Transplantation von magnetisch markierten embryonalen Stammzellen im Parkinson Modell der Ratte

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Fragestellung

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Das Ziel jeder intrastriatalen Transplantation von Stammzellen bei Morbus Parkinson ist die Restaurierung dopaminerger Funktionalität. Es ist zurzeit Gegenstand intensiver Forschung, welche Stammzellpopulation – embryonale Stammzellen, fötale Progenitorzellen oder adulte Stammzellen – dazu am besten in der Lage ist. Tierexperimentelle Studien zeigen, dass alle drei Zellpopulationen nach intrastriataler Injektion in unterschiedlichen Graden zu dopaminergen Neuronen differenzieren und sich funktionell in der neuronalen Umgebung des Wirtsorganismus integrieren. Eine Differenzierung embryonaler Stammzellen zu neuronalen Vorläuferzellen vor der Transplantation führt wie oben dargelegt sowohl zu einer deutlichen Verminderung des Risikos einer Teratomentstehung, als auch zu einer signifikanten Erhöhung des Anteils dopaminerger Neuronen. Dennoch wurden hier undifferenzierte embryonale Stammzellen transplantiert. Dies begründet sich darin, dass dopaminerge Vorläuferzellen, obgleich aus der Differenzierung embryonaler Stammzellen entstanden, eine neue Zellpopulation mit ggf. deutlich differenten Eigenschaften hinsichtlich der Aufnahme von Eisenoxidnanopartikeln darstellen. Zur Evaluierung des optimalen Markierungsprotokolles sind hohe Zellzahlen nötig (siehe oben). Diese waren jedoch nach der sechswöchigen Differenzierung von embryonalen Stammzellen mit den vorhandenen Laborkapazitäten nicht zu erreichen. Demzufolge wurden in der folgenden Studie undifferenzierte Stammzellen transplantiert, da der Schwerpunkt dieser Arbeit in der Visualisierung der Lokalisation und Migration der transplantierten Zellen zu sehen ist.

Die Studie sollte die folgenden Fragen beantworten:

5.1  Kernspintomographische Studie über 6 Monate bei 7 T in vivo

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Die kernspintomographischen Aufnahmen eines Kontrolltieres, das eine intrastriatale Injektion von 1 × 105 unmarkierten embryonalen Stammzellen 4 Wochen nach der Läsion des MFB durch 6-OHDA erhalten hatte, zeigte keine Signalauslöschungen, von einer leichten Demarkation des Stichkanals und anatomischen Strukturen abgesehen (Abb. 31 a). Die durch 6-OHDA vermittelte Läsion der Substantia Nigra scheint zu keinen weiteren kernspintomographischen Signalveränderungen zu führen, zumindest nicht in T2 und T2*-gewichteter Bildgebung. Auch die weiteren 5 Kontrolltiere zeigten sich unauffällig, Mikroblutungen traten nicht auf. 1 × 104 magnetisch markierten Zellen lassen sich als deutliche Hypointensität abgrenzen. Es zeigt sich eine homogene Signalauslöschung entlang des Stichkanals (Abb. 31 b). Nach der Injektion von 1 × 105 Zellen stellen sich ausgeprägte Hypointensitäten dar (Abb. 31 c), besonders zu beachten ist die deutliche Verbreiterung der Signalauslöschungen im Bereich des Corpus Callosum.

Abbildung 31: In vivo MRT 4 Wochen nach Transplantation von NaCl (a), 10.000 (b) bzw. 100.000 (c) magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten.

Das Injektionsvolumen betrug 2 µl, Zellen gelöst in NaCl. Die räumliche Auflösung beträgt 137×137×420 μm.

An der Grenzschicht der Signalauslöschungen zum umgebenden Hirnparenchym ist eine hyperintense Grenzschicht sichtbar. Diese hyperintensen Artefakte sind typisch für Bereiche in denen es zu sprunghaften Änderungen der magnetischen Suszeptibilität kommt.

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Abbildung 32 zeigt die T2*-gewichtete kernspintomographische Visualisierung von 100.000 magnetisch markierten Zellen zwei Tage, acht Wochen und 16 Wochen nach Transplantation. Die untere Bildreihe zeigt die auf Schwellenwerten der normierten Signalintensitäten basierte 3D Volumenrekonstruktion mittels des Visualisierungs- und Analysesoftware Amira. Es zeigte sich zwei Tage nach Transplantation eine ausgeprägte Hypointensität entlang des Stichkanals, wobei sich im Bereich des Corpus Callosum eine signifikante Verbreiterung der hypointensen Struktur darstellt. Es ergeben sich nach der 3D Volumenkonstruktion eine Anzahl von 976 hypointensen Voxeln (7,7 mm3). Das injizierte Volumen der Zellsuspension betrug 2 µl bzw. 2 mm3.

Abbildung 32: In vivo MRT bei 7T nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum einer 6-OHDA-läsionierten Ratte.

Das Injektionsvolumen betrug 2 µl, Zellen gelöst in NaCl.
a) Zwei Tage nach Transplantation,
b) 8 Wochen n.T.,
c) 16 Wochen n.T.
Die räumliche Auflösung beträgt 137×137×420 μm, 3D-Volumenrekonstruktion mit Amira.

Acht Wochen nach Transplantation zeigt sich eine Volumenvergrößerung der Hypointensität, es ergeben sich 1467 hypointense Voxel (11,6 mm3), dies entspricht einer Volumenzunahme von 50 %. Die hypointense Struktur hat sich deutlich verbreitert. 16 Wochen nach Transplantation hingegen zeigt sich eine signifikante Verringerung des hypointensen Volumens, es ergeben sich nur noch 671 hypointense Voxel (5,4 mm3), deutlich unterhalb des Volumens zwei Tage nach der Injektion. Die Volumenmessungen nach 24 Wochen zeigen keine signifikanten Volumenänderungen im Vergleich zur Situation nach 16 Wochen. Die Analyse der weiteren 5 experimentellen Tiere ergibt ein vergleichbares Bild, eine deutliche Volumenzunahme der beobachteten Hypointensitäten in der zweiten und dritten kernspintomographischen Studie nach Transplantation, und eine darauf folgende Reduktion nach 16 Wochen, keine signifikante Veränderung nach 24 Wochen. Darüber hinaus zeigen sich weder bei dem unten dargestellten Tier noch bei den übrigen Tieren signifikante Änderungen der räumlichen Verteilung der Hypointensitäten.

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Jedoch zeigten sich signifikante interindividuelle Unterschiede. So zeigt Abb. 33 drei verschiedene Tiere zum gleichen Zeitpunkt nach Transplantation, die Transplantation erfolgte zu den gleichen stereotaktischen Koordinaten. Im Tier a (d) stellt sich eine Verteilung der Hypointensitäten entlang des Stichkanals dar, ähnlich des obigen Tieres, jedoch findet sich eine deutliche Verteilung entlang des Corpus Callosum.

Tier b (e) zeigte hingegen praktisch keine Signalauslöschungen im Bereich des Striatums, beinahe die gesamte Hypointensität ist im Bereich des Balkens lokalisiert. Besonders deutlich wird dies in der Volumenrekonstruktion (e), hier zeigt sich darüber hinaus ein kleineres abgegrenztes Depot am lateralen Ende des Corpus Callosum (Pfeil). Das Tier c (f) hingegen zeigt die räumlich am weitesten ausgedehnte Verteilung, neben Verteilungen entlang des Balkens findet sich eine flächige Struktur im Bereich des gesamten Stichkanals.

Abbildung 33: a – c: In vivo MRT 8 Wochen nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten. d – f: Volumenrekonstruktion der hypointensen Struktur als farbiges 3D-Objekt (Amira)

5.2 Funktionelle Korrelation

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Um eine funktionelle Restauration der motorischen Funktionen durch die Transplantation der magnetisch markierten Stammzellen zu erfassen, wurde das amphetamininduzierte Rotationsverhalten der Tiere vor und nach Transplantation gemessen. Vor Transplantation zeigten beide experimentelle Gruppen eine durchschnittliche Zahl von ca. 11 Rotationen / min. Bei einer funktionellen Dopaminausschüttung ist eine Reduktion der Rotationszahl zu erwarten. Dahingegen zeigen beide Gruppen nach der Transplantation von magnetisch markierten Stammzellen bzw. NaCl eine weitere Verschlechterung der motorischen Störung, im Durchschnitt ergaben sich 15 Rotationen / min, wobei sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen feststellen ließ (Abb. 34). Die Transplantation von 1 × 105 magnetisch markierten Stammzellen vermochte somit keine Verbesserung der motorischen Funktionalität zu erreichen.

Abbildung 34: Amphetamininduzierte Rotation vor bzw. nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bzw. NaCl (Kontrollen).

5.3 Histologische Korrelation und Charakterisierung

Zur Klärung der Frage, inwieweit die beobachteten Hypointensitäten in der kernspintomographischen Bildgebung auch nach einer Studiendauer von sechs Monaten noch ein zelluläres Korrelat besitzen, wurde eine umfangreiche Analyse des histologischen Materials durchgeführt. Dabei wurden sowohl horizontale als auch frontale Gefrierschnitte in einer Dicke von 20 µm angefertigt. Da die embryonalen Stammzellen neben ihrer magnetischen Markierung auch stabil GFP (green fluorescent protein) exprimieren, wurde zunächst mittels confocaler Laser Scanning Mikroskopie nach nativer GFP-Fluoreszenz gesucht, um das Transplantat zu lokalisieren.

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Abbildung 35: Histologische Korrelation der kernspintomographischen Hypointensitäten mit GFP-positiven Zellen.

a), c): In vivo MRT 8 Wochen nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen.
b), d): Confocale Laser-Scanning Aufnahme der nativen GFP-Fluoreszenz.
b) Frontale Schnittebene, wie in a) schematisch gezeigt.
d) Horizontale Schnittebene, wie in c schematisch gezeigt.
Der Maßstab sind 100 µm.

Es zeigte sich, dass auch 6 Monate nach Transplantation in allen sieben Tieren die Injektionen magnetisch markierter GFP exprimierender Stammzellen erhielten (1 Tier 1 × 104, 6 Tiere 1 × 105 Zellen) zelluläre Strukturen hoher Fluoreszenzemission im für GFP charakteristischen Wellenlängenbereich (500 - 550 nm) gefunden werden konnten.

Abbildung 35 b zeigt eine native confokale Laser Scanning Aufnahme in frontaler Schnittführung. Der Stichkanal ist deutlich als vertikaler Defekt demarkiert. Im Stichkanal sind ca. 30 Zellen mit hoher Fluoreszenzemission abzugrenzen. Im umgebenden Parenchym finden sich vereinzelte Zellen mit vergleichbarer Signalintensität. Auch in horizontaler Schnittführung (Abbildung 35 c) ist der Stichkanal als kleiner zentraler Defekt abzugrenzen. Auch hier finden sich Zellen hoher Fluoreszenzintensität, sowohl direkt im Stichkanal als auch lateral verteilt. Es findet sich jedoch nur in seltenen Fällen eine radiale Dispersion der Zellen, meist ist wie in Abbildung 35 c ersichtlich eine streifenförmige Verteilung der Zellen vorhanden. Dies legt eine Verteilung entlang Bahnstrukturen nahe. Es fanden sich nur vereinzelte fluoreszenzintense Zellen, die nicht in direkter räumlicher Nachbarschaft zum Stichkanal standen. Dabei handelte es sich stets nur um punktuelle Fluoreszenzintensitäten, so dass Artefakte oder Autofluoreszenz in diesen Fällen nicht ausgeschlossen werden konnten. Die maximale Entfernung vom Stichkanal, in der eindeutige zelluläre Signale gefunden wurden, betrug ca. 1 mm. Nach der confokalen Laser Scanning Mikroskopie wurden die Schnitte, in denen GFP-Fluoreszenz detektiert wurde, mittels der konventionellen histochemischen Berliner Blau Färbung behandelt. Diese Färbung stellt eine spezifische und seit langem etablierte Detektionsmethode von sowohl freiem als auch biologisch gebundenem Eisen dar. Es fanden sich klar abgegrenzte zelluläre Strukturen starker blauer Farbintensität (Abbildung 36 a). Eine diffuse bläuliche Färbung, die bei einer extrazellulären Verteilung der Eisenoxidnanopartikel in der extrazellulären Matrix zu erwarten gewesen wäre, konnte nicht festgestellt werden. Das lichtmikroskopische Bild (Abb. 36 a) wurde mit den korrelierenden CLSM-Aufnahmen (Abb. 36 b) überlagert. Diese Überlagerung der beiden voneinander methodisch unabhängigen Bildgebungsmodalitäten zeigt eine Colokalisation der fluoreszenzintensen mit den Berliner Blau positiven Zellen (Abb. 36 c). Es fanden sich nur vereinzelte fluoreszenzintensitäten, die nicht Berliner Blau positiven Signalen zugeordent werden konnten. Es konnten im Umkehrschluss allen Berliner Blau positiven Zellen räumlich korrelierende GFP-Signale zugeordnet werden.

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Abbildung 36: Räumliche Korrelation GFP-positiver mit Eisen-positiver Zellen.

a) Histochemische Berliner Blau Färbung.
b) GFP-positive Stammzellen, detektiert mittels CLSM.
c) Überlagerung beider Bilder.

Zur histologischen Abschätzung der Überlebensrate der transplantierten embryonalen Stammzellen, wurde an einem Tier, dass 1 × 105 Zellen erhielt, eine Quantifizierung anhand der nativen GFP-Fluoreszenz durchgeführt. Eine zelluläre Struktur mit hoher Fluoreszenzintensität im Bereich der GFP-Emission stellt den wahrscheinlichsten Hinweis dar, dass es sich um eine transplantierte, exogene Zelle handelt. Bei der Berliner Blau Färbung kann eine andere Quelle eines positiven Signals, wie z.B. Hämoglobin oder durch sekundäre Phagozytose aufgenommene Eisenoxidpartikel nicht ausgeschlossen werden.

Abbildung 37 stellt die schematische Übersicht der Quantifizierung der GFP-positiven Zellen dar. Es kann sich dabei nur um eine Abschätzung der Zellzahl handeln, eine Auszählung aller 130 verfügbaren Schnitte war nicht zu realisieren. Abbildung 37 a zeigt die Volumenrekonstruktion der T2*-gewichteten Hypointensitäten. Die anhand von anatomischen Strukturen approximierte Position des ersten und letzten untersuchten Schnittes ist dargestellt. Insgesamt konnten in den 130 Schnitten, die mit einer individuellen Schnittdicke von 20 µm somit 2,6 mm des insgesamt 5 mm langen Stichkanals abbilden, 5300 positive Zellen gefunden werden. In den fehlenden 2,4 mm des Stichkanals ist eine Zellzahl gleicher Größenordnung anzunehmen, ausgehend von der räumlichen Verteilung der Hypointensitäten in Abbildung 37 a. Insgesamt ergibt sich somit eine Zellzahl von ca. 10.000, wobei aufgrund der vielen notwendigen Schätzungen und Vereinfachungen von einer Streuung von mindestens 50 % auszugehen ist.

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Abbildung 37: Quantifizierung der GFP-positiven Zellen zur Abschätzung der Überlebensrate der transplantierten Stammzellen.

a) In vivo MRT 6 Monate nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten Stammzellen. Sagittale Schichtführung, T2*-gewichtete Hypointensitäten sind als farbiges 3D-Objekt visualisiert. Die räumliche Korrelation zu den histologischen horizontalen Schnitten ist anhand des ersten untersuchten Schnittes (slice 20) und des letzten untersuchten Schnittes (slice 150) schematisch dargestellt.
b) Grafische Darstellung der Anzahl der GFP-positiver Zellen pro histologischem Schnitt von 20 µm Dicke. Aus praktischen Gründen (Die Untersuchungszeit pro Schnitt betrug ca. 2 h) konnten nicht alle 130 histologischen Schnitte untersucht werden. Die eingefärbten Balken stellen untersuchte Schnitte dar, die hellen Balken stellen die Mittelwerte der Zellzahl des davor bzw. danach liegenden untersuchten Schnittes dar.
c), d), e) Exemplarische Darstellung der CLSM-Aufnahmen, die korrespondieren Schnittnummern sind in b) rot eingefärbt (c) 23, d) 81, e) 147).

Zur phänotypischen Charakterisierung wurden die Gefrierschnitte mit primären Antikörpern spezifisch für embryonale Stammzellen (SSEA1), Makrophagen (CD 11b) und frühe neuronale Marker (Nestin und β-3-Tubulin) inkubiert. Mittels CLSM, einem rot fluoreszierenden sekundären Antikörper und der simultanen Detektion zweier unabhängiger Fluoreszenzbandbreiten, konnte sowohl die native GFP-Fluoreszenz als auch die Fluoreszenz des Sekundärantikörpers detektiert werden.

Abbildung 38: CLSM-Aufnahme eines horizontalen Gefrierschnittes, es ist die Überlagerung beider simultan aufgenommener Fluoreszenzkanäle dargestellt.

Der grüne Kanal ist von der Emission der nativen GFP-Fluoreszenz dominiert, der rote Kanal von der Emission des fluoreszierenden Sekundärantikörpers, gebunden an den Primärantikörper gegen den Makrophagenmarker CD11b. Der Maßstab sind 20 µm.

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In Abbildung 38 stellt sich in horizontaler Schnittebene der Stichkanal als zentraler Defekt dar. Zellen hoher roter Fluoreszenzintensität finden sich kreisförmig um den Stichkanal aggregiert. Es zeigt sich keine Überlagerung der nativen GFP-Fluoreszenz mit der Fluoreszenz des Sekundärantikörpers des Makrophagenmarkers CD11b.

Zur Feststellung des Phänotyps der GFP-positiven Zellen wurde zunächst Antikörper gegen den Stammzellmarker SSEA1 verwendet. Die confokale Analyse zeigte nur sehr vereinzelte SSEA1-Fluoreszenz der GFP-positiven Zellen. Auch eine Colokalisation mit frühen neuronalen Markern wie Nestin und β-3-Tubulin konnte nicht nachgewiesen werden.


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07.11.2006