MRT von systemisch injizierten Vorläuferzellen im Schlaganfallmodell der Maus bei 7 T in vivo

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Fragesstellung

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Die vorangegangenen Untersuchungen zeigten, dass eine nicht-invasive Bildgebung magnetisch markierter Zellen möglich ist, ohne die Zellen bzw. das Wirtsgewebe nennenswert zu belasten. Des Weiteren konnten bereits geringe Zellzahlen sicher nachgewiesen werden, auch die Darstellung von eisenoxidmarkierten Zellen über einen Zeitraum von sechs Monaten konnte gelingen. Diese beiden Grundvoraussetzungen sollten auch eine Bildgebung systemisch injizierter Zellen möglich machen. Hierbei ergeben sich eine Reihe von neuen Schwierigkeiten, so ist im Gegensatz zur direkten intracerebralen Injektion der Ort der Zellaggregation nicht bekannt und die Zellen müssen sicher von pathologischen Veränderungen abgegrenzt werden. Auf der anderen Seite eröffnet eine nicht-invasive Methodik die Möglichkeit, Aussagen über die Dynamik einer Zellaggregation bzw. –migration zu treffen. Bei der experimentellen zellbasierten Therapie der cerebralen Ischämie sind insbesondere Fragen der Dynamik des Einwanderns der injizierten Stamm- bzw. Progenitorzellen von größter Bedeutung. Im Einzelnen stellten sich die folgenden Fragen:

6.1  T2-gewichtete Bildgebung

Nach 30 bzw. 60 minütiger Okklusion der Arteria cerebri media (MCAO) gefolgt von Reperfusion wurden den Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten entweder magnetisch markierte mononukleäre Zellen (MNC) oder NaCl in die Schwanzvene injiziert (siehe Abb. 3). 12 Stunden nach MCAO stellten sich bei allen Tieren in der T2-gewichteten Bildgebung Hyperintensitäten dar, die ihr Maximum nach ca. 48 Stunden erreichten (Abb. 39). Nach 30 minütiger MCAO waren die hyperintensen Signalveränderungen auf das ipsilaterale caudale Putamen beschränkt, wohingegen nach 60 minütiger MCAO zusätzlich Teile des Cortex und der Hippocampus betroffen waren. 4 Tage nach MCAO begannen die Hyperintensitäten zu verblassen, nach 7 bis 10 Tagen zeigten sich an gleicher Lokalisation in den meisten Fällen hypointense Signalveränderungen.

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Abbildung 39: T2 und T2*-gewichtete Bildgebung einer Kontrollmaus im Zeitverlauf nach 30 minütiger MCAO.

24 h nach MCAO stellt sich das ischämische Areal als T2-Hyperintensität dar. Nach 4 Tagen kommt es zu einem Verblassen dieser Hyperintensität und zum Auftreten einer Hypointensität nach ca. 7 - 10 Tagen, diese bleibt bis zum Ende des Experiments konstant. In der T2*-gewichteten Bildgebung ist die Ischämie nicht sicher zu erkennen. Weitere Signalveränderungen abgesehen vom anatomischen Kontrast treten nicht auf.

Hinsichtlich dieser Dynamik der Läsionsentwicklung fanden sich keine Unterschiede zwischen Tieren, denen magnetisch markierten Zellen oder NaCl injiziert wurden. Neben der beschriebenen Läsionsdynamik fanden sich keine weiteren Signalveränderungen in der T2-gewichteten Bildgebung.

6.2 T2*-gewichtete MR-Bildgebung

Bei den Höchstfelduntersuchungen bei 17,6 T zeigte sich, dass bei längeren Echozeiten das Volumen der hypointensen Signalveränderungen in der T2*-gewichteten Bildgebung nach einer lokalen Injektion von magnetisch markierten Zellen ansteigt (siehe oben). Da bei dieser Studie einer hohen Sensitivität eine entscheidende Bedeutung zukommt, wurden zu Beginn der Studie zusätzliche kernspintomographische Messungen bei längeren Echozeiten durchgeführt. Die evaluierten längeren Echozeiten von 10,4 und 15,4 ms führten jedoch zu signifikant niedrigeren Signal-zu-Rausch-Verhältnissen. Darüber hinaus zeigte sich eine hohe Artefaktanfälligkeit, auch in Kontrolltieren stellten sich in der grauen Substanz erhebliche hypointense Signalveränderungen dar. Im Gegensatz dazu zeigte die T2*-gewichtete Bildgebung bei 5,4 ms Echozeit ein signifikant besseres Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Darüber hinaus zeigten sich bei 6 von 9 Kontrolltieren in keinem Bereich des Gehirns zu keinem Zeitpunkt hypointense Signalveränderungen, von anatomischen Strukturen abgesehen. Lediglich in zwei Kontrolltieren stellten sich einige ellipsoide, schattierte, hypointense Signalveränderungen in einer Fläche von ca. 100 Voxeln (ca. 1,8 mm2) dar, ohne räumliche Präferenz über das Gehirn verteilt. Diese Hypointensitäten erstreckten sich nicht weiter als über eine Schichtdicke (0,4 mm). Die numerische Analyse bestätigte die fluktuierende Natur dieser Hypointensitäten der Kontrollmäuse. Ein weiteres Kontrolltier zeigte scharf abgegrenzte stark hypointense Signalveränderungen im Kernbereich des ischämischen Areals. Diese Signalveränderungen konnten histologisch Mikroblutungen zugeordnet werden (siehe unten).

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Abbildung 40: T2 und T2*-gewichtete Bildgebung einer Maus nach systemischer Injektion von magnetisch markierten MNC 8 h nach Okklusion der MCA.

Die T2-gewichteten Aufnahmen (obere Reihe) zeigen die typische zeitliche Entwicklung einer ischämischen Läsion. Es treten keine zusätzlichen Signalveränderungen auf. In den T2*-gewichteten Aufnahmen (untere Reihe) stellen sich am Tag 1 nach Transfusion hypointense Signalveränderungen in räumlicher Nähe zur ischämischen Läsion dar. Am Tag 2 erreichen sie ihre maximale Intensität.

Im Gegensatz dazu zeigten sich ca. 48 h nach der Injektion der magnetischen markierten Vorläuferzellen bei 13 der 20 Tiere hypointense Signalveränderungen (Abb. 40). Diese stellten sich im Randbereich der ischämischen Läsion dar, und zwar sowohl striatal (30 und 60 min MCAO) als auch cortical (60 min MCAO). Die durchschnittliche Fläche der runden bis ellipsoiden Signalauslöschungen betrug 80-100 Voxel (0,18 bis 1,4 mm2) in der Bildebene, sie erstreckten sich über zwei Schichtdicken (ca. 0,8 mm). In Abgrenzung zu den beobachteten Signalveränderungen der Kontrolltiere (siehe oben); i) entwickelten sie sich nur nach der Injektion der Zellen; ii) blieben in Lokalisation und Intensität konstant über alle kernspintomographischen Untersuchungen.

Abbildung 41: Numerische Analyse der normierten Signalintensitäten in definierten hypointensen regions-of-interest.

a) Dynamik der mittleren Signalintensität bei einer Maus nach Injektion magnetisch markierter MNC: Es stellt sich ein deutlicher Signalabfall in der ersten drei Tagen dar, die Hypointensität bleibt über den gesamten Untersuchungszeitraum konstant.
b) Dynamik der mittleren Signalintensität einer Hypointensität in einer Kontrollmaus. Es stellt sich keine vergleichbare Dynamik dar.

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Um die Dynamik der Entwicklung der oben beschriebenen hypointensen Signalverläufe zu erfassen, wurden die T2*-gewichteten Aufnahmen aller Messzeitpunkte normiert und coregistriert. Hypointense Signalveränderungen am Tag vier nach Transplantation wurden visuell identifiziert und regions-of-interest (ROI) definiert. Die ROI wurde nun auf die früheren und späteren Messungen übertragen. Somit ist der zeitliche Verlauf der mittleren Signalintensität zu erfassen. In Abbildung 41 zeigt sich ein signifikanter Unterschied zwischen den vereinzelten Hypointensitäten, die in drei Kontrollmäusen beobachtet wurden (Abb. 41 b) und den Hypointensitäten die sich nach 24 - 48 h bei den Tieren entwickelten, denen magnetisch markierte Zellen injiziert wurden (Abb. 41 a). Die numerische Analyse dieser Signalveränderungen zeigt einen signifikanten Abfall der T2*-Signalintensität, die ihr Minimum nach 96 h erreicht und über alle folgenden Messungen stabil bleibt.

Abbildung 42: T2- bzw. T2*-gewichtete Bildgebung 4 Tage nach 30 minütiger MCAO und Injektion magnetisch markierter Vorläuferzellen (Gruppe3, Kategorie ++).

Im T2-gewichtetem Bild (a) stellt sich die Läsion als hyperintenses Areal in der linken Hemispäre dar (Pfeil). Die T2*-gewichtete Bidgebung (b) zeigt hypointense Signalveränderungen in der linken Hemisphäre. Die Volumenrekonstruktion der T2-gewichteten Hyperintensitäten grenzt das ischämische Areal als rotes 3D-Objekt ab. Die T2*-Hypointensitäten sind als graues 3D-Objekt dargestellt. Die Zusammenführung beide Objekte im gleichen Bildraum (c, d) zeigt, dass die T2*-Hypointensitäten räumlich direkt dem ischämischen Areal anliegen, eine Colokalisation liegt jedoch nicht vor.

Interessanterweise erstreckten sich die beobachteten Hypointensitäten niemals bis in den Kernbereich des ischämischen Areals (Abb. 42). Bei 3 der 13 Tiere entwickelten sich zusätzlich Hypointensitäten um den dritten Ventrikel und um den kontralateralen lateralen Ventrikel herum. Injektion von freiem VSOP führte in einer Dosis vergleichbar zu der zellulär aufgenommenen Menge zu keinen Signalveränderungen.

6.3  Histologische Korrelation

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Innerhalb von 24 h nach der letzten kernspintomographischen Untersuchung wurden die Tiere getötet und die Gehirne histologisch aufgearbeitet. Es wurden coronale Schnitte in einer Dicke von 40 µm angefertigt und jeder 5. Schnitt wurde zur Detektion eisenoxidmarkierter Zellen mit der Berliner Blau Färbung behandelt. Zusätzlich wurden bei dem Vorhandensein Berlin Blau positiver Zellen die jeweils benachbarten Schnitte gefärbt.

Bei 8 der 9 Kontrolltiere wurden keine Berliner Blau positive Zellen gefunden, dies beinhaltet auch die beiden Tiere, die transiente Hypointensitäten aufwiesen. Im Gegensatz dazu zeigte das Kontrolltier mit den stark abgegrenzten Signalauslöschungen eine Nekrose im Bereich der MCA Okklusion, multiple Mikroblutungen und eine signifikante Anzahl Berliner Blau positiver Zellen.

Abbildung 43: T2*-Hypointensitäten nach MCAO und Injektion magnetisch markierter Zellen (Gruppe 4, Kategorie +++) mit korrespondierender Histologie.

a) T2*-gewichtete Bildgebung 4 Tage nach Injektion der Zellen. Es sind mehrere hypointense Areale in der linken ischämischen Hemisphäre zu sehen. Berliner Blau positive Zellen finden sich in räumlicher Korrelation zu den T2*-gewichteten Hypointensitäten.
b) Überblick,
c) 100 ×,
d) 400 ×.

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In allen 20 Tieren denen VSOP-markierte MNC injiziert wurden, fanden sich zumindest vereinzelte Berliner Blau positive Zellen. Jedoch zeigte sich eine große interindividuelle Variabilität, neben einzelnen positiven Zellen fanden sich auch Zellaggregate mit 50-100 Zellen pro histologischem Schnitt. Diese Zellaggregate fanden sich jedoch nur in jenen 13 Tieren, in denen sich auch deutliche T2*-gewichtete Hypointensitäten darstellten. Alle Aggregate von 10 oder mehr Zellen pro histologischem Schnitt konnten zu T2*-Signalauslöschungen räumlich korreliert werden. In der Gruppe der 7 Tiere, die nach der Injektion von VSOP-markierten MNC keine T2* Signalveränderungen aufwiesen, fanden sich auch nur einzelne Berliner Blau positiven Zellen. Nichtsdestotrotz konnten lediglich ca. 80 % aller Hypointensitäten eindeutig mit Berliner Blau positiven Zellen räumlich korreliert werden.

Abbildung 44: Multimodale Korrelation des T2*-gewichteten hypointensen kernspintomographischen Signals.

a) Kernspintomographsche Bildgebung 4 Tage nach Injektion magnetisch markierter MNC, es stellt sich eine kleine hypointense Struktur dar (Pfeil).
b) Histologisch finden sich Berliner-Blau positive Zellen in räumlicher Korrelation zum MR-Signal (100 ×).
c) CLSM-Aufnahme nativer GFP Fluoreszenz des benachbarten histologischen Schnittes. Der Maßstab sind 30 µm.
d) CLSM-Aufnahme nach Inkubation mit Iba 1 Antikörper, die GFP-positiven Zellen zeigen keine Doppelfärbung. Der Maßstab sind 15 µm.

6.4 Vergleich der Transplantationsprotokolle

Zwischen den verschiedenen Transplantationsprotokollen fanden sich signifikante Unterschiede hinsichtlich der Anzahl, der Ausdehnung und der Signalintensität der T2*-gewichteten Hypointensitäten. Demzufolge wurde ein semiquantitatives Bewertungssystem entwickelt (Kategorien 0, +, ++, +++) um für jedes Tier das Ausmaß der T2*-Hypointensitäten bzw. der damit korrelierenden Anzahl Berliner Blau positiver Zellen festzulegen.

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Tabelle 3: Semiquantitativer Vergleich der Effektivität der verschiedenen Zeitpunkte der Injektion mononukleärer Zellen nach Induktion der cerebralen Ischämie.

Gruppe

Kat. 0

Kat. +

Kat. ++

Kat. +++

1 (30 min, 0,5 h)

1

2

1

-

4

2 (30 min, 8h)

1

-

4

-

5

3 (30 min 24h)

4

1

1

-

6

4 (60 min, 8h)

1

-

1

3

5

7

3

7

3

20

Wie in Tabelle 3 ersichtlich finden sich die höchsten Bewertungen (Kategorien ++ und +++) bei Tieren der Gruppen 1 und 4, sie erhielten die Zellen 8 h nach Okklusion der MCA. Innerhalb dieser beiden Gruppen zeigten die Tiere mit einer 60 minütigen Okklusion der MCA (Gruppe 4) die weitaus besten Ergebnisse (Kategorie +++). Im Gegensatz zeigten die Tiere der Gruppe 3 (30 min. MCAO, Injektion der Zellen nach 24 h) die niedrigsten Bewertungen.


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07.11.2006