Detektionslimit magnetisch markierter embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo – MR-Tomographie bei 1,5 T, 7 T und 17,6 T

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Fragestellung

Die Ermittlung des Detektionslimits magnetisch markierter Zellen ist von großer Wichtigkeit hinsichtlich der Grenzen der zellulären Kernspintomographie. Ein Nachweis von einigen 10.000 Zellen mag für die reine Lokalisation des Transplantats zum Beispiel bei der direkten intracerebralen Zelltransplantation bei Morbus Parkinson ausreichend sein. Geht es jedoch um Fragen der Migration von Zellen oder soll eine Anreicherung von Zellen nach systemischer Injektion visualisiert werden, wie hier später folgend am Beispiel der cerebralen Ischämie, so sind wenige hundert Zellen spezifisch zu erkennen. Gerade bei einer systemischen Injektion ist der Ort des Eintritts der Zellen in das Hirnparenchym aus dem vaskulären System nicht bekannt. Neben einer maximalen Sensitivität muss somit auch eine hohe Spezifität gewahrt bleiben. Eisenoxidmarkierte Zellen verursachen keine direkte Signaländerung, sie sind nur durch mittelbare Effekte auf die Phasenkohärenz der umgebenden Wasserprotonen sowie durch ihr lokales Magnetfeld zu detektieren. Dies ist insbesondere bei der Verwendung von T2*-gewichteten Sequenzen von entscheidender Bedeutung, da diese Sequenzen neben ihrer hohen Sensitivität für eisenoxidmarkierte Zellen auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Bildartefakten besitzen. Darüber hinaus stellt sich die Frage, inwieweit das Detektionslimit magnetisch markierter Zellen von der Feldstärke des Kernspintomographen abhängt. Dies ist insbesondere im Hinblick auf die klinische Anwendung der Methodik von Wichtigkeit. In diesem Problemkreis wurden die folgenden Fragen beantwortet:

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4.1  Kernspintomographische Bildgebung VSOP-markierter Zellen in einer Gelmatrix

Zur in vitroVisualisierung eisenoxidmarkierter Zellen wurden diese auf zwei unterschiedlichen Wegen in die Gelmatrix eingebracht. Zum einen wurden sie direkt in das Gel injiziert (Injektionsphantom). Dies simuliert eine direkte intrazerebrale Injektion. Zum anderen wurden die Zellen mit dem Gel vermischt, somit entstanden Gelphantome mit Schichten unterschiedlicher Zellzahl (Schichtphantom). Diese Phantome simulieren eine Anreicherung von Zellen nach systemischer Injektion.

Die Injektionsgele wurden bei einer Feldstärke von 17,6 T kernspintomographisch untersucht, die Schichtgele bei 7 T.

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In Übereinstimmung mit dem in vivoTransplantationsprotokoll wurden 2 µl einer NaCl-Suspension mit VSOP-markierten embryonalen Stammzellen in unterschiedlichen Zellzahlen in ein Agarosegel injiziert. Pro Gel wurden vier Injektionen durchgeführt. In T2*-gewichteter Bildgebung stellt sich die Gelmatrix homogen und frei von Luftblasen dar. Die Injektionskanäle können durch den etwas helleren Bildkontrast im Vergleich zum Gel identifiziert werden. Abbildung 22 zeigt longitudinale Schnittebenen durch die Injektionskanäle. Die markierten Stammzellen stellen sich als Signalauslöschungen dar. Bei der Injektion von 500 Zellen / µl sind ausgedehnte hypointense Bereiche im gesamten Bereich des Stichkanals zu sehen (Abb. 22 b). Die Injektion von 50 Zellen / µl hingegen führt zu räumlich separierten Signalauslöschungen geringerer Intensität (Abb. 22 c). Unmarkierte Zellen zeigen keine signifikanten Hypointensitäten (Abb. 22 a).

Abbildung 22: T2* gewichtete MR-Aufnahmen bei 17,6 T von Gelphantomen mit injizierten magnetisch markierten embryonalen Stammzellen.

ESC wurden in 2µl NaCl injiziert.
a) Injektion von 1000 unmarkierten Stammzellen. Zwei Injektionskanäle sind als hyperintense Bereiche zu sehen.
b) Injektion von 1000 magnetisch markierten Stammzellen. Drei Injektionskanäle sind zu sehen. Die Zellen sind als hypointense Areale visualisiert.
c) Injektion von 100 magnetisch markierten Stammzellen. Aggregate von 10 oder weniger Zellen sind deutlich abzugrenzen. Die räumliche Auflösung beträgt 98 µm.

Die Schichtgele stellen sich in der T2*-gewichteten Bildgebung bei 7 T ebenfalls homogen und luftblasenfrei dar. Schichten unmarkierter Zellen zeigen keinen Kontrast, lediglich die Grenzschichten der Gele verursachen vereinzelte Suszeptibilitätsartefakte. Schichten mit im Gel gelösten magnetisch markierten Zellen zeigen in der axialen Schnittführung (Abb. 23 a) deutliche hypointense Signalveränderungen. Diese stellen sich im Vergleich zu den Injektionsgelen jedoch weitgehend homogen dar. Die Zellen verteilen sich auf einer Fläche von ca. 1 cm2, die Dicke der Zellschichten beträgt weniger als 1 mm. Auch 1000 Zellen sind deutlich abzugrenzen, 100 Zellen zeigen lediglich in der axialen Schichtführung kleinere hypointense Signalveränderungen, eine sichere Abgrenzung von Grenzflächenartefakten ist jedoch nicht möglich. Im Vergleich zum Injektionsgel kann jedoch von einer wesentlich geringeren lokalen Zelldichte ausgegangen werden.

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Abbildung 23: T2*-gewichtete Aufnahmen bei 7 T von einem Schichtphantom. Es wurden drei Schichten von 10.000, 1000 und 100 humanen mononukleären Zellen aus der Nabelschnur (HUCB) in das Gel eingebracht.

Die Zellen wurden mit 6 mM VSOP magnetisch markiert und in jeweils 100 µl Gel gelöst.
a) Axiale Aufnahme der obersten Schicht mit 10.000 Zellen.
b) Sagittale Aufnahme, alle drei Zellschichten sind zu sehen.
Die Auflösung beträgt bei beiden Schnittebenen 194 x 172 x 189 µm.

4.2 Detektionslimit von magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bei 17,6 Tesla in vivo

Zur Bestimmung der minimalen Anzahl an Zellen, die mittels Kernspintomographie im Höchstfeld zu erfassen sind, wurden sowohl magnetisch markierte als auch unmarkierte embryonale Stammzellen in das Striatum von insgesamt 17 weiblichen Wistar Ratten transplantiert. Der intrinsische Bildkontrast der T2*-gewichteten 3D-Flash Sequenz erlaubte die Unterscheidung zwischen grauer und weißer Substanz sowie die Darstellung des Corpus Callosum, des Fornix sowie der anterioren Kommissur. Darüber hinaus konnten Teile der Ventrikel sowie Gefäße identifiziert werden. Der Bildkontrast der Gefäße war in großem Maße abhängig von der Richtung des Blutflusses im Verhältnis zur Bildgebungsebene. 120.000 magnetisch markierte embryonale Stammzellen stellten sich nach der intrastriatalen Injektion kernspintomographisch als ausgedehnte Hypointensitäten dar (Abb. 24). Diese verteilten sich über einen großen Teil der linken Hemisphäre. Neben dem Injektionskanal fanden sich Hypointensitäten hauptsächlich entlang des linken Ventrikels. In der contralateralen Hemisphäre sind keine Signaländerungen festzustellen. Bei der erneuten kernspintomographischen Untersuchung drei Tage nach der Injektion lassen sich hinsichtlich der räumlichen Verteilung der Hypointensitäten nur minimale Unterschiede feststellen. Die Signalauslöschungen entlang des Injektionskanals zeigten sich weniger stark ausgeprägt, jedoch stellte sich eine etwas ausgedehntere Verteilung entlang des linken Ventrikels dar. Zusätzlich fanden sich Hypointensitäten im linken Teil des dritten Ventrikels. Über die nächsten 22 Tage ergaben sich keine signifikanten Veränderungen in der räumlichen Verteilung der Zellen.

Abbildung 24: a) T2* gewichtete MR Aufnahme bei 17,6 T nach Injektion von 120.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen. b) Die 3D-Rekonstruktion der Hypointensitäten (rot) zeigt die Verteilung der Zellen im Injektionskanal und im Ventrikel. Die räumliche Auflösung beträgt 98 µm.

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Nach der intrastriatalen Transplantation von 1000 magnetisch markierten Zellen zeigte sich bei allen drei transplantierten Tieren im Bereich des Injektionskanals eine deutlich ausgeprägte Signalauslöschung (Abb. 25 a). Im Gegensatz dazu zeigte sich bei der Transplantation von unmarkierten Stammzellen keine vergleichbare Signaländerung in den sechs transplantierten Tieren (Abb. 25 c). Nichtsdestotrotz zeigten sich bei zwei dieser Kontrolltiere Signaländerungen im oberen Teil des Injektionskanals. Diese konnten histologisch einer Mikroblutung zugeordnet werden. Transplantation von 100 Zellen führte zu kleineren Signalauslöschungen, die sich jedoch noch immer über mehrere 3D Schichten erstreckten (Abb. 25 b). Nach der Transplantation von 20 Zellen zeigten sich nur kleiner Signalauslöschungen. Eine eindeutige Zuordnung der Hypointensitäten zu den markierten Zellen konnte nicht erreicht werden, da Infiltration der Cerebrospinalflüssigkeit oder Mikroblutungen als Ursache der Signaländerungen nicht ausgeschlossen werden konnten.

Abbildung 25: T2*-gewichtete MR-Aufnahmen bei 17,6 T in vivo nach intrastriataler injektion von a) 1000, b) 100 magnetisch markierten bzw. c) 1000 unmarkierten Stammzellen.

Die magnetisch markierten Zellen sind deutlich als abgegrenzte Hypointensitäten sichtbar. Unmarkierte Zellen verursachen nur leichte Signaländerungen. In b) sind die lateralen Ventrikel als Signalauslöschungen abzugrenzen (kurze Pfeile).

Eine absolute Quantifizierung der T2*-Zeit der hypointensen Bereichen war nicht möglich, da nach der kürzesten realisierbaren Echozeit von 3,0 ms das MR-Signal bereits im Bereich des Rauschens lag. Somit kann keine quantitative Abhängigkeit der Reduktion der T2*-Zeit von der Anzahl der transplantierten Zellen berechnet werden. Durch die Quantifizierung der hypointensen Voxel konnte jedoch ein empirischer Zusammenhang hergestellt werden. Es zeigte sich eine Größenzunahme des hypointensen Areals sowohl bei der Erhöhung der Zahl der transplantierten Zellen als auch bei der Verlängerung der Echozeit. Nach der Transplantation von 100 Zellen fanden sich Signalauslöschungen in 183 ± 86 (3,0 ms Echozeit) bzw. 204 ± 132 Voxel (4,6 ms Echozeit). Die Transplantation von 1000 Zellen führte zu 492 ± 135 (3,0 ms) bzw. 654 ± 86 (4,6 ms) hypointensen Voxel. Diese empirische Quantifizierung zeigt, dass bei einer Erhöhung der Zellzahl um den Faktor 10 der T2* Effekt um etwa den Faktor drei zunimmt. Die große Standardabweichung begründet sich in der großen interindividuellen Variabilität durch eine heterogene lokale Zelldichte.

4.3 Histologische Korrelation und Quantifizierung

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In der Histologie konnte nach genauer Prüfung der seriellen coronalen Schnitte in allen transplantierten Tieren der Injektionskanal gefunden werden. Es zeigte sich eine kleine gliöse Narbe, teilweise verbunden mit einem zentralen Defekt. Die Abbildungen 26 a - c zeigen coronale Schnitte eines Tieres, welches drei Wochen nach der Transplantation von 1000 magnetisch markierten Stammzellen transkardial perfundiert wurde. Der Stichkanal (Pfeil) verläuft beginnend vom parietalen Cortex durch den Corpus Callosum. Im Bereich der Basalganglien stellt sich eine Mikroblutung dar. Ähnliche Mikroblutungen fanden sich bei mehreren Tieren, inklusive der zwei Kontrolltiere mit homogenen Signalauslöschungen in der kernspintomographischen Bildgebung. Bei Tieren denen 20 oder 100 Zellen transplantiert wurden fanden sich nur vereinzelte Berliner Blau oder SSEA positive Zellen. Nach der Transplantation von 1000 Zellen fanden sich jedoch eine große Anzahl von Berliner Blau positiven Zellen im unteren Bereich des Stichkanals. Abbildung 26 b zeigt die quantitative histologische Evaluierung Berliner Blau positiver Zellen aus insgesamt 14 seriellen Schnitten. Die räumliche Verteilung der insgesamt 832 Stammzellen im Stichkanal oder in der unmittelbaren Umgebung ist schematisch dargestellt. Eine größere Anzahl Stammzellen fand sich in den unmittelbar benachbarten Bahnen des Corpus Callosum. Abbildung 26 d zeigt einen coronalen Schnitt mit einer Dicke von 25 µm eines Tieres welches direkt nach der Transplantation von 1000 Stammzellen und der MRT-Untersuchung getötet wurde. Es konnten in diesem Schnitt insgesamt 60 SSEA positive Zellen bestimmt werden. Die Quantifizierung der SSEA-positiven Zellen der 10 Schichten im Bereich des Transplantationskanals und der unmittelbaren Umgebung ergab insgesamt 746 Stammzellen. In anderen Bereichen des Gehirns wurden keine SSEA-positiven Zellen gefunden.

Abbildung 26: Histologische Untersuchung einer Ratte nach der intrastriatalen Injektion von 1000 magnetisch markierten Stammzellen.

a) Übersichtsaufnahme in coronaler Schnittebene. Hämatotoxylin / Eosin-Färbung.
b) Schematische Abbildung der histologischen Quantifizierung Berliner-Blau-positiver Zellen. Insgesamt wurden 832 Zellen gefunden.
c) Serieller Schnitt gefärbt mit Berliner Blau für den Nachweis von Eisen.
d) Serieller Schnitt eines weiteren Tieres, ebenfalls nach Transplantation 1000 magnetisch markierter Stammzellen.
Immunhistochemischer Nachweis des Stammzellmarkers SSEA1. Insgesamt 60 SSEA-positive Zellen konnten in diesem Schnitt nachgewiesen werden.

4.4 Abhängigkeit des Detektionslimits magnetisch markierter Zellen von der Feldstärke

Bei einer Erhöhung der Stärke des Hauptmagnetfeldes B0 kommt es zu einer Erhöhung der Grundmagnetisierung, eine größere Anzahl von Protonen richten sich in Feldrichtung aus. Die kernspintomographische Signalstärke S steigt proportional im Quadrat an, . Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis verhält sich dazu direkt proportional, . So kann durch das höhere Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei höheren Feldstärken im Allgemeinen eine höhere Ortsauflösung realisiert werden.

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Des weiteren steigt bei einer Erhöhung der Feldstärke jedoch auch die Leistung des Anregungspulses RF, da die Resonanzfrequenz steigt: , mit als dem gyromagnetischen Verhältnis und ω0 als der Resonanzfrequenz. Daraus folgend kommt es bei schnellen Bildgebungssequenzen zur Problematik einer Überschreitung der SAR-Grenzwerte.

Zur Ortskodierung sind bei einer höheren Feldstärke stärkere Gradientenfelder nötig, die Empfindlichkeit gegegenüber Magnetfeldinhomogenitäten steigt. Da eisenoxidmarkierte Zellen ebendiese Magnetfeldinhomogenitäten verursachen, ist von einer höheren Empfindlichkeit der Detektion bei höheren Feldstärken auszugehen, jedoch steigt parallel dazu die Artefaktanfälligkeit.

Zur Evaluierung der Auswirkungen dieser Abhängigkeiten auf das Detektionslimit magnetisch markierter Zellen wurde kernspintomographische Bildgebung an gesunden weiblichen Wistar-Ratten bei Feldstärken von 1,5 und 7 T durchgeführt. Des weitern wurde untersucht, inwieweit sich unterschiedliche Stammzellpopulationen hinsichtlich ihrer kernspintomographischen Visualisierbarkeit unterscheiden.

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Die kernspintomographische Bildgebung bei 1,5 T wurde an einem klinischen Scanner (Siemens Sonata) durchgeführt. Die Injektion von 50.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen führte zu signifikanten Signalauslöschungen in der T2*-gewichteten Bildgebung (Abb. 27 a). Auch eine Injektion von 2000 Zellen führte noch zu signifikanten Signalauslöschungen (Abb. 27 b). Bei einer Injektion von unmarkierten Zellen kam es zu keinen vergleichbaren Signalauslöschungen, lediglich der Injektionskanal konnte vom umgebenden Hirnparenchym diskriminiert werden.

Abbildung 27: In vivo MRT 1h nach intrastriataler Injektion von a) 50.000 bzw. b) 2.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bei 1,5 T. Räumliche Auflösung 300×300×500 μm.

Die Bildgebung bei 7 T wurde an einem Kleintier-Kernspintomographen durchgeführt (Bruker Pharmascan). Im Vergleich zu klinischen Feldstärken stellten sich die T2*-gewichteten Bilder wesentlich kontrastreicher dar, anatomische Strukturen wie Ventrikel und der Corpus Callosum konnten deutlich vom Hirnparenchym abgegrenzt werden. Es konnte eine wesentlich größere räumliche Auflösung realisiert werden. Nach Transplantation von 10.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen stellten sich deutliche Hypointensitäten im Bereich des Stichkanals dar. In Vorbereitung zur Langzeitstudie bei einem Rattenmodell des Morbus Parkinson (siehe unten), wurden die Tiere nach vier Monaten erneut kernspintomographisch untersucht. Neben Signalauslöschungen im Bereich des Stichkanals zeigte sich bei einem Tier deutliche Signalauslöschungen im Bereich des Corpus Callosum, räumlich direkt an den Stichkanal angrenzend (Abb. 28 a). Ca. 1,6 mm anterior konnte ein hypointenses Depot abgegrenzt werden (Abb. 28 b). In der Histologie konnten in räumlicher Korrelation Berliner-Blau-positive Zellen detektiert werden. Ein eindeutiger Nachweis, dass es sich bei diesen Zellen um die transplantierten magnetisch markierten embryonalen Stammzellen handelt, konnte jedoch nicht erbracht werden. Im Gegensatz zur späteren Parkinson-Studie waren die embryonalen Stammzellen nicht GFP-markiert.

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Abbildung 28: a), b), In vivo MRT bei 7 T 4 Monate nach der Transplantation von 10.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum einer gesunden Ratte.

Das Injektionsvolumen betrug 2 µl, Zellen gelöst in NaCl.
a) Schicht im Bereich des Injektionskanals.
b) Schicht 1,6 mm anterior von a). Die räumliche Auflösung beträgt 117×117×400 μm.
c), d) Histologischer Schnitt im Bereich des Corpus Callosum in räumlicher Kolokalisation von b).
HE und Berliner Blau Färbung.
c) Übersichtsaufnahme (100 ×),
d) Ausschnittsvergrößerung.

Neben embryonalen Stammzellen wurden auch mononukleäre Zellen aus der Nabelschnur (HUCB) und mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark der Ratte (MBM) intrastriatal injiziert, um Unterschiede in der kernspintomographischen Visualisierbarkeit zwischen den verschiedenen Zellpopulationen zu evaluieren.

Beide mononukleäre Zellpopulationen (HUCB und MBM) konnten in einer Zellzahl von 10.000 als ausgeprägte Hypointensität visualisiert werden (Abb. 29 b). Signifikante Unterschiede zwischen den drei Zellpopulationen (ESC, HUCB bzw. MBM) hinsichtlich der Ausdehnung der Hypointensitäten konnten nicht festgestellt werden, obgleich zu bemerken ist, dass zur vergleichbaren magnetischen Markierung der mononukleären Zellen wesentlich höhere VSOP-Inkubationskonzentrationen benötigt wurden (siehe oben).

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Das kernspintomographische Detektionslimit aller drei Zellpopulationen liegt bei 7 T bei ca. 300 Zellen, in Abbildung 29 a stellen sich 500 magnetisch markierte mononukleäre Zellen als deutliches hypointenses Depot dar.

Abbildung 29: T2*-gewichtete Bildgebung bei 7 T in vivo 1 h nach intrastriataler Transplantation von magnetisch markierten mononukleären Zellen.

a) Transplantation von 500 magnetisch markierten Knochenmarkszellen der Ratte (MBM), gelöst in 2 µl NaCl und inkubiert mit 6 mM VSOP.
b) Injektion von 10.000 magnetisch markierten Knochenmarkszellen der Ratte (MBM) (solider Pfeil) bzw. 10.000 magnetisch markierter humaner Zellen aus der Nabelschnur (HUCB)(gepunkteter Pfeil), inkubiert mit 6 mM VSOP.

Zusammenfassend zeigen die Versuche bei einer Feldstärke von 7 T (Bruker Pharmascan) ein Detektionslimit intracerebral injizierter Zellen von ca. 300, bei klinischen Feldstärken von 1,5 T (Siemens Sonata) von ca. 1000. Bei Höchstfeldstärken von 17,6 T liegt das Detektionslimit wie oben dargelegt bei unter 100 Zellen.

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Bei der Modellierung dieser Abhängigkeit konnte bei einer monoexponentiellen Kurvenanpassung ein quadratischer Korrelationskoeffizient von 0,98 erreicht werden (Abb. 30), dieser lag bei der Annahme eines linearen Zusammenhanges lediglich bei 0,77.

Abbildung 30: Modellierung des Zusammenhanges des Detektionslimits magnetisch markierter Zellen in vivo von der magnetischen Feldstärke.

Die experimentellen Daten (grün) wurden mit einer monoexponentiellen Funktion approximiert (rot).


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07.11.2006