diesen Kapitel die Leberproteasomen, die vor der L. monocytogenes Infektion aus den Wildtypmäusen isoliert wurden, zur Vereinfachung als konstitutive Proteasomen bezeichnet. Dementsprechend werden die Leberproteasomen vom Tag 6 p.i. sowie die Dünndarmproteasomen nur Immunoproteasomen genannt.

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Die eingesetzten Peptidsubstrate wurden in den in vitro Prozessierungsexperimenten von den Immunoproteasomen schneller degradiert als von den konstitutiven Proteasomen. Abb. 33 zeigt dies am Bespiel des LLO-Substrates im Verdau mit Leberproteasomen, die in Anlehnung an die Ergebnisse aus ( 3.3.2.2 ) in konstitutive und Immunoproteasomen eingeteilt wurden. Wurde die übriggebliebene Substratmenge nach einem 2 h Verdau mit konstitutiven Proteasomen auf 100% gesetzt, waren in den Ansätzen mit Immunoproteasomen nach derselben Verdauzeit nur noch weniger als 30% Substrat vorhanden.

Abb. 33 : Beschleunigter Substratabbau durch Immunoproteasomen. Nach 2 h Verdauzeit des LLO-Substrates wurde die Substratmenge aus den Ansätzen mit den Tag 0 Leberproteasomen der Wildtypmäuse, I- und T-Tiere auf je 100% gesetzt. Hellere Flächen kennzeichnen die Prozessierungsansätze mit Immunoproteasomen.

Da Immunoproteasomen die Substrate schneller umsetzten, kann geschlussfolgert werden, dass die Produkte in diesen Prozessierungsansätzen schneller generiert wurden. Daraus ergab sich die Frage, ob die in 3.2.4 beobachteten Unterschiede ausschließlich auf die Geschwindigkeit der Immunoproteasomen zurückzuführen sind. Um diese Frage zu klären wurden sogenannte Antitope in die Auswertung miteinbezogen. Antitope sind Fragmente, die durch einen Schnitt innerhalb der Epitopsequenz entstehen, so dass eine weitere Prozessierung der Fragmente zu Precursor oder Epitopen nicht mehr möglich ist. Das Antitop 4-12 sowie ein weiteres untersuchtes Antitope ( Abb. 34 A und nicht gezeigt; vergl. Abb. 14 ) wurden aus dem LLO-Substrat durch die Immunoproteasomen häufiger gebildet als durch die konstitutiven Proteasomen, was der Generierung der immunrelevanten Fragmente entsprach ( Abb. 34 B; vergl. Abb. 18 ).

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Abb. 34 : Auswertung des Antitopes 4-12. (A) Schnittkarte des LLO-Substrates zur Veranschaulichung der Lage des Antitopes 4-12. (B) Normierte und gemittelte Intensitäten des Antitopes 4-12 nach 2 h Verdauzeit mit Leberproteasomen der Wildtyptiere. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) bezogen auf den Ansatz mit Tag 0 Proteasomen (konstitutive Proteasomen).

Um Unterschiede in den Zunahmen quantitativ erfassen zu können, sollte geklärt werden, ob die Intensitäten linear zu den Fragmentmengen stiegen und somit quantitative Aussagen möglich wurden. Bei der Erstellung von Eichgeraden musste in diesem Zusammenhang beachtet werden, dass sich die Peptide in der massenspektrometrischen Messung und auch in der vorgeschalteten HPLC gegenseitig beeinflussten (Tang et al., 2004). Demnach waren die detektierten Intensitäten auch von der Zusammensetzung der Probe abhängig. Für den Precursor 4-14, das Antitop 4-12 und die beiden Epitope 6-14 und 7-14 wurden Eichreihen angefertigt, die diese Fragmente in zwölf unterschiedlichen Konzentrations-Zusammensetzungen enthielten, um sich der realen Situation, die einem viele verschiedene Produkte enthaltenen Prozessierungsansatz entspricht, anzunähern.

Die Auswertung ergab, dass die Zunahme der Epitope 6-14 und 7-14 sowie des Precursors mit einer linearen Intensitätszunahme einherging, die unabhängig von der Zusammensetzung der Probe war ( Abb. 35 ). Die Intensität des Antitopes hingegen wurde bei 10 pmol und 20 pmol von den Mengen der anderen Fragmente beeinflusst, was durch die große Streuung der Intensitäten deutlich wurde. Zuvor erstellte Daten und ein bei den Eichmessungen mitgeführter proteasomaler LLO-Prozessierungsansatz zeigten, dass die normalerweise gemessenen Intensitäten durch Fragmentmengen zwischen 1 pmol und 5 pmol erreicht wurden. Da in diesem Bereich auch die Streuung des Antitopes gering war, konnte die Generierung dieser Fragmente in den Prozessierungsexperimenten direkt miteinander verglichen werden.

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Abb. 35 : Eichgeraden für ausgewählte Fragmente in verschieden Konzentrations-Zusammen setzungen. Die Fragmentmischungen wurden mit gleichen Mengen LLO-Substrat und internem Standard versetzt und mithilfe der HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch analysiert. Jeder Punkt zeigt die gemessene Intensität bei bestimmter Fragmentmenge pro Probe in einer der insgesamt zwölf doppelt gemessenen Eichlösungen. Die Gerade geht durch die Mittelwerte der Intensitäten für die jeweiligen Fragmentmengen; die Standardabweichungen sind rot eingezeichnet.

Die normierten Intensitäten des Precursors und des Epitopes wurden zu den normierten Intensitäten des Antitopes 4-12 ins Verhältnis gesetzt. Bei den konstitutiven Proteasomen, also den Leberproteasomen der I-Tiere und dem Tag 0 Leberproteasomen der Wildtypmäuse, lag das Verhältnis der Intensitäten bei ungefähr 1 ( Abb. 36 ). Im Gegensatz dazu generierten die Immunoproteasomen – Dünndarmproteasomen und Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. Leberproteasomen der Wildtypmäuse – mindestens das Doppelte an Epitop und Precursor. Obwohl die Immunoproteasomen alle untersuchten Fragmente, demnach auch das Antitop, verstärkt bildeten, konnte also zusätzlich eine Änderung in der Schnittpräferenz zugunsten der immunrelevanten Produkte beobachtet werden.

Abb. 36 : Änderung der Schnittpräferenz. Das LLO-Substrat wurde durch konstitutive und Immunoproteasomen degradiert und mittels der HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch analysiert. Normierte Intensitäten der immunrelevanten Fragmente wurden zu den normierten Intensitäten des Antitopes 4-12 ins Verhältnis gesetzt. (A) Leberproteasomen der I-Tiere (konstitutive Proteasomen). (B) Leberproteasomen der Wildtypmäuse (Tag 0: konstitutives Proteasom; Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i.: Immunoproteasomen). (C) Dünndarmproteasomen der Wildtypmäuse (Immunoproteasomen). ♦ – Precursor 4-14; #SYMBOL# – Epitop 6-12; o – Antitop 4-12.

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Außerdem sollte geklärt werden, ob Immunoproteasomen durch die geänderte Schnittpräferenz zusätzlich in der Lage sind, Spaltungen nach Aminosäuren vorzunehmen, hinter denen konstitutive Proteasomen nicht schneiden. Hierfür wurden insgesamt 16 Prozessierungsansätze mit verschiedenen Inkubationszeiten unter dem Aspekt untersucht, ob jeder Ansatz sämtliche massenspektrometrisch identifizierten Produkte enthielt (vergl. Abb. 14 ). Immunoproteasomen generierten in jedem Ansatz alle Fragmente, die in der vollständige Schnittkarte auftreten; in den Degradationen mit konstitutiven Proteasomen fehlten jedoch immer die Produkte 6-12 und 17-25 ( Abb. 37 ). Diese Produkte wurden aber von Immunoproteasomen mit Schnitten gebildet, welche auch von konstitutiven Proteasomen durchgeführt wurden, da verlängerte und angrenzende Fragmente in den Prozessierungsansätzen mit konstitutiven Proteasomen detektierbar waren. Es ließ sich also schlussfolgern, dass beide Proteasomenarten dieselben Schnittstellen nutzten, die Immunoproteasomen aber mehr Fragmente oberhalb des massenspektrometrischen Detektionslimits produzierten.

Abb. 37 : Fragmentgenerierung durch konstitutive und Immunoproteasomen. Das LLO-Substrat wurde 2 h und 8 h mit konstitutiven oder Immunoproteasomen inkubiert. Sämtliche Fragmente (alle Farben) wurden durch die Immunoproteasomen gebildet. Die rote Balken zeigen die Fragmente 6-12 und 17-25, die nicht von den konstitutiven Proteasomen generiert wurden. Die dunkelblaue Balken symbolisieren die Produkte, die durch die Schnitte entstanden sind, welche auch die Fragmente 6-12 und 17-25 betreffen; diese Schnitte sind rot umrandet. Die hellblauen Balken repräsentieren die Fragmente, deren Schnittstellen nicht mit den Fragmenten 6-12 und 17-25 übereinstimmen.

3.6 Posttranslationale Modifikation der Proteasomen mit O-GlcNAc – Erste Hinweise

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Immunoproteasomen können sich strukturell und funktionell weiter unterscheiden. Dies wurde neben der Arbeit von Kuckelkorn et al. (Kuckelkorn et al., 2002) auch durch die in 3.2.4.3 durchgeführten Prozessierungsexperimente bestätigt: Obwohl der Colon der Wildtypmäuse am Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i. Immunoproteasomen enthielt, war die Generation des (pp89)Precursor 5-15 nicht erhöht – im Gegensatz zu der Produktion dieses Produktes durch die Immunoproteasomen aus den Lebern derselben Tiere (vergl. Abb. 23 B, Abb. 25 , Abb. 28 ). Die proteasomale Funktion wird also nicht ausschließlich durch das Vorhandensein der Immuno-Untereinheiten bestimmt. Eine Regulation der proteasomalen Aktivität, die nur das pp89-Substrat aber nicht das LLO- und Hsp60-Substrat betrifft (vergl. Abb. 19 und Abb. 23 A), wäre z.B. durch posttranslationale Modifikationen zu erreichen. Bisher wurde nachgewiesen, dass mehrere proteasomale Untereinheiten phosphoryliert vorliegen können, wobei aber keine eindeutige Korrelation zur proteasomalen Aktivität hergestellt werden konnte (Fernandez Murray et al., 2002; Iwafune et al., 2002; Mason et al., 1996). Allerdings führt IFNγ zu einer Dephosphorylierung und Destabilisierung von 26S Proteasomen (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Ein Antagonist der Phosphorylierung ist die nukleo-cytosolische Glycosylierung mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosaminin (GlcNAc), da GlcNAc über den Sauerstoff von Serin- und Threoninresten (O-GlcNAc) an dieselben oder benachbarten Aminosäuren wie die Phosphatgruppe binden kann (Slawson und Hart, 2003). Aus diesem Grund ist interessant zu überprüfen, ob nach der L. monocytogenes Infektion, die zu einem Anstieg von IFNγ führt (vergl. Abb. 9 ), auch ein Effekt auf eine möglicherweise vorhandene Modifikation der Proteasomen mit O-GlcNAc zu verzeichnen ist.

In Vorversuchen wurde mit aus der RMA-Zellkulturlinie isolierten 20S Proteasomen untersucht, ob O-GlcNAc an 20S Proteasomen nachweisbar ist. Eine unspezifische Zuckerfärbung über Aufspaltung des Pyranoseringes durch Perjodat und anschließender Streptavidin-Biotin Markierung ergab ein initial positives Ergebnis (nicht gezeigt). Als nächstes wurden das GlcNAc-spezifische Lektin WGA getestet, welches GlcNAc auch in Verbindung mit anderen Zuckern erkennt, sowie zwei Antikörper, die ausschließlich die über Sauerstoff gebundenen Monosaccharide detektieren ( Abb. 38 ). Das Lektin und die Antikörper erkannten die meisten proteasomalen Untereinheiten. Da die Lektin- und Antikörperbindungen durch freies GlcNAc konzentrationsabhängig zu inhibieren waren, sprach dies für einen spezifischen Nachweis und bedeutete somit, dass die meisten Untereinheiten mit O-GlcNAc modifiziert vorlagen. Zwei der mit allen drei Detektionsmethoden stark gefärbten Banden konnten massenspektrometrisch als α4 beziehungsweise als iβ5/β5 identifiziert werden.

Abb. 38 : O-GlcNAc Nachweis an 20S Proteasomen. Aus der Zellkulturlinie RMA isolierte Proteasomen wurde in der Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow getrennt, geblottet und mit Coomassie gefärbt. Zu den Inkubationsansätzen mit Lektin oder Antiköper wurde kein (-), 10 mM (+10) oder 500 mM (+500) freies GlcNAc zugegeben. Die mit allen drei Nachweismethoden detektierten Banden sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet und beschriftet, wenn sie massenspektrometrisch identifiziert werden konnten. (A) WGA-Lektin; (B) MA1-076 Antikörper; (C) CTD-110.6 Antikörper.

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Die Antikörper- und Lektinfärbung der in der 2D-Gelelektrophorese aufgetrennten und geblotteten RMA-Proteasomen war generell sehr schwach (nicht gezeigt). Um einen sensitiveren Nachweis zu etablieren, wurden in Zellkulturexperimenten radioaktive in vivo Markierungen durchgeführt. RMA-Zellen wurden in Glucose-freiem Medium mit 14C-Glucosamin versetzt, welches die Zellen aufnehmen und zu GlcNAc umbauen können. Nach Inkubationszeiten von 1 bis zu 5 h wurden 20S Proteasomen durch Immunopräzipitation angereichert und im SDS-Gel aufgetrennt. Als Kontrolle wurden die Zellen auch mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid behandelt, um zu verhindern, dass möglicherweise in die Aminosäuresyntheseeingegangenes 14C-Glucosamin eine Proteinmarkierung verursachte. Wie aus Abb. 39 ersichtlich ist, war jedoch genau dies der Fall, da die zeitabhängige radioaktive Markierung sich unter nicht-toxischer Cycloheximidzugabe nicht reproduzieren ließ. Die in vivo Markierung ist deshalb nicht für den Nachweis von O-GlcNAc Modifikationen geeignet. Als methodische Alternative steht eine noch zu testende radioaktive in vitro Markierung zur Verfügung.

Abb. 39 : In vivo Markierung mit 14 C-Glucosamin. RMA-Zellen wurden für die angegebenen Zeiten ohne (-) und mit (+) Cycloheximid in 14C-Glucosamin-haltigem Medium inkubiert. Die immunopräzipitierten Proteasomen wurden in der SDS-PAGE getrennt. Als Größenkontrolle wurde 35S-markiertes 20S aus humanen Zellen (h) oder den murinen RMA-Zellen (mu) mitaufgetragen.

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Für weitere Experimente mit kultivierten Zellen zur Analyse der posttranslationalen Modifikation mit O-GlcNAc wurde das spezifisch O-GlcNAc von Proteinen abspaltende Enzym N-Acetylglucosaminidase (NAG) kloniert sowie eine gegen NAG gerichtete siRNA entwickelt. Die Transfektion von 500 pmol siNAG in RMA-Zellen führte zu einer spezifischen Abnahme der NAG-Expression und hatte keinen Effekt auf die zur Kontrolle untersuchte Aktin-Expression ( Abb. 40 ). Wie erwünscht zeigte die Transfektion mit einer unspezifischen siRNA keinen Effekt. Klonierung und spezifische siRNA sind derzeit auch für die O-GlcNAc-Transferase (OGT) in Bearbeitung.

Abb. 40 : RT-PCR zur Überprüfung der siRNA-Funktion. RMA-Zellen wurden durch Elektroporation mit 200 pmol, 500 pmol oder 1000 pmol der siRNA gegen NAG (siNAG) oder einer unspezifischen siRNA (siKontrolle) transfiziert. Nach 24 h wurde durch RT-PCR für NAG und Aktin überprüft, ob die Genexpression beeinflusst wurde.

Die exakte Position der Glycosylierung innerhalb eines Proteins lässt sich theoretisch durch massenspektrometrische Untersuchungen bestimmen. Da O-GlcNAc in diesen Analysen jedoch nicht stabil ist, wird momentan eine regulierte beta-Elimination des Zuckers mit anschließender stabiler Substitution etabliert, die in einer definierten Verschiebung des m/z resultiert. Um die Suche so weit wie möglich einzugrenzen, wurden in einigen Untereinheiten Aminosäuren identifiziert, welche für eine Modifizierung in Frage kommen. Hierfür wurden die Primärsequenzen zuerst mithilfe des im Internet verfügbaren Vorhersageprogramms „YinOYang“ für Phosphorylierungs- und O-Glycosylierungsstellen ausgewertet. Als zusätzliche Kriteria wurden Konserviertheit und exponierte Lage auf Oberfläche des Proteasoms festgelegt. Zusätzlich wurden die Rohdaten für die proteasomale Röntgenkristallstrukturaufklärung dahingehend untersucht, ob in der Nähe der ausgewählten Aminosäuren strukturell nicht zu identifizierende Elektronendichten auftraten: Eine regulatorische Modifikation ist nicht unbedingt an allen Proteasomen gleich stark vertreten und würde wegen ihres vereinzelten Vorkommens nur als undefinierte Elektronenwolke in der Strukturaufklärung auffallen (Dr. Michael Groll, persönliche Mitteilung). Die Ergebnisse sind in Tab. 5 zusammengefasst.

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Tab. 5 : Potentiell modifizierte Aminosäuren. Die Positionen der Aminosäuren beziehen sich auf die murinen Untereinheiten (UE). „zugänglich“ bedeutet, dass die Aminosäure an der Oberfläche des Proteasoms liegt und für modifizierende Enzyme gut erreichbar ist. „theoretische Modifikationsstellen“ sind mit dem „YinOYang“ Programm ermittelt worden.

UE

Aminosäure

Beschreibung

α2

Y5-T15

gut zugänglich

drei theoretische Phosphorylierungsstellen

davon eine auch theoretische O-GlcNAc Stelle

S53, S197, T221

zugänglich, theoretische Phosphorylierungsstelle

T106, S151

zugänglich, theoretische O-GlcNAc Stellen

α3

S7

zugänglich, theoretische O-GlcNAc Stelle

T10, T13, S173, T185, S204

zugänglich, theoretische Phosphorylierungsstellen

S133

zugänglich

zusätzliche Elektronendichte

S207-Umgebung

zugänglich

benachbarte α-Helix nicht lokalisiert

zusätzliche Elektronendichte

theoretische Phosphorylierungsstelle

α4

S49-Umgebung

sehr gut zugänglich, da Schlaufe auf der Oberfläche

2 bis 3 Aminosäuren nicht lokalisiert

T141, S166, T183

zugänglich, theoretische Phosphorylierungsstellen

α6

T11

zugänglich, theoretische O-GlcNAc Stelle

S165

zugänglich, theoretische Phosphorylierungsstelle

S177

sehr gut zugänglich, da auf kleiner Spitze exponiert

diffuse Elektronendichte für Seitenkette

theoretische Phosphorylierungsstelle

T206-T207

beide zugänglich

eine theoretische Phosphorylierungsstelle

eine theoretische O-GlcNAc Stelle

Um erste Hinweise auf eine mögliche Regulation der proteasomalen Aktivität durch O-GlcNAc nach der L. monocytogenes Infektion zu erlangen, wurden in der 2D-Gelelektrophorese separierte Leberproteasomen aus den Wildtyptieren vom Tag 0 und Tag 6 p.i. geblottet und mit dem MA1-076 Antikörper gegen O-GlcNAc inkubiert ( Abb. 41 ). Wie auf Grund der 1D-Gele zu erwarten war (vergl. Abb. 38 ), wurden auch in den 2D-Gelen die meisten mit Coomassie gefärbten Spots durch den Antikörper detektiert. In den Tag 0 Proteasomen ließ sich α3 mit dem MA1-076 Antikörper nicht sehr gut anfärben, in den Tag 6 p.i. Proteasomen hingegen war α3 deutlich zu erkennen. Besonders auffällig war dies in Bezug auf die Coomassie-Färbungen der α3-Spots. Dies lässt darauf schließen, dass nicht nur die aktiven Untereinheiten ausgetauscht wurden, sondern dass mit durch die Infektion ausgelösten Glycosylierungen weitere Regulationsmechanismen am Proteasom angesetzt haben könnten.

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Abb. 41 : O-GlcNAc Nachweis an Leberproteasomen aus L. monocytogenes infizierten Mäusen. Leberproteasomen der Wildtyptiere vom Tag 0 und Tag 6 p.i. wurden in der Mini-2D-Gelelektrophorese separiert und geblottet. Es sind die Coomassie-gefärbten Membranen und darunter die Färbung der jeweiligen Membran mit MA1-076 Antikörper gezeigt. Kreise markieren die proteasomalen Untereinheiten: türkis – β1; rot –β7; dunkelgrün – α1; orange – α3; violett – iβ5/β5-Paar.

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass 20S Proteasomen mit O-GlcNAc modifiziert werden können und dass die Infektion mit L. monocytogenes einen regulatorischen Effekt auf den Glycosylierungsstatus ausübt. Inwieweit diese Modifikation der 20S Proteasomen einen funktionellen und eventuell sogar gewebespezifischen Einfluss auf die proteasomale Funktion besitzt, kann bislang nur theoretisch diskutiert werden. Für die experimentelle Klärung dieser Fragestellungen sind weitere und sensitivere Nachweismethoden für O-GlcNAc erforderlich, die derzeit getestet und etabliert werden.


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24.05.2007