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2.  Material und Methoden

2.1. Tiere, Gewebe, Zellen

. Unbehandelte männliche Sprague-Dawley Ratten (140-200g), männliche NOS 1-/- Mäuse und Wildtyp Kontrollmäuse NOS 1+/+ (25-30g) wurden von der lokalen Tierabteilung bezogen. Behandelte Ratten, Goldblatt-Modell: Tiere für das 2 Nieren 1 Clip Goldblatt-Modell des renovaskulären Bluthochdruckes und Kontrolltiere wurden über Zeiträume von 3 und 28 Tagen behandelt 14. Der Blutdruck wurde ab dem 1. Tag nach der Operation schwanzplethysmographisch gemessen und alle Tiere wurden am letzten Tag des Experimentes zur Urinvolumenbestimmung über 24h in metabolischen Käfigen gehalten. Die verwendeten Glomeruli, Mesangialzellen und medulläre Fibroblasten wurden in Zusammenarbeit mit unseren Kooperationspartnern isoliert. Hierzu wurde Nierenkortexgewebe in Zellkulturmedium aufbereitet und durch Stahlsiebe der Porengröße 150 µm gesiebt, zentrifugiert, das entstandene Pellet in einem geringen Volumen aufgenommen und die Glomeruli mikrodisseziert 15. Zur Isolierung der Mesangialzellen wurden die Glomeruli enzymatisch mit Kollagenase verdaut, in Medium aufgenommen und morphologisch im Phasen-Kontrastmikroskop charakterisiert. 16. Zur Isolierung der medullären interstitiellen Zellen wurde das innere Nierenmark mit Kollagenase und Hyaluronidase aufgespalten und die Sammelrohrzellen durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wurden die Zellen mit Dolichos biflorus Agglutinin überzogenen Beads isoliert 17 und durch Dichtegrandientenzentifugation weiter aufgereinigt. Zur Isolierung von Ito-Zellen wurden nichtparenchymale Zellen über Pronase-Kollagenase-Methode 18 isoliert und die Ito-Zellen anschließend durch Dichtegrandientenzentifugation weiter aufgereinigt. Ihre Identifikation erfolgte auf Grund ihrer typischen Strukturmerkmale und ihrer Vitamin-A spezifischen Autofluoreszenz.

Für morphologische und immunhistochemische Untersuchungen wurden die Tiere anästhesiert und retrograd über die abdominale Aorta perfusionsfixiert 14.

2.2. Histochemische und Western blot Analyse.

2.2.1. Antikörper gegen:

Antikörper

Wirt

Herkunft

β1 sGC

Kaninchen

D. Koesling

NOS1

Kaninchen

Alexis

Podosynapsin

Maus

P. Mundel

Desmin

Maus

Dako

5´-Ekto-Nukleotidase

Kaninchen

B. Kaissling

NOS1 (Exon2)

Maus

Calbiochem

NOS1 (Exon 12-21)

Kaninchen

Sigma

COX-1

Kaninchen

Caymanchemicals

COX-1

Kaninchen

Santa Cruz

COX-2

Kaninchen

Caymanchemicals

COX-2

Ziege

Santa Cruz

mPGES

Kaninchen

Caymanchemicals

THP

Kaninchen

J. Hoyer

Na-Cl Kotransporter

Kaninchen

D. H. Ellison

Na/Ca Austauscher

Meerschweinchen

R. Reilly

Calbindin

Maus

Sigma

2.2.2. Western blot.

Gewebe (Nieren aufgetrennt in Kortex und Mark; Lunge; Skelettmuskel und Leber) und Zellen (Mesangialzellen; interstitielle Zellen und Ito-Zellen) wurden in Homogenisierungspuffer aufbereitet, zentrifugiert, und das Gewebehomogenat und Zellysat bis zur Verwendung bei –80°C eingefroren. Die Homogenate und Lysate wurden anschließend gelelektrophoretisch in SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen, welche anschließend zur Blockierung unspezifischer Proteinbindung in Milch übertragen wurde. Zur Detektion spezifischer Proteine wurde die Membran mit dem jeweiligen Primärantikörper, gefolgt von einem HRP-gebundenen Sekundärantikörper inkubiert. Mit Hilfe eines Chemiluminescenz-Kits wurde das Signal generiert. Immunhistochemie . Zur immunhistochemischen Färbung wurden Cryostatschnitte oder Paraffinschnitte verwendet. Nach der Inkubation mit dem Primärantikörper erfolgte die Detektion des Signals durch Fluorochrom oder HRP-konjugierte Antikörper. Durch die Blockierungstests mit dem zur Antikörperproduktion verwendeten antigenen Peptids wurde die Spezifität der anti-β1-sGC und anti-COX-2 Antikörper überprüft.

2.3. Immun-Elektronenmikroskopie.

Für eine ultrastrukturelle Immunperoxidasemarkierung wurden 20µm dicke Vibratomschnitte mit anti-β1-sGC, anti-COX-1 und anti-COX-2 in Mikrotiterplatten inkubiert und anschließend mit 1% Osmiumtetroxid nachfixiert, mit Maleatpuffer gewaschen, en bloc mit Uranylacetat markiert und in Epon 812 eingebettet. Die danach hergestelltenSemi- und Ultradünnschnitte wurden mit einem Licht bzw. Elektronenmikroskop ausgewertet.

2.4. NADPH-Diaphorase Markierung.

Die katalytische Aktivität der NOS wurde über die enzymatische Reduktion von Nitroblau -Tetrazoliumsalz in Anwesenheit von NADPH (NADPH-Diaphorase Reaktion) demonstriert. Das Gewebe wurde in 0.1 M Phosphatpuffer bei 37°C inkubiert und bei Sichtbarwerden des Signals abgestoppt.

2.5. In situ Hybridisierung.

Die Lokalisation der mRNA Expressionen, α1 sGC, β1 sGC, COX-1, COX-2 und mPGES, wurden durch die In situ Hybridisierung untersucht. Digoxigenin-markierte RNA-Sonden (sense und antisense) wurden über in vitro Transkription der entsprechenden cDNA hergestellt und auf Nierengewebe aufgetragen 14. Nach der Inkubation mit einem alkalische Phosphatase-konjugierten anti-Digoxigenin Antikörper wurde das Signal durch eine Farbreaktion generiert.


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2.6.  RT-PCR.

Die RNA aus dem Nierenkortex, dem Nierenmark, den isolierten Glomeruli und aus der Leber wurdennach der Guanidinium Thiocyanat-Methode extrahiert, spektrophotometrisch bei 260 nm quantifiziert und anschließend revers transkribiert. Passende Oligonukleotidprimer für α1 sGC, β1 sGC, COX-1, COX-2, PGES und GAPDH wurden zur Amplifizierung der cDNA mit einer Taq Polymerase benutzt. Nach der Auftrennung im Agarosegel und Ethidiumbromidfärbung wurden die spezifischen cDNA Fragmente im Ultraviolettlicht überprüft.

2.7. Messungen intrazellulärer zytosolischer cGMP Fraktionen in Geweben und isolierten Zellen.

Zytosolische Proteine aus Nieren-, Leber- und Lungengewebe sowie isolierte Podozyten, Mesangial-, interstielle- und Ito-Zellen wurden in Anwesenheit von 3-isobutyl-1-methylxanthine mit einem NO-Donor inkubiert und anschließend die Konzentration des gebildeten cGMP über Radioimmunoassay oder enzymatisch gebundenen Immunabsorptionsassay gemessen.


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18.07.2005