Struktur und Funktion der 20S Proteasomen
aus Organen Listeria monocytogenes infizierter Mäuse

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat. )

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diplom-Biologin Britta Katharina Strehl

geboren am 19.04.1975 in Lüdenscheid

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
2. Prof. Dr. Hermann-Georg Holzhütter
3. PD Dr. Ulrich Steinhoff

Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2005

Zusammenfassung

Das Proteasomensystem der Zelle ist für die Degradation von Proteinen verantwortlich und spielt eine zentrale Rolle bei der Generierung von Epitopen, die auf MHC-Klasse-I Molekülen den cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) präsentiert werden. Die Stimulation von Zellen mit Interferon-γ (IFNγ) führt zu der Bildung von Immunoproteasomen, die im Vergleich zu den konstitutiven Proteasomen eine verbesserte Generierung vieler MHC-Klasse-I Epitope aufweisen. In gesunden Mäusen werden Immunoproteasomen vorwiegend in den lymphatischen Geweben exprimiert, wohingegen nicht-lymphatische Gewebe hauptsächlich konstitutive Proteasomen enthalten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion von Proteasomen aus verschiedenen murinen Organen vor und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes untersucht. Damit wurde zum ersten Mal in einem Infektionsmodell die Struktur der Proteasomen mit ihrer physiologischen Funktion verbunden.

Die Funktion der isolierten Proteasomen wurde durch in vitro Prozessierung von drei oligomeren Peptidsubstraten analysiert und die Prozessierungsprodukte mittels HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch identifiziert sowie quantifiziert. Nach Optimierung der Auswertemethodik konnte gezeigt werden, dass die Proteasomen, die aus den nicht-lymphatischen Organen isoliert wurden, signifikant mehr MHC-Klasse-I Epitop und Epitopprecursor nach der Infektion produzierten als vorher. Dies galt sowohl für die Produkte aus dem murinen Hsp60-Substrat als auch aus dem viralen pp89-Substrat und einem erstmalig untersuchten bakteriellen Substrat, dem LLO-Substrat. Die gesteigerte Generierung der immunrelevanten Fragmente ging einher mit der deutlichen Zunahme der Immunoproteasomen in den nicht-lymphatischen Geweben, wie durch zweidimensionale Gelelektrophorese und Westernblotanalyse nachgewiesen werden konnte. Zudem wurden bei den aus Leber isolierten Proteasomen Hinweise auf eine nach der Infektion erhöhte posttranslationale Modifikation mit dem Monosaccharid N-Acetylglucosamin gefunden. In den lymphatischen Geweben veränderte sich der hohe Anteil der Immunoproteasomen sowie die proteasomale Funktion nach der Infektion nicht. Die durch die Infektion ausgelöste Induktion der Immunoproteasomen war unabhängig von der Präsenz der Erreger in den jeweiligen Organen. Die parallel durchgeführten Analysen von Cytokinrezeptor-defizienten Mäusen ergaben keinen Einfluss von Tumor Nekrose Faktor-α auf die Expression der Immunoproteasomen, aber eine eindeutige Abhängigkeit von IFNγ. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass nach einer Infektion ausgeschüttetes INFγ dazu führt, dass auch die nicht-lymphatischen Organe Immunoproteasomen bilden, um so durch eine verbesserte Epitoppräsentation die Erkennung und Beseitigung infizierter Zellen durch die CTLs zu erleichtern und daher einer weiteren Ausbreitung des Erregers effizient entgegenzuwirken.

In der vorliegenden Arbeit wurde außerdem eine detaillierte Analyse der massenspektrometrischen Daten hinsichtlich des Schnittverhaltens der konstitutiven und Immunoproteasomen durchgeführt. Hierfür wurde die Verhältnisbildung zwischen sogenannten Antitopen, die durch eine Spaltung des Peptidsubstrates innerhalb der Epitopsequenz entstehen, und den immunrelevanten Produkten etabliert. Die Auswertung ergab, dass die Immunoproteasomen der lymphatischen Organe und der nicht-lymphatischen Gewebe nach der Infektion zwar dieselben Spaltstellen nutzten wie die konstitutiven Proteasomen, aber andere Schnittstellenpräferenzen besaßen. Zudem degradierten die Immunoproteasomen die Substrate deutlich schneller. Dies bedeutet, dass die Immunoproteasomen nach einer Infektion durch schnellere und veränderte Nutzung bestehender Spaltstellen an der verbesserten Epitoppräsentation beteiligt sind.

Abstract

The proteasome system of the cell is responsible for the degradation of proteins and plays a central role in the generation of epitopes which are presented to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) on MHC-class-I molecules. The stimulation of cells by interferon-gamma (IFNgamma) leads to the formation of immunoproteasomes that show an improved generation of many MHC-class-I epitopes compared to constitutive proteasomes. In healthy mice, immunoproteasomes are mainly expressed in the lymphatic tissues, whereas the non-lymphatic organs predominantly contain constitutive proteasomes. In this project the structure and function of proteasomes derived from several murine organs before and at different times after infection with the intracellular bacteria Listeria monocytogenes were investigated. Therefore for the first time the structure of proteasomes was correlated with their physiological function in an infection model.

The function of isolated proteasomes was analyzed through in vitro processing of three oligomeric peptide substrates and the processing products were identified and quantified by HPLC-ECI-ion trap mass spectrometry. After optimization of the theoretical analysis it could be shown that proteasomes isolated from the non-lymphatic organs produce significantly more MHC-class-I epitopes and epitope precursors after than before the infection. This applied to the products of the murine Hsp60-substrate as well as of the viral pp89-substrate and also for the products of the bacterial LLO-substrate which was studied for the first time. The enhanced generation of the immuno-relevant fragments was coupled to the clear induction of immunoproteasomes in non-lymphatic tissues as demonstrated by two-dimensional gel electrophoresis and western blot analysis. In addition an increase of the posttranslational modification with the monosaccharide N-acetylglucosamine could be detected in liver-derived proteasomes after infection. In the lymphatic tissues neither a change in the proteasomal function nor in the high amounts of immunoproteasome could be detected post infection. The induced formation of immunoproteasomes after infection was independent of the presence of pathogens in the studied organs. The additional analysis of cytokine receptor deficient mice revealed that tumor necrosis factor-alpha does not influence the expression of immunoproteasomes whereas the induction is definitely dependent on IFNgamma. The results of this project lead to the conclusion that, after infection, secreted IFNgamma induces immunoproteasomes also in the non-lymphatic organs in order to facilitate recognition and elimination of infected cells by improved epitope presentation. Thus a further dissemination of the pathogens should be efficiently antagonized.

Furthermore, a detailed analysis of the mass spectrometry data was established according to the cleavage site usage of constitutive and immunoproteasomes. For this purpose ratios between so-called antitopes, which are generated by a cleavage inside of the epitope sequence, and the immuno-relevant products were calculated. The result was that immunoproteasomes of the lymphatic tissues and the non-lymphatic organs after infection used the same cleavage sites however with different preferences. Immunoproteasomes additionally degraded the substrates much faster. This means that immunoproteasomes are involved in improved epitope generation after infection by faster and changed usage of existing cleavage sites.

Eigene Schlagworte: Proteasom, Immunoproteasom, Listeria monocytogenes , Mausmodell, lymphatische Organe, nicht-lymphatische Organe, IFNγ, TNFα, Antigenprozessierung, MHCKlasseI Epitop, Antitop, LLO, Hsp60, pp89, HPLC-ESI-Ionenfalle, Massenspektrometrie, posttranslationale Modifikation, N-Acetylglucosamin, OGlcNAc

Keywords: 20S proteasome, immunoproteasome, Listeria monocytogenes , mouse model, lymphatic organs, non-lymphatic organs, IFNγ, TNFα, antigen processing, MHC-class-I epitope, antitope, LLO, Hsp60, pp89, HPLC-ESI-ion trap, mass spectrometry, posttranslational modification, N-acetylglucosamine, O-GlcNAc

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Struktur und Funktion des Proteasomensystems
    • 1.1.1  Strukturelle Komponenten des Proteasomensystems
    • 1.1.2 Strukturvariabilität durch posttranslationale Modifikationen
    • 1.1.3 Generierung der MHC-Klasse-I Epitope und ihrer Precursor durch das Proteasomensystem
  • 1.2 Präsentation von Epitopen auf MHC-Klasse-I Molekülen
  • 1.3 Das murine Infektionsmodell mit Listeria monocytogenes
    • 1.3.1  Verlauf der Listeriose
    • 1.3.2 Die MHC-Klasse-I Epitope von Listeria monocytogenes
  • 1.4 Massenspektrometrische Analyse der in vitro Prozessierungsexperimente
  • 1.5 Zielstellung
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Material
    • 2.1.1  Reagenzien und Chemikalien
    • 2.1.2 Antikörper
    • 2.1.3 Nukleinsäuren
    • 2.1.4 Enzyme
    • 2.1.5 Kits
    • 2.1.6 Verbrauchsmaterialien
    • 2.1.7 Geräte
    • 2.1.8 Software
  • 2.2 Methoden
    • 2.2.1  Mäuse
      • 2.2.1.1  Mausstämme und Listeria monocytogenes Infektion
      • 2.2.1.2 Bestimmung der Bakterientiter in Organen
      • 2.2.1.3 Herstellung der Organhomogenate für die Präparation von 20S Proteasomen
      • 2.2.1.4 Herstellung der Organhomogenate für Cytokinbestimmung
    • 2.2.2 Biochemische Methoden
      • 2.2.2.1  Präparation von 20S Proteasomen
      • 2.2.2.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
      • 2.2.2.3 Proteinfällung
      • 2.2.2.4 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Aktivitätstest im Gel
      • 2.2.2.5 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli
      • 2.2.2.6 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow
      • 2.2.2.7 Mini-2D-Gelelektrophorese
      • 2.2.2.8 Elektrotransfer von Proteinen auf PVDF-Membran
      • 2.2.2.9 Coomassie-Färbung von Polyacrylamidgelen und PVDF-Membranen
      • 2.2.2.10 Densitometrische Auswertung Coomassie-gefärbter 2D-Gele
      • 2.2.2.11 Silberfärbung von Polyacrylamidgelen
      • 2.2.2.12 Zuckeridentifizierung mittels Lektinen
      • 2.2.2.13 Aktivitätstest mit fluorogenen Substraten
      • 2.2.2.14 Proteolytische Prozessierung von Modellpeptiden
      • 2.2.2.15 Analytische Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC)
    • 2.2.3 Massenspektrometrie
      • 2.2.3.1  Massenspektrometrische Analyse der Prozessierungsprodukte
      • 2.2.3.2 Identifizierung der Prozessierungsprodukte: Erstellung von Schnittkarten
      • 2.2.3.3 Auswertung und Kinetik der Prozessierungsprodukte
      • 2.2.3.4 Excel-Programm zur statistischen Analyse der Produktgenerierung
      • 2.2.3.5 Erstellung der Eichreihen für ausgewählte Prozessierungsprodukte
      • 2.2.3.6 Epitop-Antitop Auswertung durch Verhältnisbildung
      • 2.2.3.7 Proteinidentifizierung durch MALDI-TOF Massenspektrometrie
    • 2.2.4 Immunologische Methoden
      • 2.2.4.1  Spezifische Protein- und Zuckeridentifizierung mittels Westernblotanalyse
      • 2.2.4.2 Immunopräzipitation von radioaktiv markierten 20S Proteasomen
      • 2.2.4.3 Immunofluoreszenz
      • 2.2.4.4 Bio-Plex Immunoassay zur Cytokinbestimmung aus Serum und den Organhomogenaten
    • 2.2.5 Molekularbiologische Methoden
      • 2.2.5.1  RNA-Isolation aus RMA-Zellen
      • 2.2.5.2 Reverse Transkription der RNA in cDNA
      • 2.2.5.3 Amplifikation von DNA durch Polymerase-Ketten-Reaktion
      • 2.2.5.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
      • 2.2.5.5 DNA-Gelelektrophorese
      • 2.2.5.6 Aufreinigung von DNA aus Reaktionsansätzen und Agarosegelen
      • 2.2.5.7 Dephosphorylierung der Vektor-DNA
      • 2.2.5.8 Ligation von DNA-Fragmenten in Vektor-DNA
      • 2.2.5.9 Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA
      • 2.2.5.10 Präparation von Plasmid-DNA
      • 2.2.5.11 Bestimmung der RNA- und DNA-Konzentration
      • 2.2.5.12 Zusammenlagerung einzelsträngiger siRNA
    • 2.2.6 Zellkultur
      • 2.2.6.1  Kultur von RMA-Zellen
      • 2.2.6.2 Einfrieren und Auftauen von RMA-Zellen
      • 2.2.6.3 Lyse der RMA-Zellen für Präparation von 20S Proteasomen
      • 2.2.6.4 Elektroporation mit siRNA
      • 2.2.6.5 Markierung von Proteinen in RMA-Zellen mit ¹⁴C
      • 2.2.6.6 Markierung von Proteinen in RMA-Zellen mit ³⁵S
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Charakteristika der Listeria monocytogenes Infektion in Mäusen
  • 3.2 Funktionsanalyse der aus Gewebe isolierten Proteasomen
    • 3.2.1  Reinheit der Proteasomenpräparationen
    • 3.2.2 Massenspektrometrische Identifizierung der Produkte aus in vitro Prozessierungsexperimenten
    • 3.2.3 Statistische Bearbeitung und Auswertung der Rohdaten
    • 3.2.4 Auswertung der Prozessierungsexperimente
      • 3.2.4.1  In vitro Prozessierung des LLO-Substrates durch Proteasomen aus den Organen der Wildtypmäuse
      • 3.2.4.2  In vitro Prozessierung des LLO-Substrates durch Proteasomen aus den Organen der Rezeptor-defizienten Mäuse
      • 3.2.4.3  In vitro Prozessierung des Hsp60-Substrates und des pp89-Substrates
  • 3.3 Struktur der aus den Geweben isolierten Proteasomen
    • 3.3.1  Gewebehomogenate im Westernblot
    • 3.3.2 Zusammensetzung der aus Geweben isolierten 20S Proteasomen
      • 3.3.2.1  Die Zusammensetzung der Proteasomen aus den Geweben der Wildtypmäuse
      • 3.3.2.2 Die Zusammensetzung der Proteasomen aus den Geweben der Rezeptor-defizienten Mäuse
  • 3.4 Struktur- und Funktionsanalyse der Proteasomen aus ausgewählten Gewebezelltypen
  • 3.5 Funktionelle Unterschiede zwischen konstitutiven und Immunoproteasomen
  • 3.6 Posttranslationale Modifikation der Proteasomen mit O-GlcNAc – Erste Hinweise
• 4 Diskussion
  • 4.1  Modifikation der Proteasomen mit O-GlcNAc
  • 4.2 Struktur- und Funktionsvergleich der Proteasomen aus den verschiedenen Organen
  • 4.3 Regulation der Proteasomen durch IFNγ und TNFα
  • 4.4 Detaillierte Auswertung des Schnittverhaltens von konstitutiven und Immunoproteasomen
• Literatur
• Abkürzungen
• Anhang
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tab. 1 : Verwendete spezifische Primer. Alle Primer wurden nach Reinigung durch Gelfiltration geliefert. Die Konzentration der Arbeitslösungen betrug 10 µM.
• Tab. 2 : Verwendete siRNAs. Die siRNAs waren HPLC-gereinigt und wurden in DEPC-H₂O zu einer Konzentration von 100 µM aufgenommen.
• Tab. 3 : Konzentrations-Zusammensetzung der ausgewählten LLO-Prozessierungsprodukte für die Eichreihen. Es sind die pmol der jeweiligen synthetisierten Peptide in 40 µl Probe angegeben. Pre – Epitopprecursor; Epi – Epitope; Anti – Antitop.
• Tab. 4 : Übersicht zu den verwendeten Antikörper-Verdünnungen und Puffern bei Protein- und Zucker identifizierung mittels Westernblot. Die Spalte „Verd.“ enthält die Verdünnung des 1. Antikörpers (1.Ak) im Verhältnis von 1 zu der angegebenen Zahl. Der 2. Antikörper (2.Ak) GAR wurde immer in der Verdünnung 1:10000, der 2. Antikörper RAM immer in der Verdünnung 1:1000 eingesetzt. Für alle Verdünnungen wurde der in der Spalte „Ak-Puffer“ genannte Puffer verwendet. Bei Benutzung von MA-I wurde die Verdünnung des 1.Ak und das anschließende Waschen mit hS-PBST durchgeführt, während beim 2.Ak PBST genutzt wurde.
• Tab. 5 : Potentiell modifizierte Aminosäuren. Die Positionen der Aminosäuren beziehen sich auf die murinen Untereinheiten (UE). „zugänglich“ bedeutet, dass die Aminosäure an der Oberfläche des Proteasoms liegt und für modifizierende Enzyme gut erreichbar ist. „theoretische Modifikationsstellen“ sind mit dem „YinOYang“ Programm ermittelt worden.

Bilder

• Abb. 1 : Komplexe des Proteasomensystems. (A) 19S Regulator: orange – Lid-Untereinheiten; violett – Base-Untereinheiten. (B) 20S Proteasom: grün – α-Untereinheiten; rot – proteolytisch aktive β-Untereinheiten; blau – inaktive β-Untereinheiten. (C) PA28. Die einzelnen Komplexe ergeben in der dargestellten Kombination das Hybrid-Proteasom 19S-20S-PA28. Das 26S Proteasom hat die Anordnung 19S-20S-19S. Daneben existiert das Proteasom als PA28-20S-PA28 Komplex in der Zelle. (Die Abbildung ist eine Kombination aus (Kloetzel, 2001; Kloetzel, 2004; Tanahashi et al., 2000))
• Abb. 2 : Unterschiedliche Molekulargewichte und isoelektrische Punkte der gleichen proteasomalen Untereinheiten. Gezeigt sind aus murinem Dünndarm isolierte und in der 2D-Gelelektrophorese separierte 20S Proteasomen. Die erste Dimension trennt nach isolelektrischem Punkt (NEPHGE – „Nonequilibrium pH Gradient Electrophoresis“); die zweite Dimension trennt nach Molekulargewicht (SDS-PAGE – denaturierende Polyacrylamid Gelelektrophorese). Die Pfeile geben die Trennrichtungen der Elektrophoresen an. Durch Massenspektrometrie identifizierte gleiche Untereinheiten sind in den gleichen Farben markiert. (Abb. nach (Kuckelkorn et al., 2002))
• Abb. 3 : Epitopgenerierung und MHC-Klasse-I Präsentation. Ubiquitinierte Proteine werden durch das 26S Proteasom zu Peptiden prozessiert, die durch cytosolische Aminopeptidasen getrimmt oder vollständig abgebaut werden können. TAP transportiert die Epitope und Precursor in das ER, wo nach eventuell weiterem Trimming die Epitope an MHC-Klasse-I Moleküle gebunden werden. Die beladenen MHC-Klasse-I Moleküle werden über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert, an der sie die Epitope den CTLs präsentieren. (Abbildung nach (Kloetzel, 2004; Pamer, 2004))
• Abb. 4 : Bindung des T-Zell-Rezeptors an ein Peptid-beladenes MHC-Klasse-I Molekül. Es werden die extrazelluläreren Bereiche des T-Zell-Rezeptors (hell- und dunkelgrün) und des MHC-Klasse-I Moleküls (blau – α-Kette; violett – β2Microglobulin) mit Epitop (rosa) gezeigt. Im Text erwähnte Domänen sind beschriftet. Der dimere T-Zell-Rezeptor bindet mit den hochvariablen Regionen an das Epitop, welches in der Furche zwischen der α1- und α2-Domäne des MHC-Klasse-I Moleküls präsentiert wird. (Erweiterte Abbildung nach http://allele5.biol.berkeley.edu)
• Abb. 5 : Intrazellulärer Lebenszyklus von Listeria monocytogenes . (A) Internalin-vermittelte oder phagocytotische Aufnahme in die Zelle; (B) Lyse der Vesikelmembran durch LLO; (C) Vermehrung im Cytosol; (D) Fortbewegung mittels Aktinschweif; (E) Befall der Nachbarzelle; (F) Lyse der Vesikelmembranen. (Abbildung nach (Tilney und Portnoy, 1989))
• Abb. 6 : Schematische Darstellung der HPLC-ESI-Ionenfalle und eines Chromatogramms. Durch eine Kapillare werden die Moleküle des HPLC-Eluats (rot) zwischen die Elektroden der ESI-Einheit (grün) gesprüht, deren Anode von der Kapillare gebildet wird. Hierbei erfolgt die Ionisierung der Moleküle. Nach der Fokussierung werden die ionisierten Moleküle in der Ionenfalle durch die Ringelektrode (hellblau) auf kreisförmige Bahnen gezwungen. Durch Zuschalten der Endkappenelektroden (dunkelblau) und daraus folgender Spannungsänderungen werden die Moleküle aus der Ionenfalle geworfen. Die Retentionszeit, der Ionenstrom und das m/z der detektierten Moleküle werden im Chromatogramm dargestellt. (Abbildung nach Dr. Katharina Janek)
• Abb. 7 : Milz. (A) Gesunde Milz einer Maus. (B) Milz einer L. monocytogenes infizierten Maus mit den typischen weißen Granuloma.
• Abb. 8 : Listeria monocytogenes Titer in den Organen. (A) Wildtypmäusen und (B) I-Tieren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion Organe entnommen. In diesen Organen wurde die Anzahl der L. monocytogenes Kolonie-bildenden-Einheiten (cfu) bestimmt. Eine Markierung entspricht einem Tier; die waagerechten Striche geben die Mittelwerte auf der logarithmischen Achse an.
• Abb. 9 : IFN γ -Spiegel im Serum nach der L. monocytogenes Infektion. Die IFNγ-Konzentration wurde in pg pro ml Serum an verschiedenen Tagen nach der Infektion der Wildtypmäuse (rot) und I-Tiere (grün) bestimmt.
• Abb. 10 : Dünndarmproteasomen im Nativgel mit Aktivitätstest. 0,7 µg der aus Dünndarm isolierten 20S Proteasomen wurden in nicht-denaturierenden Gelen aufgetrennt, Aktivitätstests auf Trypsin-ähnliche Aktivität unterzogen und anschließend mit Coomassie gefärbt. rot – Wildtypmäuse (Wt); blau – T-Tiere; grün – I-Tiere; / – mit Bromphenolblau beladene Bahn.
• Abb. 11 : HPLC-Profile der LLO-Degradation mit Inhibitoren. LLO-Substrat wurde mit Tag 6 p.i. Leberproteasomen der Wildtypmäuse unter Zugabe von MG132 oder AAF-CMK verdaut und anschließend mittels HPLC analysiert. Von unten nach oben: hellblau – LLO-Substrat, Positivkontrolle; rosa – 0 h Verdau ohne Inhibitoren; dunkeltürkis – 8 h Verdau ohne Inhibitoren; violett – 8 h Verdau mit MG132; grün – 8 h Verdau mit AAF-CMK.
• Abb. 12 : Nachweis des Clp-Proteasekomplexes von L. monocytogenes . 1µg der aus Leber isolierten 20S Proteasomen der Wildtypmäuse und der I-Tiere sowie Lysat von 10⁷ cfu L. monocytogenes wurden in einem 10%igen SDS-Gel aufgetrennt, geblottet und mit Antikörper gegen ClpC inkubiert. (A) Coomassie-gefärbte Membran. (B) Westernblot. Der Pfeil markiert die für ClpC beschriebene spezifische Bande bei 60 kDa. rot – Wildtypmäuse; grün – I-Tiere; L.m. – Listeria monocytogenes Lysat, Positivkontrolle; MW (kDa) – Molekulargewicht in Kilodalton.
• Abb. 13 : Aktivitätsmessung mit fluorogenen Substraten. Leberproteasomen der Wildtyptiere wurden 60 min mit verschiedenen Konzentrationen der fluorogenen Substrate inkubiert, welche von den verschiedenen Aktivitäten der 20S Proteasomen gespalten werden. Gemessen wurde die Emission der freigesetzten fluorogenen Gruppe bei 460 nm nach Anregung bzw. bei 405 nm nach Anregung für die Messung der Caspase-ähnlichen Aktivitäten. gelbe Rauten – Tag 0 Proteasomen; rote Quadrate – Tag 2 p.i. Proteasomen; braune Dreiecke – Tag 6 p.i. Proteasomen.
• Abb. 14 : Vollständige Schnittkarte des LLO-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit aufgelistet. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten; X – Peptide, die in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden.
• Abb. 15 : Schnittkarte des Hsp60-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit geordnet. Es wurden nur die Peptide aufgelistet, welche anschließend in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten.
• Abb. 16 : Schnittkarte des pp89-Substrates. Die Verdauprodukte sind nach ihrer Retentionszeit geordnet. Es wurden nur die Peptide aufgelistet, welche anschließend in den Quantifizierungsläufen ausgewertet wurden. Ladung – elektrische Ladungsstufe; MW (Da) – Molekulargewicht in Dalton; RT (min) – Retentionszeit in Minuten.
• Abb. 17 : Gerätebedingte Intensitätsschwankungen in der Messung mit HPLC-ESI-Ionenfalle und Normierung auf den internen Standard. Das Hsp60-Substrat wurde in vitro mit Tag 0 Leberproteasom der Wildtypmäuse für 4 und 20 h verdaut und anschließend mittelsHPLC-ESI-Ionenfalle analysiert. Gezeigt sind die Auswertungen des internen Standards und ausgewählter Degradationsprodukte. (A) Gemessene Produktintensitäten. (B) auf internen Standard normierte Intensitäten. schwarz – 1. Messung; rot – 2. Messung.
• Abb. 18 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Leberproteasomen der Wildtypmäuse. (A) Repräsentative Prozessierungsprodukte aus dem LLO-Substrat. (B) Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten der in (A) dargestellten Produkte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) und Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen.
• Abb. 19 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Colonproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) und Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen.
• Abb. 20 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Milzproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) oder reproduzierbaren Tendenzen festgestellt werden.
• Abb. 21 : In vitro Generierung immunrelevanter Produkte durch Dünndarmproteasomen der Wildtypmäuse. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten repräsentativer Degradationsprodukte nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) oder reproduzierbaren Tendenzen festgestellt werden.
• Abb. 22 : In vitro Generierung des Precursors 4-14 durch die Gewebeproteasomen der Rezeptor-defizienten Mäuse. (A) I-Tiere. (B) T-Tiere. Es werden die normierten und gemittelten Intensitäten nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzu- oder abnahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. Dünnd. – Dünndarmproteasomen.
• Abb. 23 : In vitro Generierung eines (Hsp60)Precursors und eines (pp89)Precursors durch Gewebeproteasomen der Wildtypmäuse. (A) (Hsp60)Precursor 5-18. (B) (pp89)Precursor 5-15. In den oberen Teilen der Abbildung sind das Hsp60- und das pp89-Substrates dargestellt; die Epitopsequenzen sind fettgedruckt; die Precursorsequenzen sind durch orange Balken markiert. Darunter werden die normierten und gemittelten Intensitäten nach 2 h Verdauzeit gezeigt. Sterne (*) kennzeichnen statistische signifikante Unterschiede (p < 0,05) bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. Dünnd. – Dünndarmproteasomen.
• Abb. 24 : Detektion der Immuno-Untereinheit i β 2 in Organhomogenaten. 200µg Gesamtprotein aus Leber- und Dünndarmhomogenaten verschiedener Tage nach der Infektion wurde in der SDS-PAGE getrennt, geblottet und mit dem Antikörper gegen iβ2 inkubiert. (A) Wildtypmäuse. (B) I-Tiere. (C) T-Tiere. Pfeile kennzeichnen reifes iβ2 und unreifes iβ2 (pro-iβ2).
• Abb. 25 : 2D-Gelelektrophorese der Leberproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Coomassie-gefärbte hochauflösende 2D-Gele der an verschiedenen Tagen nach der Infektion aus Leber isolierten 20S Proteasomen. Kreise markieren Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar. (B) Densitometrische Auswertung der in (A) gezeigten Gele zusammen mit den Wiederholungsgelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) an der Proteasomenisolation angegeben. Klammern und Sterne kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05).
• Abb. 26 : 2D-Gelelektrophorese der Dünndarmproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Coomassie-gefärbte hochauflösende 2D-Gele der an verschiedenen Tagen nach der Infektion aus Dünndarm isolierten 20S Proteasomen. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar. (B) Densitometrische Auswertung der in (A) gezeigten Gele zusammen mit den Wiederholungsgelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) an der Proteasomenisolation angegeben. Es waren keine statistisch signifikanten Unterschiede (p < 0,05) zu verzeichnen.
• Abb. 27 : Westernblotanalyse und 2D-Gelelektrophorese der Milzproteasomen aus Wildtypmäusen. (A) Repräsentative Westernblots gegen die Immuno-Untereinheiten. Zum Vergleich sind Westernblots gegen Leberproteasomen vom Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtypmäuse dargestellt (LeK). Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden. (B) 2D-Gel der Milzproteasomen, die am Tag 0 aus Wildtypmäusen isoliert wurden. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar.
• Abb. 28 : Westernblotanalyse der Colonproteasomen aus Wildtypmäusen. Es sind repräsentative Westernblots gegen die Immuno- und konstitutiven Untereinheiten isolierter 20S Proteasomen gezeigt. Zum Vergleich sind Westernblots gegen Leberproteasomen von Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtypmäuse dargestellt (LeK). Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden.
• Abb. 29 : Übersicht des Anteils der Immuno proteasomen in den Präparationen aus Leber und Dünndarm. Densitometrische Auswertung der drei Immuno-Untereinheiten von je zwei bis drei 2D-Gelen. Es ist der prozentuale Anteil der Immunoproteasomen (i20S) angegeben. Zum Vergleich ist die Auswertung der Proteasomen aus den Wildtypmäusen noch einmal gezeigt. (A) Leberproteasomen. (B) Dünndarmproteasomen. Klammern und Sterne kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05).
• Abb. 30 : Westernblotanalyse der Colon- und Milzproteasomen aus Cytokinrezeptor-defizienten Mäusen. Es sind repräsentative Westernblots gegen die Immuno-Untereinheiten isolierter 20S Proteasomen der I-Tiere (grüne Schrift) und T-Tiere (blaue Schrift) gezeigt. Die Coomassie-gefärbten Membranen demonstrieren, dass gleiche Proteasomenmengen eingesetzt wurden. (A) Colonproteasomen. (B) Leberproteasomen von Tag 0 und Tag 6 p.i. der Wildtyptiere als Kontrolle (LeK). (C) Milzproteasomen.
• Abb. 31 : Funktionelle und strukturelle Analyse der Hepatocytenproteasomen. (A) Es werden die normierten Intensitäten nach einer repräsentativen Prozessierung des LLO-Substrates mit 4 h Verdauzeit gezeigt. Punkte (•) markieren reproduzierbare Fragmentzunahmen bezogen auf Ansätze mit Tag 0 Proteasomen. (B) Coomassie-gefärbte 2D-Gele der aus Hepatocyten präparierten Proteasomen. Kreise markieren die Paare aus der konstitutiven und der jeweiligen Immuno-Untereinheit: türkis – iβ1/β1-Paar; rosa – iβ2/β2-Paar; violett – iβ5/β5-Paar.
• Abb. 32 : Expression der Immunoproteasomen in lymphatischen und nicht-lymphatischen Zellen. Es werden Übersichtssaufnahmen der Immunofluoreszenz-Analysen von (A) Leberschnitten und (B) Colonschnitten vom Tag 0 und Tag 2 nach der L. monocytogenes Infektion gezeigt. Die Immunoproteasomen wurden mit einem Antikörper gegen iβ2 gefärbt (grün). Makrophagen wurden durch Färbung des Markerproteins F4/80 nachgewiesen (rot). Die Überlagerung der beiden Färbungen ist orange dargestellt. Die Schnitte der beiden Organe zeigen am Tag 2 p.i. eine deutlich stärkere Expression der Immunoproteasomen als am Tag 0. (Vergrößerung ca. 100x)
• Abb. 33 : Beschleunigter Substratabbau durch Immunoproteasomen. Nach 2 h Verdauzeit des LLO-Substrates wurde die Substratmenge aus den Ansätzen mit den Tag 0 Leberproteasomen der Wildtypmäuse, I- und T-Tiere auf je 100% gesetzt. Hellere Flächen kennzeichnen die Prozessierungsansätze mit Immunoproteasomen.
• Abb. 34 : Auswertung des Antitopes 4-12. (A) Schnittkarte des LLO-Substrates zur Veranschaulichung der Lage des Antitopes 4-12. (B) Normierte und gemittelte Intensitäten des Antitopes 4-12 nach 2 h Verdauzeit mit Leberproteasomen der Wildtyptiere. Sterne (*) kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) bezogen auf den Ansatz mit Tag 0 Proteasomen (konstitutive Proteasomen).
• Abb. 35 : Eichgeraden für ausgewählte Fragmente in verschieden Konzentrations-Zusammen setzungen. Die Fragmentmischungen wurden mit gleichen Mengen LLO-Substrat und internem Standard versetzt und mithilfe der HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch analysiert. Jeder Punkt zeigt die gemessene Intensität bei bestimmter Fragmentmenge pro Probe in einer der insgesamt zwölf doppelt gemessenen Eichlösungen. Die Gerade geht durch die Mittelwerte der Intensitäten für die jeweiligen Fragmentmengen; die Standardabweichungen sind rot eingezeichnet.
• Abb. 36 : Änderung der Schnittpräferenz. Das LLO-Substrat wurde durch konstitutive und Immunoproteasomen degradiert und mittels der HPLC-ESI-Ionenfalle massenspektrometrisch analysiert. Normierte Intensitäten der immunrelevanten Fragmente wurden zu den normierten Intensitäten des Antitopes 4-12 ins Verhältnis gesetzt. (A) Leberproteasomen der I-Tiere (konstitutive Proteasomen). (B) Leberproteasomen der Wildtypmäuse (Tag 0: konstitutives Proteasom; Tag 2 p.i. und Tag 6 p.i.: Immunoproteasomen). (C) Dünndarmproteasomen der Wildtypmäuse (Immunoproteasomen). ♦ – Precursor 4-14; #SYMBOL# – Epitop 6-12; o – Antitop 4-12.
• Abb. 37 : Fragmentgenerierung durch konstitutive und Immunoproteasomen. Das LLO-Substrat wurde 2 h und 8 h mit konstitutiven oder Immunoproteasomen inkubiert. Sämtliche Fragmente (alle Farben) wurden durch die Immunoproteasomen gebildet. Die rote Balken zeigen die Fragmente 6-12 und 17-25, die nicht von den konstitutiven Proteasomen generiert wurden. Die dunkelblaue Balken symbolisieren die Produkte, die durch die Schnitte entstanden sind, welche auch die Fragmente 6-12 und 17-25 betreffen; diese Schnitte sind rot umrandet. Die hellblauen Balken repräsentieren die Fragmente, deren Schnittstellen nicht mit den Fragmenten 6-12 und 17-25 übereinstimmen.
• Abb. 38 : O-GlcNAc Nachweis an 20S Proteasomen. Aus der Zellkulturlinie RMA isolierte Proteasomen wurde in der Gelelektrophorese nach Schagger/vonJagow getrennt, geblottet und mit Coomassie gefärbt. Zu den Inkubationsansätzen mit Lektin oder Antiköper wurde kein (-), 10 mM (+10) oder 500 mM (+500) freies GlcNAc zugegeben. Die mit allen drei Nachweismethoden detektierten Banden sind mit roten Pfeilen gekennzeichnet und beschriftet, wenn sie massenspektrometrisch identifiziert werden konnten. (A) WGA-Lektin; (B) MA1-076 Antikörper; (C) CTD-110.6 Antikörper.
• Abb. 39 : In vivo Markierung mit ¹⁴ C-Glucosamin. RMA-Zellen wurden für die angegebenen Zeiten ohne (-) und mit (+) Cycloheximid in ¹⁴C-Glucosamin-haltigem Medium inkubiert. Die immunopräzipitierten Proteasomen wurden in der SDS-PAGE getrennt. Als Größenkontrolle wurde ³⁵S-markiertes 20S aus humanen Zellen (h) oder den murinen RMA-Zellen (mu) mitaufgetragen.
• Abb. 40 : RT-PCR zur Überprüfung der siRNA-Funktion. RMA-Zellen wurden durch Elektroporation mit 200 pmol, 500 pmol oder 1000 pmol der siRNA gegen NAG (siNAG) oder einer unspezifischen siRNA (siKontrolle) transfiziert. Nach 24 h wurde durch RT-PCR für NAG und Aktin überprüft, ob die Genexpression beeinflusst wurde.
• Abb. 41 : O-GlcNAc Nachweis an Leberproteasomen aus L. monocytogenes infizierten Mäusen. Leberproteasomen der Wildtyptiere vom Tag 0 und Tag 6 p.i. wurden in der Mini-2D-Gelelektrophorese separiert und geblottet. Es sind die Coomassie-gefärbten Membranen und darunter die Färbung der jeweiligen Membran mit MA1-076 Antikörper gezeigt. Kreise markieren die proteasomalen Untereinheiten: türkis – β1; rot –β7; dunkelgrün – α1; orange – α3; violett – iβ5/β5-Paar.
• Abb. 42 : Modell für den Einfluss der reziproken Phosphorylierung/Glycosylierung auf die Interaktionen des 20S Proteasoms. Das in der Infektion ausgeschüttete IFNγ bewirkt eine Dephosphorylierung des 26S Proteasoms, das daraufhin destabilisiert wird und in 20S Proteasom und 19S Regulatoren dissoziiert. IFNγ verursacht möglicherweise die Glycosylierung des freien 20S Proteasoms mit O-GlcNAc, was die Bindung des durch IFNγ induzierten PA28-Komplexes begünstigen könnte. violett – 19S Regulator; grün – α-Untereinheiten; blau – nicht-aktive β-Untereinheiten; rot – proteolytisch aktive β-Untereinheiten; grau – PA28-Komplex; oranger Kreis mit P – Phosphorylierung; rotes Sechseck mit G – Glycosylierung mit O-GlcNAc. (Teile der Abbildung sind (Kloetzel, 2004) entnommen)