Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Hans Jürgen Prömel, in Vertretung

• Präambel

• 1  Einleitung

  • 1.1  Zelluläre Magnetresonanztomographie

  • 1.2 Morbus Parkinson und Stammzelltherapie

  • 1.3 Cerebrale Ischämie und Stammzelltherapie

  • 1.4 Zielsetzung der Arbeit

• 2  Material und Methoden

  • 2.1  Zelllinien und Methoden der Zellkultur

  • 2.2 Magnetische Markierung von Zellen

  • 2.3 NMR-Relaxometrie und Atom-Absorptions-Spectroskopie (AAS)

  • 2.4 Confocale Laser-Scanning Mikroskopie

  • 2.5 Präparation der Gelphantome

  • 2.6 Bestimmung der zellulären oxidativen Belastung

  • 2.7 6-OHDA-Läsion der Ratte

  • 2.8 Stereotaktische Transplantation magnetisch markierter Stammzellen

  • 2.9 Amphetamininduzierte Rotation

  • 2.10 Bildgebungsstudie an einem 6-OHDA-Modell der Ratte

  • 2.11 Bildgebungsstudie an einem Mausmodell der cerebralen Ischämie

  • 2.12 Magnetresonanztomographie bei 1,5 und 7 Tesla

  • 2.13 MR-Bildgebung zum zellulären Detektionslimit bei 17,6 Tesla

  • 2.14 Histologie und Immunhistochemie

• 3  Untersuchungen zur magnetischen Markierung von Zellen in vitro durch Eisenoxidnanopartikel

  • 3.1  Magnetische Markierung von Zellpopulationen mit Eisenoxidnanopartikeln VSOP

  • 3.2 Einfluss von Lipofektionsagenzien und Inkubationszeiten auf die intrazelluläre Aufnahme von Eisenoxidnanopartikeln

  • 3.3 Modellierung des Zusammenhanges der Reduktion der T2-Zeiten von der Erhöhung der intazellulären Eisenmenge

  • 3.4 Intrazelluläre Lokalisation des fluoreszenzmarkierten Eisenoxidnanopartikels VSOP C200

  • 3.5 Magnetische Markierung von Zellen als Vitalitätsmarker in vitro und in vivo

  • 3.6 Vitalitäts- und Proliferationsassays

  • 3.7 Untersuchungen zum oxidativen Stress in vitro

  • 3.8 Einfluss der magnetischen Markierung auf die Differenzierungsfähigkeit embryonaler Stammzellen

• 4  Detektionslimit magnetisch markierter embryonaler Stammzellen in vitro und in vivo – MR-Tomographie bei 1,5 T, 7 T und 17,6 T

  • 4.1  Kernspintomographische Bildgebung VSOP-markierter Zellen in einer Gelmatrix

  • 4.2 Detektionslimit von magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bei 17,6 Tesla in vivo

  • 4.3 Histologische Korrelation und Quantifizierung

  • 4.4 Abhängigkeit des Detektionslimits magnetisch markierter Zellen von der Feldstärke

• 5  Transplantation von magnetisch markierten embryonalen Stammzellen im Parkinson Modell der Ratte

  • 5.1  Kernspintomographische Studie über 6 Monate bei 7 T in vivo

  • 5.2 Funktionelle Korrelation

  • 5.3 Histologische Korrelation und Charakterisierung

• 6  MRT von systemisch injizierten Vorläuferzellen im Schlaganfallmodell der Maus bei 7 T in vivo

  • 6.1  T2-gewichtete Bildgebung

  • 6.2 T2*-gewichtete MR-Bildgebung

  • 6.3  Histologische Korrelation

  • 6.4 Vergleich der Transplantationsprotokolle

• 7  Diskussion

  • 7.1  Zelluläre magnetische Markierung

  • 7.2 Kernspintomographische Visualisierung magnetisch markierter Zellen

  • 7.3 Zelluläre Magnetresonanztomograpie an Kleintiermodellen des Morbus Parkinson sowie der cerebralen Ischämie

  • 7.4 Ausblick

• Literaturverzeichnis

• Abkürzungsverzeichnis

• Danksagung

• Eidesstattliche Erklärung

• Publikationen

• Tabelle 1: Physikochemische Eigenschaften des Eisenoxidnanopartikels VSOP C200

• Tabelle 2: Zellspezifischer Zusammenhang zwischen T2-Zeiten und absoluten Eisenmengen

• Tabelle 3: Semiquantitativer Vergleich der Effektivität der verschiedenen Zeitpunkte der Injektion mononukleärer Zellen nach Induktion der cerebralen Ischämie.

• Abbildung 1: Experimentelles Grundkonzept des vorliegenden Ansatzes zellulärer Magnetresonanzbildgebung.

• Abbildung 2: Schematische Darstellung des experimentellen Ablaufs der Visualisierungsstudie magnetisch markierter embryonaler Stammzellen in einem Rattenmodell des Morbus Parkinson.

• Abbildung 3: Schematischer Überblick über den zeitlichen Ablauf der Induktion der Ischämie (MCAO), der Injektion der mononukleären Zellen (MNC) und der kernspintomographischen Bildgebung.

• Abbildung 4: Inkubation primärer embryonaler Mittelhirnzellen der Ratte (E 14) (2,5 × 10⁶ Zellen pro Ansatz) mit zwei verschiedenen zitratbeschichteten Eisenoxidnanopartikeln VSOP C184 und VSOP C200.

• Abbildung 5: Messungen der T2-Relaxationszeiten (a) bzw. der aufgenommenen Eisenmenge (b) einer Zellsuspension von jeweils 0,6 × 10⁶ muriner embryonaler Stammzellen (ESC), humaner Nabelschnurblutzellen (HUCB) sowie Knochenmarkszellen der Ratte (MBM).

• Abbildung 6: Stabilität der zellulären magnetischen Markierung. Schwarze Balken stellen die Relaxationszeiten der Kontrolle (unmarkierter Makrophagen) dar.

• Abbildung 7: Abhängigkeit der intrazellulären Aufnahme des Eisenoxidnanopartikels VSOP C200 von der Inkubationszeit und der Coinkubation mit dem Lipofektionsagenz FuGENE. 0,6 × 10⁶ murine embryonale Stammzellen wurden für 1,5, 4 bzw. 24 h mit 1,5 mM VSOP oder mit 1,5 mM VSOP und 6 µl FuGENE inkubiert.

• Abbildung 8: Lichtmikroskopische Aufnahmen (100 ×) muriner embryonaler Stammzellen.

• Abbildung. 9: Exponentielle Kurvenanpassung der Abhängigkeit der T2-Zeit von der Menge an aufgenommenem Eisen.

• Abbildung 10: Confokale Fluoreszenzaufnahmen embryonaler Stammzellen nach Inkubation mit fluoreszenzmarkierten Eisenoxidpartikeln.

• Abbildung 11: a) Messung der T2 Relaxationszeit von Makrophagen der Ratte (Zelllinie RAW; 0,8 × 10⁶ Zellen pro Ansatz). Zellen wurden nach der Inkubation mit VSOP C200 für 90 min entweder vital oder lysiert gemessen. Zelllyse durch osmotischen Schock wurde durch Zugabe von 1M NaCl induziert. b) Prozentuale Änderung der T2-Relaxationszeiten magnetisch markierter Makrophagen nach Lyse der Zellen bei verschiedenen VSOP Konzentrationen.

• Abbildung 12: a) T2-gewichtete axiale MR-Aufnahme bei 7T. Schichtphantom mit 10.000 Zellen aus dem Knochenmark, magnetisch markiert mit 1,5 mM VSOP, eingebettet in 100 µl Gelmatrix. Räumliche Auflösung 137×137×600 μm. b) T2-Karte berechnet durch monoexponentielle Anpassung von T2-gewichteten Multiechoaufnahmen mit 8 Echos (Matlab).

• Abbildung 13: T2 Karten in vivo nach der Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten.

• Abbildung 14: a) Vitalitätsfärbung unmarkierter embryonaler Mittelhirnzellen (Kontrolle). b) Vitalitätsfärbung embryonaler Mittelhirnzellen 24h nach Inkubation mit 8 mM VSOP C200 für 90 min.

• Abbildung 15: Vitalitätsbestimmung dreier Zellpopulationen mittels Trypanblautest: humaner Nabelschnurzellen (HUCB), Knochenmarkszellen der Ratte (MBM) sowie muriner embryonaler Stammzellen (ESC).

• Abbildung 16: Proliferationskurven magnetisch markierter (grün) bzw. unmarkierter Makrophagen in den ersten drei Tagen nach der Inkubation.

• Abbildung 17: Messung der Malondialdehydkonzentration direkt bzw. 24 h nach der Inkubation von Makrophagen (RAW) mit Eisenoxidnanopartikeln.

• Abbildung 18: Applikation von Anti-Oxidantien während der Inkubation von Makrophagen mit Eisenoxidnanopartikeln.

• Abbildung 19: FACS-Messungen muriner embryonaler Stammzellen nach Inkubation mit VSOP.

• Abbildung 20: Murine embryonale Stammzellen in der ersten Phase der Differenzierung, in der Bildmitte ist ein embrioid-Körper (embryoid body, EB) zu sehen. Durchlichtmikroskopie 100 ×.

• Abbildung 21: Überlagerung durchlicht- und fluoreszenzmikroskopischer Aufnahmen vordifferenzierter embryonaler Stammzellen.

• Abbildung 22: T2* gewichtete MR-Aufnahmen bei 17,6 T von Gelphantomen mit injizierten magnetisch markierten embryonalen Stammzellen.

• Abbildung 23: T2*-gewichtete Aufnahmen bei 7 T von einem Schichtphantom. Es wurden drei Schichten von 10.000, 1000 und 100 humanen mononukleären Zellen aus der Nabelschnur (HUCB) in das Gel eingebracht.

• Abbildung 24: a) T2* gewichtete MR Aufnahme bei 17,6 T nach Injektion von 120.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen. b) Die 3D-Rekonstruktion der Hypointensitäten (rot) zeigt die Verteilung der Zellen im Injektionskanal und im Ventrikel. Die räumliche Auflösung beträgt 98 µm.

• Abbildung 25: T2*-gewichtete MR-Aufnahmen bei 17,6 T in vivo nach intrastriataler injektion von a) 1000, b) 100 magnetisch markierten bzw. c) 1000 unmarkierten Stammzellen.

• Abbildung 26: Histologische Untersuchung einer Ratte nach der intrastriatalen Injektion von 1000 magnetisch markierten Stammzellen.

• Abbildung 27: In vivo MRT 1h nach intrastriataler Injektion von a) 50.000 bzw. b) 2.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bei 1,5 T. Räumliche Auflösung 300×300×500 μm.

• Abbildung 28: a), b), In vivo MRT bei 7 T 4 Monate nach der Transplantation von 10.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum einer gesunden Ratte.

• Abbildung 29: T2*-gewichtete Bildgebung bei 7 T in vivo 1 h nach intrastriataler Transplantation von magnetisch markierten mononukleären Zellen.

• Abbildung 30: Modellierung des Zusammenhanges des Detektionslimits magnetisch markierter Zellen in vivo von der magnetischen Feldstärke.

• Abbildung 31: In vivo MRT 4 Wochen nach Transplantation von NaCl (a), 10.000 (b) bzw. 100.000 (c) magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten.

• Abbildung 32: In vivo MRT bei 7T nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum einer 6-OHDA-läsionierten Ratte.

• Abbildung 33: a – c: In vivo MRT 8 Wochen nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen in das Striatum von 6-OHDA-läsionierten Ratten. d – f: Volumenrekonstruktion der hypointensen Struktur als farbiges 3D-Objekt (Amira)

• Abbildung 34: Amphetamininduzierte Rotation vor bzw. nach Transplantation von 100.000 magnetisch markierten embryonalen Stammzellen bzw. NaCl (Kontrollen).

• Abbildung 35: Histologische Korrelation der kernspintomographischen Hypointensitäten mit GFP-positiven Zellen.

• Abbildung 36: Räumliche Korrelation GFP-positiver mit Eisen-positiver Zellen.

• Abbildung 37: Quantifizierung der GFP-positiven Zellen zur Abschätzung der Überlebensrate der transplantierten Stammzellen.

• Abbildung 38: CLSM-Aufnahme eines horizontalen Gefrierschnittes, es ist die Überlagerung beider simultan aufgenommener Fluoreszenzkanäle dargestellt.

• Abbildung 39: T2 und T2*-gewichtete Bildgebung einer Kontrollmaus im Zeitverlauf nach 30 minütiger MCAO.

• Abbildung 40: T2 und T2*-gewichtete Bildgebung einer Maus nach systemischer Injektion von magnetisch markierten MNC 8 h nach Okklusion der MCA.

• Abbildung 41: Numerische Analyse der normierten Signalintensitäten in definierten hypointensen regions-of-interest.

• Abbildung 42: T2- bzw. T2*-gewichtete Bildgebung 4 Tage nach 30 minütiger MCAO und Injektion magnetisch markierter Vorläuferzellen (Gruppe3, Kategorie ++).

• Abbildung 43: T2*-Hypointensitäten nach MCAO und Injektion magnetisch markierter Zellen (Gruppe 4, Kategorie +++) mit korrespondierender Histologie.

• Abbildung 44: Multimodale Korrelation des T2*-gewichteten hypointensen kernspintomographischen Signals.