Material und Methoden

2.1  Zelllinien und Methoden der Zellkultur

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Embryonale Stammzellen (ESC). Murine embryonale Stammzellen (ESC) (CRL-1934, ATCC, Manassas, USA) wurden in DMEM-Medium mit 30 % durch Fibroblastenzellen (Feederzellen) (CRL-1503, ATCC) konditioniertem Medium, 15 % fötalem Kälberserum (PAA, Pasching, Österreich), 15 ng / ml Leucemia Inhibitory Factor (LIF) (Sigma-Aldrich, München), 0,1 mM 2-Mercaptoethanol und 1 % Penizillin-Streptomyzin (Sigma-Aldrich) kultiviert. Die Zellen wurden in 75 cm2 Zellkulturflaschen in Zelldichten von 1,5 × 106 Zellen / 20 ml Medium bei 37° C und 5 % CO2 gehalten und alle zwei Tage passagiert. Für die Experimente wurden nur undifferenzierte und nicht adhärente Zellen verwendet. Die Vitalität der ESC wurde wie auch bei allen folgenden Zelllinien durch Inkubation mit Trypan-Blau-Lösung (4 %) (Sigma-Aldrich) für drei Minuten bestimmt, die vitalen Zellen wurden in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Differenzierung der embryonalen Stammzellen zu neuronalen Vorläuferzellen wurde in einem fünfschrittigen Protokoll nach Lee et al. [35] durch die Depletion der Differenzierungshemmer und die Zugabe von Wachstumsfaktoren induziert. Die Identifizierung des Differenzierungsstadiums erfolgte über stadiumsspezifische primäre Antikörper. Dies sind stammzellspezifische Antikörper (Anti-SSEA1) (Sigma), Antikörper gegen frühe neuronale Marker (Anti-Nestin, Anti β III-Tubulin) (beide von Sigma) und Antikörper gegen dopaminerge Marker (Anti-Tyrosin-Hydroxylase) (Sigma).

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Makrophagen. Die Makrophagenzelllinie RAW 264.7 der Ratte wurde in RPMI-Medium (PAA) mit 10 % fötalem Kälberserum (PAA) und 1 % Glutamax (Gibco, Karlsruhe) bei 37° C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden alle zwei Tage passagiert, die eingesetzte Zelldichte betrug 4 × 104 Zellen / cm2.

Mononukleäre Zellen der Milz (MNC). Adulten 129/SV Mäusen (Bundesinstitut für Risikobewertung, BfR Berlin) bzw. C57/B6-GFP Mäusen, die GFP (green fluorescent protein) unter Kontrolle des chicken-β-actin-Promotors und des Cytomegalovirus Enhancers exprimieren [50], wurde die Milz explantiert und mechanisch aufgeschlossen. Die mononukleären Zellen wurden mit einem Ficoll Gradienten isoliert (Lympholite-M, Cedarlane). Die Zellen wurden von der AG Endres zur Verfügung gestellt.

Humane mononukleäre Zellen aus der Nabelschnur (HUCB). Proben von HUCB wurden aus verschiedenen Krankenhäusern in Leipzig unter Einhaltung der ethischen Richtlinien erhalten. Zusätzlich wurden Proben von der Nabelschnurblutbank VITA34 im Rahmen einer Kooperation bezogen. Die mononukleären Zellen wurden mit einem Ficoll-Paque PLUS Gradienten (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) isoliert. Die Zellen wurden von Johannes Boltze, AG Prof. Emmrich, Leipzig zur Verfügung gestellt.

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Mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark der Ratte (MBM). 11 männliche Wistar Ratten mit einem Körpergewicht zwischen 275 und 320 g wurden in CO2 getötet. Der Femur und die Tibia wurden entnommen und an beiden Enden eröffnet. Das Knochenmark wurde mit einer Spritze mit einer 21G Injektionsnadel herausgespült und bis zur Separation in RPMI 1640 Medium (Biochrome, Berlin) suspendiert. Die Separation der mononukleären Zellen erfolgte wie bei den HUCB. Die Zellen wurden von Johannes Boltze, AG Prof. Emmrich, Leipzig zur Verfügung gestellt.

Primäre Mittelhirnzellen der Ratte (E 14). Diese Zellen wurden im Rahmen einer Kooperation von Herrn Peer Lorenz zur Verfügung gestellt und nur für die initialen Aufnahmestudien verwandt.

2.2 Magnetische Markierung von Zellen

Zur magnetischen Markierung der Zellen wurden die Eisenoxidnanopartikel very small superparamagnetic iron oxide particles (VSOP C200, Ferropharm, Teltow) benutzt [51]. Die VSOP C200 Eisenoxidnanopartikel bestehen aus einem Eisenoxidkern mit einem Durchmesser von 5 nm, ähnlich den USPIO. VSOP sind mit einer Hülle aus monomerem Zitrat umgeben, der resultierende hydrodynamische Durchmesser beträgt 11 nm und sie tragen eine saure Oberflächenladung. Dieser hydrodynamische Durchmesser ist wesentlich kleiner als der Durchmesser der USPIO von 30-40 nm. Für die Confokale Laser Scanning Mikroskopie wurde ein Teil der Partikel mit dem fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin-Succimidylester-Hydrochlorid (Molecular Probes, Eugene, USA) konjugiert.

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Tabelle 1: Physikochemische Eigenschaften des Eisenoxidnanopartikels VSOP C200

Hüllstruktur

Zitrat Monomer

Kern

Eisenoxid

Kerndurchmesser

5 nm

Hydrodynamischer Durchmesser

11 nm

R1

22,5 l/mmol*s (bei 0.47 T)

R2

49,7 l/mmol*s (bei 0.47 T)

R1/R2

0,45

Die Inkubation der Zellen erfolgte direkt in den Zellkulturflaschen. Die Eisenoxidnanopartikel VSOP wurden in unterschiedlichen Konzentrationen in das Kulturmedium pipettiert Die Inkubation erfolgte über 90 min bei 37° C und 5 % CO2. Nach der Inkubation wurden die Zellen geerntet und bei 1500 UPM (bei embryonalen Stammzellen 1000 UPM) zentrifugiert (Labofuge 400R, Heraeus-Sepatech, Osterode) und zweimal in PBS gewaschen.

Zur confokalen Laser-Scanning Mikroskopie wurden 1 × 105 embryonale Stammzellen in 3 ml Stammzellmedium ohne den Differenzierungshemmer LIF in 6-Loch-Platten (Falcon, BD Biosciences) ausgesät. Nach 24 h waren die meisten embryonalen Stammzellen adhärent. Es wurden nun Rhodamin-Grün-markierte VSOP Eisenoxidnanopartikel (Konjugation der Partikel siehe oben) in einer Konzentration von 1,5 mM dazugegeben und 1,5 h bei 5 % CO2 und 37° C mit den Zellen inkubiert. Nach 45 min Inkubationszeit wurde zusätzlich der Fluoreszenzfarbstoff Di-8-ANEPPS (Molecular Probes), der spezifisch sowohl die äußere Zellmembran als auch intrazelluläre Membranen anfärbt, hinzupipettiert. Nach 1,5 h wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen um nicht aufgenommenen Eisenoxidnanopartikel und überschüssigen Fluoreszenzfarbstoff zu entfernen.

2.3 NMR-Relaxometrie und Atom-Absorptions-Spectroskopie (AAS)

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Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit Eisenoxidnanopartikeln inkubiert und gewaschen. Nach der Bestimmung der Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer wurden die Zellen in PBS resuspendiert. Zwei Milliliter mit 0,6 × 106 Zellen wurden in ventilierte 14-ml Gefäße (Falcon, BD Biosciences, San Jose, USA) auf Eis gestellt. Die transversale Relaxationszeit (T2-Zeit) der Zellsuspension wurde durch den exponentellen Fit des Signalabfalls einer Turbospin-Mulitechosequenz im Relaxometer (Minispec, Bruker, Ettlingen) bei 0,49 T bestimmt. Nach der Relaxometermessung wurde der Zellsuspension 1 ml HNO3 (Merck, Darmstadt) und 10 µl H2O2 (Merck) zugegeben und die Zellen somit lysiert. Die lysierte Zellsuspension wurde gefiltert und der Eisengehalt durch Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS) (Solaar, Unicam, Cambridge, UK) quantifiziert.

2.4 Confocale Laser-Scanning Mikroskopie

Das wichtigste Charakteristikum des confocalen Laser-Scanning Mikroskops (CLSM) (Leica) besteht im Gegensatz zu konventionellen Fluoreszenzmikroskopen in der genauen Festlegung der Focusebene. Vom Laser generiertes Licht definierter Wellenlänge wird über zwei galvanometrische Spiegel als beugungsbegrenzter Lichtpunkt durch das Objektiv sequentiell auf das Präparat fokussiert. Aus der Focusebene emittiertes Licht gelangt über einen Scanner zu verschiedenen Farbteilern, wo die Fluoreszenzemission wellenspezifisch diskriminiert und pixelweise auf die Detektoren (Photomultiplier) verteilt wird. Bei der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie tragen neben dem emittierten Licht aus der Focusebene alle Photonen, die ober- und unterhalb der focalen Ebene emittiert werden, zur Bildentstehung bei. Beim CLSM ermöglicht eine variable Lochblende die ausschließliche Detektion von Licht aus der focalen Ebene, während alle Photonen, die nicht aus der Ebene stammen, wirkungsvoll ausgeblendet werden. Somit ist eine genaue räumliche Lokalisation subzellulärer Strukturen in allen drei Raumrichtungen möglich.

Zur intrazellulären Lokalisation der Rhodamin-Grün-markierten Eisenoxidnanopartikel wurden die Stammzellen nach der Inkubation (siehe oben) mittels eines 20-fachen Immersionsobjektiv (NA 0,5, Leica) untersucht. Es wurden zwei Frequenzkanäle simultan detektiert, der erste Kanal (510 - 560 nm) beinhaltet das Emissionsmaximum von Rhodamin-Green, der zweite Kanal (610 - 670 nm) das Emissionsmaximum von Di-8-ANEPPS.

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Zur Detektion der GFP-positiven exogenen Zellen in situwurden ebenfalls zwei Fluoreszenzkanäle simultan aufgenommen. Der erste Kanal (500 - 550 nm) beinhaltet das Emissionsmaximum des GFP bei 508 nm. Der zweite Kanal (610 - 670 nm) beinhaltet das Emissionsmaximum des rot fluoreszierenden Sekundärantikörpers (Sigma) zur Phänotypisierung.

2.5 Präparation der Gelphantome

Zur Herstellung der Gelphantome für die in vitroMRT-Studien wurde 1,5 g Agar (Qbiogene, Heidelberg) in 100 ml TBE-Puffer (Qbiogene) gelöst. Die Suspension magnetisch markierter Zellen wurde entweder in das Gel injiziert (Injektionsphantom), oder die Zellen wurden in dünnen Schichten in das Gel eingebracht (Schichtphantom). Für die Injektionsphantome wurden 12 ml des heißen Gels in 15 ml Falcon Gefäße gegossen und unmittelbar danach bei 3000 UPM für 5 min zentrifugiert um Luftblasen zu entfernen. 2 µl der Zellsuspension mit definierter Zellzahl (Bestimmung der Zellzahl siehe oben) wurden mittels einer Hamilton Microspritze, ausgestattet mit einer 26iger Nadel in das Gel injiziert. Nach der Injektion wurde die Nadel vorsichtig retrahiert. Pro Gel wurden vier Injektionen durchgeführt. Die Gele wurden bei 800 UPM für 4 min zentrifugiert, um Luftblasen aus den Injektonskanälen zu entfernen.

Zur Herstellung der Schichtphantome wurden 20 ml der flüssigen 1,5 %igen Agarose in ein 50 ml Falcon gegossen und sofort bei 3000 UPM für 4 Minuten zentrifugiert. Nach dem Erhärten der ersten Schicht wurde die benötigte Zahl vitaler Zellen (100, 1.000 oder 10.000 Zellen) in 50 µl Medium aufgenommen und mit 50µl flüssiger Agarose vermischt. Dabei sollte die Agarose zwar flüssig aber dennoch so kühl wie möglich sein, um eine sofortige Lyse der Zellen zu verhindern. Diese 0,75 % -ige Agarose-Zellsuspension wurde auf die ausgekühlte Grundschicht pipettiert und sofort für 4 Minuten bei 3000 UPM zentrifugiert. Nach dem Abkühlen folgte eine weitere Agaroseschicht, auf die eine zweite Zellschicht wie oben beschrieben aufgebracht wurde. Insgesamt wurden bis zu vier Zellschichten in ein Gelphantom eingebracht.

2.6 Bestimmung der zellulären oxidativen Belastung

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Als Maß für den zellulären oxidativen Stress wurden sowohl die Konzentrationen von Malondialdehyd (MDA), einem Zwischenprodukt der Lipidperoxidation, und Proteincarbonylen, den Produkten der Proteinoxidation gemessen [52]. Zusammengefasst wurden die Zellsuspensionen in Gegenwart von 2-Thiobarbitursäure und butyliertem Hydroxytoluol für 60 min gekocht. Anschließend wurde die Reaktion durch Kühlung der Proben in einem Eisbad gestoppt. Vor der HPLC- (High Performance Liquid Chromatography) Analyse wurden die Proben neutralisiert. Die Proben wurden in einem isokratischen RP-(Reversed Phase) HPLC-System unter Verwendung eines Kaliumphosphat-Puffer / Methanol-Elutionsmittels analysiert. Dafür wurde eine Supercosil 150 x 4 mm LC-18-S (5 µm) Säule benutzt. Der Nachweis erfolgte über Fluoreszenzmessung (Anregung: 525 nm, Emission: 550 nm). Die Bestimmung des oxidativen Stress erfolgte in Kooperation mit der AG PD Dr. Grune, Universität Düsseldorf.

2.7 6-OHDA-Läsion der Ratte

Es wurde eine linksseitige, unilaterale, MFB-(middle forebrain bundle) Läsion durchgeführt.

Die Ratten wurden mit einem Gewicht von 180 bis 200 g lädiert. Die Narkotisierung der Tiere erfolgte durch intraperitoneal appliziertes Pentobarbital (Dosis 32 mg / kg KG, Substanz in 0,9 % NaCl-Lösung). Nach Rasur und Desinfektion der Kopfhaut wurden die Tiere in einem stereotaktischen Rahmen (David Kopf Instruments, Tujunga, USA) platziert und durch die Interauralstifte und den Incisorstift fixiert. Anschließend erfolgte die linksseitige, paramediane Inzision der Kopfhaut und die Freilegung des Periostes. Entsprechend den nachfolgend aufgeführten stereotaktischen Koordinaten für die striatalen Läsionspunkte wurde der Schädelknochen über der betreffenden Hirnregion, also gemäß den anterioren (A) und lateralen (L) Koordinaten, mittels eines Dentalbohrers trepaniert.

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Koordinaten MFB in Bezug auf das Bregma nach Paxinos & Watson (1986):

Nach Entfernung der Dura mater unter der Trepanationstelle wurde die an einem stereotaktischen Arm fixierte Injektionskanüle (Außendurchmesser 0,23 mm), die über einen Polyethylenschlauch mit einer Hamilton-Mikroliterspritze des Typs CR 400-20 (Hamilton 21 Company, Reno, USA) verbunden war, langsam durch das Bohrloch in das MFB (entsprechend den ventralen [ V ] Koordinaten) vorgeschoben. Anschließend erfolgte die langsame Applikation (Volumen 2 µl, Applikations-geschwindigkeit 1µl / min) der 6-OHDA-Lösung (3,5 µg / µl, Substanz in 0,9 % NaCl- Lösung mit 0,1 % Ascorbatanteil). Nach Injektion des o.g. Volumens verblieb die Kanüle noch für 2 min in entsprechender Position, bevor sie langsam retrahiert wurde. Die insgesamt applizierte Dosis an 6-OHDA betrug 28 µg. Die Operation endete mit dem Wundverschluß durch einreihige Naht. Postoperativ erhielten die Ratten 50 µl Novaminsulfon (Metamizol-Na, ratiopharm, Deutschland) zur Analgesie. Die 6-OHDA-Läsion wurde von dem Tierarzt Peer Lorenz durchgeführt.

2.8 Stereotaktische Transplantation magnetisch markierter Stammzellen

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Die jeweilige Anzahl magnetisch markierter embryonaler Stammzellen wurde in 2 µl PBS gelöst. Weibliche Wistar-Ratten (Charles River WIGA, Sulzfeld) wurden mit einer Isofluran-Gasnarkose narkotisiert. In tiefer Narkose wurden die Ratten in einen stereotaktischen Rahmen fixiert. Jede Ratte erhielt eine Injektion von 2 µl Zellsuspension mittels einer Hamilton Mikrospritze (1 µl / 2 min) in das Striatum der linken Hemisphäre (stereotaktische Koordinaten vom Bregma: AP -0,5; ML 4,0; DV -5,0). Nach der Injektion wurde die Nadel für 10 min am Injektionsort belassen, anschließend wurde sie langsam retrahiert. Die Operation endete mit dem Wundverschluß durch einreihige Naht. Postoperativ erhielten die Ratten 50 µl Novaminsulfon (Metamizol-Na, Ratiopharm, Deutschland) zur Analgesie.

2.9 Amphetamininduzierte Rotation

Zur Objektivierung der Läsionsstärke intra vitam wurden die Ratten auf ihr substanzinduziertes Rotationsverhalten untersucht.

Die Prüfung erfolgte 4 Wochen post lesionem sowie 10 Wochen nach der Transplantation mit Amphetamin. Dazu wurden die Tiere einzeln in standardisierten, mit einem Bewegungssensor ausgestatteten Rotameterhalbschalen (TSE, Bad Homburg, Deutschland) gesetzt. Die Verbindung der Ratte mit dem Bewegungssensor wurde durch einen semiflexiblen, doppelt gewindelten Stahldraht gewährleistet. Über ein Computerprogramm erfolgte die Berechnung des Netto-Rotations-Asymmetrie (rechts/links)-Scores, ausgedrückt als Körperumdrehung mit einem Drehwinkel ≥ 180 Grad pro Minute. Die Aufzeichnung der Bewegungen / Rotationen erfolgte nach einer 5- minütigen Anflutungsphase für das Pharmakon und wurde für 60 Minuten gemessen. Die Applikation von Amphetamin (Dosis: 2,0 mg / kg KG, Substanz gelöst in 0,9 % NaCl-Lösung, Injektionsvolumen 0,5 ml / kg KG) erfolgte intraperitoneal. Die amphetamininduzierte Rotation wurde in Zusammenarbeit mit dem Tierarzt Peer Lorenz durchgeführt.

2.10 Bildgebungsstudie an einem 6-OHDA-Modell der Ratte

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Insgesamt wurden 13 weibliche Wistar-Ratten in die Studie aufgenommen. Alle Tiere wurden mittels 6-OHDA unilateral läsioniert (siehe oben). 4 Wochen post lesionem wurde das amphetamininduzierte Rotationsverhalten gemessen. Die Tiere wurden in drei experimentelle Gruppen unterteilt. 6 Tieren wurden 1 × 105, einem Tier 1 × 104 magnetisch markierte murine embryonale Stammzellen (ESC) intrastriatal injiziert. Die Stammzellen wurden zuvor stabil mit eGFP transfiziert (Zusammenarbeit mit dem Institut für Immunologie, Charité Campus Mitte). Die intrastriatale Injektion wurde wie oben dargelegt durchgeführt. 6 weitere Tiere dienten als Kontrollgruppe, sie erhielten eine intrastriatale Injektion von physiologischer Kochsalzlösung. Die intrastriatalen Injektionen wurden von dem Tierarzt Peer Lorenz wie oben dargelegt durchgeführt. Die beiden Gruppen mit jeweils sechs Tieren wurden so zusammengestellt, dass die Anzahl der amphetaminduzierten Rotationen / min, summiert über alle Tiere in jeder Gruppe möglichst übereinstimmte.

Alle Tiere wurden insgesamt jeweils 4 Mal kernspintomographisch untersucht, in der 1., der 8., der 16. und der 24. Woche nach Transplantation. Eine kernspintomographische Messung unmittelbar nach Transplantation war nicht möglich, da die Tiere bereits durch den operativen Eingriff zur intrastriatalen Injektion stark geschwächt waren, eine sich anschließende zweistündige Narkose zur kernspintomographischen Bildgebung war unter diesen Umständen abzulehnen.

Um eine funktionelle Restaurierung der dopaminergen Funktionalität zu erfassen, erfolgte 10 Wochen nach Transplantation eine zweite Messung des amphetamininduzierten Rotationsverhaltens.

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6 Monate (24 Wochen) nach Transplantation wurden die Tiere getötet und es erfolgte die histologische Aufarbeitung.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs der Visualisierungsstudie magnetisch markierter embryonaler Stammzellen in einem Rattenmodell des Morbus Parkinson.

2.11 Bildgebungsstudie an einem Mausmodell der cerebralen Ischämie

Allen Empfängermäusen wurde eine Woche vor Induktion der zerebralen Ischämie in tiefer Narkose die Milz entfernt. Die Splenektomie ist nötig, um eine längere vaskuläre Passage der im späteren Verlauf der Studie injizierten exogenen mononukleären Zellen zu gewährleisten. Die Mäuse wurden mittels Isofluran-Gasnarkose anästhesiert. Mittels eines Fadens wurde bei insgesamt 45 Mäusen die linke Arteria cerebri media für 30 min (n = 36 Mäuse) bzw. 60 min (n = 9) okkludiert. Nach der Okklusion wurde der Faden wieder entfernt, es erfolgte eine Reperfusion. Eine Zellsuspension aus 1 × 106 mononukleären Zellen aus der Milz (MNC), gelöst in 200 µl physiologischer Kochsalzlösung, wurde den Mäusen in tiefer Narkose intravenös in die Schwanzvene injiziert. Die operativen Eingriffe wurden von Mitarbeitern der AG Prof. Endres durchgeführt. Insgesamt wurden 45 Mäuse in die Studie aufgenommen. Davon dienten 12 Tiere der histologischen Phänotypisierung der injizierten Zellen. Kernspintomographische Untersuchungen wurden an 33 Tieren durchgeführt. Davon erhielten 20 Mäuse VSOP-markierte MNC, in einer Teilgruppe davon waren die Zellen zusätzlich GFP-transfiziert. 9 Mäuse erhielten nur NaCl ohne Zellen (Kontrolle) und vier Mäusen wurde freies VSOP injiziert. Von diesen wurde zwei Tieren VSOP in der maximal tolerablen Konzentration von 100 µM Fe / kg Körpergewicht injiziert, den anderen zwei Tieren wurde VSOP in einer Konzentration injiziert, die der von 1 × 106 MNC intrazellulär aufgenommenen Eisenmenge entspricht (0,1 µM Fe / kg). Den Mäusen wurden die Zellen 0,5 h, 8 h bzw. 24 h nach der Induktion der cerebralen Ischämie injiziert (siehe Abbildung 3).

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Abbildung 3: Schematischer Überblick über den zeitlichen Ablauf der Induktion der Ischämie (MCAO), der Injektion der mononukleären Zellen (MNC) und der kernspintomographischen Bildgebung.

Beinahe alle Tiere wurden nach der Induktion der cerebralen Ischämie (MCAO), aber vor Injektion der Zellen kernspintomographisch untersucht, lediglich bei Tieren, die bereits 0,5 h nach MCAO die Zellen erhielten, musste darauf verzichtet werden. Darauf folgend wurden alle Tiere in den ersten drei Tagen täglich kernspintomographisch untersucht, gefolgt von 2 Untersuchungen in der Woche bis zum Ende des Experiments nach bis zu 37 Tagen.

2.12 Magnetresonanztomographie bei 1,5 und 7 Tesla

Bildgebung der Ratte bei 1,5 T: Die Bildgebung erfolgte an einem klinischen 1,5 T MR-Tomographen (Siemens Sonata). Die Tiere wurden mittels intraperitonealer Injektion von Ketamin-Rompun narkotisiert. Für die Messung wurde den Tieren die small-loop-Spule (Fingerspule) mittels Klebeband flach auf dem Kopf befestigt. Zur Bildgebung wurden 2D-steady-state-Gradientenechosequenzen verwendet (TR / TE 35,0 / 17,1 ms). Die Akquisitionszeit betrug ca. 20 min, die realisierte räumliche Auflösung 300×300×500 μm.

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Bildgebung der Ratte bei 7 T: Die Bildgebung erfolgte an einem 7 T Kernspintomographen für Kleintiere (Bruker Pharmascan, Ettlingen) mit einer 68 mm Rattenkopfspule. Die Tiere wurden mittels Isofluran und 100 % O2 als Trägergas narkotisiert. Die Lagerung erfolgte auf einem Wärmebett, dieses wurde mit 35° warmem Wasser beheizt. Zur Überwachung der Narkosetiefe während der kernspintomographischen Messung wurde die Atmungsfrequenz der Tiere mittels eines Brustpads (Bruker Bio-Trig) gemessen. Es wurden T2*-gewichtete 2D-Gradientenechoaufnahmen (GRE) (TR / TE = 400,4 / 5,4 ms) mit einer räumlichen Auflösung von 117×117×400 μm und einer Messzeit von 22 min akquiriert. Zusätzlich wurden T2*-gewichtete FLASH 3D steady-state Sequenzen (TR / TE = 15,0 / TE 6,0 ms; Flip Angle (FA) = 30°) mit einer im Vergleich zur 2D-Sequenz höheren räumlichen Auflösung von 161×194×194 μm, jedoch geringerem Signal-zu-Rausch Verhältnis (SNR) und einer Messzeit von 42 min aufgenommen. Zur Berechnung der T2-Karten wurde eine T2-gewichtete Turbospin-Multiechosequenz (TR / TE = 5456 / 8,5 ms) mit acht Echos und einer Auflösung von 137×137×600 μm verwendet.

Bildgebung der Maus bei 7 T: Für die kernspintomographischen Untersuchungen (Pharmascan, Bruker Biospin) wurden die Tiere mit ca. 1 % Isofluran mittels 100 % O2 als Trägergas narkotisiert. Die Mäuse wurden in das Zentrum einer 68 mm Spule platziert. Die Atmung wurde mit einem Bio-Trig-Monitoring-System (Bruker) überwacht. Für die T2-gewichtete Bildgebung wurde eine 2D Turbo Spin-Echo-Sequenz verwendet (TR / TE = 5109 / 65,2 ms). Es wurde eine 1282-Matrix mit einer Auflösung in der Ebene von 156 µm und einer Schichtdicke von 0,4 mm realisiert. Es wurde das gesamte Gehirn exklusive des anterioren Bulbus olfactorius und des Cerebellum erfasst. Für die T2*-gewichtete Bildgebung wurde 2D-Gradientenecho Sequenz (TR / TE = 468,1 / 5,4 ms) verwendet. Die Schichtgeometrie wurde von der T2-gewichteten Sequenz importiert um eine direkte räumliche Korrelation zwischen den beiden Bildgebungssequenzen zu ermöglichen. Lediglich die Matrix wurde aufgrund des besseren Signal-zu-Rausch Verhältnissen auf 1502 erhöht, dies führte zu einer Auflösung in der Ebene von 133 µm. Bei 8 Tieren wurden zusätzlich T2*-gewichtete Bildgebungssequenzen mit längeren Echozeiten von 10,4 und 15,4 ms akquiriert. Die 3D-Volumenrekonstruktion der T2-Hyperintensitäten und T2*-Hypointensitäten wurde mit dem Visualisierungsprogramm AMIRA (T65, San Diego, USA) durchgeführt.

2.13 MR-Bildgebung zum zellulären Detektionslimit bei 17,6 Tesla

Die kernspintomographische Studie wurde an gesunden weiblichen Wistar-Ratten (130 – 150 g) (Charles River) durchgeführt. Die intrastriatale Injektion der magnetisch markierten Stammzellen erfolgte wie oben dargelegt. 17 Tiere wurden transplantiert, davon erhielten 6 Tiere 1000 unmarkierte Zellen und 11 Tiere magnetisch markierte Zellen (1 Tier 120.000; 3 Tiere 1000; 3 Tiere 100 und 4 Tiere 20 Zellen).

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Die kernspintomographische Bildgebung bei 17,6 T wurde mit einem 750 MHz MR-Spektrometer (Bruker, Rheinstetten) mit weiter Bohrung und einem Bildgebungsgradientensystem mit einer maximalen Gradientenstärke von 200 mT / m durchgeführt. Eine 38 mm birdcage-Spule wurde eingesetzt. Die Tiere wurden mittels einer Isofluran-Gasnarkose anästhesiert, Atmung und Herzschlag wurden überwacht. Es wurden mindestens zwei hochaufgelöste 3D-Gradientenecho-Bildgebungsexperimente durchgeführt. Zunächst wurde ein 3D-Datensatz mit einer isotropen Auflösung von 98 µm und einer 2563 Matrix des gesamten Gehirns aufgenommen (TE / TR = 3,0 / 20 ms, Akquisitionszeit 22 min). Nach der Identifikation des Injektionskanals wurde ein zweiter 3D-Datensatz mit einer isotropen Auflösung von 98 µm jedoch einem kleineren field-of-view aufgenommen (TE / TR = 4,6 / 15 ms, Akquisitionszeit 32 min). Das Signal-Rausch-Verhältnis betrug in der grauen Substanz circa 20-30:1. Alle Tiere wurden direkt nach der Transplantation kernspintomographisch untersucht, einige erhielten wiederholte Untersuchungen bis zu 4 Wochen nach der Transplantation.

2.14 Histologie und Immunhistochemie

Detektion embryonaler Stammzellen nach intrastriataler Injektion bei der Ratte. Direkt nach der letzten Bildgebungssequenz wurden die Ratten in tiefer Narkose mit einer Überdosis Pentobarbital getötet und für die Paraffineinbettung perfundiert oder für den Gefrierschnitt präpariert. Für die Gefrierschnitte wurde das Gehirn in flüssigem Stickstoff eingefroren und es wurden 15 µm bzw. 25 µm (Detektion des Stammzellmarkers SSEA1) dicke serielle Schnitte auf einem Jung Kryostaten angefertigt (Leica, Bensheim). Sechs Tiere mit Überlebenszeiten von 3 Wochen wurden mit 250 ml 10 % Phospat-gepuffertem Formalin transkardial perfundiert. Nach Entnahme wurden die Gehirne in Formalin gelagert. Es wurden nach der Einbettung in Paraffin 6 µm dicke serielle Schnitte in der Umgebung des Stichkanals angefertigt. Die Schnitte wurden mit Hematoxylin/Eosin gefärbt, zusätzlich wurde eine Berliner-Blau Färbung zum Eisennachweis durchgeführt. Immunhistochemie wurde mittels der ABC-Methode und primärer Antikörpern gegen GFAP (Sigma), MIB (Ki67) und dem Stammzellmarker SSEA1 (Sigma) durchgeführt. Die Präparation der Schnitte erfolgte in Zusammenarbeit mit der AG Prof. Schober, Leipzig.

Detektion mononukleärer Zellen aus der Milz nach Injektion in ein MCAO-Mausmodell. Innerhalb von 24 h nach der letzten Bildgebung wurden die Mäuse in tiefer Narkose mit einer Überdosis Chlorhydrat getötet und mit 4 % phospatgepuffertem Paraformaldehyd transkardial perfundiert. Mittels eines Mikrotoms (Leica) wurden 40 µm dicke coronale Schnitte angefertigt. Zum Eisennachweis wurde eine Berliner-Blau Färbung durchgeführt. Zur Immunhistochemischen Phänotypisierung der Berliner-Blau-positiven Zellen wurden primäre Antiköper gegen GFP (AdvanceImmunoChemical, Long Beach, USA) (Zur Verstärkung des GFP-Signals), Maus-NeuN (Chemicon, Temecula, USA), GFAP (AdvancedImmunoChemical) und von Willebrand Faktor (Abcam, Cambridge, UK) verwendet. Zur Detektion mittels Confokaler Laser-Scanning-Mikroskopie wurde ein fluoreszierender Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA) verwendet. Die Präparation der Schnitte erfolgte in Zusammenarbeit mit der AG Prof. Endres.


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07.11.2006