Untersuchungen zur magnetischen Markierung von Zellen in vitro durch Eisenoxidnanopartikel

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Fragestellung

Für eine sensitive und spezifische kernspintomographische Visualisierung transplantierter Zellen ist es nötig, einen möglichst hohen Bildkontrast zwischen den Zellen und dem umgebenden Hirnparenchym zu erreichen. Der effektive Bildkontrast sollte sich proportional zur Menge an aufgenommenen Eisen verhalten. Hinsichtlich dieser kernspintomographischen Visualisierbarkeit wäre somit das Ziel, eine möglichst hohe Beladung der Zellen mit den Eisenoxidpartikeln VSOP zu erreichen. Letztendlich soll jedoch dieser Ansatz zellulärer MR-Bildgebung wie oben dargelegt dazu dienen, biologisch bzw. medizinisch relevante Fragestellungen der Transplantationsmedizin zu beantworten. Hierzu muss jedoch gewährleistet sein, dass die magnetische Markierung keinen signifikanten Einfluss auf die Biologie der Zellen ausübt. Natürlich kann nur eine Auswahl an Vitalitäts- und Funktionsparametern überprüft werden. Die Auswahl der Parameter erfolgte jedoch sowohl unter Berücksichtigung des Therapieziels als auch in dem Bewusstsein, dass es am Ort der Transplantation durch die Lyse der transplantierten Zellen zu einer Freisetzung der Eisenoxidnanopartikel und somit zur sekundären Phagozytose durch Wirtszellen kommen kann. Im Einzelnen wurde versucht folgenden Fragen durch in vitroUntersuchungen zu beantworten:

3.1  Magnetische Markierung von Zellpopulationen mit Eisenoxidnanopartikeln VSOP

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Zu Beginn der Studie wurden zwei verschiedene VSOP Eisenoxidnanopartikel hinsichtlich ihrer Eignung zur zellulären magnetischen Markierung miteinander verglichen. VSOP C184 bestehen aus einem Eisenoxidkern mit einem Durchmesser von 4 nm, mit der umgebenden monomeren Zitrathülle ergibt sich ein hydrodynamischer Durchmesser von 7 nm. VSOP C200 hingegen sind bei gleicher Zusammensetzung von Kern und Hülle deutlich größer, der Kerndurchmesser beträgt 5 nm, der hydrodynamische Durchmesser des Partikels inklusive Hülle 11 nm.

Es wurden embryonale Mittelhirnzellen der Ratten mit verschiedenen Konzentrationen der Eisenoxidnanopartikel für 90 min inkubiert. Die Inkubationszeit von 90 min hatte sich in früheren Studien der Arbeitsgruppe als am besten geeignet herausgestellt [51], somit wurden zu Beginn dieser Arbeit 90 min als Anfangswert ausgewählt. Um die Effektivität der magnetischen Markierung zu quantifizieren, wurde die charakteristische Zeitkonstante der transversalen Relaxationszeit (T2-Zeit) der Zellsuspension mittels NMR-Relaxometrie gemessen. Als Kontrollwert dienten unmarkierte Zellen in gleicher Zellzahl, dies wurde auch in den nachfolgenden Zellaufnahmestudien beibehalten. Es zeigte sich sowohl nach Inkubation mit den Partikeln VSOP C200 als auch mit den Partikeln C184 eine signifikante Reduktion der T2-Zeit nach Inkubation mit 1,5 mM Substanz (Abbildung 4). Zwischen den beiden Partikeln zeigten sich bei einer Inkubation mit 3 bzw. 6 mM ein signifikanter Unterschied, die Partikel C200 führen zu wesentlich geringeren T2-Zeiten der jeweiligen Zellsuspension, es findet sich eine inverse Proportionalität zwischen der Inkubationskonzentration und der transversalen Relaxationszeit, wohingegen bei den Partikeln C184 Sättigung vorliegt. Für die weiteren Studien wurden somit die Eisenoxidnanopartikel VSOP C200 für die magnetische Markierung der Zellen ausgewählt, zumal sich keine Unterschiede zwischen den Partikeln hinsichtlich der Vitalität der Zellen zeigten.

Abbildung 4: Inkubation primärer embryonaler Mittelhirnzellen der Ratte (E 14) (2,5 × 106 Zellen pro Ansatz) mit zwei verschiedenen zitratbeschichteten Eisenoxidnanopartikeln VSOP C184 und VSOP C200.

Die Inkubation erfolgte bei 37°C im Schüttelinkubator für 90 min. Es sind wie auch bei allen folgenden NMR- und AAS-Messungen der Mittelwert und die Standardabweichung aus zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils vier Einzelmessungen dargestellt.

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Es wurde eine Vielzahl von Zellpopulationen hinsichtlich ihrer magnetischen Markierungsfähigkeit untersucht. Dazu gehören neben Primärzellen wie fötalen Mittelhirnzellen auch immortalisierte Zellen, als Beispiel seien Makrophagen der Ratte (Zelllinie RAW) genannt. Das Hauptaugenmerk dieser Studie liegt jedoch in Untersuchungen zur magnetischen Markierbarkeit von Stammzellen und mononuklären Zellen. Dazu gehören murine embryonale Stammzellen (ESC), humane mononukleäre Zellen aus der Nabelschnur (HUCB), mononukleäre Zellen der murinen Milz (MNC), sowie mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark der Ratte (MBM).

Murine embryonale Stammzellen (ESC) zeigen einen signifikanten Abfall der transversalen Relaxationzeit (T2-Zeit) nach Inkubation mit den Eisenoxidnanopartikeln VSOP C200 für 90 min (Abb. 5 a, schwarze Balken). Der Abfall der Relaxationszeit ist invers proportional zur Konzentration der Eisenoxid-Partikel während der Inkubation. Die gemittelte Relaxationszeit der Zellsuspension verkürzt sich auf 34 % (1,5 mM VSOP) bzw. 25 % (3 mM VSOP) des Kontrollwertes (unmarkierte embryonale Stammzellen).

Mononukleäre Zellen aus humanem Nabelschnurblut (HUCB) bzw. mononukleäre Zellen des Rückenmarks der Ratte (MBM) zeigen im Vergleich zu embryonalen Stammzellen eine wesentlich geringere Reduktion der T2-Zeit. Erst eine Erhöhung der Inkubationskonzentration auf 6 mM führt zu einer deutlichen Reduktion der T2-Zeit. Eine weitere Verdopplung der Inkubationskonzentration von 6 auf 12 mM VSOP resultiert in keiner weiteren Reduktion der T2-Zeit, es liegt Sättigung vor (Abb. 5). Mononukleäre Zellen aus der Milz (MNC) zeigen eine nahezu identische Aufnahmecharakteristik.

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Abbildung 5: Messungen der T2-Relaxationszeiten (a) bzw. der aufgenommenen Eisenmenge (b) einer Zellsuspension von jeweils 0,6 × 106 muriner embryonaler Stammzellen (ESC), humaner Nabelschnurblutzellen (HUCB) sowie Knochenmarkszellen der Ratte (MBM).

Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Eisenoxidnanopartikels VSOP C200 für 90 Minuten inkubiert. Die Messung der T2-Relaxationszeit erfolgte mittels NMR-Relaxometrie (a), die Messung der aufgenommenen Eisenmenge erfolgte mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS) (b), hier wurden die Eisenmengen auf 1 × 106 Zellen normiert.

Bei der Messung der Menge an aufgenommenem Eisen durch Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS) zeigt sich eine signifikante konzentrationsabhängige Eisenaufnahme durch die embryonalen Stammzellen (Abb. 5 b). Die mononukleären Zellen aus dem Knochenmark (MBM) bzw. aus der Nabelschnur (HUCB) zeigen hingegen eine geringere Eisenaufnahme. Ein Vergleich der Messungen der transversalen Relaxationszeit mittels NMR-Relaxometrie mit der direkten Messung des intrazellulären Eisens mittels AAS legt einen inversen Zusammenhang nahe.

Mit immortalisierten Makrophagen der Ratte (RAW) wurden identische Markierungsversuche durchgeführt, die Aufnahmecharakteristik ist mit derer embryonaler Stammzellen vergleichbar.

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Zur Messung der Stabilität der magnetischen Markierung wurden Versuche mit Makrophagen der Ratte durchgeführt, da diese unter in vitroBedingungen ein stabileres Proliferationsverhalten zeigen.

In Abbildung 6 sind die T2-Relaxationszeiten magnetisch markierter Makrophagen über einen Zeitraum von vier Tagen dargestellt. An Tag 0 erfolgte die magnetsche Markierung von jeweils 0,6 × 105 Makrophagen. Nach der magnetischen Markierung wurden die Zellen wieder in Medium überführt und im Brutschrank weiter kultiviert, lediglich die Proben für den Tag 0 wurden sofort gemessen.

In den darauf folgenden Tagen wurde jeweils die gesamte Zellpopulation mittels NMR-Relaxometrie untersucht. Es zeigte sich, dass trotz Proliferation der Zellen (siehe Abschnitt Proliferationsassays) die T2-Relaxationszeit nicht ansteigt. dies weist darauf hin, dass die absolute Menge an aufgenommenen Eisenoxidnanopartikeln in der gesamten Zellpopulation trotz Zunahme der Zellzahl nahezu gleich bleibt.

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Abbildung 6: Stabilität der zellulären magnetischen Markierung. Schwarze Balken stellen die Relaxationszeiten der Kontrolle (unmarkierter Makrophagen) dar.

Weiße bzw. graue Balken zeigen Relaxationszeiten von Zellsuspensionen magnetisch markierter Makrophagen (weiß 1,5 mM VSOP, grau 3 mM VSOP Inkubationskonzentration). Die Einheit der x-Achse sind Tage. Es sind der Mittelwert und die Standardabweichung von vier unabhängigen Ansätzen pro Versuchstag und Konzentration dargestellt.

3.2 Einfluss von Lipofektionsagenzien und Inkubationszeiten auf die intrazelluläre Aufnahme von Eisenoxidnanopartikeln

Um eine optimale magnetische Markierung muriner embryonaler Stammzellen zu erreichen, denen im Rahmen dieser Studie die größte Bedeutung zukommt, wurde der Einfluss der Inkubationszeit auf die Menge an aufgenommenen Eisenoxidnanopartikeln untersucht. Des weiteren legten Studien anderer Arbeitsgruppen die Möglichkeit der weiteren Erhöhung der Partikelinkorporation durch die Verwendung von Lipofektionsreagenzien nahe [53, 25].

Die zelluläre Eisenaufnahme wurde in Übereinstimmung mit den obigen Untersuchungen sowohl indirekt durch NMR-Relaxometrie als auch direkt durch Atom-Absorptionsspektroskopie (AAS) bestimmt. Die Zellen wurden 1,5, 4 bzw. 24 h mit 1,5 mM VSOP inkubiert. Die Inkubationskonzentration von 1,5 mM hat hinsichtlich zellulärer Viabilität als am besten geeignet herausgestellt (siehe Abschnitt Vitalitätsessays).

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Die Lipofektion ist eine Methode zur Einschleusung von DNA, RNA und anderer Partikel in eukaryotische Zellen mithilfe von Liposomen. Dabei kommt es zur Bildung eines lipophilen Komplexes aus Liposomen und Partikeln, der gesamte Komplex wird von der Zelle durch Endozytose aufgenommen. Zur Formation dieser Komplexe wurden die Eisenoxidnanopartikel 30 Minuten mit 6 µl der Transfektionsreagenz FuGENE (Roche) coinkubiert. Anschließend erfolgt die Inkubation dieses Liposomen-Eisen-Komplexes mit den Stammzellen für 90 Minuten, 4 oder 24 Stunden bei 37°C und 5 % CO2.

Abbildung 7: Abhängigkeit der intrazellulären Aufnahme des Eisenoxidnanopartikels VSOP C200 von der Inkubationszeit und der Coinkubation mit dem Lipofektionsagenz FuGENE. 0,6 × 106 murine embryonale Stammzellen wurden für 1,5, 4 bzw. 24 h mit 1,5 mM VSOP oder mit 1,5 mM VSOP und 6 µl FuGENE inkubiert.

a) Messung der transversalen Relaxationszeit (T2-Zeit) mittels NMR-Relaxometrie.
b) Messung der aufgenommenen Eisenmenge durch Atom-Absorptionsspektroskopie, normiert auf 1 × 106 Zellen.

In Abbildung 7 stellt sich eine signifikant höhere Eisenaufnahme bei Verwendung des Liposomen-VSOP-Komplexes im Vergleich zur Inkubation mit VSOP allein dar. Besonders deutlich wird dies bei der Inkubationszeit von 1,5 h, hier konnte eine Erhöhung der aufgenommenen Eisenmenge von 6,5 auf 41,3 µg / 1 × 106 Zellen erreicht werden, dies entspricht einer über sechsfachen Erhöhung. Die inverse Proportionalität zwischen der Reduktion der T2-Zeiten und der aufgenommen Eisenmenge konnte erneut bestätigt werden.

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Weiterhin stellt sich eine signifikante Abhängigkeit der Eisenaufnahme – sei es nach Inkubation mit VSOP allein oder mit dem Liposomen-VSOP-Komplex – von der Inkubationszeit dar. Nach 24 h Inkubation ergaben sich für VSOP allein bzw. VSOP-FuGENE Werte von 27,8 bzw. 111,7 µg Fe / 1 × 106 Zellen.

Neben der Quantifizierung der intrazellulären Eisenmenge wurden Vitalitätsassays durchgeführt (siehe unten), außerdem wurde die Morphologie der Stammzellen lichtmikroskopisch untersucht.

Abbildung 8: Lichtmikroskopische Aufnahmen (100 ×) muriner embryonaler Stammzellen.

Es sind unmarkierte (Kontrolle), mit VSOP inkubierte und mit VSOP-FuGene inkubierte Stammzellen bei drei Inkubationszeiten dargestellt.

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In Abbildung 8 stellen sich die unmarkierten Zellen morphologisch normal dar, es kommt nach 24 h zur Bildung von Embryoidkörperchen (embryoid bodies, EB), da im Inkubationsmedium die Differenzierungshemmer depletiert wurden. Nach Inkubation mit Eisenoxidnanopartikeln allein zeigt sich bereits nach 1,5 h eine homogene bräunliche Färbung der Zellen. Die Morphologie der Zellen ist unauffällig. Die Erhöhung der Inkubationszeit führt zu keiner weiteren signifikanten Veränderung der zellulären Morphologie und Färbung.

Nach Inkubation mit den VSOP-FuGENE-Komplexen stellt sich ein gänzlich anderes Bild dar. Nach 1,5 h Inkubation sind die Liposomen deutlich sichtbar, sie scheinen sich an die Zellmembaren der Stammzellen zu adhärieren. Die Färbung der Zellen stellt sich heterogen dar. Nach 4 h Inkubation finden sich deutlich mehr adhärente Liposomen. Ein besonderes Bild bietet sich 24 h nach Inkubation, es zeigen sich die Liposomen rasenartig am Boden der Petrischale. Auch fällt eine heterogene Färbung der embryonalen Stammzellen auf, weiterhin stellen sich Aggregate von zellulär adhärierten Liposomen dar. Auch durch wiederholtes Waschen mit PBS und der Erhöhung der Umdrehungszahl bei der Zentrifugation auf für die Zellen maximal tolerable 1500 UPM konnte keine signifikante Reduktion der liposomalen Aggregate erreicht werden.

3.3 Modellierung des Zusammenhanges der Reduktion der T2-Zeiten von der Erhöhung der intazellulären Eisenmenge

Es konnte bei allen Markierungsversuchen ein Zusammenhang zwischen der Reduktion der T2-Zeit und der intrazellulären Eisenmenge festgestellt werden. Diese inverse Proportionalität wurde mittels einer Regressionsanalyse (SPSS) quantifiziert. Die Aufnahmecharakteristika dreier Zelllinien wurden untersucht: muriner embryonaler Stammzellen (ESC), Knochenmarkszellen der Ratte (MBM) sowie humaner Nabelschnurblutzellen (HUCB). Es zeigte sich bei allen drei Regressionsanalysen eine Korrelation nahe -1, somit liegt eine inverse Korrelation zwischen der Eisenaufnahme und der Reduktion der T2-Zeit vor. Dies beantwortet jedoch noch nicht die Frage nach der Art der Korrelation. Der Angabe von Relaxivitäten für Kontrastmittel in der Literatur liegt ein linearer Zusammenhang zwischen Eisenmenge T2-Zeit zugrunde [21]. Der lineare Fit ergab in allen drei Fällen quadratische Korrelationskoeffizienten zwischen 0,87 und 0,96. Eine exponentielle Korrelation zeigt jedoch in allen drei Fällen einen nahezu ideale Kurvenanpassung mit Korrelationskoeffizienten nahe 1. Es ergeben sich Exponentialfunktionen mit den Parametern T2 [ms] und F [µM Fe] (Tabelle 2). Eine gleiche Menge an aufgenommenem Eisenoxid führt bei jedem Zelltyp zu unterschiedlichen T2-Zeiten.

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Tabelle 2: Zellspezifischer Zusammenhang zwischen T2-Zeiten und absoluten Eisenmengen

Zelltyp/Partikel

Korrelation

R2lin fit

R2exp fit

Gleichung

MBM

-0,980*

0,961

0,987

HUCB

-0,982*

0,964

0,965

ESC

-0,932

0,869

0,928

Abbildung. 9: Exponentielle Kurvenanpassung der Abhängigkeit der T2-Zeit von der Menge an aufgenommenem Eisen.

Die exponentielle Korrelation ist nur in µM-Fe Bereich möglich. Eine Modellierung der Abhängigkeit bis in den Bereich von Eisenmengen diagnostisch applizierter Dosen (mM Fe) war nicht möglich.

3.4 Intrazelluläre Lokalisation des fluoreszenzmarkierten Eisenoxidnanopartikels VSOP C200

Zur Bestimmung der intrazellulären Lokalisation der Eisenoxidnanopartikel wurden diese mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin-Grün markiert und mit embryonalen Stammzellen in vitroinkubiert. Mittels Confocaler Laser Scanning Mikroskopie wurden zwei Fluoreszenzkanäle simultan aufgenommen.

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Im Überblick (Abb. 10 a) stellen sich 10 adhärente embryonale Stammzellen dar. Die Überlagerung von grünen (RhD-VSOP) und rotem (ANEPPS) Intensitäten ergibt ein gelbes Summensignal im Falle einer Kolokalisation. In der linken mittigen Bildhälfte schneidet die Focusebene eine Stammzelle in der Mitte. Die intrazelluläre Lokalisation des RhD-VSOP-Signals wird hier deutlich. Es findet sich darüber hinaus eine homogene Aufnahme der RhD-VSOP in der gesamten beobachteten Zellpopulation, bei allen Zellen zeigte sich je nach Focusebene entweder ein gelbes Summensignal oder eine hohe Signalintensität im grünen Frequenzbereich. Zur Visualisierung der intrazellulären Kompartimentierung ist in Abb. 10 b-d eine einzelne embryonale Stammzelle dargestellt, die Focusebene schneidet die Zelle in der Mitte. Im roten Kanal, dominiert durch die Fluoreszenz des Membranfarbstoffes ANEPPS, stellen sich die Zellmembran, die nukleäre Membran, sowie eine Vielzahl von Vesikelmembranen dar (Abb. 10 b). Im grünen Kanal zeigen sich isolierte Aggregate hoher Signalintensität. Das Summensignal zeigt, dass eine Kolokalisation nur im Bereich der Vesikel vorliegt. Das Zytoplasma sowie die nukleäre und zelluläre Membran zeigen keine grüne Signalintensität.

Abbildung 10: Confokale Fluoreszenzaufnahmen embryonaler Stammzellen nach Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Eisenoxidpartikeln.

Zwei Fluoreszenzkanäle wurden simultan aufgenommen. Der grüne Kanal (510-560 nm) beeinhaltet das Emissionsmaximum der Rhodamin-Grün-VSOP-Partikel. Der rote Kanal (610-670 nm) beeinhaltet das Emissionsmaximum des Membranmarkers ANEPPS. Bild a zeigt einen Überblick über eine Gruppe von adhärenten Stammzellen, beide Kanäle wurden überlagert. Der Maßstab sind 20 µm. Die Bilder b-d zeigen eine einzelne embryonale Stammzelle, der Maßstab sind 5 µm. Bilder b und c zeigen den grünen bzw. roten Kanal, Bild d die Überlagerung beider Kanäle.

3.5 Magnetische Markierung von Zellen als Vitalitätsmarker in vitro und in vivo

Die obigen Untersuchungen zeigen, dass die T2-Zeit und damit der kernspintomographische Bildkontrast nicht nur abhängig ist von der Menge an aufgenommenem Eisen, sondern auch vom Zelltyp und somit der räumlichen Verteilung, Aggregation und Mikroumgebung der Eisenoxidnanopartikel. Dies schien die Möglichkeit zu eröffnen, vitale und lysierte Zellen nichtinvasiv anhand ihrer magnetischen Eigenschaften zu unterscheiden. Dazu wurden magnetisch markierte Makrophagen der Ratte (RAW) durch Zugabe von 1 M NaCl lysiert. Die Lyse der Zellen wurde lichtmikroskopisch kontrolliert, es fanden sich nach Inkubation mit 1 M NaCl lediglich Membranfragmente, nahezu keine intakten Zellen. Die Zellsuspension wurde nun vor und nach der Lyse mittels NMR-Relaxometrie untersucht. Es ergeben sich signifikante Unterschiede in den T2-Zeiten, die Lyse der Zellen zieht eine signifikante Reduktion der T2-Zeit nach sich (Abb. 11 a).

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Abbildung 11: a) Messung der T2 Relaxationszeit von Makrophagen der Ratte (Zelllinie RAW; 0,8 × 106 Zellen pro Ansatz). Zellen wurden nach der Inkubation mit VSOP C200 für 90 min entweder vital oder lysiert gemessen. Zelllyse durch osmotischen Schock wurde durch Zugabe von 1M NaCl induziert. b) Prozentuale Änderung der T2-Relaxationszeiten magnetisch markierter Makrophagen nach Lyse der Zellen bei verschiedenen VSOP Konzentrationen.

Die Reduktion der T2-Zeiten nach der Lyse der Zellen zeigte sich nicht abhängig von der VSOP-Konzentration während der Inkubation (1,5; 3 oder 6 mM). Die Reduktion der T2-Zeiten beträgt bei allen Inkubationskonzentrationen ca. 50 % (Abb. 11 b).

Zur Übertragung der in vitroUntersuchungen auf die in vivoSituation war es nötig, kernspintomographische Bildgebungssequenzen zu etablieren, die eine räumlich aufgelöste Quantifizierung der charakteristischen Zeitkonstante der transversalen Relaxation (T2-Zeit) erlauben. Konventionelle T2-gewichtete Sequenzen erlauben diese Quantifizierung nicht. Anhand von Gelphantomen, in die schichtweise magnetisch markierte Zellen aus dem Knochenmark eingebracht wurden, konnten T2-gewichtete Multiechosequenzen evaluiert werden (Abb. 12). Dabei wurde bei 8 verschiedenen Echozeiten, beginnend bei der minimalen Echozeit von 3 ms kernspintomographische Bildgebung durchgeführt. Die jeweilige Signalintensität jedes Voxels lässt sich durch approximieren. Durch monoexponentielle Kurvenanpassung an die experimentellen Signalintensitäten kann ein Parameterbild der absoluten T2-Zeiten berechnet werden (Abb. 12 b).

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Abbildung 12: a) T2-gewichtete axiale MR-Aufnahme bei 7T. Schichtphantom mit 10.000 Zellen aus dem Knochenmark, magnetisch markiert mit 1,5 mM VSOP, eingebettet in 100 µl Gelmatrix. Räumliche Auflösung 137×137×600 μm.
b) T2-Karte berechnet durch monoexponentielle Anpassung von T2-gewichteten Multiechoaufnahmen mit 8 Echos (Matlab).

In der single-echo Turbospinaufnahme stellen sich die magnetisch markierten Stammzellen als hypointenses Areal dar (Abb. 12 a). Dieses Areal korrespondiert zu Bereichen geringer T2-Zeiten im Parameterbild. Ein Vergleich vitaler und lysierter Zellen vergleichbar zu der NMR-Relaxometrie in vitro ließ sich in den Gelphantome nicht verwirklichen, da die Zellen das Einbetten in die heiße Gelmatrix nicht überlebten.

Der nächste Schritt zur nicht-invasiven Detektion der Vitalität transplantierter Zellen bestand in der Akquirierung der T2-Karten im Rahmen der Studie zur Detektion embryonaler Stammzellen im Parkinson-Modell der Ratte (siehe unten). Neben T2- und T2*-gewichteten Sequenzen wurden die oben dargelegten T2-Multiechosequenzen bei nahezu jeder kernspintomographischen Untersuchung gemessen. Abbildung 13 zeigt axiale in vivo T2-Karten nach monoexponentieller Kurvenanpassung eine bzw. acht Wochen nach der Transplantation. Es finden sich Bereiche niedriger T2-Zeiten im Bereich des Stichkanals. Diese korrespondieren zu den Signalauslöschungen in der T2*-gewichteten morphologischen Bildgebung (siehe unten). Im Vergleich der Zeitpunkte zeigt sich 8 Wochen nach der Transplantation (Abb. 13 b) ein signifikant reduzierter Bereich niedriger T2-Zeiten. Jedoch konnte keine ausreichende räumliche Auflösung realisiert werden, um weitergehende Aussagen zu treffen. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis von Multi-Echosequenzen ist signifikant geringer verglichen mit single-echo Turbospinechosequenzen, da die Repetitionszeit TR sehr groß gewählt werden muss, und somit eine geringere Zahl an Mittellungen möglich ist.

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Abbildung 13: T2 Karten in vivo nach der Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten.

T2-Karten berechnet durch monoexponentielle Anpassung von T2-gewichteten Multiechoaufnahmen mit 8 Echos (Matlab).
a) Eine Woche nach Transplantation,
b) 8 Wochen nach Transplantation. Räumliche Auflösung 137×137×600 μm.

3.6 Vitalitäts- und Proliferationsassays

Untersuchungen zu möglichen Einflüssen der magnetischen Markierung auf die Biologie der Zellen wurden bei allen magnetisch markierten Zellen durchgeführt. Es seien hier drei Ansätze der Vitalitätsbestimmung an verschiedenen Zellpopulationen vorgestellt.

Primäre fötale Mittelhirnzellen der Ratte wurden direkt nach der Präparation mit 8 mM VSOP inkubiert, dies entspricht mehr als der doppelten Dosis, die für eine effiziente magnetische Markierung ausreicht (siehe Abb. 4). 24 h nach der Inkubation wurden die inzwischen adhärenten Zellen mit den fluoreszierenden Vitaliätsmarkern Akridin-Orange und Ethidium-Bromid inkubiert. Bei dieser Färbung stellen sich vitale Zellen grün fluoreszierend dar, tote Zellen stellen sich durch die Interkalierung des roten Fluoreszenzfarbstoffes mit der zellulären DNA, der nur durch eine ruptierte Zellmembran in den Nukleus diffundieren kann, rot dar. Zwischen den unbehandelten und VSOP-markierten Zellen zeigen sich nach visueller Inspektion keine Unterschiede (Abb. 14). Auch die zelluläre Morphologie der unreifen Neuronen und Glia stellte sich normal dar.

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Abbildung 14: a) Vitalitätsfärbung unmarkierter embryonaler Mittelhirnzellen (Kontrolle). b) Vitalitätsfärbung embryonaler Mittelhirnzellen 24h nach Inkubation mit 8 mM VSOP C200 für 90 min.

Inkubation mit den Fluoreszenzmarkern Akridin-Orange und Ethidiumbromid. Fluoreszenzmikroskopie (100x)

Eine Quantifizierung der Vitalitätsrate ist durch den Trypanblautest möglich. Drei Zellpopulationen wurden mit unterschiedlichen VSOP-Konzentrationen für 90 Minuten inkubiert. Humane Nabelschnurblutzellen (HUCB) und Knochenmarkszellen der Ratte (MBM) zeigten bis zur höchsten Inkubationskonzentration von 12 mM, die wie oben dargestellt hinsichtlich der Eisenaufnahme bereits im Bereich der Sättigung liegt, keine signifikante Reduktion der Vitalitätsrate (Abb. 15). Embryonale Stammzellen hingegen zeigen einen konzentrationsabhängigen Abfall der Vitalität, die unmarkierten Zellen sind zu 93 % vital, nach Inkubation mit 1,5 mM zu 90 % und nach Inkubation mit 3 mM VSOP zu 87 % (Abb. 15; schwarze Balken).

Abbildung 15: Vitalitätsbestimmung dreier Zellpopulationen mittels Trypanblautest: humaner Nabelschnurzellen (HUCB), Knochenmarkszellen der Ratte (MBM) sowie muriner embryonaler Stammzellen (ESC).

Zellen wurden mithilfe einer Neubauer Zählkammer quantifiziert, tote Zellen erscheinen durch das Eindringen des Trypans in die Zelle blau.

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Die Untersuchungen zu einem möglichen Einfluss der magnetischen Markierung auf die zelluläre Proliferationsrate wurden an Makrophagen der Ratte (RAW) durchgeführt, da diese als immortalisierte Zellen ein stabiles Proliferationsverhalten zeigen. Die Zellen wurden mit 1,5 mM VSOP markiert und über einen Zeitraum von 4 Tagen wurde die Anzahl der vitalen Zellen bestimmt. Die Proliferationsrate wurde mittels der Anpassung einer exponentiellen Wachstumskurve an die experimentellen Daten modelliert um diese zu skalieren: . Für die Kontrollzellen und für die mit 1,5 mM VSOP magnetisch markierten Zellen ergeben sich die folgenden, nahezu identischen Wachstumskonstanten: kk=1.06 ± 0.11 [1/d] bzw. k1,5=1.07 ± 0.10 [1/d].

Wie in Abbildung 16 visualisiert ergeben sich keine Unterschiede zwischen markierten und unmarkierten Zellen hinsichtlich ihres Proliferationsverhaltens.

Abbildung 16: Proliferationskurven magnetisch markierter (grün) bzw. unmarkierter Makrophagen in den ersten drei Tagen nach der Inkubation.

Die Einheiten der y-Achse stellen die normierten Zellzahlen dar, die Einheiten der x-Achse sind Tage.

3.7 Untersuchungen zum oxidativen Stress in vitro

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Zur Bestimmung der oxidativen Belastungen der Zelle nach Inkubation mit Eisenoxidpartikeln wurden die Konzentrationen des Markers der Lipidperoxidation, Malondialdehyd und den Produkten der Proteinoxidation, Proteincarbonylen, mittels HPLC bestimmt. Die Konzentration von Malondialdehyd (MDA) steigt unmittelbar nach Ende der Inkubation von RAW-Zellen mit Eisenoxidnanopartikeln signifikant an (Abb. 17, weiße Balken). Proteincarbonyle zeigen die gleiche Tendenz, auch wenn aufgrund der großen Streuung der Messwerte keine Signifikanz festgestellt werden konnte. Der Anstieg der MDA-Konzentration ist abhängig von der VSOP-Konzentration während der Inkubation. Um festzustellen, ob es sich um einen permanenten Anstieg oder nur um einen transienten Effekt handelt, wurden zusätzlich die MDA-Konzentrationen 24 h nach Inkubation bestimmt (Abb. 17, graue Balken). Es zeigte sich eine Reduktion des oxidativen Stresses der magnetisch markierten Zellen auf Kontrollniveau.

Abbildung 17: Messung der Malondialdehydkonzentration direkt bzw. 24 h nach der Inkubation von Makrophagen (RAW) mit Eisenoxidnanopartikeln.

Um festzustellen, ob freies intrazelluläres Eisenoxid die transiente Erhöhung des oxidativen Stress verursacht, wurde während der Inkubation das Antioxidanz PBN und der Eisenchelator Desferal zugesetzt. Beide Substanzen vermögen die gesteigerte oxidative Belastung auf Kontrollniveau zu senken (Abb. 18).

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Abbildung 18: Applikation von Anti-Oxidantien während der Inkubation von Makrophagen mit Eisenoxidnanopartikeln.

3.8 Einfluss der magnetischen Markierung auf die Differenzierungsfähigkeit embryonaler Stammzellen

Um eine Beeinträchtigung der Differenzierungsfähigkeit embryonaler Stammzellen auszuschließen, wurden diese mit 1,5 bzw. 3 mM VSOP für 90 Minuten inkubiert und anschließend in normalem Stammzellmedium weiter kultiviert. Als Indikator für die Totipotenz diente der Nachweis des Stammzellantigens surface specific embryonic antigen 1 (SSEA 1) durch Immunfluoreszenz. Direkt nach der Inkubation und an den darauf folgenden zwei Tagen wurde der Anteil der SSEA positiven Zellen mittels FACS-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich kein signifikanter Einfluss der magnetischen Markierung auf den Anteil der undifferenzierten Stammzellen (Abb. 19).

Abbildung 19: FACS-Messungen muriner embryonaler Stammzellen nach Inkubation mit VSOP.

Undifferenzierte Zellen tragen das Oberflächenantigen SSEA1. Mittels eines Antikörpers gegen SSEA1 und einem fluoreszierenden Sekundärantikörper konnte der Anteil fluoreszierender und somit undifferenzierter Zellen bestimmt werden.

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Neben der Frage einer ungewollten Induktion der Differenzierung ist auch die Frage zu klären, ob die Eisenoxidnanopartikel einen Einfluss auf eine gerichtete Differenzierung nehmen, die durch die Applikation von Wachstumsfaktoren und die Depletion von Differenzierungshemmern erreicht wird. Embryonale Stammzellen lassen sich per definitionem in alle Körperzellen exklusive der Keimzellen differenzieren. Naturgemäß können nicht alle Differenzierungswege untersucht werden. Hier wurde die Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen untersucht, da sie in der stammzellbasierten Therapie neuronaler ZNS-Krankheiten die größte Rolle spielen.

Abbildung 20: Murine embryonale Stammzellen in der ersten Phase der Differenzierung, in der Bildmitte ist ein embrioid-Körper (embryoid body, EB) zu sehen. Durchlichtmikroskopie 100 ×.

Mittels Immunfluoreszenz wurden wie oben methodisch bereits dargelegt die Anzahl der Zellen quantifiziert, die sich in einem bestimmten Differenzierungsstadium befinden. Es wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Anteil der Intermediärfilamente Nestin und β-3-Tubulin bestimmt. Zusätzlich wurde der Anteil der dopaminergen Neuronen durch Nachweis des für die Dopaminsynthese spezifischen Enzyms Tyrosinhydroxilase bestimmt, um Einflüsse auf die Neurogenese ausschließen zu können. Es fanden sich keine signifikanten quantitativen Unterschiede zwischen markierten und unmarkierten Zellen. Abbildung 21 zeigt die mikroskopische Darstellung von Zellaggregaten unterschiedlicher Differenzierungsstadien in Überlagerung von Durchlicht und antigenspezifischer Fluoreszenz. Auch bei visueller Inspektion stellt sich die zelluläre Morphologie markierter Zellen normal dar.

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Abbildung 21: Überlagerung durchlicht- und fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen vordifferenzierter embryonaler Stammzellen.

Die Stammzellen wurden im undifferenzierten Stadium magnetisch markiert und anschließend nach Protokollen von Lee et al. [35] in die Richtung dopaminerger Neuronen differenziert.


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07.11.2006