Material und Methoden

3.1 Arbeitsmaterialien

▼ 18 (fortgesetzt)

Geräte

 

- FACS-CaliburTM-Durchflusszytometer

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- IMMULITE®

[DPC Biermann; Bad Nauheim, D]

- Beri-Lux Analyzer 250

[Behring; Marburg, D]

- ELISA-Mess-System

[Anthos Labtec Instruments; Salzburg, A]

- Agilent 2100 Bioanalyzer

[Agilent Technologies; Waldbronn, D]

- DNA Thermo Cycler (TC 1)

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

- GeneAmp 5700 Sequenz Detection System

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

- Megafuge 1.0

[Heraeus Sepatech; Osterode, D]

- Kühlzentrifuge CR 422

[Jouan; Saint Nazaire, F]

- Mikrozentrifuge

[Eppendorf; Hamburg, D]

- Brutschrank EG 110 R

[Jouan; Saint Nazaire, F]

- Absaugpumpe Laboport

[Neuberger; Freiburg, D]

- Pipetten

[Eppendorf; Hamburg, D]

  

Verbrauchsmaterialien

 

- Blutentnahme-Monovetten

[Sarstedt; Nümbrecht, D]

- Reaktionsgefäße

[Eppendorf; Hamburg, D]

 

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

 

[Greiner, Frickenhausen, D]

- Pipettenspitzen

[Sarstedt; Nümbrecht, D]

- Pipettierhilfe Pipettus standard

[Hirschmann; Eberstadt, D]

- MicroAmp Optical Tubes

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

- MicroAmp Optical Caps

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

  

Biochemikalien / Reagenzien

 

- Anti-HLA-DR PE / Anti-CD14 PerCP-Cy5.5 - Antikörper

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- Anti-CD86 PE / Anti-CD14 PerCP-Cy5.5 - Antikörper

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- Anti-CD71 PE / Anti-CD14 PerCP-Cy5.5 - Antikörper

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- Anti-CD64 PE / Anti-CD45 PerCP - Antikörper

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- Anti-CD11b PE / Anti-CD45 PerCP - Antikörper

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- FACS®-Lysing-Solution

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- Zell-Lyse-Lösung für IL-8

[Milenia Biotec GmbH; Bad Nauheim, D]

- PBS

[Hausapotheke Charité, Berlin, D]

- Aqua-dest

[Braun; Melsungen, D]

- DEPC

[Sigma; Steinheim, D]

- PMA

[Sigma; Steinheim, D]

- RPMI 1640 Zell-Kultur-Medium

[Biochrom KG; Berlin, D]

- Mercaptoethanol

[Merck; Darmstadt, D]]

- TaqMan®-Mastermix

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

- PCR-Primer

[Metabion; Planegg-Martinsried, D]

- PCR-Sonden

[Eurogentec; Seraing, B]

 

FACS-Puffer, Zusammensetzung:

 

- PBS

[Biochrom KG; Berlin, D]

- 2 % FKS (bezogen auf Volumen)

[Serva; Heidelberg, D]

- 0,1 % NaN3 (bezogen auf Masse)

 
  

NH 4 Cl-Lyse, Herstellung von 1 Liter:

 

- 8,29 g NH4Cl (0,15 M)

[Sigma; Steinheim, D]

- 1 g KHCO3 (10,0 mM)

[Sigma; Steinheim, D]

- 37,2 mg Na2EDTA (0,1 mM)

[Sigma; Steinheim, D]

- 800 ml Aqua-dest

 

- HCl / NaOH - Titration auf einen pH von 7,2 - 7,4

 

- mit Aqua-dest auf 1 Liter auffüllen

 
  

Lösung D, Zusammensetzung:

 

- tri-Natrium-Citrat-Dihydrat

[Merck; Darmstadt, D]

- Guanidin-Isothiocyanat

[Invitrogene GmbH; Karlsruhe, D]

- Na-Lauroylsarcosin

[Sigma; Steinheim, D]

- Citrat

[Sigma; Steinheim, D]

- DEPC-H2O

 
  

Test- / Reaktions-Kits

 

- CaliBRITETM-Beads

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- QuantiBRITETM PE

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- IMMULITE® IL-6 / IL-8 / IL-10 / TNF-α / LBP / CRP

[DPC Biermann; Bad Nauheim, D]

- LUMITEST PCT Assay

[BRAHMS Diagnostica GmbH; Berlin, D]

- ex vivo LPS-Stimulation Kit

[Milenia Biotec GmbH; Bad Nauheim, D]

- PMN Elastase

[Milenia Biotec GmbH; Bad Nauheim, D]

- Absolutely RNA Miniprep Kit

[Stratagene; La Jolla, USA]

- RNA 6000 Nano LabChip® Kit

[Agilent Technologies; Waldbronn, D]

- First Strand cDNA-Synthesis Kit

[Amersham Pharmacia; Uppsala, S]

  

Software

 

- FACSCompTM

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- CellQuestTM

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- QuantiCALCTM

[Becton Dickinson; San Jose, USA]

- GeneAmp 5700 Sequence Detection Software

[Applied Biosystems; Rodgau-Jügesheim, D]

- MS Office 2000

[Microsoft; Redmont, USA]

- Micrografx Designer Version 7

[iGrafx Inc.; Tualatin, USA]

- SPSS 10.0 for Windows

[SPSS Inc.; Chicago, USA]

- MedCalc 6.14 Demo Version

[MedCalc Software; Mariakerke, B]

- SAS Version 8

[SAS Inc., Cary, USA]

- StatXact 5

[Cytel Software Corp., Cambridge, USA]

3.2 Patienten

Von November 2000 bis Oktober 2001 wurden 97 Patienten aus dem Deutschen Herzzentrum Berlin (DHZB) in die Studie eingeschlossen. Einschlusskriterien für die Studie waren ein Alter von mindestens 18 Jahren, elektive Operation unter Einschluss der Herzlungenmaschine und postoperative Verlegung auf die Intensivstation. Ausgeschlossen wurden transplantierte Patienten, Patienten mit bekannter HIV-Infektion oder anderen immunologischen Erkrankungen, sowie Patienten, die präoperativ mit Kortikosteroiden behandelt wurden, dialysepflichtig waren oder klinische Zeichen einer Infektion zeigten. Um eine Population von Patienten mit erhöhtem Risiko für das Auftreten für postoperative Komplikationen (Infektionen) zu erhalten, wurden nur solche Patienten eingeschlossen, die mindestens 70 Jahre alt waren und/oder eine präoperative linksventrikuläre Ejektionsfraktion von <25 % aufwiesen.

▼ 19 

Die Studie wurde von der lokalen Ethik-Kommission genehmigt; Einverständniserklärungen liegen für alle Patienten in schriftlicher Form vor. Außerdem wurden nach Beendigung der Studie bei zehn weiteren Patienten des Deutschen Herzzentrums Berlin, die die genannten Studien-Einschlusskriterien erfüllten, präoperativ jeweils am Abend vor der Operation ex vivo Elastase-Bestimmungen durchgeführt, um Referenzwerte für diesen Test zu erhalten. Hier stimmten die Patienten jeweils mündlich zu. Des weiteren wurden RT-PCR-Kontroll-Messungen an 8 gesunden Probanden durchgeführt.

3.3 Laborbestimmungen und klinische Datenerhebung

Die Oberflächenexpressionen von HLA-DR, CD86, CD71, CD64, CD11b (auf Monozyten), CD64 und CD11b (auf neutrophilen Granulozyten), die PCT- und LBP-Plasma-Spiegel, die total-IL-8-Spiegel nach Erythrozytenlyse sowie die ex vivo -Sekretion von TNF-α wurden postoperativ täglich vom 1. bis zum 3., und wenn möglich bis zum 6. Tag durchgeführt. Ex vivo-Elastase-Sekretion wurde am 1. und 2. postoperativen Tag bestimmt, während die IL-6-, IL-10- und CRP-Plasma-Spiegel sowie die leukozytären mRNA-Expressionen von IL-8, IL-10, SOCS-3, Rantes, TNF-α und HO-1 nur am 1. postoperativen Tag gemessen wurden.

Es sei hinzuzufügen, dass für die mRNA-Expressionsbestimmungen anstatt der 81 Studienpatienten beziehungsweise der 56 klinisch ausgewerteten Patienten nur 58 beziehungsweise 41 Patienten herangezogen wurden, da bei einem Teil der Patienten zu Beginn der Studie keine RNA-Präparation durchgeführt werden konnte. Grund hierfür war die Verwendung einer ungeeigneten Lyselösung.

▼ 20 

Zusätzlich wurden täglich klinische und paraklinische Daten der Patienten bezüglich des Auftretens von Infektion erhoben, insbesondere die Vergabe von Antibiotika, SIRS-Kriterien, mikrobiologische Befunde, Röntgen-Thoraces, vom DHZB bestimmte CRP-Werte, und andere. Auf dieser Grundlage erfolgte die klinische Einteilung der Patienten (Kapitel 4.1).

3.4 Durchflusszytometrische Bestimmung von Oberflächenproteinen

Grundlagen

Mit Hilfe der Durchflusszytometrie ist es möglich, Zellen oder andere Partikel auf der Grundlage von Streulicht und Fluoreszenzeigenschaften zu untersuchen (FACSTM-Methode5). Dabei wird die Suspension, in der die Zellen einzeln vorliegen müssen, durch eine Röhre geleitet und mittels einer Mantelflüssigkeit derartig beschleunigt, dass eine laminare, nicht-turbulente Strömung entsteht. Die Zellen gelangen einzeln nacheinander zum Messpunkt, auf den im Falle des im Rahmen dieser Arbeit verwendeten FACS-CaliburTM-Durchflusszytometers ein Argon-Laserstrahl (Wellenlänge bei 488 nm) fokussiert ist. Dadurch kommt es zur Streuung des Lichtes, die von den physikalischen Eigenschaften der Zellen abhängt und für jede Zelle einzeln von speziellen Photomultipliern (PMTs) detektiert und in ein digitales Signal umgewandelt wird. Es werden zum einen das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) detektiert, welches vor allem von der Zellgröße abhängt, und zum anderen das 90°-Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC), das Aussagen über die innere Struktur der Zelle (Granularität) zulässt. Mit diesen Angaben ist es bereits möglich, die einzelnen leukozytären Populationen (Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten) zu unterscheiden und in einem Diagramm (Scatterplot) darzustellen.

Des weiteren können beispielsweise Antigene (Oberflächenmoleküle) einer Zellpopulation qualitativ und quantitativ untersucht werden, indem die Zellen beziehungsweise ihre zu untersuchenden Antigene mit fluoreszenzmarkierten spezifischen Antikörpern gefärbt werden. Durch das Laserlicht werden die Fluoreszenzmoleküle angeregt und emittieren ihrerseits Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches. Dieses wird nun in 90°-Richtung entsprechend seiner Wellenlänge gefiltert und von zusätzlichen PMTs detektiert. Das FACS-CaliburTM-Durchflusszytometer kann über vier solcher PMTs (FL-1 bis -4) unter anderem die Signale von Fluoreszeinisothiozyanat (FITC, Erfassung durch FL-1, Emissionsmaximum bei 530 nm), Phycoerythrin (PE, von FL-2 erfasst, Emissionsmaximum bei 580 nm), Peridin-Chlorophyll (PerCP, von FL-3 erfasst, Emissionsmaximum bei 670 nm) und Allophycocyanin (APC, von FL-4 erfasst) detektieren.

▼ 21 

Da sich die Lichtemissionen eines Fluoreszenzfarbstoffes über einen größeren Wellenlängenbereich erstrecken und sich die Spektren einiger Farbstoffe überlappen, können die Emissionen eines Farbstoffes auch von anderen als dem einen zugeordneten PMT erfasst werden. Insbesondere FL-2 erfasst neben dem PE-Signal auch Emissionen, die von FITC ausgehen, wodurch die Messwerte verfälscht werden können. Dieses Problem wird elektronisch korrigiert, was als „Kompensation“ bezeichnet wird.

Mit der Auswertungssoftware ist es möglich, die Zellpopulationen in verschiedenen Parameterkombinationen darzustellen und damit Aussagen über Subpopulationen zu machen (Multiparameteranalyse). Darüber hinaus kann die durchschnittliche Menge an markierten Antikörpern pro Zelle absolut quantifiziert werden, indem mit Hilfe synthetischer Partikel (Beads), die eine bestimmte Anzahl an Farbstoffmolekülen auf ihrer Oberfläche tragen, die gemessenen Signale gemäß einer Standardkurve standardisiert werden.

Durchführung

HLA-DR-, CD86- und CD71-Ansätze

▼ 22 

Zu jeweils 50 µl auf Eis gelagerten EDTA-Blutes wurden je 20 µl Antikörperlösung gegeben. Diese enthielt PE-konjugierte Antikörper gegen das jeweilige Antigen und PerCP-CY5.5-konjugierte Antikörper gegen das vor allem auf Monozyten exprimierte Molekül CD14; durch den Cyanofarbstoff CY5.5 wird die Spezifität des Antikörpers für Monozyten zusätzlich erhöht. Es folgte eine 30 minütige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur, danach wurde mit 200 g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Anschließend wurden die Erythrozyten mit 0,5 ml FACS®-Lysing-Solution für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln lysiert, danach wurde zentrifugiert (200 g), der Überstand entfernt. Als letztes wurde mit 1 ml FACS-Puffer gewaschen.

CD64- und CD11b-Ansätze

Es wurden 50 µl auf Eis gelagertes EDTA-Blut (CD64) beziehungsweise Heparin-Blut (CD11b) mit jeweils 20 µl Antikörperlösung gemischt, die PE-konjugierte Antikörper gegen CD64 beziehungsweise CD11b und PerCP-konjugierte Antikörper gegen CD45 als Marker für Leukozyten enthielt. Die Bindung der Antikörper an die Antigene erfolgte auch hier während einer 30 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln, danach wurde bei 200 g zentrifugiert und der Überstand entfernt. Für die Lyse der Erythrozyten wurde 1 ml FACS®-Lysing-Solution hinzugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Ein Waschschritt erfolgte nicht.

Analyse und Auswertung

▼ 23 

Die Messung der Ansätze erfolgte mit einem FACS-CaliburTM Durchflusszytometer und der zum Gerät gehörigen CellQuestTM-Software. An jedem Tag wurde zu Beginn der Messung eine Geräte-Kalibrierung mit dem Programm FACSCompTM und dem „CaliBRITETM-Beads-Kit“ durchgeführt. Dabei wurden synthetische, mit den genannten Fluoreszenzmolekülen bestückte Beads gemessen und die Photomultiplier-Spannungen automatisch eingestellt. Außerdem wurden die elektronische Kompensation und ein Empfindlichkeitstest durchgeführt. Anschließend wurde mit dem „QuantiBRITETM PE-Kit“ die 1:1-Quantifizierung durchgeführt. Dieser Kit enthält vier Populationen von Beads, die jeweils mit einer bestimmten Anzahl von PE-Molekülen bestückt sind. Diese wurden gemessen und die Messwerte (angegeben als geometrische Mittelwerte) der Molekülzahl der jeweiligen Population zugeordnet. Es folgte die Messung der Proben. Schließlich konnte mit dem Programm QuantiCALCTM jede Probe ausgewertet und die durchschnittliche Anzahl gebundener Antikörper pro Zelle angegeben werden.

Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen die Erfassung der Monozyten- und Neutrophilen-Populationen während einer Messung, Abbildung 4 zeigt beispielhaft die Auswertung einer Monozyten-Population mit QuantiCALCTM.

Abbildung 2 : Für die Bestimmung von HLA-DR, CD86 und CD71 wurde CD14PerCP-CY5.5 gegen den Side-Scatter aufgetragen, um die Monozyten als „Events“ darzustellen und „gaten“ zu können.

▼ 24 

Abbildung 3 : Für die Bestimmung von CD64 und CD11b auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten wurden die Monozyten (durchgezogene Linie) und die Granulozyten (gepunktete Linie) mit Hilfe ihrer unterschiedlichen Eigenschaften (Granularität und Stärke der CD45-Expression) „gegated“, um sie jeweils gesondert auszuwerten.

Abbildung 4 : QuantiCALCTM-Auswertung: Die grünen Punkte auf der Ordinate repräsentieren die mit dem QuantiBRITETM-Kit gemessenen Geomeans, die nun der Einheit „Antikörper pro Zelle“ zugeordnet werden können. Auf den Monozyten dieses Patienten befanden sich durchschnittlich 4939 Anti-HLA-DR-Antikörper.

3.5 Konzentrationsbestimmungen humoraler Marker mittels ELISA

Grundprinzip des ELISA anhand der ex vivoElastase-Bestimmungen und Erweiterung des Elastase-Messprotokolls

Bislang lagen für die Messung mit dem „Milenia-PMN-Elastase-Kit“ nur Daten für EDTA- und Citrat-Plasma vor, deshalb wurde zunächst anhand von fünf freiwilligen Probanden in einer Versuchsreihe mit EDTA- und Heparin-Blut das Messprotokoll durchgeführt, zudem wurden unterschiedliche Vorverdünnungen der Überstände nach Stimulation (siehe unten) getestet . Es stellte sich heraus, dass heparinisiertes Plasma ebenso geeignet war, und dass eine Verdünnung der Stimulationsüberstände von 1:1000 (gegenüber der 1:100-Verdünnung bei der Verwendung von Plasma gemäß der Anleitung des Herstellers, ohne vorherige ex vivo-Vollblut-Stimulation) notwendig war, um Werte zu erhalten, die innerhalb des Bereiches der Standardproben lagen (Daten nicht dargestellt).

▼ 25 

Da die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Bestimmungen löslicher Parameter demselben Prinzip des ELISA gehorchen, soll dieses anhand der Messung der ex vivoElastase-Produktion veranschaulicht werden.

100 µl Heparin-Vollblut wurden mit 100 µl auf 1:2000 vorverdünnter Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA)-Stock-Lösung (1 mg / ml) und 300 µl RPMI 1640 Zell-Kultur-Medium gemischt und für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde mit 1000 g zentrifugiert, und der Überstand bei –70°C gelagert, bis mit dem „Milenia-PMN-Elastase-Kit“ der ELISA durchgeführt und die Elastase-Konzentration bestimmt wurde.

Dazu wurden gemäß der Vorversuche und der Anleitung des Herstellers alle Proben auf 1:1000 verdünnt und je 100 µl in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiter-Platte, deren Böden mit Anti-Elastase-Antikörpern beschichtet waren, aufgetragen. Außerdem wurde eine 1:2 Verdünnungsreihe mit dem mitgelieferten Verdünnungspuffer und dem Standard (1000 ng/ml) über die Konzentrationen 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml und 15,625 ng/ml durchgeführt, das letzte Glied in dieser Reihe und damit der Null-Standard war der Probenverdünnungspuffer. Die Mikrotiterplatte wurde für 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert, um eine Bindung der Elastase an die an den Böden der Vertiefungen fixierten und damit immobilisierten (primären) Anti-Elastase-Antikörpern zu erzielen. Danach wurde vier mal mit Waschpuffer gewaschen und 150 µl Antikörperlösung hinzugegeben, die an Meerrettichperoxidase gekoppelte (sekundäre) Antikörper gegen Elastase enthielt. Indem erneut für 60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert wurde, haben sich die Antikörper-Elastase-Antikörper- (sogenannte „Sandwich“-) Komplexe gebildet, wie sie für das ELISA-Prinzip typisch sind (Abbildung 5). Anschließend wurden 200 µl der Substratlösung hinzupipettiert, die 3,3´,5,5´-Tetra-Methyl-Benzidin (TMB) enthält. Dieses wurde während einer 20 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur als Substrat farblich umgesetzt. Nach einer Beendigung der Reaktion mit Stopp-Lösung wurde die optische Dichte bei 450 nm mit dem luminometrischen System der Firma Anthos Labtec gemessen, die proportional zur Stärke der Farbbildung und damit zur Konzentration an Elastase in den Proben war.

▼ 26 

Abbildung 5 : „Sandwich-Komplex“ bestehend aus am Boden fixierten primären Anti-Elastase-Antikörpern, daran gebundenen Elastase-Molekülen und einem flüchtigen sekundären Anti-Elastase-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Dieses Enzym setzt TMB als Substrat farblich um. Die Stärke der Farbreaktion ist proportional zur Konzentration an Elastase in der Lösung.

Anhand einer Standardkurve, die aus den gemessenen Standards mit den bekannten Konzentrationen hervorging, wurden die Konzentrationen der Proben angegeben. Zusätzlich wurden Kontroll-Proben mituntersucht, die festgelegte Elastase-Mengen enthielten, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu überprüfen.

Bestimmung von IL-6, total-IL-8, Plasma-IL-10, LBP, CRP und PCT

Ein ELISA mit sehr wenig Arbeitsaufwand und hohem Standardisierungsgrad ist der halb-automatische „IMMULITE®-Chemilumineszenz-Immunoassay“, mit dem die Konzentrationen von IL-6, total-IL-8, Plasma-IL-10, LBP, und CRP bestimmt wurden. Als feste Phase enthielten die mitgelieferten Reaktionsgefäße kleine beschichtete Kügelchen, und als Antikörper-gekoppeltes Enzym fungierte die Alkalische Phosphatase.

▼ 27 

Im Falle des IL-8 wurde zur Lyse der Erythrozyten zuvor Vollblut mit Milenia-Zell-Lyse-Lösung im Verhältnis 1:1 versetzt. Hintergrund hierfür ist die Tatsache, dass im Blut IL-8 von Erythrozyten abgebunden wird und somit durch „konventionelle“ IL-8-Plasma-Bestimmungen nur Sekretions-Spitzen messbar sind, die die Bindungskapazität der Erythrozyten übersteigt. Durch die vorherige Lyse der Erythrozyten wird bei den IL-8-Bestimmungen neben dem Plasma-IL-8 auch das abgebundene IL-8 erfasst (→„total-IL-8“). In verschiedenen Messreihen konnte gezeigt werden, dass Plasma-IL-8-Werte und total-IL-8-Werte gut korrelierten, wobei nur das total-IL-8 regelmäßig im messbaren Bereich lag (unveröffentlichte Daten, Institut für Medizinische Immunologie, CCM).

PCT wurde mit einem Kit der Firma Brahms Diagnostica und dem Luminometer „Beri-Lux Analyzer 250“ der Firma Behring gemäß der Arbeitsanleitung des Herstellers gemessen.

Monozytäre ex vivo TNF-α Sekretionskapazität

Es wurden nur die im Stimulations-Kit enthaltenen, pyrogenfreien und einzeln verpackten Materialien (Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße) verwendet, um zusätzliche Stimuli für die TNF-α-Bildung möglichst auszuschließen.

▼ 28 

50 µl heparinisiertes, bei Raumtemperatur gelagertes Blut wurden mit 500 µl LPS-Lösung (500 pg/ml) versetzt und zur Stimulation der Monozyten für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach Zentrifugation mit 1000 g wurde der Überstand bei –70°C gelagert, bis zur Bestimmung der TNF-α-Konzentration der „IMMULITE®-Chemilumineszenz-Immunoassay“ durchgeführt wurde.

3.6 Bestimmung der leukozytären mRNA-Expression mittels RT-PCR

Um die Expression bestimmter Gene quantitativ untersuchen zu können, ist es zuvor notwendig, aus Zellmaterial die RNA zu präparieren und diese in cDNA umzuschreiben, da für RT-PCR-Messungen nur DNA verwendet werden kann.

3.6.1 Leukozytenpräparation

Vor Beginn wurde Ammoniumchlorid-Lyse-Lösung hergestellt (siehe Kapitel 3.1). Aus den auf Eis gelagerten EDTA-Monovetten wurde der zwischen der erythrozytären Phase und der Plasmaphase nach Zentrifugation mit 1000 g befindliche „Leukozytenrasen“ in eine 500 µl Pipettenspitze aufgenommen, so dass man neben Lymphozyten und Monozyten auch die granulozytäre Fraktion erhielt. Zu der Leukozytenlösung wurden 5 ml NH4Cl-Lyse gegeben und anschließend für fünf Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen, zentrifugiert wurde jeweils bei 250 g. Zu den Zellpellets wurden abschließend 500 µl Lösung D und 3,5µl Mercaptoethanol zur Auflösung der Zellmembranen und Inaktivierung von RNAsen gegeben, und die so erhaltenen Zelllösungen wurden bis zur RNA-Präparation bei –70°C gelagert.

3.6.2 RNA-Präparation und Quantifizierung mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer

▼ 29 

Die Präparation der RNA erfolgte mit dem „Absolutely RNA Miniprep Kit“ (Stratagene) und den darin enthaltenen Reagenzien. Zentrifugiert wurde jeweils bei 14000 g.

Die in Lösung D und Mercaptoethanol gelösten Zellproben wurden zwecks Auflösung eventueller Zellklumpen auf einen Prä-Filter gegeben und für 5 Minuten zentrifugiert. Danach wurden zum Filtrat jeweils 600 µl 70%-Ethanol hinzugegeben und für fünf Sekunden gevortext. Das Gemisch wurde auf einen RNA-Bindungsfilter gegeben, dessen Silikabeschichtung die RNA bindet. Nach einminütiger Zentrifugation wurde mit 600 µl Low-Salt-Wash-Puffer gewaschen und 2 mal zentrifugiert (je eine Minute). 5 µl DNase-Lösung plus 50 µl DNase-Digestion-Puffer wurden auf den Filter gegeben und für 15-30 Minuten bei 37°C inkubiert, um eventuell vorhandene Verunreinigungen mit genomischer DNA zu entfernen. Anschließend folgten drei Waschschritte, mit 600 µl High-Salt-Puffer, 600 µl Low-Salt-Puffer und 300 µl Low-Salt-Puffer (jeweils Zentrifugation für 1-2 Minuten). Als letztes wurde die RNA mit 60°C warmen Elutionspuffer eluiert und entweder sofort weiterverarbeitet oder bei –70°C tiefgefroren.

Die Bestimmung der RNA-Konzentration erfolgte mit dem „RNA 6000 Nano LabChip®Kit“ unter Verwendung des Agilent 2100 Bioanalyzers. Dabei wurde jeweils 1 µl der RNA-Lösung auf einem Chip aufgetragen. In einer im Chip enthaltenen Kapillare wurde die RNA elektrophoretisch aufgetrennt, und durch Fluoreszenzmarkierung (durch Zugabe des „Gel Dye Mix“) wurden die Fluoreszenzsignale zeitlich aufgelöst widergegeben und in Beziehung zu einer Standardprobe mit bekanntem RNA-Gehalt gesetzt. Auf diese Weise wurden die Konzentrationen der 18-S und 28S-rRNA ermittelt; außerdem erlaubte die graphische Darstellung der Signale Rückschlüsse auf die Qualität der RNA.

3.6.3 Reverse Transkription mit dem „First Strand cDNA-Synthesis Kit”

▼ 30 

Für die Umschreibung der RNA in cDNA wurden 2 µl Oligo-dT-Primer-Lösung mit 18 µl RNA-Lösung gemischt und bei 75°C für 10 Minuten zur Beseitigung von Sekundärstrukturen vorinkubiert und danach abgekühlt. Nach Zugabe von 8 µl First Strand Buffer, 4 µl Dithiothreitol, 4 µl dNTP, 2 µl DNase und 0,5 µl RNase-Inhibitor erfolgte bei 37°C für 30 Minuten ein weiterer Verdau potenziell vorhandener genomischer DNA. Danach wurden die Proben zur Inaktivierung der DNase für 5 Minuten bei 75°C erhitzt und anschließend auf Eis abgekühlt. Nun erfolgte die eigentliche Transkription durch Zugabe von 1 µl M-MLV-Reverse Transkriptase und 1 µl RNase-Inhibitor während einer 60-minütigen Inkubation bei 42°C. Danach wurde das Enzym durch Inkubation bei 94°C für 5 Minuten inaktiviert, die Proben entweder weiterverarbeitet oder bei –20°C gelagert.

Da trotz des zweimaligen Entfernens von DNA (während der RNA-Präparation und während der Transkription von RNA in cDNA) eine Kontamination mit genomischer DNA nicht ausgeschlossen werden kann, wurde zu jedem Ansatz ein weiterer RT--Ansatz, bei dem keine Reverse Transkriptase hinzugefügt wurde, mitgeführt, um später mittels PCR und genomischer Amplifikationsprimer solche Verunreinigungen erkennen zu können.

3.6.4 TaqMan® Real Time Reverse Transkriptase (RT) Polymerase-Kettenreaktion

Grundlagen

Ausgehend von DNA-Proben werden bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Genabschnitte / Nukleinsäurefragmente amplifiziert, um entweder das Vorhandensein eines Gens qualitativ nachzuweisen (konventionelle PCR), oder um die Menge an DNA-Ausgangsmaterial quantitativ zu bestimmen (Real-Time-RT-PCR).

▼ 31 

Analog zur Nukleinsäuresynthese in vivo fungieren als „Ausgangsnukleotide“ ein Forward-Primer (DNA-Fragment, welches am 5´-3´-Strang bindet) und ein Reverse-Primer (am 3´-5´-Strang bindendes Fragment). Nach Aufspaltung des DNA-Doppelstranges in seine beiden Einzelstränge (Denaturierung) binden die beiden Primer jeweils an den Abschnitt des komplementären DNA-Fragmentes der präparierten cDNA. Die Amplifikation geschieht durch eine hitzestabile Polymerase, die an die Primer jeweils ein zum vorhandenen Strang komplementären neuen Strang synthetisiert (Extensionsphase). Danach werden die neu synthetisierten Fragmente ebenfalls denaturiert, und es kommt zu einer weiteren Extensionsphase. Es können zahlreiche Zyklen aufeinanderfolgen, wobei sich im Idealfall mit jedem Zyklus die Menge der synthetisierten DNA verdoppelt (Amplifikations-Effizienz = 1).

Im Unterschied zur konventionellen PCR bindet bei der TaqMan®-Real-Time-RT-PCR neben den beiden Primern ein zusätzliches Oligonukleotid, die sogenannte TaqMan®-Sonde. Diese ist an zwei Stellen fluoreszenzmarkiert: am 5´-Ende mit einem sogenannten Reporterfarbstoff (zum Beispiel FAM), der nach Anregung Licht mit einer Wellenlänge von 518 nm (FAM) emittiert, und in der Nähe des 3´-Endes mit TAMRA (nach Anregung Lichtemission bei 582 nm). Durch die räumliche Nähe der beiden Farbstoffe zueinander (an der intakten Sonde) wird die Emission des Reporterfarbstoffes aufgrund eines Fluoreszenz-Energietransfers (FET) durch TAMRA unterdrückt, TAMRA fungiert somit als Quencher. Das Enzym zur Amplifikation ist die AmpliTaq GoldTM-DNA-Polymerase, welche zu ihrer Polymerase-Aktivität zusätzlich eine 5´-3´-Nuklease-Aktivität besitzt. Dadurch wird während der Synthesephase die Sonde hydrolysiert und damit vom 5´-3´-Strang verdrängt, wenn der neu synthetisierte Strang, beziehungsweise die AmpliTaq GoldTM-DNA-Polymerase, auf die gebundene Sonde trifft, wobei von der Hydrolyse-Aktivität nur die gebundene, nicht aber die (noch) ungebundene Sonde betroffen ist. Die Konsequenz ist, dass das Signal des Reporterfarbstoffes nun nicht mehr vom Quencherfarbstoff unterdrückt werden kann. Deshalb ist es nun möglich, mittels eines Argonlasers (488 nm) den Reporterfarbstoff anzuregen und das Signal zu detektieren. Die Stärke des Signals ist direkt proportional zur Menge des amplifizierten DNA-Produkts und nimmt im Verlauf der Synthese von Zyklus zu Zyklus zu. Es hängt entscheidend von der Ausgangsmenge des entsprechenden DNA-Fragmentes beziehungsweise von der ursprünglichen Menge an mRNA ab und wird auf das Fluoreszenzsignal eines in der Regel konstant exprimierten Genes (House Keeping Gen) bezogen, welches im selben RT-PCR-Lauf synthetisiert wird. Auf diese Weise kann die relative Genexpression berechnet werden.

Abbildung 6 und Abbildung 7 geben die entscheidenden biochemischen Reaktionen während eines Zyklus grafisch wieder.

▼ 32 

Abbildung 6 : Beginn der Polymerisation. An den am 3´-Ende gebundenen Primer synthetisiert die Taq®-Polymerase einen komplementären neuen Strang. Durch die intakte Sonde wird das Reportersignal vom Quencher durch FET unterdrückt.

Abbildung 7 : Stößt die Taq®-Polymerase auf die in der Nähe des Primers gelegene Sonde, wird diese durch die 5´3´-Exonukleaseaktivität der Polymerase hydrolysiert, so dass das Reportersignal nun nicht mehr unterdrückt wird und nach Anregung mit einem Argonlaser (488 nm) detektiert werden kann.

Durchführung

Alle Ansätze wurden zur Optimierung der Genauigkeit der Ergebnisse als Doppelbestimmungen durchgeführt. Für einen Ansatz wurden 1 µl cDNA, 1 µl Sonde, 6 µl Primermix (Forward- und Reverse-Primer in entsprechendem Verhältnis, siehe Kapitel 3.6.5) und 4,5 µl Aqua dest in ein Reaktionsgefäß (Optical Tube) pipettiert. Außerdem wurden 12,5 µl Mastermix hinzugefügt, der aus folgenden Komponenten besteht:

▼ 33 

Als Housekeeping-Gen wurde ein Panel für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) eingesetzt. Um die Proben auf Kontaminationen mit genomischer DNA zu untersuchen, wurden für jedes Panel No Template Controls (NTCs, Negativ-Kontrollansätze ohne cDNA) angesetzt, sowie für jede cDNA eine RT--Probe mit einem kreuzreaktiven Histone-Panel, welches genomische DNA detektiert. Tabelle 1 gibt die Sequenzen der verwendeten Panel an.

Tabelle 1 : Sequenzen der verwendeten Primer und Sonden.

Panel

 

Sequenzen

   

HPRT

Sonde

5´-TTT-CAC-CAG-CAA-GCT-TGC-GAC-CTT-GA-3´

 

forward

5´-AGT-CTG-GCT-TAT-ATC-CAA-CAC-TTC-G-3´

 

reverse

5´-GAC-TTT-GCT-TTC-CTT-GGT-CAG-G-3´

   

Histone

Sonde

5´-GCA-AGT-GAG-GCC-TAT-CTG-GTT-GGC-CTT-T-3´

 

forward

5´-CCA-GAG-CGC-AGC-TAT-CGG-T-3´

 

reverse

5´-CAC-GTT-TGG-CAT-GGA-TAG-CAC-3´

   

IL-8

Sonde

5´-ACT-GCA-CCT-TCA-CAC-AGA-GCT-GCA-GAA-ATC-3´

 

forward

5´-CTA-AGT-TCT-TTA-GCA-CTC-CTT-GGC-AA-3´

 

reverse

5´-TGA-CTT-CCA-AGC-TGG-CCG-T-3´

   

IL-10

Sonde

5´-AAA-GAA-AGT-CTT-CAC-TCT-GCT-GAA-GGC-ATC-TCG-3´

 

forward

5´-CAA-GTT-GTC-CAG-CTG-ATC-CTT-CAT-3´

 

reverse

5´-GGC-AAC-CTG-CCT-AAC-ATG-CTT-3´

   

TNF-α

Sonde

5´-TGT-AGC-CCA-TGT-TGT-AGC-AAA-CCC-TCA-AGC-3´

 

forward

5´-TCT-CGA-ACC-CCG-AGT-GAC-AA-3´

 

reverse

5´-TCA-GCC-ACT-GGA-GCT-GCC-3´

   

HO-1

Sonde

5´-TGC-TCA-ACA-TCC-AGC-TCT-TTG-AGG-AGT-TG-3´

 

forward

5´-GAA-GAG-GCC-AAG-ACT-GCG-TTC-3´

 

reverse

5´-TGG-TCC-TTG-GTG-TCA-TGG-GT-3´

   

Rantes

Sonde

5´-CAA-CCC-AGC-AGT-CGT-CTT-TGT-CAC-CC-3´

 

forward

5´-TTT-CTA-CAC-CAG-TGG-CAA-GTG-CT-3´

 

reverse

5´-GCA-CAC-ACT-TGG-CGG-TTC-TT-3´

   

SOCS-3

Sonde

5´-CCA-GCG-CCA-CTT-CTT-CAC-GCT-CAG-3´

 

forward

5´-CTT-TCT-GAT-CCG-CGA-CAG-CT-3´

 

reverse

5´-TCA-CAC-TGG-ATG-CGC-AGG -T-3´

▼ 34 

Die TaqMan®-Läufe wurden mit dem „GeneAmp 5700 Sequence Detection System“ durchgeführt. Dies ist ein Thermocycler, der maximal 96 Reaktionsansätze nach einem bestimmten Programm zu erhitzen und abzukühlen vermag und dadurch die biochemischen Reaktionen ermöglicht. Dabei wird der Strahl eines Argon-Lasers (Wellenlänge von 488 nm) über einen Multiplexer auf die Proben geleitet, so dass die Reportermoleküle (FAM), die in den Synthesephasen eines Laufes durch die Hydrolyse der Sonden frei werden, angeregt werden. Ihr emittiertes Licht wird nun mittels einer CCD-Kamera in ein digitales Signal umgewandelt. Ein TaqMan®-Lauf besteht aus vier Schritten:

  1. Zuerst wird für 2 Minuten bei 50°C der UNG-Verdau durchgeführt.
  2. Dann wird für 10 Minuten auf 95°C erhitzt, um die UNG zu inaktivieren und gleichzeitig die AmpliTaq GoldTM-DNA-Polymerase zu aktivieren.
  3. Als drittes wird für 15 Sekunden bei 95°C die cDNA denaturiert und für 60 Sekunden bei 60°C das Annealing (Andocken der Primer und Sonden) und die Extension (Synthese durch die Polymerase) durchgeführt. Dieser Schritt wird 40 mal wiederholt (40 Zyklen)...
  4. ...bis die Proben bei 4°C gekühlt werden, und der PCR-Lauf damit beendet wird.

Ausgewertet wurde mit der zugehörigen Software „GeneAmp 5700 Sequence Detection Software“, welche die normalisierten Reportersignale der einzelnen Ansätze im Verlauf der 40 Zyklen angibt. Dabei wurde für jede Probe diejenige Zyklenzahl bestimmt, bei der erstmalig ein statistisch signifikantes Signal über dem Grundrauschen (unspezifisches Basissignal, zu Beginn eines PCR-Laufes einziges Signal) detektiert werden konnte: der Threshold Cycle (CT). Dieser gibt somit an, wie vieler Amplifikationszyklen es bedurfte, um messbare Mengen an Produkt zu erhalten. Die CTs der Doppelansätze durften zwecks Messgenauigkeit um nicht mehr als einen halben Zyklus (CT<0,5) voneinander abweichen, ansonsten wurde der Ansatz wiederholt. Für die weiteren Berechnungen wurden jeweils die arithmetischen Mittelwerte verwendet.

▼ 35 

Bei einem CT>35 war die Ausgangskonzentration der cDNA derart gering, dass eine Messung unter Umständen nicht mehr reproduzierbar gewesen wäre und somit von den Auswertungen ausgeschlossen wurde.

Zur Berechnung des dimensionslosen Ergebnisses für ein Zielgen wurde zunächst die Differenz zwischen dem CT der interessierenden Sequenz und von HPRT bestimmt (ΔCT). Da die Panel für eine Real-Time-RT-PCR so konstruiert werden, dass die Effizienzen bei annähernd 1 liegen, gilt entsprechend den Ausführungen von Livak und Schmittgen [[LINK to cms:entry] ]:

Ergebnis (auf ein Housekeeping-Gen normalisierte und zu einer Kontrollprobe relativierte Gen-Expression) = 2- Δ Δ C(T).

3.6.5 Etablierung eines Panels

▼ 36 

Ein TaqMan®-Panel beinhaltet die erwähnten Primer (Forward- und Reverse-Primer) und die Sonde der zugehörigen mRNA. Ein Primer besteht aus 18 bis 28 Basen, der GC-Gehalt soll circa 50 % betragen, es soll möglichst keine Poly-T-Bereiche geben. Zur Vermeidung / möglichst geringen Bildung von Dimeren soll nur eine geringe Komplementarität zwischen beiden Primern bestehen. Man bevorzugt wegen der erhöhten Reinheit HPLC-gereinigte Primerlösungen. Folgende Kriterien sollten beim Design einer Sonde beachtet werden:

Außerdem sollte die Sonde direkt mittig über die Exongrenzen gelegt werden, da auf diese Weise die Kreuzreaktivität mit genomischer DNA verhindert wird. Die Länge des Amplikons sollte circa 70-110 Basenpaare lang sein, da mit zunehmender Amplikonlänge die Effizienz der PCR stark abnimmt.

▼ 37 

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines Panels für SOCS-3 (ab Primertitration) zu Ende geführt. Nachdem im Vorfeld die entsprechenden Sequenzen gemäß den genannten Kriterien herausgesucht und weitere Übereinstimmungen mit dem humanen Genom ausgeschlossen worden waren, waren sie bei der Firma Metabion (Primer) beziehungsweise Eurogentec (Sonde) zur Synthese in Auftrag gegeben worden.

Zur Bestimmung der optimalen Primerkonzentrationen für das SOCS-3-Panel wurde eine Titration der Primer mit jeweils 50 nM, 300 nM und 900 nM durchgeführt, und diejenige Kombination mit dem frühesten CT und der höchsten Fluoreszenz ermittelt. Zur Bestimmung der Effizienz der Amplifikation mit diesem Panel wurde eine Verdünnungsreihe von für SOCS-3 stark positiver cDNA angefertigt, wobei in vier Stufen die cDNA jeweils auf ein Viertel verdünnt wurde. Mit diesem cDNA-Material wurde daraufhin ein PCR-Lauf mit dem SOCS-3-Panel und mit HPRT als Housekeeping-Gen durchgeführt. Es wurde in einem Koordinatensystem der Threshold Cycle gegen den Logarithmus der cDNA-Verdünnungen aufgetragen und durch lineare Regression eine Standardkurve erstellt. Da der Betrag der Steigung unter 0,01 lag, wurden die Effizienzen von HPRT und SOCS-3 für in etwa gleich (≈1) angenommen.

3.7 Exploratorische Analyse (deskriptive Statistik) und Interferenz-Statistik (konfirmatorische Analyse)

Die Auswertung und Darstellung der Daten erfolgte mit SPSS 10.0, MedCalc 6.14 Demo Version, SAS, StatXact, MS Excel, Micrografx Designer und MS PowerPoint. Es wurden Boxplots mit Angabe der Mediane, der 75% (QO)- und der 25% (QU)-Perzentilen und der inneren Eingrenzung (QO+1,5*(QO-QU) beziehungsweise QU-1,5*(QO-QU)) ohne Berücksichtigung der Ausreißer dargestellt. Aufgrund der schiefen Verteilung der Merkmale wurden nonparametrische Tests für nicht-normalverteilte Stichproben angewendet: ausgehend von einem Signifikanzniveau von α=0,05 wurden zur Untersuchung auf Parameterunterschiede zwischen Patientengruppen der Kruskal-Wallis- und bei dessen Signifikanz der Mann-Whitney-U-Test durchgeführt.

▼ 38 

Für die Beziehungen der Parameter untereinander wurden nonparametrische Varianzanalysen durchgeführt, zusätzlich wurden Korrelationskoeffizienten nach Spearman für nicht normal-verteilte Merkmale ermittelt.

Für die Auswertung der Marker bezüglich ihrer diskriminativen Aussagekraft – Entwicklung versus keine Entwicklung von Infektion – wurden Receiver Operating Characteristics (ROC)-Kurven erstellt.


Fußnoten und Endnoten

5  FACS = Fluorescence Activated Cell Sorting



© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
XDiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
11.04.2006