Einleitung

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1.1  Zelluläre Magnetresonanztomographie

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Die Magnetresonanztomographie ist eine nicht-invasive Bildgebungsmodalität, deren Bilderzeugung auf dem magnetischen Spin von Atomkernen mit ungeraden Protonenzahlen beruht. Unter diesen Atomkernen eignen sich Protonen aufgrund ihres hohen gyromagnetischen Verhältnisses und der daraus resultierenden hohen Signalintensität und ihres ubiquitären Vorkommens zur Bildgebung von organischen Strukturen am besten. Die Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT) ermöglicht sowohl im Menschen als auch im Kleintiermodell eine hohe Ortsauflösung, erfordert jedoch eine effiziente magnetische Markierung um eine ausreichende Spezifität für eine zelluläre bzw. molekulare Bildgebung zu gewährleisten. Nuklearmedizinische Techniken wie die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) erlauben im Vergleich zur Magnetresonanztomographie zwar ebenso eine nicht-invasive und hochspezifische Visualisierung, jedoch ist keine ausreichende räumliche Auflösung gegeben [12].

Die maximale räumliche Auflösung in einem kernspintomographischen Bildgebungsexperiment hängt von physikalischen und technischen Faktoren wie der Stärke des statischen Magnetfeldes B0, der Gradientenfeldstärke und der Art der Sende- bzw. Empfangsspule ab. Sie liegt im Falle des hier verwendeten 7 T Kleintier-MRT bei unter 50 µm3. Bei in vivo Experimenten kann diese Auflösung aufgrund des zu kleinen Signal-zu-Rausch Verhältnisses, bedingt durch die Limitationen der Messzeit (maximale Narkosedauer), jedoch nicht realisiert werden. Dabei verhält sich die Signalintensität S0 proportional zur Protonendichte ρ und stellt somit bei gegebener Feldstärke einen unveränderlichen Gewebeparameter dar. Bei der Bildgebung des ZNS in vivo kann somit von maximalen effektiven Auflösungen von 100 µm3 bei einer Feldstärke von 7 T ausgegangen werden. Der Bildkontrast im kernspintomographischen Bildgebungsexperiment ist neben der Protonendichte ρ abhängig von der Spin-Gitter-Relaxation (longitudinale Relaxation, T1) bzw. der Spin-Spin-Relaxation (transversale Relaxation, T2) der durch einen elektromagnetischen Puls (RF-Puls) angeregten Protonenspins. Die longitudinale Relaxation und die transversale Relaxation können mit Exponentialfunktionen beschrieben werden. Die charakteristischen Zeitkonstanten werden als T1-Relaxationszeit (Spin-Gitter-Relaxation) bzw. T2-Relaxationszeit (Spin-Spin-Relaxation) bezeichnet und stellen weitere voneinander unabhängige Gewebeparameter dar. Im realen Bildgebungsexperiment ist jedoch der Zerfall der Phasenkohärenz der Protonenspins nicht nur durch die Spin-Spin-Relaxation bestimmt, vielmehr kommt es zu einer wesentlich schnelleren Dephasierung durch lokale Magnetfeldinhomogenitäten, die resultierende effektive Relaxation wird als T2*-Relaxation beschrieben. Der jeweiligen Bildgebungssequenz kommt neben der Ortskodierung die Wichtung des Bildes nach den oben beschriebenen Kontrastparametern zu.

Die bislang erfolgreichste Strategie zur Schaffung eines zellulären Kontrastes in der Magnetresonanztomographie (MRT) liegt in der Markierung von Zellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln [13, 14, 15, 16]. Die Kontrasterzeugung erfolgt durch die mittelbare Beeinflussung des Relaxationsverhaltens der umgebenden signalgebenden Protonen durch Suszeptibilitätseffekte der superparamagnetischen Magnetite, die den Kern der Nanopartikel bilden [17, 18]. Die Magnetite besitzen ein eigenes lokales magnetisches Moment, dies führt zu Inhomogenitäten innerhalb des angelegten äußeren Magnetfeldes B0. Nach dem Anregungspuls (RF-Puls) kommt zu einer schnelleren Dephasierung des Spins der umgebenden Protonen, dies resultiert in einer Reduktion der transversalen Relaxationszeit und somit zu Signalauslöschungen in T2- und T2*-gewichteten Bildgebungssequenzen. Eisenoxidpartikel bewirken zwar auch eine Reduktion der longitudinalen (T1) Relaxation, jedoch sind sie in ihrer T1-Kontrastverstärkung reinen T1-Kontrastmitteln wie z.B. Gadoliniumderivaten unterlegen [19]. Die Dephasierung durch die superparamagnetischen Magnetite geht in ihrer Wirkung räumlich weit über die direkt benachbarten Wasserprotonen hinaus. Es kommt zu einem „blooming effect“, d.h. das Volumen der Signalauslöschungen übersteigt das tatsächliche Volumen der Eisenoxidnanopartikel bzw. der mit diesen Partikeln markierten Zellen [14]. Die Dephasierung der Protonenspins wird von dem Rephasierungspuls in einer T2-gewichteten Sequenz jedoch zum großen Teil wieder aufgehoben. Somit ist die Sensitivität der T2*-gewichteten Gradientenechobildgebung, bei der auf den Rephasierungspuls verzichtet wird, insgesamt als wesentlich größer anzusehen. Jedoch bietet die T2-gewichtete Bildgebung den großen Vorteil eines besseren morphologischen Kontrastes und einer größeren Unempfindlichkeit gegenüber Bildartefakten, die zum großen Teil ebenfalls durch Magnetfeldinhomogenitäten bedingt sind.

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Die verschiedenen Typen von superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln, seien es USPIO (ultra small superparamagnetic iron-oxide-particles), MION (monocrystalline iron oxide nanoparticles) [20] oder VSOP (very small superparamagnetic iron-oxide-particles) [21] unterscheiden sich zum einen in der Größe ihres Kerns, zum anderen in der Zusammensetzung ihrer Hülle, die zur Abschirmung des Kerns vom umgebenden Medium bzw. Zytosol nötig ist. Mittels des Ansatzes der magnetischen Markierung von Zellen mit Eisenoxidnanopartikeln erfolgte die kernspintomographische Visualisierung der markierter Zellen zunächst in vitro [22] sowie ex vivo [23, 24]. Es konnte mit dieser Methodik nicht-invasiv zelluläre Migration dargestellt werden [23]. In späteren in vivo Studien konnte z.B. in einem Rattenmodell der cerebralen Ischämie mittels zellulärer Magnetresonanztomographie die Migration magnetisch markierter Stammzellen von der contralateralen Hemisphäre zum Ort der ischämischen Läsion gezeigt werden [25]. In das Gebiet molekularer Magnetresonanztomographie fällt z.B. die kernspintomographische Darstellung spezifischer Genexpression in vivo [26]. Auch die Anreicherung von systemisch injizierten Stammzellen aus dem Knochenmark in einem Modell einer corticalen Läsion [27] konnte kernspintomographisch dargestellt werden, sogar die Messung der Migrationsgeschwindigkeit magnetisch markierter Zellen aus der subventrukulären Zone war mittels zellulärer Magnetresonanztomographie möglich [28].

1.2 Morbus Parkinson und Stammzelltherapie

Das idiopathische Parkinson-Syndrom gehört mit einer Inzidenz von über 1,8 ‰ in der Gesamtbevölkerung und 10 ‰ in der Gruppe der über 65-Jährigen zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen [29]. Das Erkrankungsalter liegt meist zwischen 40 und 60 Jahren, wobei das Alter selbst keinen ursächlichen Faktor darstellt. Die Ätiologie des Morbus Parkinson ist noch unbekannt, es gibt keine Befunde für eine immunologische oder virale Beteiligung. Eine genetische Ursache (Parkin-Gen) und Erblichkeit ist nur bei einem kleinen Teil der Patienten festzustellen.

Als klinische Leitsymptome zeigen sich Tremor, Akinese und Rigor, dazu kommen depressive Verstimmungen und vegetative Begleitsymptome. Neuropathologisch zeigt sich eine fortschreitende, symmetrische Degeneration vor allem der dopaminergen Neuronen der Pars compacta der Substantia Nigra. Jedoch finden sich darüber hinaus auch Zelluntergang und Gliose in dem noradrenergen Locus coeruleus, im dorsalen Vaguskern, in der cholinergen Substantia innominata sowie im serotonergen Raphekern. Gleichzeitig treten in den überlebenden Nervenzellen der betroffenen Regionen verstärkt sogenannte Lewy-Körperchen auf. Dies sind eosinophile, konzentrische zytoplasmatische Einschlüsse, die das Protein α-Synuklein enthalten. Der Nachweis der Lewy-Körperchen in diesen Lokalisationen ist Voraussetzung für die histopathologische Diagnose dieser Krankheit. Da Lewy-Körperchen jedoch auch in anderen Bereichen des Gehirns, wie dem Hirnstamm und der Hirnrinde beschrieben wurden und sich auch bei ca. 10 % der gesunden älteren Menschen finden lassen, bleibt ihre Bedeutung hinsichtlich der Ätiologie des Morbus Parkinson bislang ungeklärt.

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Das Striatum zählt zu den Basalganglien. Es gehört zum extrapyramidalen System. Striatum und Substantia nigra stellen ein wichtiges Bindeglied zwischen dem assoziativen und dem motorischen Großhirn dar. Funktionell bilden sie mit den anderen Basalganglien einen motorischen Regelkreis und sind für die Feinabstimmung der Bewegungen verantwortlich. Die dopaminergen Neurone der Substantia nigra projizieren direkt in das Striatum. Durch ihren Untergang kommt es dort zu einem Dopaminmangel, dies führt zu einer fortschreitenden Dysfunktion des motorischen Regelkreises und somit zu der motorischen Symptomatik. Der striatale Dopaminmangel lässt sich durch medikamentöse Gabe des Dopaminprekursors L-Dopa zu Beginn der Erkrankung ausgleichen. Der fortschreitende Zellverlust in der Substantia nigra im späteren Verlauf der Krankheit kann jedoch von dieser symptomatischen Therapie nur noch bedingt ausgeglichen werden, zusätzlich kommt es bei höheren Dosen von L-Dopa zu erheblichen Nebenwirkungen. Somit ist eine große Notwendigkeit eines restaurativen Ansatzes gegeben. Einen vielversprechenden Therapieansatz stellt die Transplantation von dopaminausschüttenden Zellen in das Striatum dar [2, 30]. Eine Wiederherstellung des motorischen Regelkreises ist jedoch nur dann möglich, wenn es zu einer funktionellen Integration der transplantierten Zellen kommt, d.h. zur Bildung von axonalen Verbindungen zu den striatalen Neuronen des Empfängers. Nur Stammzellen besitzen die dazu nötige Plastizität, sich in existierende neuronale Strukturen zu integrieren und zu dopaminergen Neuronen zu differenzieren. Experimentelle Studien an Tiermodellen des Morbus Parkinson zeigen, dass sowohl embryonale Stammzellen [1, 2], adulte Stammzellen [31] als auch fötale Mittelhirnzellen [32, 33] dazu in der Lage sind. Embryonale Stammzellen besitzen im Vergleich zu anderen Stammzellpopulationen jedoch die größte Plastizität [34]. Sie werden aus der inneren Zellmasse der Blastozyste entnommen und verfügen in der Zellkultur über eine nahezu unbegrenzte Teilungsfähigkeit. Sie sind pluripotent, d.h. sie können in alle somatischen Zelltypen mit Ausnahme der Keimzellen differenzieren. Um embryonale Stammzellen in ihrem undifferenzierten Zustand zu halten, sind in der Zellkultur die Zugabe von Differenzierungshemmern und die Cokultur mit Fibroblasten nötig. Nach einer Transplantation von embryonalen Stammzellen in ein Empfängergewebe kommt es aufgrund der Depletion der Differenzierungshemmer zur Differenzierung. Anders als in der Vergangenheit postuliert kommt es jedoch nicht zu einer nennenswerten Beeinflussung der Differenzierung durch den Phänotyp der umgebenden Wirtszellen, jedoch zeigte sich eine Anhängigkeit der neuronalen Differenzierung von der Zelldichte des Transplantates [1]. Um den Anteil insbesondere der dopaminergen Neuronen zu erhöhen, der bei der ungerichteten Differenzierung in vitrobei weniger als 2 % liegt [35], ist es sinnvoll, die embryonalen Stammzellen vor der Transplantation in vitro bis zum Stadium von neuronalen oder sogar dopaminergen Vorläuferzellen zu differenzieren. Neben der Erhöhung der Rate an neuronalen bzw. dopaminergen Zellen ist eine Vordifferenzierung jedoch insbesondere im Zusammenhang mit dem erheblichen Risiko der Entstehung von Teratomen nach der Transplantation von undifferenzierten Stammzellen von hoher Wichtigkeit. Häufigkeiten der Teratomentstehung in Tiermodellen von bis zu 20 % haben humane klinische Transplantationsstudien bislang verhindert [36, 37]. Insbesondere ist zu bemerken, dass bei den meisten Transplantationsstudien bei Tiermodellen des Morbus Parkinson eine Xenotransplantation durchgeführt wurde, d.h. embryonale Stammzellen der Maus wurden in das Striatum von Ratten transplantiert. Bei Transplantationen allogener Zellen, wie selbstverständlich in zukünftigen humanen Studien, liegt das Risiko einer Teratomentstehung nochmals höher [38]. In jüngsten Studien konnte jedoch durch die neuronale Differenzierung der embryonalen Stammzellen in Verbindung mit der Applikation von Mitosehemmern eine Teratomentstehung verhindert werden [39]. Zur neuronalen Differenzierung existieren eine Reihe von Differenzierungsprotokollen, die entweder auf der zeitlich definierten Zugabe von Wachstumsfaktoren oder der Cokultivierung mit stromalen Zellen beruhen. Hier wurde das fünfschrittige Differenzierungsprotokoll von Lee et al. verwendet [35].

1.3 Cerebrale Ischämie und Stammzelltherapie

Schlaganfälle stellen die dritthäufigste Todesursache und die führende Ursache dauernder Invalidität dar. 80 % der Schlaganfälle sind ischämische Infarkte, d.h. Durchblutungsstörungen, die zur Ischämie in umschriebenen Gefäßterritorien des Gehirns führen. Das Gehirn ist auf eine kontinuierliche Sauerstoffversorgung angewiesen, da sein Energiestoffwechsel ausschließlich auf aerober Glykolyse basiert, es finden sich fast keine Sauerstoff und Glukosevorräte im Hirnparenchym. Bei einem Unterschreiten der Ischämieschwelle der lokalen Hirndurchblutung kommt es aufgrund der reduzierten Sauerstoffversorgung zu neurologischen Funktionsstörungen. Der zelluläre Funktionsstoffwechsel wird zunächst reversibel eingestellt. Bei einer weiteren Reduktion des pO2 und Unterschreitung der Infarktschwelle kommt es zum Zusammenbrechen des Strukturstoffwechsels der Hirnzelle. Die zelluläre Integrität kann nicht mehr aufrechterhalten werden, die Zelle stirbt. Zur Festlegung der Ischämie- bzw. Infarkschwelle dient der zerebrale Blutfluss (CBF), dem Quotienten von Perfusionsdruck und Gefäßwiderstand. Der CBF-Bereich zwischen Infarkt- und Ischämieschwelle wird als Penumbra bezeichnet. Die Penumbra ist somit für die Therapie des ischämischen Schlaganfalls von besonderer Bedeutung, insbesondere auch für die zellbasierte regenerative Therapie. Die Ausdehnung der Penumbra kann durch diffusionsgewichtete MRT abgeschätzt werden, eine Abgrenzung zum Infarktareal bleibt jedoch schwierig.

Die Lokalisation des Gebietes der Minderperfusion im ZNS ist durch das Versorgungsgebiet der thrombosierten, das Hirngewebe penetrierenden Arterie bestimmt. Besonders häufig von Thrombosen betroffen ist die Arterie cerebri media (MCA), das Mediasymptom zeigt sich klinisch als armbetonte Hemiparese, Hemipaesthesie und Aphasie. In der vorliegenden Studie wurde in einem Mausmodell mittels einer transienten Okklusion der MCA mittels eines Fadens ein Mediainfarkt induziert.

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Auch bei der Therapie der cerebralen Ischämie wird einem zellbasierten Ansatz großes Potential beigemessen. So konnte gezeigt werden, dass Progenitorzellen aus dem Knochenmark sowohl nach direkter intracerebraler als auch nach systemischer Injektion zum Randbereich des Infarkts migrieren. Dort führen sie zu einer Aktivierung endogener Reparaturmechanismen, im speziellen zur Aktivierung der Angiogenese, Neurogenese und Synaptogenese [40, 41]. Jüngste Studien zeigen darüber hinaus, dass transplantierte exogene Progenitorzellen aus dem Knochenmark zur Aktivierung und Migration endogener neuronalen Stammzellen führen [42]. Neben Stammzellen haben auch mononukleäre Zellen restauratives Potential sowohl in experimentellen Modellen der cerebralen Ischämie [43], als auch - nach ihrer Differenzierung zu endothelialen Progenitorzellen - in Modellen vaskulärer Läsionen [44].

1.4 Zielsetzung der Arbeit

Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit sollte sein, sowohl die zelluläre magnetische Markierung zu optimieren, als auch den Einfluss dieser Markierung auf die Biologie der Zelle zu evaluieren. Es muss ausgeschlossen werden, dass die Beladung der Zellen mit Eisenoxidpartikeln die Viabilität und Differenzierungsfähigkeit der Stammzellen negativ beeinflusst. Eisen bzw. Eisenoxid interagiert mit einer ganzen Reihe von metabolen Stoffwechselwegen. Eine Erhöhung der zellulären Eisenkonzentration kann zu einem Anstieg der oxidativen Belastung der Zelle führen, zum oxidativen Stress. Insbesondere die Genese neurodegenerativer Erkrankungen wie z.B. Morbus Parkinson wird mit einer Erhöhung der oxidativen Belastung der Zellen in Zusammenhang gebracht [45, 46]. Bei einer intracerebralen Injektion eisenoxidmarkierter Zellen könnten sowohl die markierten Zellen selbst als auch im Falle der Lyse die Zellen des Empfängergewebes beeinträchtigt werden [47]. Um einen direkten Kontakt mit dem Zytosol zu vermeiden, ist der Eisenoxidkern der meisten Partikel mit polymerem Dextran oder monomerem Zitrat umhüllt, jedoch kann eine Metabolisierung dieser Hülle nicht ausgeschlossen werden [48]. Darüber hinaus muss im Falle der Transplantation embryonaler Stammzellen sichergestellt sein, dass die Differenzierungsfähigkeit der Stammzellen und damit die funktionelle Restaurierung neuronaler Strukturen im ZNS des Empfängers gewährleistet bleiben.

In allen bisherigen bildgebenden Transplantationsstudien wurden eine große Anzahl (105-106) magnetisch markierter Zellen transplantiert und visualisiert. Für ein besseres Verständnis der Migrationsdynamiken und zur Visualisierung systemisch injizierter Zellen ist es jedoch von großer Bedeutung, auch kleinere Zellzahlen (< 1000 Zellen) MR-tomographisch spezifisch zu erkennen. Die Sichtbarmachung einzelner magnetisch markierter Zellen konnte in vitrobereits nachgewiesen werden [49, 15].Über das Detektionslimit magnetisch markierter Zellen in vivo existieren jedoch nur Schätzungen. Die vorliegende Arbeit versucht im zweiten Abschnitt mittels Höchstfeld-MR-Bildgebung bei 17,6 T in Verbindung mit einer effektiven magnetischen Markierung die Grenzen der kernspintomographischen Bildgebung magnetisch markierter Stammzellen im lebenden Gehirn der Ratte zu bestimmen. Darüber hinaus wird auf die Feldstärkenabhängigkeit des Detektionslimits eingegangen, dies ist insbesondere im Hinblick auf die klinische Umsetzbarkeit der Methodik von Bedeutung.

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Der dritte und vierte Teil der vorliegenden Studie soll zeigen, ob sich durch die Anwendung der oben beschriebenen Methodik der zellulären MR-Bildgebung biologisch bzw. therapeutisch wichtige Fragen der regenerativen Medizin beantworten lassen. Dabei sollte der Schwerpunkt im Falle der intrastriatalen Injektion magnetisch markierter embryonaler Stammzellen im Rattenmodell des Morbus Parkinson in dem Versuch der kernspintomographischen Detektion der exogenen Zellen über einen möglichst langen Zeitraum liegen. Es ist noch ungeklärt, wie lange sich magnetisch markierte Zellen in vivo visualisieren lassen. Ergänzt werden soll die Studie durch funktionelle Untersuchungen, um den restaurativen Effekt der Stammzelltransplantation zu erfassen. Darüber hinaus soll eine umfassende Histologie die Quelle von beobachteten kernspintomographischen Signalveränderungen zweifelsfrei klären und den Phänotyp der Stammzellen nach eventueller Differenzierung im Wirtsgewebe bestimmen.

Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit soll der Frage nachgegangen werden, ob mittels Magnetresonanztomographie eine Visualisierung systemisch injizierter mononukleärer Zellen in einem Mausmodell der cerebralen Ischämie möglich ist. Dabei ist der Ort der Anreicherung der Zellen unbekannt, die Zellen müssen von der akuten Pathologie sicher abgegrenzt werden. Es soll versucht werden, mittels Magnetresonanztomographie die Dynamik der Anreicherung der exogenen Zellen im Bereich der ischämischen Läsion zu erfassen.


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07.11.2006