Struktur und Funktion der 20S Proteasomen
aus Organen Listeria monocytogenes infizierter Mäuse

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat. )

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Britta Katharina Strehl

geboren am 19.04.1975 in Lüdenscheid

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
2. Prof. Dr. Hermann-Georg Holzhütter
3. PD Dr. Ulrich Steinhoff

Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2005

Zusammenfassung

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-γ (IFNγ) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion von Proteasomen aus verschiedenen murinen Organen vor und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes untersucht. Damit wurde zum ersten Mal in einem Infektionsmodell die Struktur der Proteasomen mit ihrer physiologischen Funktion verbunden.

Die Funktion der isolierten Proteasomen wurde durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert und die Prozessierungsprodukte mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Nach Optimierung der Auswertemethodik konnte gezeigt werden, dass die Proteasomen, die aus den nicht-lymphatischen Organen isoliert wurden, signifikant mehr MHC-Klasse-I Epitop und Epitopprecursor nach der Infektion produzierten als vorher. Dies galt sowohl für die Produkte aus dem murinen Hsp60-Substrat als auch aus dem viralen pp89-Substrat und einem erstmalig untersuchten bakteriellen Substrat, dem LLO-Substrat. Die gesteigerte Generierung der immunrelevanten Fragmente ging einher mit der deutlichen Zunahme der Immunoproteasomen in den nicht-lymphatischen Geweben, wie durch zweidimensionale Gelelektrophorese und Westernblotanalyse nachgewiesen werden konnte. Zudem wurden bei den aus Leber isolierten Proteasomen Hinweise auf eine nach der Infektion erhöhte posttranslationale Modifikation mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin gefunden. In den lymphatischen Geweben veränderte sich der hohe Anteil der Immunoproteasomen sowie die proteasomale Funktion nach der Infektion nicht. Die durch die Infektion ausgelöste Induktion der Immunoproteasomen war unabhängig von der Präsenz der Erreger in den jeweiligen Organen. Die parallel durchgeführten Analysen von Cytokinrezeptor-defizienten Mäusen ergaben keinen Einfluss von Tumor Nekrose Faktor-α auf die Expression der Immunoproteasomen, aber eine eindeutige Abhängigkeit von IFNγ. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass nach einer Infektion ausgeschüttetes INFγ dazu führt, dass auch die nicht-lymphatischen Organe Immunoproteasomen bilden, um so durch eine verbesserte Epitoppräsentation die Erkennung und Beseitigung infizierter Zellen durch die CTLs zu erleichtern und daher einer weiteren Ausbreitung des Erregers effizient entgegenzuwirken.

In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen durchgeführt. Hierfür wurde die Verhältnisbildung zwischen sogenannten Antitopen, die durch eine Spaltung des Peptidsubstrates innerhalb der Epitopsequenz entstehen, und den immunrelevanten Produkten etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen der lymphatischen Organe und der nicht-lymphatischen Gewebe nach der Infektion zwar dieselben Spaltstellen nutzten wie die konstitutiven Proteasomen, aber andere Schnittstellenpräferenzen besaßen. Zudem degradierten die Immunoproteasomen die Substrate deutlich schneller. Dies bedeutet, dass die Immunoproteasomen nach einer Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind.

Abstract

The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the structure and function of proteasomes derived from several murine organs before and at different times after infection with the intracellular bacteria Listeria monocytogenes were investigated. Therefore for the first time the structure of proteasomes was correlated with their physiological function in an infection model.

The function of isolated proteasomes was analyzed through in vitro processing of three oligomeric peptide substrates and the processing products were identified and quantified by HPLC-ECI-ion trap mass spectrometry. After optimization of the theoretical analysis it could be shown that proteasomes isolated from the non-lymphatic organs produce significantly more MHC-class-I epitopes and epitope precursors after than before the infection. This applied to the products of the murine Hsp60-substrate as well as of the viral pp89-substrate and also for the products of the bacterial LLO-substrate which was studied for the first time. The enhanced generation of the immuno-relevant fragments was coupled to the clear induction of immunoproteasomes in non-lymphatic tissues as demonstrated by two-dimensional gel electrophoresis and western blot analysis. In addition an increase of the posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. In the lymphatic tissues neither a change in the proteasomal function nor in the high amounts of immunoproteasome could be detected post infection. The induced formation of immunoproteasomes after infection was independent of the presence of pathogens in the studied organs. The additional analysis of cytokine receptor deficient mice revealed that tumor necrosis factor-alpha does not influence the expression of immunoproteasomes whereas the induction is definitely dependent on IFNgamma. The results of this project lead to the conclusion that, after infection, secreted IFNgamma induces immunoproteasomes also in the non-lymphatic organs in order to facilitate recognition and elimination of infected cells by improved epitope presentation. Thus a further dissemination of the pathogens should be efficiently antagonized.

Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. For this purpose ratios between so-called antitopes, which are generated by a cleavage inside of the epitope sequence, and the immuno-relevant products were calculated. The result was that immunoproteasomes of the lymphatic tissues and the non-lymphatic organs after infection used the same cleavage sites however with different preferences. Immunoproteasomes additionally degraded the substrates much faster. This means that immunoproteasomes are involved in improved epitope generation after infection by faster and changed usage of existing cleavage sites.

Eigene Schlagworte: Proteasom, Immunoproteasom, Listeria monocytogenes , Mausmodell, lymphatische Organe, nicht-lymphatische Organe, IFNγ, TNFα, Antigenprozessierung, MHCKlasseI Epitop, Antitop, LLO, Hsp60, pp89, HPLC-ESI-Ionenfalle, Massenspektrometrie, posttranslationale Modifikation, N-Acetylglucosamin, OGlcNAc

Keywords: 20S proteasome, immunoproteasome, Listeria monocytogenes , mouse model, lymphatic organs, non-lymphatic organs, IFNγ, TNFα, antigen processing, MHC-class-I epitope, antitope, LLO, Hsp60, pp89, HPLC-ESI-ion trap, mass spectrometry, posttranslational modification, N-acetylglucosamine, O-GlcNAc

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24.05.2007