4 Diskussion

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4.1  Modifikation der Proteasomen mit O-GlcNAc

Das zentrale nicht-lysosomale proteolytische System der Zelle, das Proteasomensystem, besteht aus den katalytisch aktiven 20S Proteasomen sowie zwei regulatorischen Komplexen, welche die proteasomale Funktion und Aktivität beeinflussen können. Ist der 19S Regulator mit dem 20S Proteasom assoziiert, werden vorrangig polyubiquitinierte Substrate abgebaut, zu denen unter anderem kurzlebige und defekte Proteine gehören. Alternativ resultiert die Bindung von PA28-Komplexen meist in der verstärkten Generierung der Epitopprecursor und Epitope, die den CTLs durch die Bindung an MHC-Klasse-I Moleküle zu der Erkennung infizierter und entarteter Zellen verhelfen. Zudem sind generell posttranslationale Modifikationen geeignet, die Aktivitäten von Proteinen zu regulieren. Auch für das Proteasomensystem sind einige posttranslationale Modifikationen beschrieben worden, die möglicherweise Einfluss auf die proteasomale Funktion nehmen. So konnte die Arbeitsgruppe von A. J. Rivett nachweisen, dass IFNγ die Phosphorylierung von einigen 19S Untereinheiten inklusive der ATPase-Untereinheit S4 und den proteasomalen Untereinheiten α3 und α7 reduziert (Bose et al., 2001; Mason et al., 1998). Infolge der Dephosphorylierungen werden die aus einem 20S Proteasom und zwei 19S Regulatoren bestehenden 26S Proteasomen destabilisiert und somit die Bildung von Komplexen aus 20S und PA28 begünstigt (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Dies bedeutet, dass IFNγ nicht nur an der Induktion, sondern auch an der Interaktion der beiden Komplexe beteiligt ist und so eine großen Einfluss auf die verbesserte Epitop- und Precursorgenerierung besitzt. Da der IFNγ-Spiegel nach der Listeria monocytogenes Infektion – wie in der vorliegenden Arbeit dokumentiert ( Abb. 9 ) – steigt, kann vermutet werden, dass der von Bose et al. beobachtete Effekt auch im Infektionsverlauf eine Rolle bei der Epitoppräsentation spielt.

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Für mehrere cytosolische und nukleäre Proteine wurde antagonistisch zu einer Phosphorylierung der Serin- und Threoninreste eine Glycosylierung mit dem Monosaccharid O-GlcNAc an denselben oder an benachbarten Aminosäuren beschrieben (Slawson und Hart, 2003). Kürzlich zeigte die Arbeitsgruppe von J. E. Kudlow, dass die Glycosylierung der 19S ATPase-Untereinheit S4 mit O-GlcNAc den Abbau des Transkriptionsfaktors Sp1 und den eines hydrophoben fluorogenen Substrates inhibiert (Zhang et al., 2003). Als zu Grunde liegender Mechanismus dieser Inhibition wurde postuliert, dass die proteasomalen Substrate nicht angemessen entfaltet werden, weil die eventuell hierfür notwendigen hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der ATPase S4 und dem Substrat nicht eingegangen werden können. Ein Effekt auf die katalytisch aktiven β-Untereinheiten konnten Zhang et al. nicht nachweisen (Zhang et al., 2003). Die hier vorliegende Arbeit zeigt, dass die Infektion von Mäusen mit L. monocytogenes zu einer verstärkten Glycosylierung der α3-Untereinheit führte ( Abb. 41 ), was wie bei Zhang et al. nicht mit der Inhibition von 20S Proteasomen oder einer reduzierten Epitopbildung einherging ( Abb. 18 B).

Aus diesen drei Beobachtungen – 1. Inhibition der 26S aber nicht der 20S Proteasomen durch Glycosylierung, 2. Zunahme der α3-Glycosylierung nach der Infektion, 3. Dissoziation des 26S in 20S Proteasom und 19S Regulator durch IFNγ-ausgelöste Dephosphorylierung – lässt sich das folgende Modell formulieren: Eine reziproke Phosphorylierung/Glycosylierung von S4 und α3 würde ermöglichen, dass infektionsbedingt ausgeschüttetes INFγ zur Dephosphorylierung und daran anschließend zur Glycosylierung dieser Untereinheiten führt. Das könnte die Aktivität von 26S Proteasomen einerseits durch Inhibition und andererseits durch die Dissoziation in 20S Proteasomen und 19S Regulatoren reduzieren. Da die α-Untereinheiten für die Interaktion mit 19S Regulator und PA28 verantwortlich sind (Davy et al., 2001; Kania et al., 1996; Stohwasser et al., 2003; Whitby et al., 2000), könnten hier wechselnde posttranslationale Modifikationen einen Einfluss auf diese Bindungen ausüben. Demnach würde die Glycosylierung in der Infektion den Effekt der Dephosphorylierung unterstützen und durch eine gesteigerte Interaktion von PA28 mit den durch O-GlcNAc modifizierten aber nicht inhibierten 20S Proteasomen die Generierung immunrelevanter Fragmente begünstigen.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass neben der Untereinheit α3 weitere Untereinheiten der 20S Proteasomen mit O-GlcNAc modifiziert sind. In den mit Proteasomen aus RMA-Zellen und aus Lebergewebe durchgeführten Versuchen reagierten sämtliche Untereinheiten mit mindestens einem der O-GlcNAc spezifischen Antikörper MA1-076 und CTD-110.6 oder dem WGA-Lektin. Die spezifische Kompetition der Antikörper- und Lektinbindung an die proteasomale Untereinheiten durch die Zugabe von freiem GlcNAc in die Inkubationsansätze bestätigte, dass es sich hierbei nicht um unspezifische Artefakte handelte ( Abb. 38 ). Zudem konnten in einer kürzlich erschienenen Publikation – den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit entsprechend – fast alle Untereinheiten der 20S Proteasomen aus Drosophila melanogaster mit Antikörpern und WGA-Lektin detektiert werden (Sumegi et al., 2003). Die einzige Ausnahme bildete die Untereinheit α1, die sich in den murinen Proteasomen durch die Bindung des MA1-076 Antikörpers und des WGA-Lektins als hingegen sehr stark mit O-GlcNAc assoziiert darstellte. Dieser Unterschied beruht wahrscheinlich auf den verschiedenen Spezies, aus denen die Proteasomen isoliert wurden, da auch für die Phosphorylierung an den Proteasomen dementsprechendes beschrieben wurde: So ist für Candida albicans eine Phosphorylierung von α5 und α6 gezeigt worden, die in Saccharomyces cerevisiae nicht nachgewiesen werden konnte (Fernandez Murray et al., 2002; Iwafune et al., 2002).

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Wie die Analysen der in der Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow und in der Mini-2D-Gelelektrophorese aufgetrennten 20S Proteasomen ergab, detektierten die beiden Antikörper und das WGA-Lektin die einzelnen Untereinheiten mit jeweils unterschiedlichen Intensitäten ( Abb. 38 und nicht gezeigt). Die Untereinheit β4 z.B. wurde durch den Antikörper CTD-110.6 sehr stark, aber durch MA1-076 und das WGA-Lektin nur wenig angefärbt. MA1-076 hingegen reagierte deutlich mit β7, während diese Untereinheit etwas weniger intensiv mit dem WGA-Lektin und nur sehr schwach mit CTD-110.6 nachgewiesen werden konnte. Die Abhängigkeit von der gewählten Detektionsmethode wurde auch in der schon zitierten Arbeit von Sumegi et al. beschrieben, in der das 20S Proteasom und der 19S Regulator auf O-GlcNAc Modifikationen untersucht wurden (Sumegi et al., 2003). Hierdurch wird deutlich die Notwendigkeit unterstrichen, weitere sensitivere Methoden zum Nachweis der O-Glycosylierung zu entwickeln, die außerdem eine Quantifizierung ermöglichen. Nachdem die versuchte in vivo Markierung mit 14C-Glucosamin nicht erfolgreich war, da das Monosaccharid in die Aminsäuresynthese gelangte und somit die Proteine unspezifisch markiert wurden ( Abb. 39 ), ist eine in vitro Markierung mit 14C-Galactose zu testen: Das Enzym Galactosyltransferase koppelt die markierte UDP-Galactose über eine β(1→4)glycosidische Bindung spezifisch an GlcNAc (Roquemore et al., 1994). Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass bei der in vitro Verwendung von isolierten 20S Proteasomen der Übergang der 14C-Galactose in andere Stoffwechselwege ausgeschlossen und daher die Spezifität gewahrt ist. Darüber hinaus wird in Zusammenarbeit mit Dr. Katharina Janek versucht, über eine beta-Elimination der Zuckergruppe mit anschließender Derivatisierung die O-GlcNAc modifizierten Peptide auch massenspektrometrisch zu analysieren (Greis et al., 1996).

Bereits 1993 wurde veröffentlicht, dass Proteasomen in der Zelle glycosyliert vorliegen können (Schmid et al., 1993). Die Daten deuteten an, dass es sich dabei um Polysaccharide inklusive Mannose und Sialinsäure handelt. Weiterhin wurden in Proteasomenpräparationen geringe Mengen solcher Zuckermoleküle nachgewiesen, wie sie in den komplexen Kohlenhydratverbindungen im ER vorkommen (nicht gezeigte Daten sowie persönliche Mitteilung von Dr. Martin Zimmermann-Kordmann, FU, und Nicola Klare). Dies könnte zu der Vermutung führen, dass Proteasomen entgegen bisheriger Kenntnisse auch durch das ER und den Golgi-Apparat transportiert würden, wo sie wie die sekretierten Proteine mit den verschiedenen Zuckermolekülen versehen werden könnten. Jedoch gibt es in den Sequenzen der proteasomalen Untereinheiten aus Mammalia weder einen Hinweis auf ein Signalpeptid für die Lokalisation im ER noch auf das ER-Retentionssignal. In zwei Fällen wird trotzdem von Proteasomen außerhalb der Zellen berichtet: Erstens können freie 20S Proteasomen im Serum von Patienten mit Autoimmunerkrankungen nachgewiesen werden. Dort gelten sie allerdings als Marker für Zellschäden und Defekte in der Apoptose, was letztendlich bedeutet, dass sie nicht über den üblichen Transportweg in das Serum gelangt sein können (Egerer et al., 2002; Mountz et al., 1994). Zweitens werden Proteasomen auch am Acrosom der Spermatozoen detektiert (Morales et al., 2004; Ziemba et al., 2002). Doch da das vom Golgi-Apparat abstammende Acrosom zusammen mit dem Nukleus immer noch von der Zellmembran umgeben ist (Ramalho-Santos et al., 2002), könnten die mittels Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie nachgewiesenen Proteasomen auch in dem engen Bereich zwischen Acrosom und Zellmembran lokalisiert sein (Berruti und Martegani, 2004). Aus den genannten Gründen lässt sich eine Glycosylierung von Proteasomen innerhalb der Organellen des regulären sekretorischen Weges ausschließen.

Auch die Modifikation der Proteasomen mit verschiedenen Zuckern in Autophagosomen ist unwahrscheinlich. Wird zu Grunde gelegt, dass der Abbau der Proteasomen lysosomal erfolgt, könnten Proteasomen in Autophagosomen zu den Lysosomen transportiert werden (Cuervo et al., 1995). Allerdings bliebe dann zu klären, wie funktionsfähige Glycosyltransferasen aus dem ER und Golgi-Apparat in die Autophagosomen gelangen. Unter Umständen wäre es denkbar, dass fehlgeleitete Glycosyltransferasen des Golgi-Apparats über den vesikulären Transport die Endosomen erreichen. Autophagosomen verschmelzen mit Endosomen, bevor sie mit den Lysosomen fusionieren (Mizushima et al., 2002), und auf diesem Weg könnten die Proteasomen mit den Glycosyltransferasen in Kontakt treten. Die Transferasen könnten solange weiterhin aktiv sein, bis der pH-Wert zu stark unter ihre Funktionsoptima gefallen ist. Es ist jedoch sehr fraglich, ob über diesen Mechanismus genug modifizierte Proteasomen entstehen würden, dass sie trotz der schnellen Degradation in den Lysosomen nachweisbar sind (Cuervo et al., 1995).

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Eine andere Möglichkeit, die Existenz der komplexen Polysaccharide in den Proteasomenpräparationen zu erklären, wäre, dass Proteasomen nicht in Organellen sondern im Cytosol der Zelle selektiv und koordiniert mit den komplexen Glycanen verbunden werden. Solche cytosolischen Mechanismen sind indes nur für niedere Eukaryoten wie für den Schleimpilz Dictyostelium discoideum bekannt. Die an dieser Glycosylierung beteiligten Enzyme weisen zwar Homologien zu Proteinen der Metazoa auf, in denen sind sie jedoch ausschließlich im Golgi-Apparat lokalisiert (West et al., 2004). Unter diesem Aspekt betrachtet ist die komplexe Glycosylierung des Proteasoms im Cytosol ebenfalls wenig wahrscheinlich. Eine weitere Erklärung für den Nachweis der komplexen Kohlenhydratverbindungen in den 20S Proteasomenisolationen könnten Verunreinigungen der Präparationen sein. Proteine, die die Qualitätskontrolle im ER nicht bestehen, werden samt den bereits an sie übertragenen Kohlenhydraten ins Cytosol befördert. Zwei Enzymkomplexe der Ubiquitinierungskaskade erkennen spezifisch diese Oligosaccharide, markieren die an sie gebundenen Proteine mit Polyubiquitin und führen sie so der proteasomalen Degradation zu (Yoshida et al., 2002; Yoshida et al., 2003). Im Cytosol sind also die von den ubiquitinierten ER-Proteinen abgespaltenen Oligosaccharide vorhanden, die womöglich unspezifisch mit Proteasomen assoziieren und daher eventuell mit ihnen zusammen angereichert werden könnten. Durch die Zugabe von freien Monosacchariden zu isolierten 20S Proteasomen kann die in vitro gemessene proteasomale Aktivität in Bezug auf fluorogene Substrate beeinflusst werden (Dr. Ulrike Kuckelkorn, persönliche Mitteilung). Dies könnte ein Hinweis sein, dass Proteasomen auch unspezifisch mit Zuckern interagieren und würde so für eine Co-Anreicherung und gegen eine spezifische Modifizierung mit den komplexen Glycanen sprechen.

Es kann zusammengefasst werden, dass Proteasomen mit GlcNAc modifiziert in der Zelle vorkommen. Die genaue Art der Glycosylierung ist noch nicht vollständig geklärt, wobei jedoch die reziproke Modifikation mit Phosphat und dem Monosaccharid O-GlcNAc als die wahrscheinlichste anzusehen ist, da sie sehr weit verbreitet ist und im Einklang mit bereits veröffentlichten Daten zum Proteasom sogar eine funktionelle Relevanz besitzen kann ( Abb. 42 ). Die komplexen Zuckerstrukturen in den Proteasomenpräparation wären demnach Verunreinigungen, die auf Grund der unspezifischen Interaktion mit den Proteasomen sehr schlecht abzutrennen sind. Um den Sachverhalt weiter aufzuklären, sind zusätzliche Analysen der Struktur und Funktion z.B. unter Cytokineinfluss oder in der Infektion notwendig, die durch verbesserte Detektionsmethoden erleichtert werden.

Abb. 42 : Modell für den Einfluss der reziproken Phosphorylierung/Glycosylierung auf die Interaktionen des 20S Proteasoms. Das in der Infektion ausgeschüttete IFNγ bewirkt eine Dephosphorylierung des 26S Proteasoms, das daraufhin destabilisiert wird und in 20S Proteasom und 19S Regulatoren dissoziiert. IFNγ verursacht möglicherweise die Glycosylierung des freien 20S Proteasoms mit O-GlcNAc, was die Bindung des durch IFNγ induzierten PA28-Komplexes begünstigen könnte. violett – 19S Regulator; grün – α-Untereinheiten; blau – nicht-aktive β-Untereinheiten; rot – proteolytisch aktive β-Untereinheiten; grau – PA28-Komplex; oranger Kreis mit P – Phosphorylierung; rotes Sechseck mit G – Glycosylierung mit O-GlcNAc. (Teile der Abbildung sind (Kloetzel, 2004) entnommen)

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4.2 Struktur- und Funktionsvergleich der Proteasomen aus den verschiedenen Organen

In Mammaliazellen können zwei verschiedene 20S Proteasomenarten auftreten: zum einen die konstitutiven Proteasomen und zum anderen die Immunoproteasomen, die sich durch den Austausch der drei katalytisch aktiven konstitutiven Untereinheiten gegen die drei aktiven induzierbaren Immuno-Untereinheiten auszeichnen. Dementsprechend zeigen auch aus verschiedenen Organen isolierte 20S Proteasomen diese Unterschiede in der Struktur, wobei in den Muskeln und dem Gehirn hauptsächlich konstitutive Proteasomen nachweisbar sind, während in der Lunge und der Leber auch Immunoproteasomen auftreten, die in der Milz eindeutig überwiegen (Cardozo et al., 1995; Dahlmann et al., 2000; Murata et al., 2001; Noda et al., 2000). Die Arbeit von Kuckelkorn et al. brachte diese Gewebsunterschiede erstmals in einen funktionellen Zusammenhang mit der Epitopgenerierung (Kuckelkorn et al., 2002): 20S Proteasomen, die aus den lymphatischen Organen Milz und Thymus sowie dem lymphatisches Gewebe enthaltenden Dünndarm isoliert wurden, zeigen eine Beziehung zwischen der proteasomalen Zusammensetzung und der erhöhten Bildung eines Epitopprecursors. Die proteasomale Gewebespezifität könnte somit erklären, warum für dieses Epitop spezifische CTLs nur gegen den Dünndarm, nicht aber gegen den Colon eine Autoimmunantwort induzieren (Kuckelkorn et al., 2002; Steinhoff et al., 1999).

Darauf aufbauend sollte die vorliegende Arbeit untersuchen, ob 20S Proteasomen nicht nur, wie gezeigt, in den einzelnen Organen eine unterschiedliche Untereinheitenzusammensetzung und proteolytische Funktion aufweisen, sondern ob diese auch innerhalb der Organe dynamisch reguliert sind. Als Modell wurde die immunphysiologische gut charakterisierte murine Infektion mit Listeria monocytogenes verwendet. Die Proteasomen, die aus den nicht-lymphatischen Organen Leber und Colon der Wildtyptiere isoliert wurden, zeigten in der Westernblotanalyse und in der 2D-Gelelektrophorese eine Zunahme der Immuno-Untereinheiten bei gleichzeitiger Abnahme der konstitutiven Untereinheiten nach der Infektion ( Abb. 25 , Abb. 28 ). Die Proteasomen der lymphatischen Organe Milz und Dünndarm dagegen besaßen schon vor der Infektion deutlich nachweisbare Mengen der Immuno-Untereinheiten ( Abb. 26 , Abb. 27 ). Ein Anstieg der Immuno-Untereinheiten in den Leberproteasomen nach der Infektion mit L. monocytogenes oder LCMV wurde auch von Khan et al. beobachtet (Khan et al., 2001). Ebenso konnte bei einer Infektion mit dem Pilz Histoplasma capsulatum eine Zunahme von Immuno-Untereinheiten in der Leber, der Lunge sowie der Milz nachgewiesen werden (Barton et al., 2002). Dagegen wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Infektion keine verstärkte Inkorporation von Immuno-Untereinheiten in die Milzproteasomen induziert ( Abb. 27 ). Die unterschiedlichen Ergebnisse bezüglich der Struktur der Milzproteasomen könnten – neben den verschiedenen Infektionsmodellen – darauf zurückzuführen sein, dass die vorliegende Arbeit die drei aktiven Untereinheiten in vollständig assemblierten und funktionsfähigen Proteasomen analysierte, während in der Veröffentlichung von Barton et al. nur eine einzige Immuno-Untereinheit im Milzhomogenat untersucht wurde. Im Homogenat nachgewiesene Untereinheiten müssen nicht unbedingt in die Proteasomen integriert sein, da z.B. die Inkorporationen von iβ1 und iβ2 voneinander abhängig sind (Groettrup et al., 1997). Aus diesem Grund sind die auf Homogenatanalysen basierenden Resultate über die Struktur funktionsfähiger Proteasomen nur wenig aussagekräftig.

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Das Vorhandensein der Immuno-Untereinheiten in den isolierten Gewebeproteasomen korrelierte mit der verstärkten in vitro Generierung der immunrelevanten Peptide sowie der N- und C-terminal flankierenden Fragmente aus dem bakteriellen LLO-Substrat ( Abb. 18 -21, Abb. 25 -28). Die vorgelegte Arbeit zeigte somit zum ersten Mal, dass Immunoproteasomen zu der verbesserten Produktion auch von bakteriellen Epitopen und Precursorpeptiden führen, da sich die Analysen von Epitopen aus Fremdproteinen bislang nur auf virale Epitope beschränkten (Kloetzel, 2001; Sijts et al., 2001). Die möglichen Gründe für das unterschiedliche Schnittverhalten von konstitutiven Proteasomen und Immunoproteasomen werden in Kapitel 4.4 diskutiert. Des Weiteren wurde erstmalig für den Infektionsverlauf die proteasomale Struktur mit der proteasomalen Funktion in Verbindung gebracht, wohingegen Barton et al. und Khan et al. in ihren Infektionsmodellen keine physiologischen Konsequenzen für die proteasomale Funktion darstellten (Barton et al., 2002; Khan et al., 2001): Die vorliegende Arbeit ergab 1. eine gleichbleibend hohe Bildung von Epitop und Precursor durch Proteasomen, die aus den Immunoproteasomen-reichen Geweben Milz und Dünndarm vor und nach der Infektion stammten, sowie 2. einen Anstieg der Epitop- und Precursorgenerierung durch Proteasomen, die aus Leber und Colon nach der Infektion isoliert wurden und vermehrt Immunoproteasomen enthielten.

Die in vitro Degradationen des murinen Hsp60-Substrates durch die Gewebeproteasomen lieferten die gleichen Resultate wie die Experimente mit dem bakteriellen LLO-Substrat: Die Epitope und Precursor beider Substrate wurden von Immunoproteasomen stärker gebildet als von konstitutiven Proteasomen ( Abb. 18 -21, Abb. 23 A). Dies lässt darauf schließen, dass die Proteasomen in diesem Fall keinen Unterschied zwischen Fremd- und Selbstproteinen machten. Es sind jedoch Epitope aus körpereigenen Substraten beschrieben, die von Immunoproteasomen weniger effizient generiert werden, als von konstitutiven Proteasomen (Morel et al., 2000; Van den Eynde und Morel, 2001). Hierzu muss allerdings angemerkt werden, dass sich diese Ergebnisse in unserem Labor nicht reproduzieren ließen (Dr. Ulrike Seifert, persönliche Mitteilung). Zusammen mit den Daten der vorliegenden Arbeit erscheint es demnach unwahrscheinlich, dass ein Mechanismus existiert, der es den Proteasomen erlaubt, zwischen Fremd- und Selbstsubstraten zu differenzieren.

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Die Auswertung der Prozessierungsexperimente mit dem viralen pp89-Substrat ergaben ein interessantes Bild im Vergleich mit der Literatur ( Abb. 23 B). Es ist beschrieben, dass Immunoproteasomen, die aus in Kultur wachsenden Zellen isoliert wurden, im Vergleich zu konstitutiven Proteasomen den Epitopprecursor aus dem pp89-Substrat erhöht produzieren, jedoch nicht das Epitop selbst (Boes et al., 1994; Kuckelkorn et al., 1995; Sijts et al., 2001). Wurde in dieser Arbeit das pp89-Substrat in vitro mit den Immunoproteasomen-haltigen Präparationen inkubiert, die aus der Leber nach der Infektion stammten, wurde nicht nur wie durch die Literatur erwartet der Precursor verstärkt gebildet, sondern auch das Epitop ( Abb. 23 B und nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu bildeten die Immunoproteasomen des Colons weder das Epitop noch den Precursor verstärkt aus dem pp89-Substrat. Daraus folgt, dass sich die Immunoproteasomen aus Leber und aus Colon nach der Infektion sowie aus kultivierten Zellen hinsichtlich ihres Prozessierungsverhaltens bezüglich des pp89-Substrates unterscheiden. Dieselben Immunoproteasomen zeigten jedoch keine funktionellen Divergenzen bei den Versuchen mit LLO- und Hsp60-Substrat ( Abb. 18 -21, Abb. 23 A). Dies deutet darauf hin, dass ein gewebespezifischer Unterschied zwischen den Immunoproteasomen der Leber und denen des Colons existiert, der sich nur auf einige Substrate auswirkt. Auch die Effekte von PA28 und den Immuno-Untereinheiten sind substratspezifisch wie in der Einleitung ausführlich dargestellt (Groettrup et al., 1996; Sijts et al., 2000). Insofern könnte eine posttranslationale Modifikation der Gewebeproteasomen vorliegen, die diese Divergenzen im Prozessierungsverhalten und damit auch die Substratspezifität verursacht. Ähnliches wurde auch in der Veröffentlichung von U. Kuckelkorn vorgeschlagen (Kuckelkorn et al., 2002). Auf Grund der Tatsache, dass die Colonproteasomen in der Westernblotanalyse nur auf das Vorhandensein der konstitutiven und Immuno-Untereinheiten hin getestet wurden ( Abb. 28 ), kann in der vorliegenden Arbeit über die Natur der strukturellen Unterschiede zwischen den Immunoproteasomen aus Leber und Colon keine Aussage getroffen werden.

Ein weiterführender Ansatz wäre, die verschiedenen Gewebeproteasomen z.B. hinsichtlich der Modifikation mit O-GlcNAc zu untersuchen, da für die Leberproteasomen bereits eine Zunahme der Glycosylierung in der Infektion gezeigt werden konnte ( Abb. 41 ). Wäre diese Modifikation nicht bei den Colonproteasomen nach der Infektion nachzuweisen, könnte sie ein potentieller Grund für die funktionellen Divergenzen zwischen den beiden Immunoproteasomenpräparationen sein. In diesem Zusammenhang wäre, wie in Kapitel 4.1 diskutiert, gleichfalls der Phosphorylierungsstatus der Proteasomen interessant. Da die Präparationen und Prozessierungsansätze weder den 19S Regulator noch den PA28-Komplex enthielten, müssten die posttranslationalen Modifikationen selbst einen Effekt auf die proteolytische Aktivität der Proteasomen besitzen. Es wäre vorstellbar, dass dies analog zu den subtilen Konformationsänderungen und der darauf folgenden Modulation der proteasomalen Aktivität geschieht, die für die Interaktion von PA28 mit 20S Proteasomen gezeigt wurde (Sun et al., 2002). Auch die Bindung von hydrophoben Peptiden an die nicht-aktive Untereinheiten beeinflussen die Funktionalität der 20S Proteasomen (Kisselev et al., 2002). Zudem ist vorstellbar, dass eine posttranslationale Modifikation einen Einfluss auf den Eintritt einiger Substrate in die 20S Proteasomen ausübt, indem z.B. die Bindestelle eines bestimmten Substrates an den α-Ring maskiert wird.

Die Zunahme der Immunoproteasomen und der damit verbundenen gesteigerten Epitop- und Precursorgenerierung aus LLO-, Hsp60- und teilweise pp89-Substrat war ausschließlich mit den Proteasomenpräparationen aus den nicht-lymphatischen Organen zu beobachten ( Abb. 18 , Abb. 19 , Abb. 23 , Abb. 25 , Abb. 28 ). Sowohl in der Leber als auch der Milz konnten hohe L. monocytogenes Titer gemessen werden; im Colon und Dünndarm der Wildtypmäuse waren dagegen keine Bakterien nachweisbar ( Abb. 8 A). Da das nicht-infizierte Colongewebe parallel zu der infizierten Leber auf die Infektion mit der Bildung von Immunoproteasomen reagierte, bedeutet dies ganz klar, dass L. monocytogenes die Expression der Immuno-Untereinheiten nicht direkt beeinflussen kann. Offensichtlich unabhängig davon, in welchem Organ sich der Infektionsherd befand, erhöhte sich in den untersuchten nicht-lymphatischen Gewebe der Anteil der Immunoproteasomen. Die hauptsächlich aus Immunoproteasomen bestehenden Proteasomenpräparationen aus den lymphatischen Geweben zeigten weder strukturell noch funktionell eine Veränderung nach der Infektion ( Abb. 20 , Abb. 21 , Abb. 23 , Abb. 26 , Abb. 27 ). Auch die starke Besiedlung der Milz durch L. monocytogenes im Infektionsverlauf löste keine weitere Induktion der Immunoproteasomen aus. Dies zeigt ebenfalls eindeutig, dass nicht der direkte Kontakt mit den Bakterien für die Regulation der Immuno-Untereinheiten verantwortlich ist, und dass somit keine der von L. monocytogenes in das Cytosol der Wirtszelle sekretierten Proteine hieran beteiligt sind. In Kapitel 4.3 wird näher auf die Mechanismen eingegangen werden, die der immunoproteasomalen Regulation zugrunde liegen.

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Eine Erklärung für den Anstieg des Immunoproteasomenanteils in den nicht-lymphatischen Organen wäre, dass nach der Infektion lymphatische Zellen einwandern, für die nachgewiesen wurde, dass sie in Kultur wachsend die Immuno-Untereinheiten exprimieren (Melanie Rieger, persönliche Mitteilung) (Macagno et al., 1999; Morel et al., 2000). Ein anderer Grund für die Zunahme der Immunoproteasomenmenge könnte jedoch auch darin liegen, dass die Gewebezellen selbst auf die Infektion mit der Expression der Immuno-Untereinheiten und dadurch gesteigerter Epitopgenerierung reagierten. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass Makrophagen und dendritsche Zellen in die Leber und auch in das Colongewebe einwanderten. Die Fluoreszenzanalysen zeigten aber, dass ebenfalls in den Epithelzellen des Colon und in den Hepatocyten eine Zunahme der Immuno-Untereinheiten nach der Infektion erfolgte ( Abb. 32 ). Hinzu kam, dass die Proteasomen, die aus den Hepatocyten von L. monocytogenes befallenen Mäusen isoliert und analysiert wurden, sich strukturell und funktionell wie diejenigen Proteasomen verhielten, die aus der gesamten Leber infizierter Tiere stammten ( Abb. 31 ). Zusammengefasst bedeutet dies, dass nicht-lymphatische Zellen auch zu dem Anstieg der Immunoproteasomen in den Organen beitrugen.

Hieraus ergeben sich die folgenden Fragen: Lässt sich ein sinnvoller Nutzen für die Bekämpfung der L. monocytogenes Infektion aus der Gegebenheit ziehen, dass auch nicht-lymphatische und sogar nicht direkt betroffene Zellen und Gewebe auf die Infektion reagieren? Und ist der mögliche Nutzen auch auf andere Infektionen und Erreger übertragbar?

Ob eine in den Hepatocyten verbesserte Epitoppräsentation auf Grund der Zunahme an Immunoproteasomen überhaupt eine Rolle spielt, ist nicht geklärt, da die Induktion einer CTL-basierten Immunantwort gegen Hepatocyten umstritten ist. Die Hepatocyten sind durch die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSECs) von dem direkten Kontakt mit den zirkulierenden CTLs getrennt. LSECs können wie professionell Antigen präsentierende Zellen exogene Antigene aufnehmen und T-Helferzellen sowie CTLs zur Proliferation anregen. Dies resultiert jedoch nicht in der Aktivierung der T-Zellen sondern in der Toleranz der T-Zellen gegenüber dem präsentierten Antigen (Limmer et al., 2000). LSECs könnten listerielle MHC-Klasse-I Epitope – entweder weil sie diese exogen aufgenommen haben, oder weil sie selbst infiziert sind – präsentieren, was dazu führen würde, dass die Immunantwort gegen L. monocytogenes unterdrückt wird. Andererseits scheinen proinflammatorische Cytokine wie TNFα einen inhibitorischen Effekt auf die Epitoppräsentation der LESCs auszuüben (Knolle et al., 1999). Da diese Cytokine besonders im Frühstadium der L. monocytogenes Infektion ausgeschüttet werden, ist der immunsuppressive Einfluss der LSECs möglicherweise so weit reduziert, dass über andere Wege aktivierte CTLs in das Leberparenchym einwandern, infizierte Hepatocyten spezifisch erkennen und lysieren können. Die spezifische Lyse von Hepatocyten durch aktivierte CTLs ist bereits in dem für ein HBV-Protein transgenen Mausmodell beschrieben worden (Ando et al., 1994). Dies zeigt, dass auch Hepatocyten das Ziel von aktivierten CTLs sein können. Da die Hepatocyten auch von L. monocytogenes infiziert werden (Rogers et al., 1996), benötigen sie sowie alle anderen Wirtszellen der Pathogene eine durch Immunoproteasomen verbesserte Epitoppräsentation, um im Falle einer Infektion von den CTLs besser erkannt und eliminiert zu werden.

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Weil neben den Leberzellen auch in nicht-infizierten Geweben wie dem Colon die Induktion von Immunoproteasomen erfolgt ( Abb. 8 , Abb. 25 , Abb. 28 , Abb. 31 , Abb. 32 ), kann dies als eine allgemeine Reaktion sämtlicher nicht-lymphatischer Körperzellen auf die L. monocytogenes Infektion angesehen werden: Durch die erhöhte Bildung von Immunoproteasomen versetzt sich der gesamte Organismus in Alarmbereitschaft, egal, wo der Infektionsherd liegt. Analog dazu zeigten Masopust et al., dass bei verschiedenen Infektionen die spezifische CTLs in allen untersuchten Geweben akkumulieren, und zwar ebenfalls unabhängig vom Infektionsherd (Masopust et al., 2001). In der adaptiven Immunantwort scheint sich somit der Organismus auf zwei aufeinander abgestimmte Arten vor einer systemischen Infektion zu schützen: Bei einer weiteren Ausbreitung des Erregers in gesundes nicht-lymphatisches Gewebe ermöglichen bereits vorher induzierte Immunoproteasomen die gesteigerte Generierung der immunrelevanten MHC-Klasse-I Epitope und Precursor. Damit geben sich neu infizierte Zellen schnellstmöglich den schon im selben Gewebe in Lauerstellung liegenden spezifischen CTLs zu erkennen, was in der Eindämmung der Infektion resultiert. In Kooperation mit Dr. Ulrich Steinhoff, MPIIB, wird überdies gerade der Frage nachgegangen, ob die generalisierte Induktion der Immunoproteasomen im infizierten Körper einen Vorteil bei der Bekämpfung von Suprainfektionen darstellt. In der Tat sieht es so aus, dass die viralen Titer einer der L. monocytogenes aufgesetzten LCMV-Infektion schneller sinken als nach einer alleinigen viralen Infektion, was für eine schon voll aktivierte Immunantwort inklusive Immunoproteasomen spricht.

Interessanterweise waren im Dünndarm und der Leber zu keinem Zeitpunkt nach der Infektion mehr als 60% Immunoproteasomen zu verzeichnen ( Abb. 25 , Abb. 26 ). Auch in der Milz sowie dem Colon waren nach der Infektion weiterhin die drei konstitutiven proteolytisch aktiven β-Untereinheiten nachweisbar ( Abb. 27 , Abb. 28 ). Dies deutet darauf hin, dass in vivo weder in den lymphatischen Organen noch nach einer Infektion ein kompletter Austausch der konstitutiven Proteasomen erreicht wird. Ebenfalls zeigte die Analyse einzelner aktiver Untereinheiten in dem viralen (Khan et al., 2001) und dem fungalen (Barton et al., 2002) Infektionsmodell sowie in maturierten Dendritschen Zellen (Macagno et al., 2001) keinen vollständigen Ersatz einer konstitutiven Untereinheit durch ihre korrespondierende Immuno-Untereinheit. In Zellkultur konnten nicht einmal extrem hohe IFNγ-Konzentrationen den Austausch von β2 gegen iβ2 über 50% heben (Stohwasser und Kloetzel, 1996). Darüber hinaus überstieg auch nach Überexpression von iβ1 und iβ5 in einem TET-induzierbaren Zellsystem die Austauschrate nie 60% (Sijts et al., 2000). In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert, dass Immunoproteasomen im Vergleich zu konstitutiven Proteasomen sowohl schneller assemblieren als auch schneller abgebaut werden (Sylvia Heink, persönliche Mitteilung). Die Zellen scheinen also weder eine längerfristige Existenz noch einen über 60% hinausgehenden Anteil der Immunoproteasomen zu tolerieren. Daraus kann geschlossen werden, dass die Funktion der konstitutiven Proteasomen für das Überleben der Zellen essentiell ist und offensichtlich nicht durch die Aktivität der Immunoproteasomen ersetzt werden kann.

Der maximale funktionelle Effekt der Immunoproteasomen auf die Generierung der immunrelevanten Produkte war schon bei einem Anteil von 40% Immunoproteasomen erreicht, wie in den Prozessierungsexperimenten mit den Leberproteasomen des Tages 2 p.i. sichtbar war ( Abb. 18 , Abb. 23 , Abb. 25 ). Die Zunahme auf 60% Immunoproteasomen in den Proteasomenpräparationen aus Leber des Tages 6 p.i. führte nicht zu einer weiteren Steigerung der Epitop- und Precursorbildung. Ein vergleichbarer Schwellenwert konnte von Sijts et al. in Zellkulturexperimenten gezeigt werden, da ein Anteil von 40% der Immuno-Untereinheiten genügte, um eine CTL-Antwort zu erzielen, die auch bei einem Anteil von 60% nicht weiter verbessert wurde (Sijts et al., 2000).

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Die Immuno-Untereinheit iβ5 war vor der Infektion deutlich in den aus Colon und Leber isolierten Proteasomen nachweisbar ( Abb. 25 , Abb. 28 ). Die gesteigerte Generierung der Epitope und Precusor war jedoch erst mit der drastischen Zunahme der anderen beiden Immuno-Untereinheiten ab Tag 2 p.i. zu beobachten ( Abb. 18 , Abb. 19 , Abb. 23 ). Dies steht im Einklang mit den Daten von Sijts et al., die durch Transfektionsexperimente nachwiesen, dass iβ5 alleine keinen großen Einfluss auf die Degradation eines Peptidsubstrates besitzt (Sijts et al., 2000). Das Vorhandensein von iβ5 in den Proteasomen vor der Infektion beeinträchtigte also nicht die weiter oben diskutierte essentielle Funktion der konstitutiven Proteasomen. Auf Grund der großen Bedeutung von iβ5 für die effiziente Bildung der Immunoproteasomen (Sylvia Heink, persönliche Mitteilung)(Griffin et al., 1998; Witt et al., 2000) könnte es sich im Falle einer Infektion sogar als positiv erweisen, dass in den Geweben bereits geringe Mengen an iβ5 existieren, weil dadurch eine sofortige und schnelle Assemblierung der Immunoproteasomen nach der anlaufenden Induktion der Immuno-Untereinheiten gewährleistet wäre.

In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal demonstriert werden, dass sich die proteasomale Funktion und Struktur nicht nur – wie schon beschrieben – lokal zwischen den einzelnen Organe unterscheiden, sondern dass sich diese ausgelöst durch eine Infektion auch innerhalb eines Organs dynamisch und temporär ändern können. Die Art der Infektion nimmt keinen Einfluss auf die Funktionsänderung, da diese mittels der Prozessierung von einem Selbst- sowie von zwei Fremdepitopen nachweisbar war. Zudem konnte eindeutig gezeigt werden, dass die proteasomale Dynamik nicht nur auf ein infiziertes Organ oder einen direkt betroffenen Zelltyp beschränkt ist, sondern wahrscheinlich in sämtlichen nicht-lymphatischen Zellen auftritt und so wahrscheinlich einen allgemeinen und körperweiten Schutzmechanismus darstellt. Dies warf die Frage auf, wie dieser weitreichende Effekt im gesamten Organismus reguliert wird.

4.3 Regulation der Proteasomen durch IFNγ und TNFα

Bekannte Botenstoffe des Immunsystems sind die proinflammatorischen Cytokine IFNγ und TNFα, die beide eine wichtige Rolle bei der Immunantwort auf die L. monocytogenes Infektion spielen: Tiere, denen diese Cytokine oder ihre Rezeptoren fehlen, überleben die L. monocytogenes Infektion nicht (Harty und Bevan, 1995; Huang et al., 1993; Pfeffer et al., 1993; Rothe et al., 1993). Auf der Basis von Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ und TNFα in vielen Zelltypen mehrere Proteine des MHC-Klasse-I Präsentationswegs induzieren, insbesondere die proteolytisch aktiven Immuno-Untereinheiten der 20S Proteasomen (Groettrup et al., 1996; Hallermalm et al., 2001; Ortiz-Navarrete et al., 1991).

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Die Analyse der Proteasomen aus IFNγ-Rezeptor defizienten Tieren (I-Tieren) zeigte, dass die 20S Proteasomen der lymphatischen Gewebe die Immuno-Untereinheiten enthielten ( Abb. 29 B, Abb. 30 C). Die densitometrische Auswertung der 2D-Gele von Dünndarmproteasomen ergab einen Anteil von 40% bis 50% Immunoproteasomen an der gesamten Proteasomenpräparation, wohingegen die Dünndarmpräparationen aus den Wildtyptieren ca. 60% Immunoproteasomen enthielten. Hieraus und aus ähnlichen Ergebnissen bezüglich der Zusammensetzung von Milzproteasomen nach einer Pilzinfektion (Barton et al., 2002) lässt sich schließen, dass IFNγ nicht alleine für die konstante Expression der Immunoproteasomen in lymphatischen Geweben verantwortlich ist, da die I-Tiere – trotz ihres Unvermögens, auf IFNγ zu reagieren – in diesen Geweben mit funktionsfähigen Immunoproteasomen ausgestattet sind ( Abb. 22 A). Barton et al. konnten zudem nachweisen, dass auch Stat1-defiziente Tiere in der Milz Immuno-Untereinheiten besitzen. Somit ist die basale Expression der Immunoproteasomen in den lymphatischen Organen nur bedingt von dem durch IFNγ ausgelösten Signalweg abhängig. Offensichtlich reichten aber die 40% Immunoproteasomen aus dem Dünndarm der I-Tiere aus, um in den Funktionsanalysen eine deutlich erhöhte Generierung immunrelevanter Produkte gegenüber den Prozessierungsversuchen mit den Leber- und Colonproteasomen der I-Tiere zu erzeugen ( Abb. 22 A, Abb. 29 B). Dies entspricht den im vorherigen Kapitel 4.2 diskutierten Ergebnissen mit den Leberproteasomen der Wildtypmäuse: Ein Anteil der Immunoproteasomen von knapp über 40% scheint einen funktionellen Schwellenwert hinsichtlich einer erhöhten Epitop- und Precursorbildung zu überschreiten.

Die nicht-lymphatischen Organe der I-Tiere exprimierten vor der Infektion fast keine Immuno-Untereinheiten, was sich nach der Infektion – im Gegensatz zu den Wildtyptieren – nur minimal, aber nicht signifikant änderte ( Abb. 29 A, Abb. 30 A,B). Dies wurde auch bei IFNγ-defizienten Tiere von Barton et al. für Leber- sowie Lungenhomogenate nach der Pilzinfektion gezeigt (Barton et al., 2002), und Khan et al. beschrieben für Leberproteasomen aus LCMV-infizierten IFNγ-defizienten Tieren ebenfalls eine deutlich reduzierte Zunahme der Immuno-Untereinheiten im Vergleich zu den Wildtypmäusen (Khan et al., 2001). Die vorliegende Arbeit konnte darüber hinaus diese proteasomalen Strukturergebnisse mit den Funktionsanalysen durch in vitro Degradation des LLO-Substrates in einen physiologischen Zusammenhang bringen: Die Effizienz bei der Generierung von Epitop und Precursor durch Proteasomen, die aus den nicht-lymphatischen Geweben der I-Tiere isoliert wurden, blieb nach der Infektion unverändert niedrig ( Abb. 22 A und nicht gezeigt). Da bei diesem Tiermodell im Colon und der Leber keine signifikante strukturelle Veränderung der Proteasomen stattfand, blieb also ein durch die Infektion ausgelöster funktioneller Effekt auf die Proteasomen der I-Tieren aus. Hieraus kann gefolgert werden, dass in den nicht-lymphatischen Organen IFNγ für die nach der Infektion induzierte hohe Expression der Immuno-Untereinheiten unbedingt notwendig ist, und dass diese Induktion nicht stattfindet, wenn das IFNγ-Signal wegfällt.

Die Analyse der I-Tierproteasomen bestätigt ebenfalls eindrucksvoll die schon in Kapitel 4.2 geschilderte Beobachtung, dass der direkte Kontakt einer Zelle mit den von L. monocytogenes sekretierten Proteinen keine Bedingung für die Expression der Immuno-Untereinheiten sein kann: Auch in den I-Tieren hatten die sehr starke L. monocytogenes Besiedlung der Leber und der Befall des Colons keinerlei Auswirkung auf die Regulation der Proteasomen ( Abb. 8 B, Abb. 22 A, Abb. 29 A, Abb. 30 A).

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Erstaunlicherweise verhielten sich die Gewebeproteasomen der TNFα Rezeptor-defizienten Mäuse (T-Tiere) nach der L. monocytogenes Infektion vollständig wie die der Wildtyptiere: Zum einen nahm nach der Infektion in den nicht-lymphatischen Geweben der T-Tiere der Immunoproteasomenanteil zu, was mit einer Steigerung der in vitro Produktion der immunrelevanten Fragmente gekoppelt war ( Abb. 22 B, Abb. 29 A, Abb. 30 A). Zum anderen stieg der auch vor der Infektion schon hohe immunoproteasomale Anteil sowie die Generierung der immunrelevanten Peptide in den lymphatischen Geweben der T-Tiere nicht weiter an ( Abb. 22 B, Abb. 29 B, Abb. 30 C). Wie klar erkennbar ist, hat das Fehlen des TNFα-Signalweges offensichtlich keine, eine Defizienz des IFNγ-Signalweges hingegen eine sehr drastische Konsequenz für die Induktion der Immuno-Untereinheiten. Dies bedeutet, dass in vivo TNFα einen Verlust von IFNγ in Bezug auf funktionelle Immunoproteasomen nicht zu kompensieren vermag, obwohl in Zellkulturexperimenten die Stimulation mit TNFα zu einer – wenn auch schwächern – Induktion der Immuno-Untereinheiten führen kann (Hallermalm et al., 2001; Loukissa et al., 2000; Raasi et al., 1999). Die durch das Vorhandensein mehrerer verschiedener Cytokine komplexe Regulationssituation in vivo kann also hinsichtlich der Immunoproteasomen nur durch IFNγ maßgeblich beeinflusst werden.

Der nicht-vorhandene Einfluss von TNFα im Kontrast zu dem deutlichen Effekt von IFNγ auf die Bildung von Immunoproteasomen war auch deshalb überraschend, weil die T-Tiere für die L. monocytogenes Infektion viel anfälliger sind als die I-Tiere. Die Überlebenschance in den frühen Stadien nach einer Infektion mit L. monocytogenes ist demnach nicht an das Vorhandensein von Immunoproteasomen und im weiteren Sinne an die Präsentation der MHC-Klasse-I Epitope gekoppelt. Tatsächlich überleben Mäuse, die keine CTLs und andere Zellen der adaptiven Immunabwehr besitzen, eine L. monocytogenes Infektion, können diese aber nie gänzlich eliminieren (Bancroft et al., 1991; Nickol und Bonventre, 1977). Die vollständige Genesung basiert hauptsächlich auf der Funktion der CTLs und damit auf einer effektiven Präsentation der MHC-Klasse-I Epitope (Ladel et al., 1994). Messbare Frequenzen der spezifischen CTLs – auch gegen das Epitop des LLO-Substrates – sind erst ab Tag 5 bis 6 nach der Infektion zu detektieren (Dr. Ulrich Steinhoff, MPIIB, persönliche Mitteilung) wohingegen funktionsfähige Immunoproteasomen schon am Tag 2 p.i. in den nicht-lymphatischen Zellen nachzuweisen waren ( Abb. 31 , Abb. 32 ). In dieser frühen Phase nach der Infektion vollzieht sich die Aktivierung von naïven T-Zellen (Wong und Pamer, 2003), an welcher die nicht-lymphatischen Zellen jedoch nicht beteiligt sind. Unter diesem Aspekt scheinen die Immunoproteasomen und die damit einhergehende verbesserte Epitopgenerierung einige Tage „zu früh“ exprimiert zu werden, da der Höhepunkt der adaptiven Immunantwort erst am Tag 8 nach der Infektion erreicht ist. In einer Sekundärinfektion expandieren die spezifischen Gedächtnis-CTLs der protektiven Immunität jedoch viel schneller und sind schon am Tag 3 p.i. messbar gestiegen (Badovinac et al., 2004). Somit lässt sich vermuten, dass die frühzeitige Expression der Immuno-Untereinheiten in einer Primärinfektion eventuell nicht nutzbringend ist, aber besonders bei der Reinfektion eine wichtige die CTLs unterstützende Rolle spielt. In einem sekundären Infektionsmodell, in dem die Immunoproteasomen induzierbar sind, ließe sich diese Hypothese eingehender untersuchen.

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Durch IFNγ-Injektion in Mäuse wurde in einer vor kurzem erschienenen Arbeit gezeigt, dass IFNγ die Induktion der Immuno-Untereinheiten in vivo stimulieren kann (Nil et al., 2004). Des Weiteren besitzt der Verlust des Rezeptors für die Typ I Interferone IFNα und IFNβ keinen Einfluss auf die Expression der Immuno-Untereinheiten nach der Infektion (Khan et al., 2001), sondern zeichnet sich sogar durch eine größere Resistenz der Mäuse gegenüber L. monocytogenes aus, deren Ursachen jedoch noch ungeklärt sind (Auerbuch et al., 2004; Carrero et al., 2004). Insgesamt betrachtet, ist also IFNγ für die Bildung von Immunoproteasomen notwendig und ausreichend, weil die Injektionen von IFNγ für die Stimulation der Immuno-Untereinheiten genügen und keine der bisher untersuchten Rezeptor- und Cytokin-defizienten Mäusen einen den I-Tieren ähnlichen Mangel an Immunoproteasomen aufweisen.

4.4 Detaillierte Auswertung des Schnittverhaltens von konstitutiven und Immunoproteasomen

Neben den 26S Proteasomen und den mit PA28 assoziierten 20S Proteasomen existieren in der Zelle auch freie 20S Proteasomen (Tanahashi et al., 2000; Yang et al., 1995). Da bei bestimmten Methoden der 20S Proteasomenpräparation, besonders unter Verwendung von Glycerol, die isolierten 20S Proteasomen nur eine geringe katalytische Aktivität aufweisen, wird im allgemeinen angenommen, dass freie 20S Proteasomen auch innerhalb der Zelle latent vorliegen (Coux et al., 1996). Unter diesem Aspekt erscheint es zunächst fraglich, ob sich die Ergebnisse von in vitro Prozessierungsexperimenten mit isolierten 20S Proteasomen auf die Situation in der Zelle anwenden lassen. Erstaunlicherweise zeigt jedoch der Vergleich der in vitro gewonnenen Prozessierungdaten von Peptidsubstraten mit den in vivo Analysen durch CTL-Experimente eine eindrucksvolle Übereinstimmung zwischen dem Schnittverhalten isolierter 20S Proteasomen und dem des endogenen Proteasomensystems (Eggers et al., 1995; Schultz et al., 2002; Schwarz et al., 2000; Seifert et al., 2004; Sijts et al., 2000; Sijts et al., 2000; Sun et al., 2002). Hinzu kommt, dass ein Vorhersageprogramm für die Präsentation von MHC-Klasse-I Epitopen sehr gute Resultate erzielt, obwohl es kombiniert mit MHC-Klasse-I und TAP Bindungsexperimenten auf der in vitro Prozessierung von Proteinen durch 20S Proteasomen beruht (Peters et al., submitted). Zusätzlich steigt die Anzahl der Berichte, die zeigen, dass 20S Proteasomen auch in „latenter“ Form und ohne 19S Regulator oder PA28 in der Lage sind, vollständige Proteine zu degradieren (Orlowski und Wilk, 2003; Tenzer et al., 2004).

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Kürzlich wurde für die 20S Proteasomen eine selbstständige Rolle im MHC-Klasse-I Präsentationsweg vorgeschlagen: Das Duale-Proteasomen-Modell postuliert, dass die 26S Proteasomen ubiquitinierte Substrate in längere Polypeptide spalten, die durch 20S Proteasomen und TPPII – eine Aminopeptidase mit der zusätzlichen Fähigkeit, auch endoproteolytisch nach Lysinresten zu schneiden (Geier et al., 1999; Seifert et al., 2003) – weiter zu Epitop und Precursor prozessiert werden (Kloetzel, 2004). Dieses Modell stützt sich neben der oben diskutierten in vitro / in vivo Übereinstimmung auch auf die Tatsache, dass es Beispiele gibt, in denen die 26S Proteasomen nicht vollständig prozessiv arbeiten und Polypeptide von mehr als 100 Aminosäuren generieren (Rape und Jentsch, 2004). Ferner ruft eine IFNγ-Stimulation der Zelle die Dephosphorylierung und dadurch die Destabilisierung von 26S Proteasomen hervor (Bose et al., 2004). Demnach scheint ein Anstieg der freien 20S Proteasomen zu den die MHC-Klasse-I Präsentation stimulierenden Vorgängen beizutragen. Ebenfalls für eine Funktion der 20S Proteasomen in vivo sprechen Versuchsergebnisse mit dem Proteasomeninhibitor 31 (PI31). In vitro ist PI31 ein potenter Inhibitor der 20S Proteasomen; die Überexpression in Zellen führt aber nicht zu einer Abnahme der Proteindegradation oder zum Zellzyklusarrest, sondern wirkt sich nur negativ auf die MHC-Klasse-I Präsentation der Epitope aus (Zaiss et al., 2002). PI31 setzt also nach der Proteolyse durch die 26S Proteasomen direkt bei den 20S Proteasomen an, um den MHC-Klasse-I Präsentationsweg zu beeinflussen.

Die dargelegten Gründe deuten darauf hin, dass der in vitro Prozessierungsansatz, der anstelle von 26S Proteasomen und polyubiquitinierten nativen Proteinen nur die 20S Proteasomen und Polypeptidsubstrate enthält, vielleicht nicht nur ein Modellsystem ist. Im Gegenteil, es wäre denkbar, dass dieser Ansatz durchaus den wahren Bedingungen in der Zelle sehr nahe kommt, wenn es darum geht, die proteasomale Generierung der Epitope und Precursor zu untersuchen. Unter diesem Gesichtspunkt betrachtet wird die detaillierte Analyse der Prozessierungsprodukte aus den Verdauansätzen mit 20S Proteasomen besonders aufschlussreich. Dies gilt vor allem in Bezug auf die durch eine Infektion induzierten proteasomalen Veränderungen bei der Bildung immunrelevanter Peptide, wie sie in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden.

Es konnte gezeigt werden, dass in den analysierten in vitro Prozessierungsansätzen die Immunoproteasomen die drei Polypeptide LLO-Substrat, Hsp60-Substrat und pp89-Substrat schneller umsetzten als die konstitutiven Proteasomen ( Abb. 33 und nicht gezeigt), was sich mit den Resultaten anderer Arbeiten deckt (Knuehl et al., 2001; Peters et al., 2002; Sijts et al., 2000; Tenzer et al., 2004). Allerdings wurde hierdurch die Frage aufgeworfen, ob die zwischen konstitutiven und Immunoproteasomen verzeichneten Unterschiede eventuell nur darauf zurückzuführen waren, dass die Immunoproteasomen die Substrate rascher degradierten und daher auch die Produkte schneller generierten. Um eine möglicherweise ebenfalls vorhandene Änderung der Schnittpräferenz von dem erhöhten Substratumsatz zu trennen, wurde die Verhältnisbildung zwischen den immunrelevanten Fragmenten und den sogenannten Antitopen eingeführt. Als Antitope werden solche Fragmente bezeichnet, die durch eine Spaltung des Peptidsubstrates innerhalb der Epitopsequenz gebildet werden und dadurch eine Epitopgenerierung ausschließen. Sind Immunoproteasomen lediglich schneller, produzieren sie auch die Antitope zügiger, und somit bleibt das Epitop/Antitop-Verhältnis oder das Precursor/Antitop-Verhältnis zwischen den beiden Proteasomenarten konstant. Setzen Immunoproteasomen aber bevorzugt die immunrelevanten Fragmente frei, so steigen diese Verhältnisse an.

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Eine Voraussetzung für die Verhältnisbildung ist, dass die massenspektrometrisch detektierten Intensitäten der analysierten Produkte linear zu ihren Konzentrationen ansteigen. In der Massenspektrometrie können jedoch die Signalintensitäten einiger Peptide durch das Vorhandensein anderer Peptide unterdrückt werden; ein Effekt, der im allgemeinen als „Suppression“ bekannt ist (Tang et al., 2004). Aus diesem Grund wurden Eichkurven für die zu analysierenden Fragmente des LLO-Substrates erstellt, die sich dadurch auszeichneten, dass sie die unterschiedlichen Konzentrationen der zu analysierenden Produkte nicht einzeln, sondern zusammen in verschiedenen Mischungsverhältnissen enthielten ( Abb. 35 ). Die Resultate bestätigten den Suppressions-Effekt, besonders für das in hoher Konzentration vorliegende Antitop. Im Bereich der normalerweise gemessenen Intensitäten allerdings zeigten die Eich-Intensitäten nur eine geringe Streuung und daher fast keine Suppression. Zudem verhielten sich die Eich-Intensitäten in diesem Bereich auch linear zu den eingesetzten Konzentrationen, was die Verhältnisbildung zwischen den immunrelevanten Fragmenten und dem Antitop in den in vitro Prozessierungen erlaubte. Die Eichgeraden zeigten ebenfalls, dass die Intensitäten für die analysierten Fragmente je nach eingesetzter Menge ungefähr gleich hoch waren. Eine Erklärung könnte sein, dass Epitop, Precursor und Antitop fast gleich lang sind sowie aus überlappenden Aminosäuresequenzen bestehen und deshalb ein unter Umständen ähnliches Ionisierungsverhalten in der ESI besaßen. Dies ermöglichte also nicht nur einen relativen sondern sogar einen absoluten Vergleich zwischen den interessanten Prozessierungsprodukten.

Prozessierungansätze mit Proteasomenpräparationen, die überwiegend aus konstitutiven Proteasomen bestanden, enthielten in etwa so viel Epitop oder Precursor wie Antitop. Stieg indessen der Immunoproteasomengehalt in den Proteasomenpräparationen, erhöhte sich die Generierung der immunrelevanten Fragmente aus dem LLO-Substrat auf fast das dreifache der Antitopbildung ( Abb. 36 ). Derselbe Verlauf wurde in Bezug auf zwei weitere Antitope des LLO-Substrates gefunden (nicht gezeigt). Hieraus lässt sich ableiten, dass die Inkorporation der Immuno-Untereinheiten nicht nur zu einem akzelerierten Substratumsatz führte, sondern zusätzlich auch in einer Änderung der Schnittstellenpräferenzen bei der Prozessierung des LLO-Substrates resultierte. Die Immunoproteasomen förderten demnach die Bildung der immunrelevanten Fragmente gegenüber der Antitopgenerierung aus dem LLO-Substrat. Eine Begründung für dieses Ergebnis lässt sich aus den Sequenzhomologien der Untereinheiten und den bisher veröffentlichen Kristallstrukturdaten nicht ableiten. Sie besagen lediglich, dass das aktive Zentrum der β1-Untereinheit in einer polaren Nische liegt, wohingegen in der korrespondierenden Immuno-Untereinheit iβ1 die entsprechende Nische durch den Austausch von zwei Aminosäuren apolar ist (Groll et al., 1997), was die geringere Caspase-ähnliche Aktivität der Immunoproteasomen verursachen kann (Gaczynska et al., 1993; Kuckelkorn et al., 1995). Für eine Erklärung des unterschiedlichen Schnittverhaltens wurde daher ein Vorhersageprogramm für die proteasomalen Schnittstellen (ProteaSMM) herangezogen, das an ca. 400 Epitopen getestet wurde (Peters et al., submitted). Die Analyse des LLO-Substrates mittels dieses Programms ergab, dass die Wahrscheinlichkeit einer immunoproteasomalen Spaltung am C-Terminus der immunrelevanten Fragmente Epitop 6-14 und Precursor 4-14 deutlich erhöht ist, da an Position 14 ein Leucin steht (Leu14). An Position 12 im LLO-Substrat – drei Aminosäuren vor Leu14 – liegt ein Valin (Val12), welches ebenfalls einen positiven Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit der Spaltung nach Leu14 durch Immunoproteasomen besitzt. Dieses Val12 bildet den C-Terminus des Antitops 4-12. Im Gegensatz zu den konstitutiven Proteasomen lehnen Immunoproteasomen in dem theoretischen Vorhersagemodell die Spaltung nach einem Valin eher ab. Die negative Auswirkung des Val12 auf die Antitopbildung durch Immunoproteasomen gekoppelt mit dem positiven Effekt von Leu14 und Val12 auf Bildung der immunrelevanten Peptide durch die Immunoproteasomen könnte die Verhältnisänderung zwischen diesen Fragmenten auf theoretischer Basis erklären.

Für die immunrelevanten Produkte und ein Antitop aus dem Hsp60-Substrat (nicht gezeigt) sowie dem pp89-Substrat (Peters et al., 2002) konnte ebenfalls die lineare Zunahme der massenspektrometrischen Intensitäten mit den Eichkonzentrationen nachgewiesen werden. Die Auswertung der Prozessierungsversuche mit Hsp60- und pp89-Substrat mittels der Verhältnisbildung zwischen den immunrelevanten Fragmenten und mehreren Antitopen ergab keine Änderung der Schnittpräferenzen durch konstitutive und Immunoproteasomen (nicht gezeigt). Bei diesen Substraten scheint die effizientere Generierung der Epitope und Precursor auf die Beschleunigung der Proteolyse beschränkt zu sein. Doch auch die schnellere Epitopgenerierung kann zu einer verbesserten Epitoppräsentation auf MHC-Klasse-I Molekülen führen. Das zeigt sich in der Hsp60-spezifischen CTL-Erkennung von Zellen des Immunoproteasom-haltigen Dünndarms und den nicht durch die CTLs erkannten Leberzellen, die hauptsächlich konstitutive Proteasomen exprimieren (Kuckelkorn et al., 2002). Zudem spiegelt sich dies ebenfalls in dem Vorhersageprogramm für die proteasomale Spaltung von Substraten wider (Peters et al., submitted).

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Hinsichtlich der Änderung bei der Schnittstellenpräferenz in den pp89- und LLO-Substraten kamen vor kurzem Peters et al. (Peters et al., 2002) durch eine andere Auswertungsmethode als die der Verhältnisbildung zu den gleichen Ergebnissen wie die vorliegende Arbeit. In der Veröffentlichung wurden die Degradationsprodukte durch die Massen-Balance-Methode quantifiziert und die so erhaltenen Produktmengen miteinander verglichen. Eine Grundvoraussetzung für die Methode ist die vollständige Erfassung sämtlicher entstandener Fragmente. Diese ist jedoch nicht gewährleistet, da auf Grund ihrer intrinsischen Eigenschaften nicht alle Peptide gleich gut in der HPLC-ESI-Ionenfalle detektiert werden können (Cech und Enke, 2001). Ein Beispiel dafür ist mit der in vitro Degradation des Hsp60-Substrates gegeben: Obwohl große Mengen der für Hsp60 immunrelevanten Produkte generiert wurden, und auch die korrespondierenden N-terminalen Produkte zu finden waren, ließen sich keine C-terminalen Produkte massenspektrometrisch nachweisen (nicht gezeigt eigene Daten und Dr. Ulrike Kuckelkorn, persönliche Mitteilung). Deswegen ist die Massen-Balance-Methode nur sehr bedingt anwendbar. Im Gegensatz dazu kann die hier vorgestellte Vorgehensweise des Epitop/Antitop- oder Precursor/Antitop-Verhältnisses für alle Substrate eingesetzt werden, bei denen auch ein Schnitt innerhalb der Epitopsequenz möglich ist. Die Existenz eines solchen Schnittes kann wegen der grundsätzlich relativ unspezifischen Spaltpräferenzen der 20S Proteasomen für jedes Epitop angenommen werden und ist neben der in dieser Arbeit untersuchten Epitope schon für viele andere genau analysierte Epitope gezeigt worden (Alvarez et al., 2001; Chapatte et al., 2004; Schultz et al., 2002; Sijts et al., 2000; Sun et al., 2002; Theobald et al., 1998). Da Eichreihen in der massenspektrometrischen Analyse nur für die interessierenden Fragmente erstellt werden müssen, ist der zusätzliche experimentelle Aufwand einfach abzuschätzen und deswegen die genaue Analyse der Schnittstellenpräferenz durch die Verhältnis-Methode sehr gut durchführbar.

Eine Änderung der Spaltpräferenzen könnte zu der Nutzung neuer Schnittstellen durch die Immunoproteasomen führen. Die umfangreiche massenspektrometrische Analyse aller detektierbaren Prozessierungsprodukte des LLO-Substrates ergab, dass sämtliche von konstitutiven Proteasomen hergestellten Peptide auch in den Ansätzen mit Immunoproteasomen detektiert wurden ( Abb. 37 ). Durch Immunoproteasomen wurden jedoch zwei Produkte gebildet, die in den Prozessierungsexperimenten mit konstitutiven Proteasomen nicht nachgewiesen werden konnten. Eine genaue Charakterisierung dieser zwei Fragmente deckte allerdings auf, dass die Schnitte, die diese Fragmente generierten, sehr wohl auch von konstitutiven Proteasomen ausgeführt wurden. Möglicherweise liegen die durch eine Kombination dieser Schnitte entstehenden Fragmente bei konstitutiven Proteasomen unterhalb des massenspektrometrischen Detektionslimits. Erst die Änderung der Spaltpräferenzen hebt die generierte Fragmentmenge auf ein nachweisbares Niveau. Für das LLO-Substrat konnten also keine ausschließlich durch die Immunoproteasomen genutzten Schnittstellen gefunden werden. Weitere Analysen müssen klären, ob sich diese Aussage auch auf andere Substrate anwenden lässt.

Die erstmals in dieser Ausführlichkeit erstellte Auswertung der in vitro Prozessierungsexperimente gibt detaillierten Aufschluss über die funktionellen Unterschiede zwischen konstitutiven Proteasomen und Immunoproteasomen. Letztere zeichnen sich demnach gegenüber den konstitutiven Proteasomen in einigen Fällen durch eine geänderte Schnittstellenpräferenz aus und generell durch einen erhöhten Umsatz der Substrate.

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Mit den genannten Aspekten sind Immunoproteasomen speziell an der nach einer Infektion wichtigen gesteigerten Epitoppräsentation auf MHC-Klasse-I Molekülen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wird dieser Zusammenhang besonders ersichtlich, da die aus mit L. monocytogenes infizierten Mäusen isolierten 20S Proteasomen das listerielle LLO-Epitop – sowie ein zweites Epitop und mehrere Precursor – deutlich effizienter generierten. Durch die IFNγ-abhängige Expression der Immuno-Untereinheiten übt die Infektion also einen starken regulativen Einfluss auf die proteasomale Struktur und Funktion in den nicht-lymphatischen Organen aus. Ob sich dieser Einfluss ebenfalls auf Regulation durch posttranslationale Modifikationen wie die O-Glycosylierung und die Phosphorylierung erstreckt, wird der Gegenstand weiterer Analysen sein.


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24.05.2007