Aus dem Institut für Medizinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Gestörte Homöostase von Inflammation und Antiinflammation bei Risikopatienten nach Herzchirurgie:

Standardisiertes Immunmonitoring zur Prädiktion infektiöser Komplikationen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von Jens-Christian Strohmeyer
aus Paderborn

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Hans-Dieter Volk
2. Prof. Dr. med. Michael Bauer
3. Priv.-Doz. Dr. med. habil. Ulrich Sack

Datum der Promotion: 07.02.2006

Abstrakt

Kardiochirurgische Eingriffe unter Einsatz der Herzlungenmaschine führen über die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren im allgemeinen zu einer systemischen Entzündung (SIRS). Um das Ausmaß zu begrenzen, wird diese von einer systemischen Gegenregulation (CARS) begleitet, die mit zunehmender Ausprägung den Organismus anfällig für sekundäre Infektionen macht. Septische Krankheitsbilder zählen zu den häufigsten Todesursachen auf operativen Intensivstationen mit jährlichen Kosten in Milliardenhöhe. Gerade die Früherkennung ist klinisch von größter Wichtigkeit. Bei der Suche nach neuen Infektionsmarkern ist das Verständnis der immunologischen Grundlagen eine Grundvoraussetzung. In dieser Studie sollte untersucht werden, ob das Modell „systemische Immunaktivierung – Gegenregulation mit Immundepression – hohe Infektanfälligkeit“ auf Risikopatienten nach Herzchirurgie übertragen werden kann. Außerdem sollte untersucht werden, ob ein standardisiertes Immunmonitoring in der Lage ist, bei diesen Patienten Infektionen frühzeitig vor klinischer Manifestation vorherzusagen, und ob diese neuen Immunparameter konventionellen Routine-Infektionsmarkern (SIRS-Kriterien, CRP) in ihrer diskriminativen Aussagekraft überlegen sind. Die Ergebnisse zeigen, dass das Modell an diesem Patientenkollektiv bestätigt werden kann. Die Immunaktivierungsmarker total-IL-8 (nach Erythrozytenlyse), PCT und ex vivo Elastase, sowie das antiinflammatorische IL-10 im Plasma und der Immunkompetenzmarker HLA-DR auf Monozyten zeigten am 1. postoperativen Tag ein hohes diskriminatives Potential, Infektionen im 6-tägigen postoperativen Verlauf vorherzusagen. Analysen der ROC-Kurven ergaben für HLA-DR eine AUC von 0,75, die AUC von total-IL-8 betrug 0,73, ex vivo Elastase erreichte 0,72, und PCT und IL-10 kamen jeweils auf 0,68. Dagegen konnten konventionelle Infektionsmarker nicht signifikant zwischen Patienten mit versus ohne postoperativer Infektion unterscheiden (CRP), beziehungsweise errechnete sich für 2 positive SIRS-Kriterien eine AUC von nur 0,66. Durch die bei einem solchen Patientenkollektiv erstmalige Verwendung hochstandardisierter Messverfahren (exakte Quantifizierung von Oberflächenmolekülen, semi-automatisches ELISA-System) wurde neben einer besseren Quantifizierung der gestörten Homöostase zwischen Inflammation und Antiinflammation eine wichtige Voraussetzung für die klinische Etablierung dieser neuen Marker geschaffen. Auf dieser Basis lassen sich früh identifizierte Risikopatienten adjuvanten Therapieversuchen zuführen.

Eigene Schlagworte: Immunmonitoring, Herzchirurgie, Prädiktion von Infektion, SIRS, CARS, Sepsis, HLA-DR, IL-8, PCT, ex vivo Elastase, IL-10

Abstract

Basically, cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass leads to systemic inflammation (SIRS) by the secretion of proinflammatory mediators. In order to limit its extend, systemic inflammation is associated with systemic counter-regulation (CARS), which, under some circumstances, may lead to high susceptibility of the organism to secondary infections. Septic disease is among the most common causes of death in surgical ICUs, the costs are estimated at several billion Euros per year. The early diagnosis in particular is of great importance clinically. Understanding of the immunologic principles is a basic assumption with regard to finding new markers of infection. This study was performed to determine whether the model “systemic immune activation – counter-regulation and immune depression – high susceptibility to infections” could be transferred to risk patients after cardiac surgery. In addition, a standardized immune monitoring program should be examined regarding its ability to predict infection in this patient population before clinical manifestation. It should also be determined if these new parameters have more discriminative power than conventional routine markers of infection (SIRS, CRP). The results show that this model can be confirmed in this patient collective. On the 1st postoperative day markers of immune activation, total-IL-8 (after lysis of erythrocytes), PCT and ex vivo elastase, as well as anti-inflammatory IL-10 in plasma and the marker of immune competence, HLA-DR on monocytes, have high discriminative potential to predict infections during the 6-day postoperative course. AUCs of the ROC were 0.75 for HLA-DR, 0.73 for total-IL-8, 0.72 for ex vivo elastase, 0.68 for both PCT and IL-10. On the other hand, conventional markers of infection were not able to discriminate significantly between patients with infection versus those without (CRP), or they only had an AUC of 0.66 (for 2 positive SIRS criteria). By using well-standardised laboratory methods (exact quantification of surface molecules, semi-automatic ELISA-system), which were used for the first time in such a patient collective, an important basis for clinical establishing these new markers was created, in addition to a better quantification of the immunologic unbalance (inflammation versus anti-inflammation). Thus, it is possible to supply early identificated risk patients for adjuvant therapy trials.

Keywords: immune monitoring, cardiac surgery, prediction of infection, SIRS, CARS, Sepsis, HLA-DR, IL-8, PCT, ex vivo elastase, IL-10

Inhaltsverzeichnis

• Zusammenfassung
• 1  Grundlagen
  • 1.1 SIRS – CARS – MARS
  • 1.2 Klinische Definitionen
  • 1.3 Herzlungenmaschine als Initiator eines SIRS
• 2 Problemstellung
• 3 Material und Methoden
  • 3.1 Arbeitsmaterialien
  • 3.2 Patienten
  • 3.3 Laborbestimmungen und klinische Datenerhebung
  • 3.4 Durchflusszytometrische Bestimmung von Oberflächenproteinen
  • 3.5 Konzentrationsbestimmungen humoraler Marker mittels ELISA
  • 3.6 Bestimmung der leukozytären mRNA-Expression mittels RT-PCR
    • 3.6.1 Leukozytenpräparation
    • 3.6.2 RNA-Präparation und Quantifizierung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer
    • 3.6.3 Reverse Transkription mit dem „First Strand cDNA-Synthesis Kit”
    • 3.6.4 TaqMan® Real Time Reverse Transkriptase (RT) Polymerase-Kettenreaktion
    • 3.6.5 Etablierung eines Panels
  • 3.7 Exploratorische Analyse (deskriptive Statistik) und Interferenz-Statistik (konfirmatorische Analyse)
• 4  Ergebnisse
  • 4.1 Klinische und paraklinische Einteilung der Patienten
  • 4.2 Werte der gemessenen Parameter
  • 4.3 Untersuchung des gesamten Patientenkollektivs bezüglich Immunaktivierung / Immundeaktivierung
    • 4.3.1 Erhöhung von Immunaktivierungsmarkern in allen Patientengruppen
    • 4.3.2 Immundeaktivierung / Immundepression in allen Patientengruppen
  • 4.4 Paraklinische Patientengruppen: Immunaktivierung und HLA-DR-Erholung
  • 4.5 Differenzierte Untersuchung der verschiedenen klinischen Patientengruppen
    • 4.5.1 Immunaktivierung bei Patienten mit postoperativer Infektion
    • 4.5.2 Immundeaktivierung bei Patienten mit postoperativer Infektion
  • 4.6 ROC-Analysen
    • 4.6.1 Marker bezüglich postoperativer Infektion (Gruppe B und C)
    • 4.6.2 Marker bezüglich bestätigter postoperativer Infektion (Gruppe C)
    • 4.6.3 Marker am Tag 1 bezüglich Infektion ab Tag 2 (Gruppe B und C)
• 5  Diskussion
  • 5.1 Untersuchung des gesamten Patientenkollektivs
    • 5.1.1 Systemische Immunaktivierung des gesamten Patientenkollektivs
    • 5.1.2 Immundepression des gesamten Patientenkollektivs
  • 5.2 Frühe Immunaktivierung am Tag 1 und persistierende Immundepression
  • 5.3 Untersuchung der klinischen Patientengruppen
    • 5.3.1 Erhöhte systemische Immunaktivierung bei Patienten mit postoperativer Infektion
    • 5.3.2 Ausgeprägte Immundepression bei Patienten mit postoperativer Infektion
  • 5.4 Bestätigung des immunologischen Modells
  • 5.5 Immunmarker für die Prädiktion von postoperativer Infektion
  • 5.6 Klinische Relevanz
  • 5.7 Einschränkende Aspekte der Auswertungen
  • 5.8 Schlussfolgerungen und Ausblick
• Abkürzungsverzeichnis
• Referenzen
• Danksagung
• Publikationen und Präsentationen
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1 : Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden.
• Tabelle 2 : Alter (Mediane und Bereiche), Geschlecht, Beobachtungszeit und Todesfälle in den drei Patientengruppen.
• Tabelle 3 : Gruppe C: Kultur-positive Patientengruppe. Material und nachgewiesene Keime.
• Tabelle 4 : Mediane (sowie 25%- und 75%-Perzentile) der gemessenen löslichen Faktoren und ex vivo Stimulationstests in den 3 Patientengruppen, sowie die ex vivo Elastase-Produktion bei 10 präoperativen Patienten. In den Infektionsgruppen (Gruppen B und C) sind signifikant unterschiedliche Werte im Vergleich zur Gruppe A fett dargestellt. Die ex vivo Elastase-Werte der 10 präoperativen Patienten sind signifikant niedriger als die Patientenwerte.
• Tabelle 5 : Mediane (sowie 25%- und 75%-Perzentile) der Oberflächenexpressionen in den 3 Patientengruppen. In den Infektionsgruppen (Gruppen B und C) sind signifikant unterschiedliche Werte im Vergleich zur Gruppe A fett dargestellt.
• Tabelle 6 : Mediane (sowie 25%- und 75%-Perzentile) der leukozytären mRNA-Expressionen am Tag 1 in den 3 Patientengruppen, sowie bei 8 Probanden (jeweils normalisiert auf HPRT). Diejenigen Probandenwerte, die sich signifikant von den Patientenwerten unterschieden, sind fett dargestellt.
• Tabelle 7 : Signifikante Korrelationen zwischen Tag 1-Werten von total-IL-8, PCT und Plasma-IL-10 und der monozytären HLA-DR-Expression an den Tagen 1-6.
• Tabelle 8 : AUC, Sensitivität (Sens.), Spezifität (Spez.), positiv prädiktiver Wert (PPV), negativ prädiktiver Wert (NPV) und Relatives Risiko (RR) von Markern am Tag 1 bezüglich postoperativer Manifestation von Infektion (vermutet (Gruppe B, n=14) oder bestätigt (Gruppe C, n=9)) im 6-tägigen postoperativen Verlauf. Außerdem sind entsprechende Werte für Markerkombinationen angegeben: für das Über- beziehungsweise Unterschreiten von mindestens 2 Schwellenwerten der 3 Marker HLA-DR auf Monozyten, total-IL-8 und ex vivo Elastase, sowie von sowohl HLA-DR UND total-IL-8. Im Vergleich dazu die Darstellung von mindestens 2 positiven SIRS-Kriterien am Tag 1, sowie von CRP.
• Tabelle 9 : AUC, Sensitivität, Spezifität, positiv prädiktiver Wert, negativ prädiktiver Wert und Relatives Risiko von Markern am Tag 1 bezüglich bestätigter Infektion (Gruppe C, n=9). Patienten mit Verdacht auf Infektion wurden von dieser Analyse ausgeschlossen.
• Tabelle 10 : AUC, Sensitivität, Spezifität, positiv prädiktiver Wert, negativ prädiktiver Wert und Relatives Risiko von HLA-DR auf Monozyten und ex vivo Elastase am Tag 1 bezüglich Infektion ab Tag 2 (vermutet (Gruppe B) oder bestätigt (Gruppe C)). Patienten mit Infektion am Tag 1 wurden von dieser Analyse ausgeschlossen (n=6).

Bilder

• Abbildung 1 : Nach schwerer Infektion, Trauma oder großer Operation kommt es zunächst zu einer Phase mit dominierender systemischer Immunaktivierung (SIRS), gefolgt von beziehungsweise einhergehend mit einer Phase dominierender Antiinflammation (CARS), in der der Patient einer erhöhten Infektanfälligkeit ausgesetzt ist. (In Anlehnung an Tom van der Poll, Lancet Infect Dis, 2001 [30])
• Abbildung 2 : Für die Bestimmung von HLA-DR, CD86 und CD71 wurde CD14PerCP-CY5.5 gegen den Side-Scatter aufgetragen, um die Monozyten als „Events“ darzustellen und „gaten“ zu können.
• Abbildung 3 : Für die Bestimmung von CD64 und CD11b auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten wurden die Monozyten (durchgezogene Linie) und die Granulozyten (gepunktete Linie) mit Hilfe ihrer unterschiedlichen Eigenschaften (Granularität und Stärke der CD45-Expression) „gegated“, um sie jeweils gesondert auszuwerten.
• Abbildung 4 : QuantiCALC^TM-Auswertung: Die grünen Punkte auf der Ordinate repräsentieren die mit dem QuantiBRITE^TM-Kit gemessenen Geomeans, die nun der Einheit „Antikörper pro Zelle“ zugeordnet werden können. Auf den Monozyten dieses Patienten befanden sich durchschnittlich 4939 Anti-HLA-DR-Antikörper.
• Abbildung 5 : „Sandwich-Komplex“ bestehend aus am Boden fixierten primären Anti-Elastase-Antikörpern, daran gebundenen Elastase-Molekülen und einem flüchtigen sekundären Anti-Elastase-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Dieses Enzym setzt TMB als Substrat farblich um. Die Stärke der Farbreaktion ist proportional zur Konzentration an Elastase in der Lösung.
• Abbildung 6 : Beginn der Polymerisation. An den am 3´-Ende gebundenen Primer synthetisiert die Taq®-Polymerase einen komplementären neuen Strang. Durch die intakte Sonde wird das Reportersignal vom Quencher durch FET unterdrückt.
• Abbildung 7 : Stößt die Taq®-Polymerase auf die in der Nähe des Primers gelegene Sonde, wird diese durch die 5´3´-Exonukleaseaktivität der Polymerase hydrolysiert, so dass das Reportersignal nun nicht mehr unterdrückt wird und nach Anregung mit einem Argonlaser (488 nm) detektiert werden kann.
• Abbildung 8 : Studienpatienten. Von ursprünglich 97 eingeschlossenen Patienten wurden 56 klinisch ausgewertet.
• Abbildung 9 : Erhöhte total-IL-8-Spiegel (nach Erythrozytenlyse) in allen Patientengruppen, vor allem am ersten postoperativen Tag, gegenüber Referenzwerten. Verglichen mit der Patientengruppe ohne Infektion ergaben sich signifikant erhöhte Werte für Patienten mit Verdacht auf Infektion an den Tagen 1-4, sowie für Patienten mit bestätigter Infektion an den Tagen 1-5 (Kruskal-Wallis, Tage 1, 4 und 5 p<0,05, Tage 2 und 3 p<0,01; Mann-Whitney, Gruppe B versus A Tag 1 p<0,05, Tage 2 bis 4 p<0,01, Gruppe C versus A Tage 1 und 4 p<0,05, Tage 2, 3 und 5 p<0,01).
• Abbildung 10 : Gleichermaßen erhöhte LBP-Plasma-Spiegel in allen Patientengruppen im Vergleich zum Referenzbereich, ohne signifikante Unterschiede zwischen den Patientengruppen.
• Abbildung 11 : Verminderte leukozytäre IL-8-mRNA-Expression aller drei Patientengruppen im Vergleich zu gesunden Probanden (Mann-Whitney, p<0,01). Signifikante Unterschiede zwischen den Patientengruppen bestanden nicht.
• Abbildung 12 : Signifikant erhöhte ex vivo Elastase-Produktion in allen Patientengruppen im Vergleich zu 10 präoperativen Patienten (Mann-Whitney, p<0,01). Patienten mit Verdacht auf Infektion (nicht dagegen Patienten mit bestätigter Infektion) zeigten signifikant erhöhte Werte an beiden gemessenen Tagen im Vergleich zu Patienten ohne Infektion (Kruskal-Wallis, Tag 1 p<0,05, Tag 2 p<0,01; Mann-Whitney, Gruppe B versus A Tage 1 und 2 p<0,01).
• Abbildung 13 : Stark erniedrigte leukozytäre Rantes-mRNA-Expression aller drei Patientengruppen im Vergleich zu gesunden Probanden (Mann-Whitney, p<0,01). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Patientengruppen.
• Abbildung 14 : Erniedrigte monozytäre HLA-DR-Expression in allen Patientengruppen verglichen mit Referenzwerten. Im Vergleich zu Patienten ohne Infektion zeigten Patienten mit Verdacht auf Infektion signifikant erniedrigte Werte an den Tagen 1 und 3, Patienten mit bestätigter Infektion zusätzlich am Tag 5 (Kruskal-Wallis, Tage 1 und 3 p<0,01, Tag 5 p<0,05; Mann-Whitney, Gruppe B versus A Tag 1 p<0,05, Tag 3 p<0,01, Gruppe C versus A Tage 1, 3 und 5 p<0,01).
• Abbildung 15 : Erniedrigte monozytäre CD86-Expression in allen Patientengruppen im Vergleich zu Referenzwerten. Es ergaben sich keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Patientengruppen.
• Abbildung 16 : Erhöhte IL-10-Plasma-Werte bei Patienten mit bestätigter Infektion im Vergleich zur Patientengruppe ohne Infektion (Kruskal-Wallis, p<0,05; Mann-Whitney, p<0,05). Inwieweit auch die Gruppe ohne Infektion über dem Referenzlimit lag, lässt sich aufgrund der unteren Nachweisgrenze von 5 pg/ml nicht eindeutig sagen.
• Abbildung 17 : Erhöhte leukozytäre IL-10-mRNA-Expression aller drei Patientengruppen im Vergleich zu gesunden Probanden (Mann-Whitney, p<0,01). Die Patientengruppe mit bestätigter Infektion zeigte tendenziell höhere Werte als Patienten ohne Infektion, jedoch ohne statistische Signifikanz.
• Abbildung 18 : Erhöhte leukozytäre SOCS-3-mRNA-Expression aller drei Patientengruppen im Vergleich zu gesunden Probanden (Mann-Whitney, p<0,05). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Patientengruppen.
• Abbildung 19 : Signifikant niedrigere HLA-DR-Expression im 6-tägigen postoperativen Verlauf bei erhöhten total-IL-8-Spiegeln am Tag 1 (nonparametrische Varianzanalyse, p<0,01).
• Abbildung 20 : Signifikant niedrigere HLA-DR-Expression im 6-tägigen postoperativen Verlauf bei erhöhten PCT-Werten am Tag 1 (nonparametrische Varianzanalyse, p<0,05).
• Abbildung 21 : Signifikant niedrigere HLA-DR-Expression im 6-tägigen postoperativen Verlauf bei erhöhten Plasma-IL-10-Spiegeln am Tag 1 (nonparametrische Varianzanalyse, p<0,05).
• Abbildung 22 : Erhöhte PCT-Plasma-Spiegel in den Patientengruppen mit Infektion (Gruppen B und C) im Vergleich zu Referenzwerten. Verglichen mit der Patientengruppe ohne Infektion ergaben sich signifikant erhöhte Werte sowohl für Patienten mit Verdacht auf Infektion (Tag 2), als auch für Patienten mit bestätigter Infektion (Tage 1, 2 und 4) (Kruskal-Wallis, Tage 1, 2 und 4 p<0,05; Mann-Whitney, Gruppe C versus A Tag 1 p<0,05, Tage 2 und 4 p<0,01, Gruppe B versus A Tag 2 p<0,05).
• Abbildung 23 : ROC-Kurven der Tag 1-Werte von monozytärem HLA-DR und Plasma-IL-10 bezüglich des Auftretens einer Infektion (vermutet (Gruppe B) oder bestätigt (Gruppe C)) im postoperativen Verlauf. Die AUC von HLA-DR war mit 0,75 unter allen gemessenen Markern am höchsten. Plasma-IL-10 erreichte eine AUC von 0,68.
• Abbildung 24 : ROC-Kurven der Tag 1-Werte von Immunaktivierungsmarkern bezüglich des Auftretens einer Infektion (vermutet (Gruppe B) oder bestätigt (Gruppe C)) im postoperativen Verlauf. Die AUCs betrugen 0,73 für total-IL-8, 0,68 für PCT und 0,72 für ex vivo Elastase.
• Abbildung 25 : ROC-Kurve der Tag 1-Werte von CRP bezüglich des Auftretens einer Infektion (vermutet (Gruppe B) oder bestätigt (Gruppe C)) im postoperativen Verlauf. Die AUC lag lediglich bei 0,58 und war aufgrund des asymptotischen Konfidenzintervalls von 0,42-0,73 nicht signifikant für p<0,05.
• Abbildung 26 : Signifikant niedrigere monozytäre HLA-DR-Expression am Tag 1 bei Patienten mit Infektion (Gruppe B und C) zwischen Tag 2 und Tag 6 (Mann-Whitney, p<0,05).
• Abbildung 27 : Signifikant höhere ex vivo Elastase-Produktion am Tag 1 bei Patienten mit Infektion (Gruppe B und C) zwischen Tag 2 und Tag 6 (Mann-Whitney, p<0,05).
• Abbildung 28 : Schema der unterschiedlichen postoperativen Verläufe. Die Ausprägung der frühen postoperativen Entzündungs- und Stressreaktion prädisponiert für den weiteren klinischen Verlauf.
• Abbildung 29 : Kaplan-Meier Kurven mit dem Prozentsatz an infektfreien Patienten in Abhängigkeit vom Über- / Unterschreiten des Tag 1- Schwellenwertes für das monozytäre HLA-DR. Die Kurven unterschieden sich signifikant voneinander (Log-Rank-Test, p<0,05).
• Abbildung 30 : Kaplan-Meier Kurven mit dem Prozentsatz an infektfreien Patienten in Abhängigkeit vom Über- / Unterschreiten des Tag 1- Schwellenwerte für CRP. Auch in diesem Fall unterschieden sich die Kurven signifikant voneinander (Log-Rank-Test, p<0,05).